1 KJ2053 Kromatografi (Analytiske metoder II) Lundanes Else, Reubsaet Léon, Greibrokk Tyge, Chromatography, Basic Principles, Sample Preparations and..., Wiley-VCH, 2014. ISBN:978-3-527-33620-3 6. Elektroforese og kapillær-elektroforese 6.A Generelt om elektroforese 6.B Klassisk elektroforese 6.C Kapillærelektroforese 1
2 Elektroforese: "forflytting av (ladede) partikler i et fluid under innflytelsen av et elektrisk felt". I praksis - forflytting av ioner ("atomare/molekylære" partikler, også høymolekylære) i elektrisk ledende væsker (elektrolytter, vanligvis vandige saltoppløsninger, "buffere"). Typisk brukt til analyse ((sub-)µg) (men også (mikro-) preparative muligheter)." Bruker relativt milde betingelser, nært fysiologiske forhold - "fysiologenes metode" (sentralt i biovitenskapen/ Life Sciences): snilt mot følsomme biologisk aktive stoffer (nær RT, vandige elektrolytt-løsninger). Elektroforese er ikke kromatografi (normalt) (det finnes ikke 2 faser hvorav den ene er stasjonær og den andre mobil ) 2
3 Elektroforese: "forflytting av (ladede) partikler i et fluid under innflytelsen av et elektrisk felt". Et elektroforese-system består av 2 hoveddeler (evt. 3): en væskefase (som utgjør et elektrolyse-system: inkl. elektroder, buffer og prøve) der separasjonsprosessen foregår, en fast fase som er i kontakt med væskefasen (kolonne-vegg, bære-plate, evt. stabiliserende porøst medium, f.eks. gel), evt. en gassfase i kontakt og (mer eller mindre) i likevekt med væskefasen. Som et lite apropos : Analyser som bruker en lignende prosess i gassfase kalles 'Ion Mobility Spectroscopy' og er en av teknikkene innen massespektrometri (MS). 3
4 Elektroforese: "forflytting av (ladede) partikler i et fluid under innflytelsen av et elektrisk felt". Under selve elektroforesen foregår også elektrolyse-prosesser ved elektrodene: (Omforming av "strøm ved elektroner" (i ledningene) til "strøm ved ioner" (i elektrolytt-løsningene) Anode-reaksjon: 6 H 2 0 O 2 + 4 H 3 O + + 4 e - Katode-reaksjon: 4 H 2 0 + 4 e - 2 H 2 + 4 OH - for å generere strømmen. Elektrolyseprosessene er ikke av interesse for selve elektroforesen men de kan få betydning, ved at (1) de kan - over tid - forandre buffer-sammensetningen (særlig ph) og (2) de er en forutsetning for å kunne gjennomføre ph-gradienten i teknikken iso-elektrisk fokusering. 4
5 Historikk - noen milepæler : Metoden ble oppfunnet og "døpt" av Michaelis, 1909, som brukte den for å bestemme det isoelektriske punkt av proteiner. (Leonor Michaelis & Peter Rona. Beiträge zur allgemeinen Eiweisschemie. II. Ueber die Fällung der Globuline im isoelektrischen Punkt. Biochem. Zeitschr., vol.28: s.193 (1910), Berlin. ) på 30-tallet: videreutvikling ved Arne Tiselius i Uppsala ('Moving-boundary'-metode, Nobelpris 1948), og P. König (papir-elektroforese); på 40-tallet innførte A.J.P. Martin 'gel slab' (tynnsjikt-) elektroforese); på 50-tallet: cellulose-acetat-film og immunoelektroforese; på 60 -tallet: innføring av polyakrylamid-gelelektroforese, første forsøk med kapillær-sone-elektroforese (bl.a. Hjertén i Sverige) og publiseringen av isotakoforese metoden (Martin & al., 1970); på 80 -tallet: kapillær-sone-elektroforese 'tar av'... Tiselius' experiments, (schematic), from Westheimer R., 2001 5
6 I dag skilles grovt 2 hoved-områder, etter "formatet" av systemet: konvensjonell EF kapillærelektroforese Kapittel-framdrift: først i 6.A. - kort sammenfattet - underliggende teori (felles) deretter 6.B. - kort nevne litt om konvensjonell "format", til slutt 6.C. - se litt på kapillærformatet (med tilhørende lab.-forsøk). 6
7 6.A. 1. Noe (enkel) teori : 1. I et elektrisk felt tiltrekkes ladede partikler (f.eks. ioner) av polen (elektroden) med motsatt ladning. Og de frastøtes av polen med lik ladning. Elektrode (katode) mobile ioner elektrode (anode) + Ө (uten elektro-osmose) 2. Kraften F E på ionene er proporsjonal med partikkelens ladning q, og feltstyrken E F E = q E = q (V / L) (Feltstyrken E er - proporsjonalt med spenningsforskjellen mellom elektrodene, V og (i enkle tilfeller) - omvendt proporsjonalt med avstanden L mellom mot-polene - elektrodene). 7
8 6.A. 1. Noe (enkel) teori : 3. Ioner - akselereres i det elektriske feltet / av spenningen - men bremses av friksjonen i mediet (bufferen) med bremskraften F f. u F f = 6 p r Bremskraften (Friction Force) F f er altså proporsjonal med - mediets viskositet,, - ion-diameteren, r...... - vandringshastigheten, u (for et enkelt sfærisk ion i uendelig fortynnet løsning, etter Stokes' lov). Apropos r - Ion-radius: Det er radiusen til det hydratiserte /solvatiserte ionet som avgjør - noe som gir tilnærmet motsatt rekkefølge av migrasjonshastighet enn forventet etter nakent -ion-radius (bestemt i krystaller e.l.). 8
9 6.A. 1. Noe (enkel) teori : 4. Ved balansen i kreftene, F E og F f, oppnås en likevektshastighet u : u = (q E) / (6 p r) I praksis akselereres ioner da opp til en konstant hastighet u, der F E = F f. 5. For reelle ioner i reelle elektrolytt-løsninger forandres kraften noe p.g.a. ioners vekselvirkning med ioner av motsatt ladning (som skjermer ionets fulle ladning noe i det eksterne elektriske feltet: ). u = (q E) (1-κr/ (6 p r) 6. Hvor raskt et ion vil bevege seg under innflytelse av det elektriske felt i et elektroforesesystem uttrykkes gjerne som hastighet pr. feltstyrke-enhet. Det kalles den elektroforetiske mobilitet, m e eller m ef : m ef = q / (6 p r) m ef = u ef / E 9
10 6.A. 1. Noe (enkel) teori : Hastighet pr. feltstyrke-enhet -- den elektroforetiske mobilitet, m e eller m ef : m ef = q / (6 p r) = u ef / E Ioner med ulik størrelse og form (som samlet kommer til uttrykk som "effektiv radius"), og med evt. ulik ladning, har dermed forskjellig mobilitet m ef. De oppnår ulik hastighet u ef i et elektriske felt under elektroforese: dermed er elektroforetisk separasjon mulig. 10
11 6.A. 1. Noe (enkel) teori : De oppnår ulik hastighet u ef i et elektriske felt under elektroforese : dermed er elektroforetisk separasjon mulig. Ideelt (hypotetisk) elektroferogram: Separasjon etter ladning og etter størrelse 11
12 6.A. 1. Noe (enkel) teori : Merk: Mobilitet (og hastighet) er "vektorer": er størrelser med retning. De kan ha positive eller negative verdier: (målt i forhold til det elektriske felt (=vektor) som går fra + til -) Elektrisk felt vektor Kationer har positive mobilitets-verdier (flytter med felt-vektor), Anioner har negativ mobilitet 12
13 6.A. 1. Noe (enkel) teori : 6.A.1. a Viktig bi-effekt i elektroforese -- Varmeutvikling. Under elektroforese-prosessen frisettes betydelig varme fra den elektriske strømmen, i, som passerer en elektrisk motstand R (som her er elektroforese-bufferen). Den kalles, Joule heating, W. I et systemet med spenning V blir varmeutviklingen: J = i 2 R t = V i t J = varmemengde [J], utviklet i tiden t i = strømstyrke R = el. Motstand t = tid N.B.: R øker med økende lengde, L, og minker med økende tverrsnittareal A av den "elektriske lederen" (her elektrolyttløsningen). Ledningsevnen (konduktiviteten) til bufferen bidrar også til R (R er omvendt proporsjonalt til ledningsevnen.) Elektrolyttløsninger med lav ledningsevne gir lavere varmeutvikling enn løsninger med høy ledningsevne. ΔT = 0,239 Q r 2 / 4 k Q = V i / A L = E i / A ΔT = temperatur-diff. (rørsenter til rør-vegg (for kapillær)) r = rør-radius k varmelednigsevne (elektrolytt) Q = effekt-tetthet = power density [W/mL J/sˑmL] A = tverrsnittareal L = Avstand mellom elektrodene 13
14 6.A. 1. Noe (enkel) teori : 6.A.1. a Viktig bi-effekt i elektroforese -- Varmeutvikling. Den kalles, Joule heating, W. I et systemet med spenning V blir varmeutviklingen : J = i 2 R t = V i t Q = V i / A L = E i / A ΔT = 0,239 Q r 2 / 4 k Strømmen, i, øker proporsjonalt med feltstyrken E, mens varmeutviklingen W øker med i 2. Økning av (lineær) vandringshastighet av ionene ved økende feltstyrke E (= ønsket effekt) produserer en sterkere (= kvadratisk) økende varmeutvikling : Varmeutviklingen oppleves som ulempe i elektroforese 14
15 6.A. 1. Noe (enkel) teori : 6.A.1. a Viktig bi-effekt i eletroforese -- Varemutvikling. Den kalles, Joule heating, W. Varmen lager følgende problemer for elektroforese: Varmen lager temperaturgradienter som gir varierende elektroforetiske mobilitet ulike steder i systemet (varmt i midten, kaldere nær kantene der varme-avledningen skjer, : 2-3% endring i mobilitet pr. C!!) økt sonespredning. og/ eller varierende migrasjon ("smilies") N.B: Migrasjonshastigheten ØKER med økende temperatur (det er en trykkfeil i læreboken (Lundanes, 2014, s. 128) i siste liste-punkt: migration velocity u kontroll m. varmen - ikke kontroll ( smilie ) (D.M. Hawcroft, El.Phor., 1997) decreases increases with increasing temperature, since the viscosity η decreases. Og ulempene bare fortsetter (!!) på neste side 15
16 6.A. 1. Noe (enkel) teori : 6.A.1. a Viktig bi-effekt i eletroforese -- Varemutvikling. Den kalles, Joule heating, W. Varmen lager følgende problemer for elektroforese-separasjoner: Og ulempene bare fortsetter (!!) her Varmeforskjellene kan gi konveksjons-strømmer i bufferen - masseforflytting av væske ( bulk movement of liquid ; varm buffer stiger opp, kald buffer synker), som forstyrrer, forflytter og/eller sprer de elektroforetiske sonene/båndene. I åpne systemer: væsketap fra bufferen (økt fordampning), som kan endre de elektroforetiske forholdene (elektrolytt-konsentrasjon) eller i ekstremtilfeller: fjerne elektrolytten (fordampe vannet) ved papir-elektroforese. eller smelte gelen ved agarose-gel-elektroforese) Varmefølsomme stoffer kan bli ødelagt. I lukkede systemer (kapillærer): oppvarming kan fri-sette gass/damp-bobler som bryter opp det homogene systemet, evt. endrer ledningsevne lokalt (eller evt. totalt - i kapillærer - bryter elektrisk kontakt helt). 16
17 6.A. 1. Noe (enkel) teori : 6.A.1. a Viktig bi-effekt i eletroforese -- Varemutvikling. Den kalles, Joule heating, W. Varme-utvikling kan begrenses - ved å begrense feltstyrken (el. spenning) men det medfører : - lengre analyser, - mer sonespredning p.g.a. mer longitudinal diffusjon. - eller ved bruk av spesielt egnede buffere (med lav ledningsevne), der det er valgmuligheter. Temperaturgradienter kan også forsøkes redusert ved å sørge for tynne tverrsnitt (kapillærer, tynne (gel-, papir-) sjikt) og god kjølekontakt med omgivelsen - effektiv varme-fjerning. Sonespredning ved konveksjon forsøkes begrenset ved å stabilisere bufferen mot konveksjons-strømninger f.eks. ved å utføre elektroforesen i geler, papir, o.l. eller begrense konveksjons-massetransport-strekningen (i forhold til vandringslengde/bånd-separasjon) f.eks. i kapillærer (se 6.B). 17
18 6.A. 2. Elektroosmose (elektroendosmose) Det kan/vil skje væske- (elektrolytt-) forflytting, "bulk"-transport, i et elektrisk felt, ved elektro-osmose (= elektro-endosmose): Forutsetning: at overflaten av "bærematerialet" for elektroforese-bufferen er ikke-ledende, og samtidig er bærer av (overflate-)ioner som gir den en netto-ladning f.eks. glass- eller silika-kapillærer: anioner (fra deprotonerte silanol-grupper ved ph > ca. 2-3) Da bygges opp et motion-lag i bufferen langs kontaktflaten (ved glass/silica: motioner = kationer). 18
19 6.A. 2. Elektroosmose (elektroendosmose) Massetransport, væske- (elektrolytt-) forflytting i et elektrisk felt vil kunne skje ved elektroosmose : Forutsetning: at overflaten av "bæreren" for elektroforese-bufferen er ikke-ledende, og samtidig er bærer av (overflate-)ioner som gir den en netto-ladning f.eks. glass- eller silika-kapillærer : anioner (fra deprotonerte silanol-grupper ved ph > ca. 2-3) Da bygges opp et motion-lag i bufferen langs kontaktflaten (ved glass/silica : kationer). Disse ytterste motionene forholder seg til de bundne, stasjonære overflate-ionene fordi de ikke har mobile "motpart-ioner" blir +/- immobile. kovalent bundne kolonnevegg-anioner (ytterst) ikke-mobile elektrolytt-kationer mindre sterkt bundne, mer mobile elektrolytt-kationer (kation-overskudd) øvrige mobile elektrolytt-ioner \ Zeta- / potensial- området (forenklet tegning) 19
20 6.A. 2. Elektroosmose (elektroendosmose) Massetransport, væske- (elektrolytt-) forflytting i et elektrisk felt vil kunne skje ved elektro-osmose : kovalent bundne kolonnevegg-anioner (ytterst) ikke-mobile elektrolytt-kationer mindre sterkt bundne, mer mobile elektrolytt-kationer (kation-overskudd) øvrige mobile elektrolytt-ioner \ Zeta- / potensial- området (forenklet tegning) Motioner fra motion-overskuddet nær veggen (de som ikke er aller-nærmest de faste anionene) utsettes (også) for elektrodenes elektriske felt og forflytter seg "elektroforetisk (i motsetning til kovalent bundne ("vegg"-)ioner og deres nærmeste sterkt assosierte (elektrolytt-)mot-ioner). Det er et overskudd av én "fritt-mobil" ladningstype (her: kationer) - Det gir et netto-overskudd av ion-forflytting/ dragning i én retning - den retningen som det bevegelige motion-ladningsoverskuddet dras mott (her mot katoden). All væske som innenfor motion-laget vil følge med: masse-forflytting / bulk movement = elektroosmose. Eksempel her passer for glass- / silika-"matriks" (eller karbohydrat-akrylamid-matriks). 20
21 6.A. 2. Elektroosmose (elektroendosmose) Massetransport, væske- (elektrolytt-) forflytting i et elektrisk felt vil kunne skje ved elektro-osmose : Elektroosmotisk væskestrøm (electroosmotic flow, EOF) har ikke en parabolsk, men en "flat" strømningsprofil (i motsetning til vanlig mekanisk ("hydrodynamisk") væsketransport): Årsak: i EOF bremses ikke væsken av den stillestående veggen eller matriksen Det er ion-overskuddet i væsken langs veggen, som drar med seg væsken innenfor. Ved hydrodynamisk strømning: store forskjell i væske-hastighet over rørtverrsnittet (og dermed massetransporten innen for MF). Ved elektroosmotisk strømning: væsken har nesten lik hastighet i hele rør-tverrsnittet. Dermed fjernes her sonespredning p.g.a. massetransfer (nesten) helt. 21
22 6.A. 2. Elektroosmose (elektroendosmose) Apropos : Elektroosmose brukes som MF-framdriftsmetode i elektrokromatografi (nevnt i kap. 0): Elektrokromatografi kan oppnå HPLC-trykk og væskestrøm med flat strømningsprofil - uten mekaniske pumper, forutsetter ioniske grupper tilknyttet stasjonærfasen, og elektrolytter som MF og elektrisk felt langs kolonna (sjikt) som "pumpe".. Elektrokromatografi-teknikk - er under utvikling (ikke blitt skikkelig etablert ennå (problemer med god nok reproduserbarhet av elektroosmosen, bl.a.)) 22
23 6.A. 2. Elektroosmose (elektroendosmose) Størrelsen av elektroosmotisk strøm, 'EOF', kan beskrives ved f.eks. dens mobilitet μ EOF μ eo = / eller dens hastighet u eo = μ eo E = μ eo V / L her er : = "Zeta potensial": beskriver potensialforløpet i fast-ion/motion-laget ved veggen (eller matrisen). Det er i hovedsak bestemt av overflate-ladningen til veggen/matrisen (ladningstype og tetthet) som er i kontakt med elektrolytten [1] og elektrolyttegenskapene, inkl. dens sammensetning. = dielektrisitets-konstanten, = viskositeten og E = den elektriske feltstyrken. Zetapotensialet er = 4 π δ e / ε ε= bufferens dielektrisitetskonstant e = total ladningsoverskudd i løsningen pr. overflatearealenhet, δ = Debye-ionradius, el. tykkelse av (Helmholtz-)dobbellaget. = 1/(3 10-7 Z c ½ ), der Z = antall valens-elektroner og c = bufferkonsentrasjon. : Også definert som the electric potential at the plane of shear N.B.: "Zeta potensialet er omvendt proporsjonalt til [c buf ] 1/2, 23
24 6.A. 2. Elektroosmose (elektroendosmose) N.B.: Elektroosmotiske vandringshastigheter u eo kan være - sterkere eller - svakere enn u ef, de elektroforetiske vandringshastighetene (eller mobiliteter). EOF kan altså under visse betingelser overkompensere selve forflyttingen ved elektroforese og flytte ioner mot den elektroden de egentlig frastøtes av. Hele elektroferogrammet (analog til kromatogram ) kan da elueres på f.eks. katode-siden, og detekteres i én detektor på sin vei mot katoden. (vikte/nyttig for anvendbarheten i vanlig kapillærelektroforese-utstyr.) 24
25 6.A. 2. Elektroosmose (elektroendosmose) Primære) opphav til overflateladningen aktiv ved EOF : deprotonert silanol (ved ph > ca. 3) karboksylat-grupper (fra (deprotonert) acrylsyre - forurensing) i polyacrylamid-geler. karboksylat-grupper i agarose- og dekstrangeler og cellulose (papir, acetylcellulose). evt. overflatemodifikatorer (s.n., 6.c). 25
26 6.A. 2. Elektroosmose (elektroendosmose) Den observerte migrasjons-hastigheten av analytter er summen av: elektroforetisk og elektroosmotisk migrasjons-hastighet (og det samme med mobiliteten): u obs = u ef + u eo, og m obs = m ef + m eo der hastighetene u obs = L det / t m (L det = avstand kol.-inngang - deteksjonspunkt) (t m = målt migrasjonstid for aktuell topp/ion ) og u eo = L det / t m,eo (L det = avstand kol.-inngang - deteksjonspunkt) (t m,eo = målt migrasjonstid for EOF, detektert v.h.a. et uladet stoff som følger passivt med EOF) er de eksperimentelt observerbare størrelsene. 26
27 6.A. 2. Elektroosmose (elektroendosmose) Mobilitetene, μ, bergenes fra hastighetene og feltstyrken : m = u / E = u / [ V / L t ] (V = Spenning mellom elektrodene) = [L det / t m ] / [V / L t ] (L t = total kolonelengde avstand mellom elektrodene) og dermed u ef = u obs - u eo, og analogt m ef = m obs - m eo (fordi m obs = m ef + m eo ) (Jfr. utregningene for lab.-oppgaven.) 27
28 6.A. 3. Separasjonsevne i elektroforese (i) Effektivitet måles som platetall, eller som varians, standardavvik eller platehøyde: - Empirisk ut fra elektroferogrammet (analog med kromatografi): N = 16 (t m / w b ) 2 = 5,545 (t m / w h ) 2 - Teoretisk ut ifra de underliggende prosessene: Der hovedfaktorene for sonespredning er : diffusjon, konveksjon, utenomkolonne-effekter, ingen Eddy-diffusjon, lite/ingen massetransfer. 28
29 6.A. 3. Separasjonsevne i elektroforese Effektivitet måles som platetall, eller som varians, standardavvik eller platehøyde: - Teoretisk ut ifra de underliggende prosessene: Hvis det er diffusjonen som begrenser effektiviteten, da er maksimal platetall : N = (u ef + u eo ) L E / 2D = V (µ e + µ eo ) / 2D u ef : migrasjonshastighet fra ren elektroforese u eo : migrasjonshastighet fra elektroosmose L : vandringslengde til sonen V : Potensialet mellom elektrodene D :Diffusjonskonstant av analytt-ionet i elektrolytten Uttrykket tilsvarer van Deemter-ligningen(e) innen kromatografi og beskriver sammenhengen mellom de(n) (viktigste) prosessen i kapillæren/gelen - diffusjonen - og effektivitet. NB: N øker proporsjonalt med V, N er omvendt proporsjonal med D. 29
30 6.A. 3. Separasjonsevne i elektroforese (ii) Oppløsningen mellom to soner måles som R s : kan f.eks. beregnes ved : Fra praksis elektroferogrammet - etter samme likning som for kromatogram. Fra grunnleggende parametere: Hvis det er diffusjonen som begrenser effektiviteten er maksimal platetall : R S = N ½ Δu /4 (u ef + u eo ) = 0,177 Δu [V / (u ef + u eo ) D m ] ½ Δu : forskjell i migrasjonshastighet for de to aktuelle komponenten u : deres gjennomsnittlige migrasjonshastighet. Legg merke til at oppløsningen øker med kvadratroten av spenningen. Effekter fra konveksjons-strømninger (fra Joule-heating) er ikke tatt med i disse ligningene (der disse finnes, øker de med økende potensiale (s.o.) - motvirker trenden for økt oppløsning med økt spenning.) 30