1 KJ2053 Kromatografi (Analytiske metoder II) Lundanes Else, Reubsaet Léon, Greibrokk Tyge, Chromatography, Basic Principles, Sample Preparations and..., Wiley-VCH, 2014. ISBN:978-3-527-33620-3 3.C LC-Separasjonsmekanismer 3.C. 1. Normal-fase Adsorpsjonskromatografi (NP-LSC) 3.C. 2. Omvendt-fase kromatografi (Reversed Phase (Bonded Phase) Chromatography) (applikasjoner 3.C.3. f. ) 3.C. 4. Hydrofilisk interaksjonskromatografi (HILIC, NP-LLC) 3.C. 5. Eksklusjonskromatografi (gel-kromatografi) og andre 1
2 (i) Oppkonsentrering av ioner (9.3.3.) (ii) Ionebytterkromatografi av aminosyrer og deres derivater a) Aminosyre-anaIysator b) Peptider og proteiner (iii) Ionekromatografi (3.5.4.1.) (iv) Ligandutbytting (ligand exchange chromatography) (v) Kromatofokusering (3.5.4.) (vi) Ion-eksklusjonskromatografi (vii) Ionpar-kromatografi (3.5.2.7) 2
3 (i) Oppkonsentrering av ioner (jfr. også SPE, Fastfase-ekstraksjon (kap. 9)) Retensjonen for ioner på ionebytter-kolonner er høy når : - selektiviteten er gunstig (sterk binding; f.eks. flerladede kationer, chelat-ionebyttere), - ionestyrken i prøveløsningen er lav (lav eluerings-styrke av prøveløsningen). Kan utnyttes, ved at store volum prøve ("liter") kan appliseres på små ionebytterkolonner ("ml","gram") og ionene retarderes/oppkonsentreres i det lille kolonne-volum. 3
4 (i) Oppkonsentrering av ioner (jfr. også SPE, Fastfase-ekstraksjon (kap. 9)) Retensjonen for ioner på ionebytter-kolonner er høy når : - selektiviteten er gunstig (sterk binding; f.eks. flerladede kationer, chelat-ionebyttere), - ionestyrken i prøveløsningen er lav (lav eluerings-styrke av prøveløsningen). Kan utnyttes. ved at store volum prøve ("liter") kan appliseres på små ionebytterkolonner ("ml","gram") og ionene retarderes/oppkonsentreres i det lille kolonnevolum. Forutsetning : Prøven skal ha lav (lavest mulig) ionestyrke - derfor spesielt anvendelig for "tynne" prøver. For maksimal gjenvinning av interesserende ioner: konsentrerte prøver fortynnes (!) før påsetting (for å unngå "plugg-eluering"). Eluering av oppsammlede (retarderte) ioner ved betingelser som gir et minst mulig eluerings- (prøve-) volum ("ml"): - eluering med høy elueringsstyrke (høy ione-styrke av ikke-forstyrrende ioner), - kompleksligander i mobilfasen, som utkonkurrerer de faste ionene. - ph-forandringer (f.eks. nøytralisering av fast ion i svak ionebytter). Anvendes f.eks. ved opparbeidelse av prøver til sporanalyser av metaller. 4
5 (ii) Ionebytterkromatografi av aminosyrer og deres derivater Herunder Aminosyreanalysator Proteomics ( deler av ) Aminosyre-anaIysatoren: Baserer seg på syre-base-egenskapene til amino-syrene. Aminosyrene er amfotere (= zwitter-ioner), d.v.s kan ha både positiv og/eller negativ ladning i samme molekyl/ion, kan opptre både som syre eller base (som zwitterion) : Aminosyrer foreligger som kationer ved lav ph (protonert amino- og karboksyl-funksjon)... R + NH 3 COOH + -H + +H + R COO 0... ved høyere ph blir de først til nøytrale zwitterioner... + NH 3... og så anioner ved enda mer alkaliske betingelser, d.v.s. høy ph. R NH 2 COO -H + +H + 5
6 ph = pk a + log ([B] / [HB + ]) log ([B] / [HB + ]) = ph - pk a (ii) Ionebytterkromatografi av aminosyrer og deres derivater Aminosyreanalysator Aminosyre-anaIysatoren: baserer seg på syre-base-egenskapene til amino-syrene. Aminosyrene er amfotere (= zwitter-ioner), d.v.s kan opptre både som syre eller base, og ha både positiv og/eller negativ ladning i samme molekyl : Når aminosyrer appliseres på en kationbytter-kolonne ved lav ph (surt miljø) vil alle aminosyrer protoneres - foreligge som kationer - og retarderes. Så startes separasjon i ph-gradient med økende ph Når den økende ph nærmer seg aminosyrenes pi (der de blir nøytrale og (helt) u- retarderte) elueres de - "sortert" etter pi (omtrent). Identifiserings-grunnlaget i aminosyreanalysen er retensjonstider, t R - og bare det! Antallet aminosyrer er stort (flere dusin naturlig forekommende, derav ca. 20 vanlige) : ==> høye krav om reproduserbare retensjonstider ==> krav om høy oppløsning/effektivitet, krav om god følsomhet og gjerne selektiv deteksjon for aminosyrene. KJ2053-2017. Kromatografi, Rudolf deteksjons- Schmid. 6
7 ph = pk a + log ([B] / [HB + ]) log ([B] / [HB + ]) = ph - pk a (ii) Ionebytterkromatografi av aminosyrer og deres derivater Aminosyreanalysator Så: separasjon i ph-gradient m. økende ph Identifiserings-grunnlaget i aminosyreanalysen er retensjonstidene t R alene, og antallet aminosyrer er stort (flere dusin naturlig forekommende, derav ca. 20 vanlige) : ==> høye krav om reproduserbare retensjonstider ==> krav om høy oppløsning/effektivitet, krav om god følsomhet og gjerne deteksjons-selektivitet Aminosyre-analysatorer benyttet tidlig (delvis) HPLC-lignende betingelser, og : rel. store kolonner og effektive (rimelig høyt platetall, (rel.) redusert ekstrakolonne- sonespredning)), rel. langsomme elueringshastigheter (tilpasset sakte ion-utbyttingskinetikk) ==> retensjonstider: (historisk) timer, nøye kontroll av temperatur, buffer-hastighet (v.h.a. pumper), bufferionestyrke og -ph, det anvendes trinnvise gradienter (som er/var enklere å reprodusere). Deteksjon v.h.a. selektiv ninhydrin-farge-reaksjon og fotometrisk deteksjon : i en "post column"-reaktor mellom kolonne og detektor. O O OH OH Ninhydrin tilsettes etter kolonna, og "reagerer ferdig" med de separerte AS før detektoren. 7
8 (ii) Ionebytterkromatografi av aminosyrer og deres derivater Aminosyreanalysator: Eksempel Fra: Biochrom Ltd: (www.biochrom.co.uk) Biochrom Amino Acid Analyzer using 5 Lithium Citrate buffers and a 200mm x 4.6mm analytical column run at increased flow rate (35ml/h) and pressure. The full amino acid profile was obtained in 90 minutes (120 minutes cycle time). ;.the pressure generated does not exceed 120 bar (1740 PSI)... ; There are no ambiguities on peak identification, even on unusual amino acids. Sample: Sigma Physiological Fluid Standard A/N and Basics Amount Loaded: 10 nanomoles Injection volume: 20μL Column Type: PEEK column packed with Ultropack 8 Cation Exchange Resin Bed Length (mm): 200 Diameter (mm): 4.6 Flow Rate (ml/h): Buffers 35, Ninhydrin 25 Buffer 1 - Lithium Citrate Buffer A Buffer 2 - Lithium Citrate Buffer B Buffer 3 - Lithium Citrate Buffer CII Buffer 4 - Lithium Citrate Buffer DII Buffer 5 - Lithium citrate Buffer 3.55 Buffer 6 - Lithium hydroxide Solution Reagent Ultra Ninhydrin solution/ultrosolve Plus Program: Title: Lithium Physiological Accelerated Program No. Time Temp Buffer Pump Nin Rec Commands 1 01:00 32 C 1 35.0ml/h ON OFF 2 00:00 32 C 1 35.0ml/h ON OFF Reset 3 01:00 32 C 1 35.0ml/h ON OFF Load 4 02:45 32 C 1 35.0ml/h ON ON 5 26:30 32 C 2 35.0ml/h ON ON 6 13:30 40 C 3 35.0ml/h ON ON 7 01:00 50 C 3 35.0ml/h ON ON 8 19:30 63 C 4 35.0ml/h ON ON 9 25:45 77 C 5 35.0ml/h ON ON 10 04:00 77 C 6 35.0ml/h ON ON 11 04:00 77 C 1 35.0ml/h ON ON 12 02:00 50 C 0 OFF OFF OFF 13 00:00 50 C 1 35.0ml/h OFF OFF 14 04:00 32 C 1 35.0ml/h ON OFF (Reagent Flow Rate: 25.0 ml/h) 8
9 (ii) Ionebytterkromatografi av aminosyrer og deres derivater Proteomics ( deler av ): (kapittel tidligere kalt: "Peptider og proteiner") Peptider og proteiner ligner i prinsippet på aminosyrer : er amfotere - danner zwitter-ioner, karakteriseres (også) ved et isoelektrisk punkt (pi). Aminosyre-analysatorer kan f.eks. brukes til analyse av hele peptider og (i prinsippet) proteiner. Ionebytter-kromatografi er veldig mye brukt for analyse (HPLC) og rensing (HP-, MP, LP-LC) av peptider og proteiner - herunder dagens 'buzz-word' : Proteomics - alene, eller som 2-dimensional HPLC ofte kombinert med RP-LC N.B.: Moderne proteomics utføres i økende grad med massespektrometrisk (ESI-MS/MS-)deteksjon. "Proteomics" (pr. 2016-04-21 fra http://proteomics.cancer.gov/whatisproteomics): " The term "proteomics" is a large-scale comprehensive study of a specific proteome, including information on protein abundances, their variations and modifications, along with their interacting partners and networks, in order to understand cellular processes." "The term "proteome" refers to the entire complement of proteins, including the modifications made to a particular set of proteins, produced by an organism or a cellular system." KJ2053-2017 Kromatografi, Rudolf Schmid 9
10 (ii) Ionebytterkromatografi av aminosyrer og deres derivater Proteomics ( deler av ): (tidligere kalt: "Peptider og proteiner") Peptider og proteiner ligner i prinsippet på aminosyrer : er amfotere - danner zwitter-ioner, karakteriseres (også) ved et isoelektrisk punkt (pi). Aminosyre-analysatorer kan f.eks. brukes til analyse av hele peptider og (i prinsippet) proteiner. Ionebytter-kromatografi er veldig mye brukt for analyse (HPLC) og rensing (HP-, MP, LP-LC) av peptider og proteiner - herunder dagens buzz-word proteomics. Særtrekk ved P&P-analyser: Proteiner krever, som regel, milde betingelser (fordi de ofte er kjemisk og termisk labile) Mange proteiner inngår hydrofobe vekselvirkninger - kan gi retensjon - på hydrofobe overflater - f.eks. (organiske) ionebytter-matriser (kan være irreversibel under visse IEC-betingelser). Krever inerte & inaktive kolonner - men også inerte materialer i systemet for øvrig (f.eks. stål unngås, og PEEK, teflon, titan, glass brukes i stedet - "biocompatible LC-systems") Blant flere parametere er mobilfasens ph helt sentralt ved optimering av separasjonen for en spesifikk prøve. ph må tilpasses proteinenes/peptidenes ulike pi-verdier, og ladningsforhold ved ulike ph-verdier (og P&Penes stabilitet, s.o.). Proteinenes store dimensjoner har også betydning for IEC-resultater : - Hvis porene i matrisen er for små vil (størrelses-) eksklusjons-prosesser bidra til separasjonen. - Flerpunkts-bindinger mellom ionebytter og protein kan forekomme: sterkere binding, tregere kinetikk. - Lavere kapasitet av ionebytteren enn for små ioner - færre faste ioner tilgjengelig (av steriske årsaker) lavere k. 10
11 (iii) Ionekromatografi (3.5.4.1.) Uspesifikk, ionebytter-kromatografisk teknikk for analyse av "vanlige" kationer og anioner (kvalitativ og kvantitativ), med (rel.) høy oppløsning og analysehastighet. (HPLC-lignende) kombinasjon av pumpe + injektor (inert mot uorganiske syrer, lut, salter). Rask, effektiv ionebytter-kolonne ("Separator") overflateporøse el. overflate-funksjonaliserte, ikke-svellende, trykkstabile partikler (spesial-kolonner); lav kapasitet, rask kinetikk. "Suppressor" ionebytterkolonne (eller hulfiber- el. membran-suppressor) Fjerner ledningsevne-bakgrunn som skapes av buffer- og ko-ioner. Ledningsevne-detektor universell detektor for alle ioner - men : bakgrunn-ledningsevne i MF må være lav! Ionekromatografi er spesielt nyttig for anion-analyser, fordi enkle, raske kvalitative og kvantitative multi-anion-analysemetoder er mangelvare* ( mens for kationer finnes f.eks. AAS, el. ICP-MS). * Et alternativ som finnes er «Capillary Ion Analysis»: «Ionekromatografi ved CZE» mye mindre etablert (og mistanke: litt mindre følsom og reproduserbar). 11
12 (iii) Ionekromatografi (3.5.4.1.) Uspesifikk, ionebytter-kromatografisk teknikk for analyse av "vanlige" kationer og anioner (kvalitativ og kvantitativ), med (rel.) høy oppløsning og analysehastighet. Eksempel : Anion-analyse ved ionekromatografi : (for kation-analyse analog med motsatte ladninger) MF: f.eks. NaOH (fort.) pumpe Inj. Prøve: f.eks. KCl & LiBr (i MF) www.metrohm.com (2016-04-21) Separator-kolonne Anion-bytter i OH - - form: (lav kapasitet, høy effektivitet) I prinsipp er også gradient-eluering mulig. elueringsrekkefølge etter separator Suppressor : Kation-bytting : Na +, K + og Li + mot H + 0. KOH & LiOH (u-retardert) 1. NaCl, 2. NaBr I dag som regel : Opprinnelig brukt: ionebyttermembransuppressorer (bytter her Kationbytter-kolonne i H + -form (høy kapasitet) kationer mot H + ) Jo lavere ionestyrke i MF, og jo større kapasitet av suppressoren, desto lengre driftstid mellom vedlikeholdsaktiviteter på suppressoren. elueringsrekkefølge (0. H 2 O= fra OH + H + ) 1. HCl, 2. HBr Ledningsevne-detektor 12
13 (iii) Ionekromatografi (3.5.4.1.) Uspesifikk, ionebytter-kromatografisk teknikk for analyse av "vanlige" kationer og anioner (kvalitativ og kvantitativ), med (rel.) høy oppløsning og analysehastighet. www.metrohm.com (2016-04-21) Membran-suppressoren er blitt videreutviklet til en Self-regenerating suppressor (SRS) : Elektrolyttionene fra regenererings-løsningen til hulfiber-membransuppressoren erstattes med H + - eller OH - -ioner som genereres ved elektrolyse av vann. Vannkilde: er i dag ofte eluenten selv, nedstrøms for detektoren. Figur : Sjematisk fremstilling av prinsippet ved en SRS, Self-regenerating Suppressor. Figur adaptert fra : A.Henshall, S. Rabin, J. Statler, J. Stillian, Internat. Chromatography Laboratory 12, s. 7-14 (jan./feb. 1993 ) 13
14 (iii) Ionekromatografi (3.5.4.1.) Uspesifikk, ionebytter-kromatografisk teknikk for analyse av "vanlige" kationer og anioner (kvalitativ og kvantitativ), med (rel.) høy oppløsning og analysehastighet. I prinsipp er også gradient-eluering mulig. og i dag i bruk (også rutinemessig) f.eks. www.metrohm.com (2016-04-21) Også separasjon / analyse av anioner og kationer i én og samme analyse mulig (Kombinasjon av (vanlig) ionebytterkromatografi) og såkalt ion-eksklusjonskromatografi. 14
15 (iii) Ionekromatografi (3.5.4.1.) Uspesifikk, ionebytter-kromatografisk teknikk for analyse av "vanlige" kationer og anioner (kvalitativ og kvantitativ), med (rel.) høy oppløsning og analysehastighet. "Non-suppressed" ionekromatografi : (Jfr. Også CE-kapittelet) Unngår suppressor-trinnet i IC (men gir som regel lavere følsomhet) F.eks. (beskrevet for anioner) : Bruk av lite mobil elektrolytt: bruker en elektrolytt som MF som selv har meget lav ledningsevne (f.eks. Na-ftalat, Na-bensoat, el.l.), måler ledningsevne moderat høy bakgrunnsignal fra MF'en tillater å detektere utslag fra prøve-(an-)ioner som har mye større ledningsevne (typisk små uorganiske anioner). Bruk av indirekte deteksjon: bruker elektrolytt-løsninger som absorberer UV-lys (f.eks. natrium-ftalat, natrium-bensoat, el.l.), måler UV-lysgjennomgang (absorbansen) i UV-detektoren detekteres lavere elektrolytt-konsentrasjoner - når (ikke-absorberende) prøve-ioner elueres - som et negativt utslag i UV-absorbansen (større lys-gjennomgang). 15
16 (iii) Ionekromatografi (3.5.4.1.) Uspesifikk, ionebytter-kromatografisk teknikk for analyse av "vanlige" kationer og anioner (kvalitativ og kvantitativ), med (rel.) høy oppløsning og analysehastighet. "Non-suppressed" ionekromatografi : (Jfr. Også CE-kapittelet) Vedr. : Indirekte deteksjon: Total-elektrolytt-konsentrasjonen vil utjevnes over kolonnen. (ikke-absorberende) analytt-ioner fortrenger en tilsvarende mengde (lys-absorberende) buffer-ioner i området (sonen) til analytten. Maksimalkonsentrasjon som kan detekteres er omtrent buffer-ionets (molare) konsentrasjon (når analyttioner har fortrengt alle absorberende elektrolytt-ioner). Samtidig må de absorberende bufferionene ikke absorbere sterkere enn at detektoren fortsatt kan måle svake endringer i dens (høyeste) konsentrasjon (må ikke helt mørklegge detektoren). Indirekte deteksjon brukes primært i ionebytting og kapillærelektroforese, der ioner analyseres i elektrolyttløsninger. 16
17 (vii) Ion-par-kromatografi (3.5.2.7.) (HPLC-teknikk med omvendt-fase kolonne) Ioner retarderes (separeres) ikke / lite under omvendt-fase-betingelser (i RP-HPLC). Men: Retardering for ioniske species øker sterkt, når MF inneholder hydrofobe ioner av motsatt ladning til analytten, som kan danne (delvis) hydrofobe ion-par : f.eks. (med anion som analytt-ion) : X - + Q + == [X - Q + ] hydrofob hydrofob Avhengig av Q-ionet, om - det dannes ionpar, som så kan absorberes i den upolare SF, eller - Q er ("på forhånd) absorbert i / adsorbert på SF (og "omdanner" den til en ionebytter med reversibelt "bundne" faste ioner.) 17
18 (vii) Ion-par-kromatografi (3.5.2.7.) Q-ionet : for eksempel: n-bu 4 N + (stort sfærisk ion med helt hydrofob overflate): ==> mistenkes å gi ion-par som da drar med seg analytt-ionet inn til / inn i (?) RP-SF en. for eksempel: n-alkyl-n + (CH 3 ) 3 el. n-alkyl-so 3 - (lang upolar kjede med rel. liten ionisk (polar) gruppe i enden; såpe-lignende stoffer : ==> eng. også: "Soap Chromatography"): ==> "omskaper" omvendt-fase SFen til en "dynamisk belagt" ionebytter med - den alifatiske kjeden "bundet" i den upolare SF, og - den ioniske gruppen på overflaten mot / i den polare SF. 18
19 (vii) Ion-par-kromatografi (3.5.2.7.) Retensjon er avhengig av : Q-konsentrasjonen (og struktur) elueringsstyrke av MF for øvrig (%-andel organisk lsm, evt. gradient-profil), evt. ph (ved syrer eller baser som analytter). llustrasjon: Endring av retensjonen (log k) på en oktadekylsilika-kolonne eluert med sur fosfatbuffer (ph = 2,1) som funksjon av ion-par-reagenskonsentrasjon (oktansulfonat) for et kation (adrenalin) og et anion (naftalensulfonat) og for ulike metanol-konsentrasjoner: analytt-kation : protonert Adrenalin (= Epinefrin) analytt-anion : deprotonert naftalensulfonsyre Normal Ion-parkromatografi (Ikke helt normal Ionpar-kromatografi: Analytt har samme ladning som ion-parion! ) 19
20 (vii) Ion-par-kromatografi (3.5.2.7.) Retensjon er avhengig av : Q-konsentrasjonen (og struktur) elueringsstyrke av MF for øvrig (%-andel organisk lsm, evt gradient-profil), evt. ph (ved syrer el. baser som analytter). Mange variabler aktuelle ved optimering - på godt og på vondt. Vanlig "standard" omvendt-fase væskekromatografi- (HPLC-) utstyr brukes. N.B.: RP-kolonner anbefales dedikert til ionpar-kromatografi (nesten umulig å bli helt kvitt ionpar-reagens etterpå). Kondisjonering kan ta en del tid (særlig ved lave konsentrasjon av IP-reagens i MF): minst 20 kolonnevolum Metanol-vann blandinger er foretrukket da de gir best løselighet for saltene. Minimum C8-kjedelengde gir silika en best stabilitet under ionpar-lc-betingelser. 20
21 (vii) Ion-par-kromatografi (3.5.2.7.) Eksempel : Biogene aminer og polyaminer : 10 mm oktansulfonat i vann-acetonitril-gradient (ph 5-4,7 (ca.)),1,2 ml/min: C18-silika-kolonne (4 um, 15 x 0,39 cm); deteksjon ved postkolonne-derivatisering (OPA-derivat). Amin-standardblanding Spinat-ekstrakt Fra : Cecchi &al., 'Ion Pairing Chromatography', Critical Reviews in Analytical Chemistry, 38: 3(2008), 161-213. Orig. ref. er : T. Lavizzari & al, J. Chromatogr. A 1129 (2006), s. 67 72. TY = tyramin, PU = putresecin, HI = histamin, SD = spermidin, SM = spermin. OC=octopamin, DO=dopamin, SE=serotonin, CA=cadaverin, AG=agmatin, PHE=β-fenyletylamin, TR=tryptamin. "OPA-derivat" - OPA = ortho-phtalic aldehyde: Jfr. Kromatografi (1994) side 223 & fig 11.33 21