FRANCISELLOSE I TORSKEOPPDRETT

Frisk Torsk FRANCISELLOSE I TORSKEOPPDRETT STATUS RAPPORT En sammenfatning av status på aktiviteter knyttet til Francisella i norsk torskeoppdrettsnæring. Mai 2009 Foto: Pharmaq

Innhold 1. Innledning... 3 2. Immunresponser og effekten av vaksine... 4 2.1. Vannbåren smitte med Francisella sp. og påfølgende antistoffrespons i torsk (Gadus morhua L.)... 4 2.2. Francisella i torskens immunceller... 4 2.3. Norge-India prosjekt... 6 3. Vaksineutvikling hvor langt er man kommet?... 6 3.1. Status vaksineutvikling mot francisellose; en oppdatering av aktiviteten hos Intervet Norbio... 7 3.2. Utvikling av Francisella-smittemodell for genetisk resistens og vaksinetesting på Atlantisk torsk (Gadus morhua).... 8 4. Metode for å ta ut smittebærende fisk i villfisk populasjonen Stamfisk kontroll - Nyrebiopsi 12 6. Spredning av smittestoff mellom anlegg... 14 7. Patogenese... 16 8. Utbreiing av Francisella smitte hos villtorsk i Noreg... 18 9. Utbredelse av francisellose i oppdrettsfisk.... 22 10. Francisella-bakterien Francisella philomiragia subsp. noatunensis, spredning i norsk torskeoppdrett... 23 11. Karakterisering av Francisella ssp. i norsk og internasjonalt havbruk... 26 12. Behandlingsregimer.... 31 13. Mulige farer forbindet med spising av Francisella fiskepatogener?... 33 14. Oppdretternes erfaringer... 35 14. Næringens syn på forvaltningsmessige tiltak mhp Francisellose og utfordringer... 43 14.1. Beskrivelse av problemstillingen og status på området... 43 14.2. Erfaringsdata fra næring og forskning... 45 14.3. Næringens utfordringer og problemer... 45 14.4. Forslag til tiltak og arbeidsoppgaver knyttet til forvaltningsmessige tiltak... 46 14.5. Retningslinjer for gode driftsrutiner... 47 14.6. Oppsummering/ konklusjon... 48 15. Oppsummering:... 48 2

1. Innledning Francisellose er pr i dag den viktigste sykdommen i torskeoppdrett og kanskje den største trussel for næringen. Siden den første gang ble oppdaget i oppdrettsanlegg i Rogaland i 2006 har den økt i omfang og utbredelse til flere anlegg i Midt Norge og til Nordland. For oppdretterne har det hatt store økonomiske konsekvenser, og i Rogaland er torskeoppdrett nesten avviklet på grunn av francisellose. For næringen som helhet er det en stor trussel som det er viktig å søke å finne løsninger på. Bakgrunnen for denne rapporten er FKD s finansiering av Frisk Torsk prosjektet som fokuserer på de helsemessige utfordringene knyttet til kommersialisering av torsk i oppdrett og fangsbasert havbruk. Hovedfokuset for prosjektet i 2008 / 2009 vil være knyttet til bakteriesykdommen francisellose. Denne rapporten er ment å gi en oversikt over dagen kunnskapsstatus om Francisella bakteriens og dens innvirkning på torskeoppdrett. Fagmiljøene som arbeider med sykdomsproblemer hos torsk er blitt bedt til å gi en status om pågående arbeider knyttet til Francisella hos torsk. I tillegg er en del oppdrettere intervjuet om deres erfaringer fra sykdomsutbrudd i anlegget. FHL har i kapittel 14 gitt en beskrivelse av næringens mange utfordringer når det gjeller francisellose. Dette er gjort med utgangspunkt i næringens eget ståsted og ikke fra en vitenskapelig synsvinkel. Rapporten er ikke en helhetlig rapport om sykdommen, men skal gi en oversikt over dagens status, samtidig som den skal gi nok bakgrunnsinformasjon til å synliggjøre fremtidige FoU behov. Hvert innlegg er presentert i sin helhet og ikke redigert i en felles mal. Innleggene komplimenterer hverandre til å danne et helhetlig bilde om Francisellose. Det er noe overlapp når det gjelder den generelle informasjonen om Francisella, men dette står for forfatternes egen regning. Bergen, 7 mai 2009 Frisk Torsk v/ Grethe Adoff, Brit Hjeltnes og Trude Nordli 3

2. Immunresponser og effekten av vaksine Både ved Universitet i Bergen og Universitetet i Tromsø er det i gang prosjekter som arbeider med å vurdere immunresponser og effekten av vaksine hos torsk. Begge prosjektene er presentert i rapporten. Terje Ellingsen fra Universitetet i Tromsø arbeider med en dr.scient grad og ved UiB har Eirin F. Pettersen et forskerprosjekt. I tillegg har Forskningsrådets Norge India program et prosjekt som også innbefatter utvikling av immunologisk verktøy blant annet mot Francisella bakterien. Arbeidet, som starter i løpet av våren, er et samarbeid mellom Fiskerihøgskolen i Tromsø og indiske forsknings miljøer og ledet av Roy Dalmo. 2.1. Vannbåren smitte med Francisella sp. og påfølgende antistoffrespons i torsk (Gadus morhua L.) Terje Ellingsen, Norges Fiskerihøgskole Våren 2008 gjennomførte vår gruppe i samarbeid med Veterinærinstituttet, et forsøk med ip smitte av torsk med Francisella sp. for å undersøke antistoffresponser, regulering av immungener og overføring av smitte via vann. Forsøket ble utført på torsk på 160 g og hadde en varighet på 90 dager. Bakterien ble mottatt fra Veterinærinstituttet. Antistoffrespons ble sammenlignet mellom usmittet fisk, smittet fisk og fisk immunisert med inaktiverte bakterier. Overføring av smitte via vann ble utført ved å la usmittet fisk gå i et kar med avløpsvann fra den smittede fisken. Smitte ved bruk av dette karoppsettet er nylig publisert av Mikkelsen og medarbeidere (200x). Torsk viste en tydelig spesifikk antistoffrespons mot Francisella sp., demonstrert både ved ELISA og western blotting. Hvilken betydning antistoffresponsen har for overlevelse ble ikke undersøkt. Det ble også påvist at Francisella sp. smitter via vann. Granulomdannelse og bakterier ble påvist i den friske fisken som mottok vann fra smittet fisk. 2.2. Francisella i torskens immunceller Eirin Fausa Pettersen, Institutt for biologi, Universitetet i Bergen, Prosjektet er finansiert av Norges forskningsråd (2007 2009) Bakterien Francisella sp. som forårsaker sykdom hos torsk er en fakultativ intracellulær bakterie. Dette betyr at den kan overleve og formere seg inne i vertens celler. Flere typer immunceller har til oppgave å fjerne og drepe bakterier og slike celler omtales som fagocyttiske celler. Disse cellene presenterer også de nedbrutte restene av bakterien til andre typer immunceller slik at disse blir aktivert og gir en immunrespons. Fagocyttiske celler som makrofager og nøytrofile granulocytter er derfor sentrale i det uspesifikke forsvaret og viktige bindeledd til det spesifikke forsvaret. Hos torsk er det spesifikke immunsystemet med B-celler som produserer antistoffer mindre aktivt enn det vi kjenner fra for eksempel laks, som gir god spesifikk respons på vaksinasjon. Flere forhold tyder på at for torsk er det uspesifikke 4

immunforsvaret svært viktig. Hos torsken har vi for eksempel funnet at den har mange nøytrofile granulocytter i blod. Disse cellene kommer raskt til et infeksjonssted og er sentrale i betennelsesreaksjonen. Andre sentrale celler er monocytter i blod. Disse differensieres til makrofager når de kommer inn i vev. Det er kjent fra infeksjoner i andre arter, både med Francisella sp. og andre intracellulære bakterier, at de har mekanismer for å omgå fagocyttenes drap og immunfunksjoner. Dette betyr at bakterien ikke fjernes og drepes inne i disse cellene, men at den derimot kan holde seg i live og formere seg i celler som har til hovedoppgave å ødelegge den. Dette skaper to spesielle forhold. Ved at bakterien oppholder seg inne i vertens celler er den gjemt for alle de komponentene i immunsystemet som vil bidra til å hemme eller begrense infeksjonen. Ved at den oppholder seg inne i immunceller kan den negativt påvirke deres funksjoner. Disse forholdene har betydning for forløp og manifestasjon av sykdommen og har svært stor betydning for hvilke immunprofylaktiske tiltak som kan eller vil virke eller om det er mulig å fremskaffe eller indusere beskyttende immunitet. I forbindelse med Francisella-infeksjon hos torsk er det derfor viktig å undersøke om bakterien forekommer inne i fiskens immunceller. For å kunne studere dette må en ha etablert en rekke metoder både i forhold til å dyrke bakterien og til å isolere og holde torskens immunceller i live med gode funksjonelle egenskaper i behold etter isolering. I tilegg skal det etableres metoder for å undersøke torskecellenes ulike drapsmekanismer, om de blir infisert og for å identifisere så langt som mulig hvilke celletyper bakterien kan oppholde seg inne i. I forhold til å studere og forstå torskens immunresponser er svært lite gjort. Særlig gjelder dette immuncellene, som samlet omtales som de hvite blodcellene eller leukocyttene. Vi vet svært lite om disse cellene hos torsk og har hittil lite erfaring med å studere deres funksjoner og responser på immunstimulering. Uten slik kunnskap må man i stor grad basere seg på å prøve og feile, og man blir avskåret fra å ha en kunnskapsbasert tilnærming til løsningsforslagene som testes i forbindelse med immunprofylakse. I prosjektet er vi godt i gang med studier av Francisella-infeksjon i torskens immunceller, etablering av egnede metoder for studier av en rekke immunfunksjoner knyttet til fagocyttiske celler og derigjennom hvilke strategier bakterien benytter for å overleve inne i vertens immunceller. Prosjektets mål er å undersøke hvordan de fagocyttiske cellene reagerer på infeksjon med Francisella og kartlegge mekanismer som den benytter for å unngå eller svekke vertens immunsystem. Et langsiktig mål vil da være å finne hvordan torsken kan stimuleres slik at den vil svekke eller blokkere de mekanismene bakterien benytter for å overleve og skape infeksjon. Immunceller (leukocytter) fra torsk Sentrale forskningsoppgaver Kunnskap om torskens immunceller Forekomst av Francisella i torskens immunceller Immuncellenes reaksjon på infeksjon med Francisella Immunstimulering i forbindelse med intracellulære bakterieinfeksjoner 5

Livssyklus til Francisella i humane makrofager 1. Looping fagocytose Francisella 2. Fagosomdannelse 4. Bakteriereplikasjon i cellens cytoplasma 3. Fragmentering av fagosomkappen og-membranen 2.3. Norge-India prosjekt Roy A. Dalmo, Fakultet for marin biovitenskap, fiskeri og økonomi, Universitetet i Tromsø. Finansiert av Norges forskningsråd. Ulike nasjonale institusjoner (Universitetet i Tromsø og Bergen, NOFIMA marin, Høgskolen i Bodø og Norges veterinærhøgskole) og vaksineprodusenten Pharmaq samarbeider med en rekke indiske forskningsmiljø innen vaksineutvikling for fisk. Den norske delen av prosjektet skal blant annet fokusere på vaksineutvikling mot Francisella sp hos torsk. I hovedsak skal det utvikles strategier med bruk av immunogene og beskyttende antigener fra Francisella som skal inngå i ulike vaksineformuleringer. Parallelt med utviklingen av vaksiner innbefatter også prosjektet studier av immunresponser - både ved Francisella smitte og etter vaksinering. Siden det ikke foreligger sentrale redskaper for å studere immunresponser skal det derfor utvikles relevante immunologiske verktøy som kan gi informasjon om korrelasjon mellom sykdom og beskyttelse. Sentralt i dette er også etablering av eksperimentell smittemodell med Francisella. 3. Vaksineutvikling hvor langt er man kommet? Vaksineselskapene Pharmaq og Intervet Norbio arbeider begge med utvikling av en vaksine mot Francisella, men fremdeles kan det synes langt frem i tid å få en vaklsine som beskytter mot sykdommen. Det følgende er en presentasjon av aktivitetene hos Intervet Norbio; 6

3.1. Status vaksineutvikling mot francisellose; en oppdatering av aktiviteten hos Intervet Norbio Bjørn Krossøy, Intervet Norbio Brukerstyrt NFR prosjekt 2006-2008: I dette prosjektet var en av hovedmålsettingene å utvikle en effektiv vaksine mot francisellose, som siden 2004 har forårsaket store tap for norsk torskeoppdrett. I denne prosjektperioden har det blitt fokusert på testing av vaksiner basert på inaktivert bakterier formulert i ulike oljeadjuvanser og inaktivert med forskjellige metoder. Resultatene så langt viser imidlertid liten effekt av vaksinering i kontrollerte smitteforsøk, både for testvaksiner som kun inneholder Francisella bakterien og for kombinasjonsvaksiner som også inneholdt vibriobakterier. Sett i lys av at det ennå ikke finnes gode vaksiner mot andre Francisella arter som forårsaker sykdom på dyr og mennesker er dette ingen stor overraskelse, og det gjør det lite realistisk å forvente en snarlig utvikling av effektive vaksiner mot francisellose i torsk. Av andre resultat fra dette prosjektet kan vi nevne at bakterien som vi finner på torsk - Francisella noatunensis - ble karakterisert og sammenlignet med beslektede bakterier som er sykdomsfremkallende for både dyr og mennesker. Det ble vist at F.noatunensis bør klassifiseres som en egen art i slekten Francisella. Et viktig delmål i prosjektet var også å utvikle spesifikke og sensitive metoder for påvisning av bakterien. To ulike sanntids PCR metoder har blitt utviklet og kommersialisert, og selges nå til kunder både i Norge og utlandet. Disse verktøyene har blitt brukt til å vise at F. noatunensis kan påvises på flere arter villfisk langs norskekysten så vel som i mange oppdrettspopulasjoner langs kysten. Undersøkelser av smittemekanismene innen og mellom anlegg ved hjelp av PCR har gitt oss god kunnskap om hvordan sykdommen utvikler seg i et anlegg. Generelt kan det sies at francisellose utvikler seg sakte, men er bakterien først introdusert i et anlegg vil prevalensen gradvis øke inntil vi får et sykdomsutbrudd typisk andre sommeren i sjøen. Den eneste måten å unngå store tap for oppdretterne er å forutse slike utbrudd ved hjelp av regelmessig testing og å slakte fisken før utbruddet får utvikle seg. Et annet viktig mål for påvisning av bakterien i fisk på et tidlig stadium er muligheten til å hindre introduksjon av infisert fisk til nye lokaliteter. Spesielt er det sett på som viktig å hindre introduksjon av bakterien til de nordlige delene av kysten som ennå ser ut til å være mindre utsatt for denne sykdommen enn det endemiske området fra Rogaland til Møre og Romsdal. Vaksineutvikling; veien fremover: De negative resultatene så langt til tross har vi ikke gitt opp! Fremover vil vi fokusere på identifisering og karakterisering av bakterielle antigener som kan indusere en beskyttende immunitet etter vaksinering. Dette arbeidet vil bli utført i nært samarbeid med flere forskningsgrupper tilknyttet Universitetet i Bergen med spesialfelt innen molekylærbiologi og databehandling. Det er vanskelig å angi en tidsplan for når en eventuell vaksine kan komme på markedet basert på resultat fra dette samarbeidsprosjektet, men det vil høyst sannsynlig være urealistisk med en kortere tidshorisont enn 4-5 år. Det utviklingsarbeidet vi nå står foran er både kunnskapsintensivt og kostnadskrevende, og vi ser på det som avgjørende at både næringen selv og myndighetene er med på å stille kapital til rådighet for utviklingsprosjekt som retter seg mot det i dag økonomisk ubetydelige 7

vaksinemarkedet som torsken representerer. Uten en slik felles innsats vil det være vanskelig å rettferdiggjøre den nødvendige resursbruken sammenlignet med andre viktige prosjekt rettet mot større marked. 3.2. Utvikling av Francisella-smittemodell for genetisk resistens og vaksinetesting på Atlantisk torsk (Gadus morhua). Claudia Maira og Marianne Bordevik, PHARMAQ AS Olaf Skjærvik, VESO Vikan I november 2006 startet PHARMAQ og VESO Vikan opp et samarbeid for å etablere en forutsigbar smittemodell for testing av vaksiner mot Francisella og til bruk i avlsarbeid på torsk. Utviklingsarbeidet inkluderte vurderingen av ulike parametre for modellen, som smittemateriale, smittedoser, temperaturer ved smitte, smitteveier, smitteforløp, sykdomsforløp etter smitte, diagnostikk og vaksinetesting. Fem forsøk er blitt gjennomført i forbindelse med utviklingsarbeidet. En kort oversikt over forsøkene gis nedenfor. Forsøk 1: Bad og ip-smitte på 70 grams uvaksinert og vaksinert torsk i 12 C sjøvann. Det ble brukt et smitteisolat fra VESO. Kun sporadisk dødelighet ble oppnådd. Fisken ble forsøkt stresset ved nedtapping av vannet 49 dager etter smitte. Temperatur ble økt til ca 15 C 62 dager etter smitte. Ingen ytre tegn på sykdom i fiskegruppene. Begge smittene (bad og ip) pågikk i 120 dager. All fisk avlivet og obdusert. Tydelige franciselloselesjoner ved avslutning på vaksinegruppe og kontrollgruppe. Fisken utsatt for badsmitten hadde mer granulomer i milt og hodenyre enn fisken som ble stikksmittet ved avslutning. Forsøk 2: Bad og ip-smitte på 16 grams uvaksinert torsk i 15 C sjøvann. Det ble brukt et smitteisolat fra PHARMAQ. 4 ulike smittedoser i stikksmitten (ip) + usmittet fisk (kohabitant) i samme kar. To ulike doser i badsmitten. Registrering av dødelighet forårsaket av Francisella-bakterien både etter bad- og stikksmitte. Det var en tydelig dose-respons i stikksmitten i forhold til dødeligheten etter smitte. Dødeligheten stoppet ca dag 25 etter smitte med laveste doser. Registrering av dødelighet forårsaket av Francisella i kohabiterende fisk fra dag 25. Ip smitte pågikk ca 40 dager og badesmitte i 58 dager. All død og overlevende fisk ble obdusert. Ved obduksjon ble granulomer i milt og hodenyre påvist i døde og overlevende fisk fra både ip og badsmitte, samt i kohabitant fisk. 8

Francisella ble re-isolert på CHAB skål fra en stor andel av de døde fiskene. IFAT ble positiv til Francisella. Forsøk 3: Bad og ip-smitte på 54,4 grams uvaksinert torsk i 15 C sjøvann. Gjentakelse av forsøk 2, samme isolat, samme fiskebatch. Tre doser i ip-smitten + usmittet fisk (kohabitant). Èn dose i badsmitten. Registrering av dødelighet forårsaket av Francisella-bakterien både etter bad- og stikksmitte. Det var en tydelig dose-respons i stikksmitten i forhold til dødeligheten etter smitte. Dødeligheten stoppet ca dag 25 etter smitte med laveste doser. Registrering av dødelighet forårsaket av Francisella i kohabiterende fisk fra dag 25. Ip smitte pågikk ca 45 dager og badesmitte i 58 dager. All død og overlevende fisk obdusert. Ved obduksjon ble granulomer i milt og hodenyre påvist i døde og overlevende fisk fra både ip og badsmitte, samt i kohabitant fisk.. Francisella ble re-isolert på CHAB skål fra en stor andel av de døde fiskene. IFAT ble positiv til Francisella. 9

Forsøk 4 og 5: To vaksineforsøk har vært gjennomført ved bruk av de utviklede smittemodellene. Uvaksinert og vaksinert torsk på 16 og 25 gram ble ip- og badsmittet ved 15 C i sjøvann etter 6 og 12 ukers immuniseringstid. Vaksinene som er benyttet har vært polyvalente og monovalente produkter som inkluderer inaktivert Francisella med ulike inaktiveringsprosedyrer og ulike type formuleringer. Effekten av vaksinene er vurdert ved å sammenligne forskjellen i dødeligheten og dannelse av granulomer etter smitte mellom uvaksinert fisk og Francisellavaksinert fisk.. I ett av forsøkene ble det også brukt en vibriosevaksine som kontroll. Observasjonstid for ip-smitter var mellom 19 25 dager og badsmitter 30 50 dager etter respektive smitter. Resultatene viser at etter ip-smitte så er dødeligheten på fiskegruppene vaksinert med Francisella lavere enn i begge kontrollgrupper. Dette ble registrert både 6 og 12 uker etter immunisering. Imidlertid, etter badsmitte ble høy dødelighet registrert i alle gruppene. Etter ip-smitte og badesmitte, ble granulomdannelse i milt og hodenyre påvist i fisk fra både vaksinerte og kontrollgrupper. Vaksinering mot francisellose er en viktig del av tiltakene for å kontrollere sykdommen. Videreutvikling og optimalisering av Francisellavaksiner er nødvendig. Imidlertid, en del av den utviklingsprosessen inkluderer testing av mulige vaksinekandidater under feltbetingelser for å kunne vurdere korrelasjon av effektresultater mellom felt og laboratorieforhold. Erfaringene med andre intracellulære bakterier tilsier at det er vanskelig å reprodusere naturlig smitteforhold under kontrollert betingelser. Utvikling av effektive vaksiner mot intracellulære bakterier har ofte vist seg å være vanskelig mot andre sykdommer i pattedyr. Det er derfor ikke overraskende at utvikling av effektive vaksiner mot francisellose vil være ressurskrevende. Det foreligger pdd. en patent søknad vedrørende bruk av en Francisella noatunensis vaksine til fisk. Det at markedstilgangen for en slik vaksine kan bli begrenset til den som eier patentet vil kunne ha innvirkning på hvor intensivt andre kommersielle aktører arbeider med å optimalisere en slik vaksine. Konklusjoner fra forsøkene: Dødelighet forårsaket av Francisella-bakterien registreres både etter ip- og badsmitte. Etter ip smitte avhenger total dødelighet av smittedose injisert. Dødelighet ser ut å være temperaturavhenging (om smitte gjennomføres ved 12 C eller 15 C). 10

Tydelige lesjoner forårsaket av Francisella -bakterie (granulomdannelse) registreres både etter ip- og badsmitte. Bakterien har vannbåren smitte og kan brukes i en kohabitantmodell. Francisella-bakterier kan re-isoleres med høy frekvens fra smittet fisk på CHAB skål. Etter smitte blir Francisella-bakterier påvist fra både lever og milt ved hjelp av IFAT. Resultatene fra ip- og badsmitte ble gjentatt med høy og forutsigbar dødelighet. Videreutvikling og optimalisering av vaksiner mot francisellose er nødvendig. Vurdering av korrelasjon mellom laboratorieresultater og resultater fra felt er viktig for videreutvikling av francisellose vaksiner. 11

4. Metode for å ta ut smittebærende fisk i villfisk populasjonen Stamfisk kontroll - Nyrebiopsi Øyvind J. Brevik 1, Trond E. Isaksen 1, Paul J. Midtlyng 2, Synnøve Helland 3, Are Nylund 1 1 Universitetet i Bergen, Institutt for Biologi. E-post: oyvind.brevik@bio.uib.no 2 VESO, Oslo 3 Nofima Marin Sunndalsøra Med den økende torskeyngelproduksjon i Norge er det behov for kunnskap og kontroll vedrørende utbredelse av sykdomsframkallende organismer (patogener/agens) hos stamfisk. Det finnes en rekke stamfiskprodusenter spredt i Norge, avls-populasjonene hos disse har i stor grad bestått av villfanget kysttorsk og skrei. Det er i dag også gjeldende praksis å supplere villfanget fisk til avlspopulasjonen forut gyting for å øke den genetisk bredden og for å øke antall regulære gytere. Dette medfører at stamfisken i stor grad er villfisk. Det er i dag en rekke kjente torskesykdommer som en finner både i villfisk og oppdrett. Francisellose (forårsaket av Francisella piscicida) er den alvorligste, men også viral nervøs nekrose (noda virus) er sykdommer som fører til tap i oppdrett. Sykdomskontroll av stamfisk består i dag av en karantene hvor nyfanget villfisk får gå i separate kar før de benyttes som stamfisk. Fisk som viser kliniske sykdomstegn i denne perioden forkastes. Dette er en dårlig tilnærmingsmåte da mange agens kan opptre som bærertilstand, dvs. at patogenet er tilstede i fisken men i små mengder og uten at det oppstår synelige sykdomstegn. Sykdomsutbrudd innebærer ofte oppblomstring av agens, og opptrer ofte som en konsekvens av nedsatt immunapparat hos verten, f.eks. i gyteperioden eller i tidlige stadier som larvefasen (lite utviklet av immunforsvar). En oppblomstring av agens i gyteperioden vil øke spredningspotensialet for vertikal overførbare agens (smitte fra foreldre til avkom). Agens vil da kunne være tilstede i høyere antall og i flere egg, noe som er en god spredingsstrategi. Karantene praksisen vil medføre en reel kontamineringsfare for avlspopulasjon, anlegg og egg om en tar bæretilstand i betraktning. Konsekvensen av dagens praksis kan være spredning av agens via stamfisk og smittede egg, noe som kan få både økonomiske og økologiske konsekvenser. Eksempelvis vil en populasjon hvor bærere av agens er tilstede fra klekking kontra smitte i sjøfase gi vidt forskjellige sykdomsforløp. Det første senarioet vil føre til større tap og høyere sannsynlighet for en gjennomsmittet populasjon før produksjonssyklusen er ferdig. Resultatet kan være at oppdrettere påføres unødvendige tap ved anskaffelse av smittet settefisk. Av økologiske konsekvenser er spredning av sykdomsagens til naive områder den største trusselen. Her vil patogenet kunne smitte til oppdrettsfisk innad i samme anlegg, eller fra oppdrett til villfisk. I dag er det størst yngel- og settefisk produksjon av torsk på vestlandet, men mye av denne fiske transporteres nordover til Nordland og Troms. Transport av levende organismer over store geografiske områder kan i verste fall medføre introduksjon av nye smittestoffer til den naturlige populasjonen områder som i utgangspunktet er naive for slike smittestoffer. Det finnes noen data på utbredelse av F. piscisida, og er nevnt i rapporten til Trond E. Isaksen ("Utbreiing av Francisella smitte hos villtorsk i Noreg ") En avlspopulasjon fri for agens bør være en målsetning for å hindre spredning av sykdomsagens. Screening av stamfisk for viktige potensielle vertikalt overførbare smittestoffer er et viktig verktøy som bør bli innført som en rutinemessig kontroll. Dette gjøres i økende grad på stamfisk hos laks, hvor befruktet rogn og obduksjonsprøver av stamfisk anvendes ved screeningen rettet mot potensielt vertikalt overførbare agens. Analyse 12

metoden som benyttes er sanntids RT-PCR, og er i dag vår mest sensitive metode for påvisning av sykdomsagens. Sanntids RT-PCR tester kan detektere arvestoff fra bakterier og virus, og kan benyttes som +\- eller kvantitativt deteksjon. Resultatet sier om agens er tilstede, men ikke noe om sykdom (dvs. det er ikke en fullverdig diagnostisk metode). Den er i bruk hos en rekke kommersielle aktører innen genteknologiske analyser av sykdomsagens hos fisk, i tillegg til forskningsinstitusjoner (PatoGen, Havbruksinstitutet, Universitetet i Bergen og Veterinærinstituttet). Obduksjonsprøver av nyre-vev hos torsk er standard i dag for slike analyser, og det er vist at det er mulig å påvise svært små mengder av patogener som F. piscicida, betanodavirus og VHS virus med bruk av sanntids RT PCR. Slike nyre-vev prøver blir ikke tatt av stamfisk før etter gyting, og en god stamfisk ønsker man heller ikke å avlive Torsk gyter flere ganger over 1-1,5mnd og samme stamfisk benyttes i flere sesonger. Så hvordan detektere potensielle vertikalt overførbare smittestoffer hos stamfisk? Egg er det beste vevet tilgjengelig for ikke letale analyser. Men sykdomsagens i egg er tilstede i små mengder, det er heller ikke homogent fordelt. Dette vanskeliggjør påvisning av sykdomsagens i eggpartier, noe som igjen kan føre til falske negative resultat. Universitetet i Bergen har i samarbeid med VESO Oslo og Nofima Marin Sunndalsøra utviklet og testet ut en metode for nyrebiopsi av torsk for påvisning av francisellose ved bruk av sanntids RT-PCR. Formålet med forsøket vårt var å utvikle en metode for å ta ut nyre-vev av levende stamfisk uten at denne ble skadet. Det ble brukt engangssprøyte / kanyle eller biopsinål. Stikkpunktet var bak gjellelokket anteriort for skulderbuen, øverste del (supra cleithrum). Fisk utsatt for prøvetakning var tilsynelatende ikke påvirket. Metoden er testet to ganger i større skala, hvor det ved en anledning gav noe dødelighet. Denne dødeligheten kunne imidlertid tilskrives håndtering på land samt dårlig bedøvelse rutiner. Kvalitetsanalyser av prøvene viste at biopsiprøvene hadde lik kvalitet som standard (obduksjon) nyreprøver med tanke på påvisning av sykdomsagens. Dette er ny metode som muliggjør nyre prøvetakning uten å skade torsken, noe som kan ha stor anvendelighet både innen forskning og næring. Vi har vist at den fungerer, og det er relativt enkelt å gjennomføre denne prøvetagningen for ansatte i næringen. Metoden krever ikke kostbart utstyr. Slike prøver som nyrebiopsi muliggjør identifisering av individer i stamfiskpopulasjonen med bærertilstander av sykdomsagens. Smittebærende fisk kan tas ut av anlegget og man kan i større grad avle frem smittefri yngel. Forvaltningsmessig er dette et problem: skal man slakte ut alt eller kun de som er infisert? Det kan jo hende at frisk fisk også har smittestoffer i seg som ikke kan påvises selv med den mest sensitive metoden tilgjengelig. Oppsummering Stamfisk som brukes i torskeyngelproduksjonen består i hovedsak av villfisk Screening av stamfisken er i dag mangelfull Ved å benytte stamfisk med vertikalt overførbare sykdomsagens vil en kunne spre patogener til naive områder i tillegg til å påføre oppdretter unødvendige tap. Nyrebiopsi av torsk kan påvise bærertilstander av vertikalt overførbare agens uten å skade fisken 13

Metoden er enkel og rimelig å benytte og svært sensitiv Denne metoden kan benyttes i målet om å få en sykdomsfri stamfisk populasjon Forvaltningsmessig vil det å kunne drive individ diagnostikk være problematisk da fisk i dag diagnostiseres som en populasjon. Avlsfisk anlegg vil være motvillige til screening om de pålegges å slakte ut all fisk i tilfeller der et individ av 100 er positiv for et vertikalt overførbart agens Litteratur 1. K. F. Ottem, A. Nylund, E. Karlsbakk, A. Friis-Møller, B. Krossøy, D.Knappskog, New species in the genus Francisella (Gammaproteobacteria; Francisellaceae); Francisella piscicida sp. nov. isolated from cod (Gadus morhua) Arch Microbiol (2007) 188:547 550 DOI 10.1007/s00203-007-0274-1 2. J. Mikalsen, A. B. Olsen, T. Tengs1 and D. J. Colquhoun, Francisella philomiragia subsp. noatunensis subsp. nov., isolated from farmed Atlantic cod (Gadus morhua L.) International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (2007), 57, 1960 1965 DOI 10.1099/ijs.0.64765-0 3. Nylund, E. Karlsbakk, S. Nylund, T. E. Isaksen, M. Karlsen, K. Korsnes, S. Handeland, R. Martinsen, T. Mork Pedersen, K. F. Ottem, New clade of betanodaviruses detected in wild and farmed cod (Gadus morhua) in Norway Arch Virol (2008) 153:541 547 DOI 10.1007/s00705-007-0015-4 4. K. F. Ottem., A. Nylund, T. E. Isaksen, E. Karlsbakk., O. Bergh,. Occurrence of Francisella piscicida in farmed and wild Atlantic cod, Gadus morhua L., in Norway. (2008) J Fish Dis 31, 525-534 5. M. R. White, S. R. Albregts, C. C. Wu, B. Breidert, The use of kidney biopsy of broodstock steelhead trout (Oncorhyncus mykiss) to determine the status of bacterial kidney disease infection. (1996) J Vet Diagn Invest 8:519-522 6. Spredning av smittestoff mellom anlegg Lars Asplin & Anne D. Sandvik, Havforskningsinstituttet Smittespredning mellom lokaliteter i et fjordområde kan være avhengig av smittedosen som spres (horisontal spredning). Denne smittedosen er igjen en funksjon av effektiviteten til smittestoffet (f.eks. bestemt av alder og omgivelsestemperatur) og spredningsveier. Når det gjelder spredningsveier i et fjordsystem må en kjenne vannbevegelsen. Havforskningsinstituttet har en stor aktivitet i forhold til bl.a. miljøvirkninger av havbruk og fjordøkologi, hvor vannbevegelse og temperaturforholdene i vannet er viktige faktorer. Derfor har vi gjennom flere år bygget opp metodikk for å skaffe nødvendig informasjon om fjordmiljøet. For å kvantifisere spredningen av vann omkring i fjordene trenger vi et relativt komplisert system bestående av både sentrale observasjoner og ikke minst et numerisk 14

Hastighet [m s -1 ] Francisella status rapport 2009 modellapparat. Sentralt i det numeriske modellapparatet som opereres ved Havforskningsinstituttet er en modell for strøm og hydrografiske forhold i et fjordområde. Vi har dessuten separate modeller for spredning av sporstoff og for partikler (f.eks. lakselus). Videre opererer vi også egne modeller for drivkrefter (bl.a. vind) og randbetingelser (havkystmodell). I prinsippet kan vi implementere modellapparatet for ethvert fjordområde, og i dag er modeller for Lysefjorden, Hardangerfjorden, Sognefjorden, Folda, Altafjorden og Porsangerfjorden operative. Vannbevegelsene i fjorder og kyststrøk er av natur sammenlignbart med atmosfærebevegelsen og det vi kjenner som været. Altså er det snakk om et kaotisk og lite forutsigbart system dersom vi snakker om tidsperioder lenger enn et par dager. Siden alt utvikler seg saktere i vann enn i lufta er det noe enklere å beregne hva som skjer og har skjedd, men det er uansett et komplisert arbeid. Målinger av strømmen fra fjorder viser at bevegelsen er satt sammen av svingninger med mange skalaer. Fra Hardangerfjorden finner vi at vanntransporten domineres av episoder med noen timer til dagers varighet (Figur 1). Disse målingene er 10-minuttersverdier fra 11 m dyp av strømkomponeneten langs fjordaksen, slik at positive verdier er strøm inn fjorden og negative er ut. Målingene er gjort med en observasjonsbøye plassert utenfor Rosendal i posisjon N 59,99 o E 5,92 o (http://data.nodc.no/observasjonsboye). Observasjonene er fra en drøy to ukers periode i månedsskiftet november-desember 2008. Her starter det med en uke der gjennomsnittlig strømhastighet ut fjorden er ca. 0,2 m s -1. Rent teoretisk vil det vannet som passerer strømmåleren kunne forflytte seg 120 km dersom vannet opprettholder denne strømhastigheten videre utover fjorden (noe som riktignok ikke er sannsynlig). Denne episoden med utstrømning avløses av en kraftig episode med innstrømning, skapt av en sterk sønnavind den 27. november (dag 331). Her når strømmen i 11 m dyp en hastighet på 0,6 m s - 1 og over en periode på 1-2 dager strømmer det gjennomsnittlig inn fjorden med ca. 0,3 m s -1. Dette skulle indikere at vannet i området forflytter seg flere 10-talls kilometer i forbindelse med denne episoden. Vi vet også at strømhastighetene drevet av vind øker betydelig fra 11 m dyp mot overflaten, og hastighetene helt i overflaten vil sannsynligvis være 2-3 ganger sterkere enn i 11 m. Observasjonene illustrerer uansett dynamikken som kan forekomme i de store oppdrettsfjordene, og samtidig hvilket potensiale strømmen har til raskt å flytte vann mellom oppdrettsanlegg. Strøm langs fjorden i 11 m dyp ved Hardangerfjord Øst observasjonsbøye 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0-0.1-0.2-0.3 324 326 328 330 332 334 336 338 340 Tid [løpende dager 2008] 15

Figur 1. Strømkomponent langs fjordaksen i 11 m dyp fra en observasjonsbøye utenfor Rosendal i Hardangerfjorden (posisjon N 59,99 o E 5,92 o ). Positive verdier er strøm inn fjorden. En illustrasjon på spredning av et smittestoff fra en bestemt kilde er resultater fra et modelleksperiment i Hardangerfjorden med spredning av et passivt sporstoff fra et kontinuerlig utslipp i perioden 15. april til 20. mai 2007. Kilden er like nord for Varaldsøy og den 20. mai er sporstoffet i overflaten tilstede i ulik konsentrasjon i omtrent hele fjorden (Figur 2). Fortynningen øker naturlig nok jo lenger vekk fra utslippspunktet en kommer, og i de ytre og de aller innerste delene av Hardangerfjorden er konsentrasjonen av sporstoffet under 2%. 30' 0.2 0.18 15' 0.16 0.14 60 o N 0.12 45' 0.1 0.08 30' 0.06 0.04 15' 0.02 4 o E 30' 5 o E 30' 6 o E 30' 7 o E 0 Figur 2. Modellert spredning av et passivt sporstoff i overflaten fra en kilde nord for Varaldsøy (markert med rød sirkel) den 20. mai 2007 etter et kontinuerlig utslipp fra 15. april 2007. Verdiene angir konsentrasjon i forhold til 1. Modellresultater viser at horisontal spredning av smittestoff innen en tidsramme på 1-2 døgn er relativt stor, minst 20km. For lengre tider, ca. en uke, vil i prinsippet hele Hardangerfjorden kunne bli berørt av patogener langveisfra. Modellresultatene vil kunne gi infomasjon om alder på smittestoffet i ulike områder samt hvilken omgivelsestemperatur det har opplevd. 7. Patogenese Duncan J. Colquhoun, Veterinærinstituttet Siden de første tilfellene av Francisellose i 2004 har det vært en intensiv forskningsinnsatts med fokus på deteksjon og karakterisering av bakterien. Så langt vet vi faktisk forholdsvis lite angående patogenese i Francisellose. Noe av det vi vet er: Temperatur/sesong svingninger: Francisellose kan bli påvist året rundt, men høyest dødelighet er observert etter lengre perioder med varmt vann på sein sommer/høst. Til dags dato er det bare to smitteforsøk, utført under kontrollerte forhold, som er publisert; en utført 16

ved 12 o C (Mikalsen et al. in press) og en ved 10 o C (Nylund et al. 2006). Disse rapporterer betydelige forskjeller i utfall (dødelighet). Videre eksisterer det en del ikke-publisert resultater på effekten av temperatur på utviklingen av Francisellose. Temperatur betraktes som det mest relevant faktor i utvikling av sykdommen i en infisert populasjon, og hovedsaklig rapporteres det en direkte forhold mellom utvikling av sykdommen (og evt. dødelighet) og vanntemperatur. Arbeid utført ved VESO Vikan viser til null dødelighet i smitteforsøk (i.p.) utførte ved 12 o C mens en reprodusbar dose respons kan oppnåes ved i.p. smitte utført ved 15 o C. Arbeid utført ved UiB viser temperaturavhengig dødelighet med maksimal dødelighet på 51 % ved 18 o C (høyest temperatur testet). Erfaringer fra prøvetaking under vintersesongen viser at sykdommen forsvinner ikke med synkende vanntemperaturen men nedre temperaturgrense for overføring av sykdommen er ikke kjent. Selv om forhøyet dødeligheten ofte ikke er registrert i felttilfeller viser arbeid utført av Mikalsen et al (in press) og Nylund et al. (2006) at sykdommen sprer seg raskt i en smittet populasjon. Horisontal smitte: Den minste infeksiøse dosen for Francisellose er ikke kjent, men det har blitt demonstrert at sykdommen er lett overførbar horisontalt. I kontrollerte smitteforsøk har en smitteoverføring til kohabitanter vært tilnærmet 100 % og horisontal smitte er ikke avhengig av kontakt mellom infiserte fisker. Ett arbeid utført ved NFH har vist at avløpsvann fra ett kar med Francisella infisert torsk har, med en høy grad av effektivitet, overført infeksjonen til torsk i mottakskaret. Vertikal smitte?: Francisella er påvist i rogn (UiB), men om sann vertikaloverføring (dvs, bakterier intracellulært i sæd eller egg) av Francisella skjer er, så vidt vi vet, ikke påvist ennå. Vertspesifisitet og nisjer utenfor torsk: Bare ett publisert arbeid har sett på tilstedeværelse av bakterien utenfor syke torsk. Ottem et al. (2008) undersøkte en del fiskearter, blåskjell og krabbe for tilstedeværelse av Francisella vha PCR. Med unntakelse av en oppdrettslaks (blant 32 testet) ble det bare påvist høye Ct verdier (dvs få kopier av Francisella DNA) i andre fisk arter, krabbe og blåskjell. På tross at en veldige nærbeslektet bakterie, trolig et medlem av samme art (F. philomiragia subsp. noatunensis), har blitt identifisert i forbindelse med dødelighet i oppdrett av atlantisk laks i Chile (Birkbeck et al. 2007), har det ikke blitt påvist sykdom pga Francisella infeksjon i oppdrettslaks i Norge, selv i populasjoner av laks i merd i nærheten til infisert torsk anlegg. Smitteforsøk ved UiB indikerer at Francisella philomiragia subsp. noatunensis stammen fra Chile gir en klinisk forskjellig sykdom i Norsk oppdrettstorsk enn den Norske stamme av bakterien. At to stammer av den samme bakterie art viser forskjellige vertstropisme er ikke ukjent. Vibrio anguillarum serotypene O2a og O2b, er genetisk identiske i MLSA (husholdning gen analyse), men viser vertstropisme for henholdsvis torsk/laksefisk og torsk. Ved Veterinærinstituttet har vi i tillegg bekreftet at en sykdom som tidligere ble omtalt som mykobakteriose i villtorsk faktisk er Francisellose. Prøve materialet stammer fra sydlige områder av Nordsjøen og ble samlet på slutten av 1980 tallet. I perioden 1980-90 ble denne sykdommen registrert med forholdsvis høy prevalens i torsk, men ikke i andre undersøkte arter. Denne epidemiologiske informasjon indikerer at F. philomiragia subsp. noatunensis /F. piscicida i Norge viser en forholdsvis høy grad av vertsspesifisitet Overlevelse utenfor fisken: Det er foreløpig ikke kjent hvor lenge Francisella spp. kan leve utenfor fiskeverten. Studier av Francisella overlevelse i mikrokosmos er underveis på 17

Veterinærinstituttet. Disse bør gi en indikasjon på fare for direkte smitte mellom anlegg og overlevelse av bakterien i miljøer hvor mottakelig fisk er ikke tilstede. Andre Francisella bakterier er kjent for å overleve i vektorer som flått, mygg osv. for så å invadere og gi sykdom i en høyere organisme. Det er mulig at fiske patogene Francisella ssp kan bruke andre mikroorganismer f.eks amoebae som vektor. Selv om vektorer er høyst sannsynlig ikke nødvendige for horisontal smitte (se over om horisontal smitte) må rollen av vektorer i forbindelse med persistens av bakterien utenfor fisken og evt. økning i virulens av bakterien (en fenomen kjent i andre intracellulære patogener) forskes på. Smittemekanismer/virulensmekanismer Alle bakterier som gir systemiske infeksjon må kunne adhere, invadere og multiplisere i verten før spredning kan skje. Hvordan Francisella kommer gjør dette er fortiden ikke kjent. Store mengder av dyrkbar bakterie i tarmen ble identifisert under smitteforsøk (Mikalsen et al. 2008) og kan tyde på utskilling av bakterie fra tarm som en viktige smittevei. Evne til å overleve og replikere innen vertens makrofager er mest sannsynlig viktige virulensegenskaper som alle Francisella patogener har til felles. 8. Utbreiing av Francisella smitte hos villtorsk i Noreg Trond E. Isaksen 1, Karl F. Ottem 1, Egil Karlsbakk 2, Linda Andersen 1, Are Nylund 1 1 Institutt for biologi, Universitetet i Bergen 2 Havforskningsinstituttet i Bergen Stamfisken som brukast i torskeyngelproduksjonen er i stor grad villfanga. Villtorsk kan vera berar av potensielle patogen som bakterien Francisella noatunensis (syn. Francisella piscicida) og betanodavirus (nervøs nekrose virus, NNV). Desse patogenane (som kan gi sjukdom hos fisk), og særleg Francisella bakterien, er vist å kunne gje sjukdom hjå torsk i oppdrett med påfylgjande tap. Vertikal overføring av smitte frå stamfisk til torskeyngel representerar særs stor fare for yngelproduksjonen. I tillegg er det ein risiko for horisontal smitte mellom villfisk og fisk i merd. Fiskesjukdomsgruppa ved institutt for biologi, Universitetet i Bergen, har delteke i prosjekt 1 vedrørande kartlegging av den naturlige førekomsten av patogenar hos torsk langs norskekysten. Ein av målsetningane for desse prosjekta har vore å klarlegge forekomsten hos villtorsk av Francisella bakteriar. Denne rapporten viser resultat av Francisella smitte påvist hos vill fanga torsk langs norskekysten. I perioden 2006 2007 vart det tekne prøvar av villfanga torsk frå ulike stader langs norskekysten (Fig. 1). Desse fiskane vart fanga av lokale fiskarar, og lagra levande i merd inntil prøvetakinga fann stad. Opphaldstida i slike merdar var maksimalt to veker. Kort opphaldstid var viktig for å unngå eventuell smitte mellom fiskane. Alle fiskane vart undersøkt og dissekert nyleg avliva ved den lokaliteten dei vart fanga. Vevsprøvar blei lagra på tørris og flytende nitrogen for seinare analyse ved Institutt for biologi (BIO), Universitetet i Bergen. Totalt er det testa 467 fisk for Francisella smitte i perioden april 2006 april 2007 (Tab. 1). Fiskens storleik og kjønn, samt grad av kjønnsmodning blei vurdert. 1 Kartlegging av forekomst av Francisella sp. og nodavirus i Hordaland finansiert av Hordaland Fylkeskommune), CodPath Bakgrunnsnivå av patogener hos villtorsk finansiert av Norges forskningsråd 18

Fiskesjukdomsgruppa (BIO) har utvikla ein rekke ulike sanntids PCR testar (assay) for ein rekke kjende fiskesjukdom agens i Noreg, blant anna salmonide alfavirus (Pancreas Disease virus), ILA virus, IPN virus m.fl. I villtorsk prosjekta er sanntids PCR også blitt optimalisert for deteksjon av Francisella bakterien. Dette er eit viktig og helt nødvendig arbeid i utviklinga av sensitive og presise verktøy for påvisning av patogen i ulike typar vev, og for biopsiprøvetaking. Metoder med bruk av sanntids PCR (real time PCR) er blitt optimalisert med tanke på å detektere førekomst av Francisella bakteriar i utvalte vevsprøvar. Vevsprøvar som er undersøkt i denne Francisella screeningen er frå nyre (fremre del). For deteksjon av Francisella smitte i villtorsk kan det brukast ulike sanntids PCR testar. I screening av villtorsk er det brukt to assay (testar, analyser); EF1A og Fc50 (Ottem et al. 2008). Referanse genar er heilt naudsynte som interne kontrollar i sanntids PCR for å vurdere RNA, mengde og kvalitet. Genet for elongeringsfaktor 1alfa frå torsk, (EF1A) har vist seg å vera egna som referanse gen for sanntids PCR analyser. Genet er alltid aktivt, ettersom det koder for eit protein som spelar ei viktig rolle i elongeringsfasen under proteinsyntesen i cellene (proteinet katalyserer acylbindinga mellom den innkommene aminosyren og peptidkjeden). Referansegen er dessutan heilt essensielle for å kunne kvantifisere gen- ekspresjon. For å kunne seie noko om kor mykje bakteriar det er til stades i ei vevsprøve av kjent storleik og gjeven type (e.g. nyre) kan EF1A og Fc50 signala verta samheldne. I påvisning av Francisella smitte hos villtorsk, vart EF1A assayet brukt i sanntids PCR på RNA for å teste kvaliteten til prøvematerialet, då mrna er labilt. I sanntids PCR reaksjonane er det DNA som blir nytta som templat for sjølve reaksjonen med primere-probe. Dette betyr at RNA må omskrivast til DNA. Dette blir gjort i ein cdna (komplementer DNA) syntese. I to-stegs sanntids PCR metoden må slik cdna tilverkast forut for testen, medan i 1-stegs sanntids PCR er denne cdna syntesen integrert som ein del av prosessen. For deteksjon av Francisella bakteriar i vevsprøven er Fc50 assayet brukt, med RNA som templat. Dette påvisar 16S rrna til bakterien F. noatunensis (sjå Ottem et al. 2008). Det er ikkje utført ein reel kvantitativ analyse av prøvematerialet (eksakt mengde bakterie i vevsprøven). Testane som er presentert i denne rapporten er kvalitative og viser tilstedeværelse av smittestoffet. Sanntids PCR resultata (Ct verdier) indikerer om det er mye eller lite av Francisella bakteriar i prøven. Sanntids PCR testane ble vurdert som positive for Francisella dersom kontroll testane var tilfredstillande og Ct-verdiane ( cycle threshold ) for Fc50 var reproduserbare. Ct verdiar korleis skal desse tolkast? Ct verdiar står for cycle threshold values, og er den syklusen der mengda fluorescens i ei prøve overstig mengde bakgrunnsfluorescens i ein sanntids PCR reaksjon. Denne verdien er direkte korrerlerbar med mengda mål-rna og dermed startmateriale i prøven (dvs. mengda patogen; bakteriar, virus). Dersom det er patogen-cdna til stades som assayet er laga for, vil dette DNA et kopierast for kvar syklus. Dess meir av arvestoff til patogenet tilstede i prøven, dess lågare Ct verdi. Her er det dessutan mange fallgruver man bør vera klar over; Ctverdiane varierer med mengde utgangs RNA og RNA kvalitet. Ein generell regel; dess lågare Ct-verdi, dess meir patogen tilstades. Fisk kan bera på smitte av t.d. Francisella noatunensis utan at det utviklast merkbar sjukdom (symptomfri). Det er uklårt om frisk fisk som er berarar av F. noatunensis bakterien (høge Ct-verdiar for bakterien i nyreprøvar) kan smitte anna fisk, men så lenge dei har smitten i seg kan det utviklast sjukdom og auka smittefare. I denne rapporten vil fisk som testar svakt positiv (Ct verdi større enn 30) for F. noatunensis reknast å ha slik berarstatus. Det er viktig å vera klar over at ein observerar ulike Ct verdiar når ein testar same templat med ulike sanntids PCR kit; ulike produsentar av kit løysningar, samt 2-19

stegs RT PCR versus 1-steg RT PCR kit. Ct verdiar er med andre ord ikkje ein måleining eller ein eksakt verdi, den viser berre når ein reaksjon finn stad. I resultata som blir presentert i denne rapporten er det berre Ct verdiar som kan reproduserast vurdert. Dette vil seie at prøven regnast som positiv berre dersom Francisella-testen (Fc50 assay) gir ein Ct verdi som er innanfor ein deteksjonsgrense for assay et (reproduserbare verdiar). Det er brukt RNA som templat i Francisella testane. Det er fordi Fc50 er optimalisert for RNA og fordi det er meir RNA arvestoff enn DNA i ein levande celle. RNA templat kan i tillegg brukast for testing av ulike typar virus. Det finnes ulike metodar og protokoller for ekstrahering av RNA frå vevsprøvar. I våre undersøkingar er det prøvd ut to ulike metodar (EZNA Total RNA Purification Kit I, Omega BIOTEK eller TRIreagent Sigma-Aldrich). Det er ikkje blitt påvist forskjell i desse RNA-ekstrasjons metodane med tanke på Francisella analysane. Tabell 1 Prøvar av villtorsk frå norskekysten. Totalt 467 fisk frå 7 fylker vart samla inn og tekne prøvar av i perioden april 2006 - april 2007. Fiskens vekt og lengde (minste største) med gjennomsnittverdi i parentes. Kjønnsfordeling er gitt som forholdstal ( : ). Relativ andel av gytemoden (stor gonade, rennande melke eller rogn) fisk er gjeven i prosent. 20

Figur 1 Lokalitetar for innsamling av villtorsk. Totalt 467 villtorsk frå Agder fylka i sør til Nordland og Vesterålen i nord har blitt undersøkt for Francisella bakteriar i perioden 2006-2008. Kartskisse: Ottem et al. 2008. Figur 2 Prevalens av villtorsk med påvist Francisella bakteriar. Totalt 467 fisk undersøkt frå Agder fylka i sør til Vesterålen i Nordland i perioden 2006-2007. Antall fisk undersøkt (N) er gitt for kvart fylke. Ingen villtorsk med Francisella smitte ble påvist i uttaket frå Rogaland eller Sogn- og Fjordane. 21

Det vart påvist fisk positiv for Francisella smitte frå 5 av 7 fylke der det vart samla torsk (Fig. 2). Ct verdiar i Fc50 testane som var lågare enn 30 vart registrert hos torsk frå Aust-Agder (2 av 53), Vest Agder (1 av 60) og Hordaland (1 av 86). Ingen kliniske symptom på sjukdom vart registrert hos fisken utan ein fisk frå Aust Agder (Ct verdi: 21,5). Det er ingen signifikant korrelasjon når det gjeld kjønnsmodning og Francisella smitte. Unntaket kan være ein tendens i Hordaland der det ser ut til at liten, kjønnsmoden fisk i større grad har Francisella smitte. Geografisk sett er Francisella smitte i villtorsk mest utbreidd sør i Noreg, men det er viktig å merke seg førekomst hos skrei i havet vest for Vesterålen. Analysar med sanntids PCR har til no vist at Francisella noatunensis kan påvisast i nyre hos klinisk frisk fisk. Det kan tenkast at fisk med berarstatus har større konsentrasjon av bakterien i andre organ enn det som er klarlagt i våre og andre undersøkingar. Det trengs difor ytterligare undersøkingar og testar av ein rekke ulike organ i forsøk på å påvise infeksjonsmønsteret til Francisella bakteriar hos torsk. Resultata som er presentert i denne rapporten er mest sannsynleg ein underestimering av mengde positiv fisk, då det berre er testa ein nyre-bit per fisk. Dersom man hadde testa fleire prøver frå kvar fisk, samt prøver frå fleire organ ville man ha fanget opp endå fleire positive fisk. Ressursane (tid, økonomi) setter grensa for ein slik omfattande testing. Prøvematerialet som hittil er undersøkt gir indikasjonar på at villtorsk kan være viktige smitteberar for patogenar som Francisella bakteriar. For å få eit meir presist og komplett bilde av dette, bør det undersøkast fleire fisk tekne i ulike årstider og fleire stadar. Slik informasjon vil vera svært viktig for val av stamfisk til torskeyngel produksjon. REFERANSER: 1. Ottem, K.F., Nylund, A., Isaksen, T.E., Karlsbakk, E., Bergh, O., 2008. Occurrence of Francisella piscicida in farmed and wild Atlantic cod, Gadus morhua L., in Norway. Journal of Fish Diseases 31, 525-534. 2. Karlsbakk, E., Isaksen, T.E., Nylund, A., Devold, M., Korsnes, K., Handeland, S.O., Nylund, S., Ottem, K.F., Brevik, Ø., Andersen, L., Karlsen, M., Jørstad, K.E., Sleire, L., 2009. CodPath prosjektet: kartlegging av sykdomsagens hos villtorsk. En kort presentasjon. Fiskehelse (i trykk). 9. Utbredelse av francisellose i oppdrettsfisk. Jarle Mikalsen, Veterinærinstituttet Det har vært en stigning i antall diagnostiserte anlegg siden 2005 da fire anlegg fikk diagnosen francisellose (Hellberg et al. 2008). I 2006 og 2007 var antallet henholdsvis 7 og 8 anlegg, mens antall anlegg for 2008 er vesentlig høyere. Sykdommen er blitt meldepliktig i 2008 noe som har bidratt til at flere saker er registrert hos veterinærinstituttet. Endelige tall for 2008 er ikke tilgjengelig men blir publisert i fiskehelserapporten for 2008 som forventes ferdig mot slutten av januar 2009. 22

Generelt for 2008 ser man en forflyttning av kjerneområde for utbrudd fra Stavanger regionen til Møre og Romsdal, men følge forløpige tall (ikke endelige!) er sykdommer påvist i oppdrett fra Rogaland til Nordland. Figur 1. Påvisnninger av Francisella philomiragia subsp noatunensis i Norge og Sverige. Sykdommer er kun påvist i villfisk i Sverige. Svarte linjer viser områder med PCR positive prøver fra villfisk (Ottem et al. 2008). Figur henter fra ph.d oppgaven til Jarle Mikalsen REFERANSER: 1. Hellberg, H., Colquhoun, D., Hansen, H. og Nilsen, H. Helsesituasjonen hos marin fisk 2007 2. Ottem, K. F., A. Nylund, T. E. Isaksen, E. Karlsbakk, and O. Bergh. 2008. Occurrence of Francisella piscicida in farmed and wild Atlantic cod, Gadus morhua L., in Norway. J. Fish Dis 10. Francisella-bakterien Francisella philomiragia subsp. noatunensis, spredning i norsk torskeoppdrett Av Jarle Mikalsen og Peder A. Jansen Ved søk i prøvejournalsystemet til Veterinærinstituttet er det identifisert i alt 23 lokaliteter med oppdrett av torsk der det er påvist eller mistanke om francisellose over årene 2005 23

2008 (Fig. 1). Et tiltagende antall funn er gjort; fra 4 lokaliteter i 2005 til 8 nye lokaliteter i 2008. I 2008 var det totalt 14 lokaliteter med francicellose ( 6 av disse hadde fått påvist sykdommen året før) (Hellberg et al., 2009). Mange av påvisningene er gjort på lokaliteter som ligger geografisk isolert, men det er en konsentrasjon av påvisninger i Rogaland relativt tidlig i perioden (2005 2007). I tre områder, i nærheten av Florø, ved Frøya og i nærheten av Bodø, er det gjort funn i nære nabolokaliteter. Figur 1. Lokaliteter med oppdrett av torsk der det er gjort positive funn av francisellose over årene 2005 2008. Områder der påvisninger er gjort i nære nabolokaliteter er fortørret (A: nærhet av Bodø; B: ved Frøya; C: nærhet av Florø). Sykdommen francisellose forekommer også i ville populasjoner av torsk og har blitt verifisert fra historisk materiale innsamlet fra vill torsk på 1980-tallet (Mulualem Adam Zerihun et al 2008). I en PCR screening av vill torsk ble det gjort positive funn av Francisella-bakterien langs kyststrekningen Aust-Agder til Hordaland, mens det på kystsstrekningen fra Sogn og Fjordane til Nordland ikke ble gjort positive funn (Ottem et al. 2008). Det ble også gjort positive PCR funn av Francisella-bakterien hos en rekke andre marine fiskearter, i krabbe, i blåskjell og i oppdrettslaks. Eksperimentelle smitteforsøk viser at Francisella-bakterien smitter horisontalt ved ko-habitant smitte (Nylund et al 2006; Mikalsen et al., in press). Det er også vist at Francisella-bakterien kan overføres med vann (personlig meddelelse fra Terje Ellingsen, UiTø og Mona Gjessing, VI Oslo). Disse funnene tyder på at villfisk kan representere et smittereservoar for Francisella-bakterien, samt at infiserte anlegg kan etablere bakterien i det nærliggende miljøet, og dermed spille en rolle i lokal smittespredning (Mikalsen 2008). 24

Francisella-bakterien er en relativt varmekjær bakterie med optimum veksttemperatur på rundt 22 C og som vokser i temperaturområdet 6-25 C (Olsen et al., 2006; Nylund et al., 2006; Mikalsen et al., 2007). Det er vist eksperimentelt at Francisella-bakterien sprer seg ved 12 C og gir en gjennominfisert populasjon uten nødvendigvis forhøyet dødelighet (Mikalsen et al., in press). Andre smitteforsøk viser økte smitterater og sykdomsutvikling ved 15 og 18 C. Dette kan være et resultat av både rask bakterievekst samt at torskens motstandsevne kan reduseres ved høye temperaturer. Temperatur synes å spille en nøkkelrolle for uttrykk av klinisk sykdom. Erfaringer fra smitteforsøk og felt indikerer at vanntemperaturer høyere en 9-10 C kan være en betingelse for sykdomsspredning, men dette er foreløpig ikke tilstrekkelig dokumentert (Mikalsen et al., in press; presentasjon av Karianne Jakobsen (Labora), Sats på Torsk 2009). Likefullt tyder funn på at Francisella-bakterien persisterer i fisken ved lavere vanntemperaturer. Et økende antall påvisninger av Francisella-bakterien i torskeoppdrett de sene år tyder på et tiltagende problem. Smitteforsøk viser at horisontal smitte mellom fisk er mulig og den geografiske fordelingen av lokaliteter med Francisella-påvisning hos nabolokalietter indikere at horisontal smittespredning mellom anlegg også kan forekomme under feltforhold. Andre smitteveier er også mulig som at torsken var smittet ved utsett, eller at oppdrettsfisk er blitt smittet av villfisk. Det er foreløpig usikkert hva som er de viktigste spredningsveiene for bakterien. Et vesentlig problem ved vurdering av mulige smitteveier for Francisella-bakterien i torskeoppdrett ved å analysere registrert smitte eller sykdom i tid og rom, er at man ikke vet hvor det til enhver tid står oppdrettstorsk. For lakseoppdrett er det et krav om innmelding av produksjonsdata fra alle sjø-lokaliteter gjennom havbruksdata. Et slikt krav bør også komme for torskeoppdrett slik at man kan få en oversikt over alle aktive lokaliteter til enhver tid. REFERANSER: 1. Hellberg Hege, Jarle Mikalsen, Duncan Colquhoun, Haakon Hansen, Geir Bornø og Arve Nilsen (2009). Helsesituasjonen hos marin fisk 2008. Veterinærinstituttet, under trykking. 2. Jakobsen Karianne Labora Analyselaboratorium og Fiskehelsetjeneste AS Notveien 17, 8013 Bodø. 3. Mikalsen Jarle (2008). Diagnosis and characterisation of intra-cellular Gram-negative pathogens of marine and salmonid fish. Thesis for the degree of Philosophiae Doctor (Ph.D.) Series of dissertations submitted to the Norwegian School of Veterinary Science No. 42 4. Mikalsen, J., A. B. Olsen, T. Tengs, and D. J. Colquhoun (2007). Francisella philomiragia subsp. noatunensis subsp. nov., isolated from farmed Atlantic cod (Gadus morhua L.). Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 57:1960-1965. 5. Mikalsen J, A B Olsen, H Rudra, T Moldal, H Lund, B Djønne, Ø Bergh and D J Colquhoun (2009). Virulence and pathogenicity of Francisella philomiragia subsp. noatunensis for Atlantic cod (Gadus morhua) and laboratory mice. J. Fish Dis., in press. 25

6. Nylund, A., K. F. Ottem, K. Watanabe, E. Karlsbakk, and B. Krossoy (2006). Francisella sp. (Family Francisellaceae) causing mortality in Norwegian cod (Gadus morhua) farming. Arch. Microbiol. 185:383-392. 7. Olsen, A. B., J. Mikalsen, M. Rode, A. Alfjorden, E. Hoel, K. Straume-Lie, R. Haldorsen, and D. J. Colquhoun (2006). A novel systemic granulomatous inflammatory disease in farmed Atlantic cod, Gadus morhua L., associated with a bacterium belonging to the genus Francisella. J. Fish. Dis. 29:307-311. 8. Ottem KF, A Nylund, TE Isaksen og Ø Berg (2008). Occurrence of Francisella piscicida in farmed and wild Atlantic cod, Gadus morhua L., in Norway. J. Fish Dis. 31: 525 534. 9. Zerihun Mulualem Adam, Stephen Feist, Anne Berit Olsen, David Bucke, Jannice Wiik and Duncan Colquhoun (2008). Retrospective identification of Francisellosis in Atlantic cod (Gadus morhua) sampled from the southern North Sea during the 1980 s. Poster ved Havbrukskonferansen i Tromsø. 11. Karakterisering av Francisella ssp. i norsk og internasjonalt havbruk Jarle Mikalsen, Veterinærinstituttet og Karl Fredrik Ottem, Universitetet i Bergen Infeksjon med Francisella bakterier i fisk er ingen ny sykdom! Den første kjente referansen til Francisella infeksjon i fisk er gjort i en WHO rapport fra 1970, der to fiskeslag blir listet som mottakelige dyr for infeksjon, dog denne rapporten er noe uklar på klassifiseringen av agens 12. Tradisjonelt har to hovedgrupper, basert på 16s rrna sekvensering (figur 1), innenfor bakterieslekten Francisella blitt anerkjent nemlig F. tularensis eller harepest gruppen og F. philomiragia gruppen 16. Inkludert i den først nevnte er flere menneskepatogene bakterier og disse har inntil nylig vært kilde for nesten all kunnskap Francisella 16. De relativt nylig identifiserte fiskepatogene Francisella spp. tilhører F. philomiragia gruppen men er forskjellig fra de kjente humanpatogene stammene i denne gruppen 4,5,7,8,10,11,14,15. Fiskepatogene Francisella stammer er ikke antatt å være sykdomsfremkallende i mennesker (Mikalsen et al. 2008). Nylig har en tredje gruppe med humanpatogene bakterier blitt identifisert i genus Francisella, men disse er fortiden ikke fult ut karakterisert 6. Dette sammen med påvisning av flere til nå uklassifiserte medlemmer i gruppen 2 illustrerer at diversiteten i denne bakterieslekten er mye større enn hva som har vært antatt tidligere. Infeksjon med Francisella i fisk har blitt beskrevet fra forskjellige geografiske områder verden over og fiskeslag, samt andre marine dyr. I hovedsak dreier det seg om to hovedtyper av fiskepatogene Francisella ssp., men mindre forskjeller er observert innenfor begge gruppene avhengig av sted for isolasjon. Den best karakteriserte av disse er den som gir sykdom i Atlantisk torsk i Norge og resten av Skandinavia. Denne har blitt gitt to forskjellige navn og taksonomisk plassering nemlig Francisella philomiragia subsp. noatunensis 8 (tilhørerer sjøen) og Francisella piscicida (fiskedreperen) 15. Begge navnene er formelt godkjente navn, men refererer til samme bakterie. Jamfør reglene for navngiving av bakterier har navnet noatunensis har prioritet over piscicida 1, men konsensus for den taksonomiske plasseringen er som en egen art. En nylig innsendt artikkel foreslår navnet Francisella noatunensis (Mikalsen & Colquhoun, submitted) og dette navnet vil bli brukt her selv om 26

dette navnet ikke er formelt akseptert. Den andre varianten er isolert fra tilapia i Costa Rica og tree linded grunt fra Japan men er ikke formelt navngitt enda. Navn som Francisella asiatica og Francisella orientalis har blitt benyttet i uformelle medier men begge navnene refererer til samme bakterie. I denne teksten vil F. asiatica bli benyttet for og navn gi denne varianten. Videre er det påvist Francisella i atlantisk laks fra Chile 3, men denne varianten er nært beslektet med den norske torskevarianten, F. noatunensis, og tilhører samme bakteriefamilie, selv om det er mindre genetiske forskjeller mellom disse variantene. I denne rapporten vil hovedfokus være på hva som er gjort med de kjente fiskepatogene stammene, men viktigheten av karakteriseringsarbeidet blir illustrert av biologien som gjelder alle medlemmene i denne gruppen. Figur1: Maximum likelihood tree av 16S rrna data generert i PAUP* Version 4.0b10 Bootstrap verdier >78 % og Genbank accession numbers er vist. Figuren er hentet fra ph.d. arbeidet til Jarle Mikalsen. Fiskepatogene Francisella ssp. skiller seg fra F. philomiragia ved å trenge tilsetning av aminosyren cystein til agaren for vekst, de har ett lavere veksttemperatur område samt sakte vekst. Videre er de fiskepatogene Francisella ssp. lite biokjemisk reaktive, ett trekk som de deler med medlemmene i F. tularensis gruppen og den fiskepatogene bakterien Piscirickettsia salmonis 9 (tabell 1). Krav til cystein i mediet for vekst utelukker en del vanlige biokjemiske tester og enzymatiske kit (f. eks APIZYM) benyttes i den fenotypiske karateriseringen av disse fiskepatogene bakteriene. Ett fastidious levesett på disse bakteriene gir få biokjemiske markører som kan benyttes til karakterisering og smittesporing og derfor har disse bakteriene i all hovedsak blitt undersøkt med molekylære metoder. 27

(Tabell hentet fra fiskehelsebladet utgave 1, 2008, dyrkning av Piscirickettsia salmonis og Francisella philomiragia subsp. noatunensis av Jarle Mikalsen.) Fiskepatogene Francisella har blitt undersøkt med sekvensering av en rekke forskjellige housekeeping gener. Disse genene har en større mutasjonsrate enn 16s rrna genet, men lavere forandringsrate enn andre genetiske elementer som finnes hos bakterier. I dagens mikrobiologi har bruken av flere housekeeping i kombinasjon (kjent under forkortelsen MLSA/T) utviklet seg til en gullstandard for epidemiologisk typing og karakterisering av bakterielle sykdommer. I det utførte karakteriseringsarbeidet ved Veterinærinstituttet og UiB ligger det tilstrekkelig med housekeeping gener tilgjengelig for å sette sammen en slik typingsregime. Disse to miljøene er verdenslendene for molekylær karakterisering av de fiskepatogene Francisella artene, men ett MLSA/T typning system krever ekstra resurser i forhold til vanlig diagnostikk. De undersøkelsene som er gjort med denne teknologien i dag viser at det er ingen variasjon mellom de isolatene som stammer fra tidlige i Francisella utbrudd i Norge noe som underbygger teorien om en felles smitteopphav for disse sykdomstilfellene. Stor grad av likhet observeres også mellom isolater av F. asiatica som er isolert fra forskjellige områder på hver sin side av Stillehavet. En forklaring på dette kan være 28

at bakterien har blitt flyttet med tilapia, eller fiskeegg, som ikke finnes naturlig i sentral Amerika, men det er kun spekulasjon på nå værende tidspunkt. Det karakteriseringsarbeidet som har vært gjennomført i løpet av de fire siste årene har hatt stor betydning for utvikling av diagnostiske metoder for påvisning av Francisellose. Ett typisk eksempel på dette er de forskjellig PCR metodene som benyttes i screening og diagnostikk av sykdommen 13. Disse metodene baserer seg på den kunnskapen vi fått fra å studere oppdrettsanlegg. I dag er det få villfisk og miljø isolater tilgjengelig for forskning og det vites lite om diversitet, overlevelse og prevalens blant marine Francisella isolater i naturen. Dette er en svakhet i vår forståelse av hvordan sykdommen opptrer i naturen. Fremtidig forskning trenger ett større antall isolater for å kunne si mer sikkert om slektskapet mellom de ulike sykdomstilfellene. I fra F. tularensis gruppen er det kjent at MLSA/T har en lavere separasjonskapasitet i utbruddsammenheng enn metoder som ser på andre genetiske markører i bakterier. Andre genetiske metoder som vil øke forståelsen av biologien til marin Francisella er PFGE og VNTR, metoder som er under utvikling ved Veterinærinsituttet og UiB. Disse metodene er viktige for å kunne undersøke slektskapet mellom isolater fra ulike sykdomslokaliteter og dermed øke kunnskapen om smittespreding, samt smitterisikoen mellom anlegg. Disse metodene vil utfylle kunnskapen som kommer gjennom den pågående sekvenseringen av hele genomet til disse fiskepatogene bakteriene. Den molekylære karakterisering av Francisellose har kommet langt, men er på ingen måte ferdig stilt. Den kunnskapen som er har blitt gjort tilgjengelig har ett stort potensial for bruk i smittesporing i oppdrettsnæringen, dog en vesentlig mangel på vår kunnskap er at ingen innsamling av data fra oppdretterne er gjort. Epidemiologisk data vil kunne være med å identifisere risiko faktorer for spredning og dokumentere eventuell effekt av tiltak som blir satt inn mot sykdommen. Noe som vil gi bedre råd til næringen over tid. REFERANSER: 1. 2008. List of new names and new combinations previously effectively, but not validly, published - Validation list no. 119 (vol 58, pg 1, 2008). International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 58:1. 2. Barns, S. M., C. C. Grow, R. T. Okinaka, P. Keim, and C. R. Kuske. 2005. Detection of diverse new Francisella-like bacteria in environmental samples. Appl. Environ. Microbiol. 71:5494-5500. 3. Birkbeck, T. H., M. Bordevik, M. K. Froystad, and A. Baklien. 2007. Identification of Francisella sp. from Atlantic salmon, Salmo salar L., in Chile. J. Fish Dis. 30:505-507. 4. Hollis, D. G., R. E. Weaver, A. G. Steigerwalt, J. D. Wenger, C. W. Moss, and D. J. Brenner. 1989. Francisella philomiragia comb. nov. (formerly Yersinia philomiragia) and Francisella tularensis biogroup novicida (formerly Francisella novicida) associated with human disease. J. Clin. Microbiol. 27:1601-1608. 5. Hsieh, C. Y., M. C. Tung, C. Tu, C. D. Chang, and S. S. Tsai. 2006. Enzootics of visceral granulomas associated with Francisella-like organism infection in tilapia (Oreochromis spp.). Aquaculture 254:129-138. 6. Kugeler, K. J., P. S. Mead, K. L. McGowan, J. M. Burnham, M. D. Hogarty, E. Ruchelli, K. Pollard, B. Husband, C. Conley, T. Rivera, T. Kelisidis, W. M. Lee, W. Mabey, J. M. Winchell, H. L. Stang, J. E. Staples, L. J. Chalcraft, and J. M. Petersen. 29

2008. Isolation and characterization of a novel Francisella sp. from human CSF and blood. J. Clin. Microbiol. 7. Mailman, T. L. and M. H. Schmidt. 2005. Francisella philomiragia adenitis and pulmonary nodules in a child with chronic granulomatous disease. Can. J. Infect. Dis. Med. Microbiol. 16:245-248. 8. Mikalsen, J., A. B. Olsen, T. Tengs, and D. J. Colquhoun. 2007. Francisella philomiragia subsp. noatunensis subsp. nov., isolated from farmed Atlantic cod (Gadus morhua L.). Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 57:1960-1965. 9. Mikalsen, J., O. Skjaervik, J. Wiik-Nielsen, M. A. Wasmuth, and D. J. Colquhoun. 2007. Agar culture of Piscirickettsia salmonis, a serious pathogen of farmed salmonid and marine fish. FEMS Microbiol. Lett. 278:43-47. 10. Nylund, A., K. F. Ottem, K. Watanabe, E. Karlsbakk, and B. Krossoy. 2006. Francisella sp. (Family Francisellaceae) causing mortality in Norwegian cod (Gadus morhua) farming. Arch. Microbiol. 185:383-392. 11. Olsen, A. B., J. Mikalsen, M. Rode, A. Alfjorden, E. Hoel, K. Straum-Lie, R. Haldorsen, and D. J. Colquhoun. 2006. A novel systemic granulomatous inflammatory disease in farmed Atlantic cod, Gadus morhua L., associated with a bacterium belonging to the genus Francisella. J. Fish. Dis. 29:307-311. 12. Olsufèv, N. G. Tularaemia. 1-12. 15-5-1970. World Health Organization. Ref Type: Report 13. Ottem, K. F., A. Nylund, T. E. Isaksen, E. Karlsbakk, and O. Bergh. 2008. Occurrence of Francisella piscicida in farmed and wild Atlantic cod, Gadus morhua L., in Norway. J. Fish Dis. 14. Ottem, K. F., A. Nylund, E. Karlsbakk, A. Friis-Moller, and B. Krossoy. 2007. Characterization of Francisella sp., GM2212, the first Francisella isolate from marine fish, Atlantic cod (Gadus morhua). Arch. Microbiol. 187:343-350. 15. Ottem, K. F., A. Nylund, E. Karlsbakk, A. Friis-Moller, B. Krossoy, and D. Knappskog. 2007. New species in the genus Francisella (Gammaproteobacteria; Francisellaceae); Francisella piscicida sp. nov. isolated from cod (Gadus morhua). Arch. Microbiol. 188:547-550. 16. Sjøsted, A. 2005. Genus I. Francisella Dorofe'ev 1947, 176 al. Bergeys Manual of Systematic Bacteriology. The Proteobacteria, Vol. 2:200-210. 30

12. Behandlingsregimer. Francisella status rapport 2009 Ole Samuelsen, Havforskningsinstutttet i Bergen For å kunne gi en vurdering av behandlingseffektiviteten av antibakterielle midler mot en sykdom er det en del grunnleggende opplysninger som må være på plass. Sensitiviteten til francisella overfor ulike antibakterielle midler samt farmakokinetiske data til de ulike antibakterielle midlene i torsk må kartlegges. STATUS Sensitivitet. Det er gjort en undersøkelse der sensitiviteten til francisella er testet overfor ulike antibakterielle midler. Det ble brukt lapper som inneholder en bestemt konsentrasjon av et legemiddel som legges på en agar skål der bakterien vokser. Dersom det dannes en inhiberingssone rundt lappen er bakterien sensitiv. Denne testen er noe grov og preliminær men skiller mellom legemidler med potensiell effekt og der bakterien er resistent. Resultatene er vist i tabell 1 og 2 og data er fremskaffet av Karl Fredrik Ottem (Universitetet i Bergen) Tabell 1 Antibiotics Abbreviation Amount on disc ( g) Zone of inhibition (mm) Sulfonamides: Trimethoprim-sulfamethoxazole SXT 23.75-1.25 1 Penicillins: Penicillin P 10 1 Ampicillin AM 10 1 Piperacillin-tazobactam * P-T 75-10 10-15 Cephalosporins: Cefuroxime CXM 30 1 Ceftazidime CAZ 30 10-14 Tetracyclines: Tetracycline T 13 15-20 Aminoglycocides: Gentamicin G 10 20-25 Macrolides: Erythromycin E 15 3 Fluoroquionolones: Ciprofloxacin CIP 5 20-25 31

Tabell 2 Francisella sp. Antibiotic GM2212 T Ceftazidime CAZ-30 + Cefuroxime CXM-30 - Ciprofloxacin CIP-5 + Doxycycline D-30 + Erythromycin E-15 - Gentamicin GM-10 + Imipenem IMP-10 - Kanamycin K-30 + Penicilin P-10 - Piperacillin PIP-30 - Sulfametoxazole/Trimethoprim SXT 23.75/1.25 - Tetracyclin TE-30 + Oxolinic acid OA-2 + Oxytetracyclin T-30 + Fluorfenicol FFC-30 + Fra Tabell 1 og 2 kan en se at det er flere antibakterielle midler som har potensial til å gi en vellykket behandling. Noen av disse er viktige medikamenter i human medisin så i praksis er det tetracyklinene, oksolinsyre, florfenikol og muligens ciprofloxacin som er aktuelle å bruke i behandlingen av francisella. Farmakokinetikk. Farmakokinetiske undersøkelser er gjennomført for de antibakterielle midlene oksolinsyre, flumekvin, florfenikol og Romet (ormetoprim og sulfadimetoxine) i torsk (Samuelsen et al 2003a,b, 2006a,b). Resultatene viser at alle medikamentene oppnår en tilfredstillende konsentrasjon av medikamentet i plasma og vev etter en oral administrasjon av legemidlet og vil derfor ha potensial for å gi en god effekt. Behandlingseffektivitet. Det er indikasjoner på at en standard oral behandling med oksolinsyre ikke hadde noen effekt (Are Nylund, pers komm). VIDERE ARBEID: MIC-bestemmelser Det er viktig at det gjøres MIC (Minimum Inhibitory Concentration) undersøkelser for en mer detaljert kartlegging av sensitiviteten til francisella bakterien overfor de mest aktuelle antibakterielle midler som flumekvin, ciprofloxacin, florfenikol og tetracyklinene. Farmakokinetikk Farmakokinetiske data for oksytetracyklin, ciprofloxacin og florfenikol administrert intraperitonealt og oksytetracyklin og ciprofloxacin ved oral administrasjon bør fremskaffes. Behandlingseffektivitet Teste ulike medikamenter og behandlingsregimer i laboratorium og felt. 32

REFERANSER: 1. O. B Samuelsen, Ø Bergh and A. Ervik. 2003 A single-dose pharmacokinetic study of oxolinic acid and vetoquinol, an oxolinic acid ester, in cod (Gadus morhua L.) held in seawater at 8 C and in vitro antibacterial activity of oxolinic acid against some Vibrio sp isolated from diseased cod. Journal of Fish Diseases, 26, 339-347. 2. O. B. Samuelsen, Ø. Bergh and A. Ervik. 2003 A single-dose pharmacokinetic study of florfenicol in cod (Gadus morhua L.) held in seawater at 8 C and in vitro antibacterial activity against some Vibrio anguillarum strains isolated from diseased cod. Diseases of Aquatic Organisms, 56, 127-133. 3. O. B. Samuelsen, 2006 Absorption, tissue distribution, metabolism and excretion of ormethoprim and sulphadimethoxine in cod (Gadus morhua) after oral administration of Romet. Journal of Applied Ichtyology, 22, 68-71. 4. O. B. Samuelsen, 2006 Multiple dose pharmacokinetic study of oxolinic acid in cod, Gadus morhua L. Aquaculture International, 14: 443-450. 13. Mulige farer forbindet med spising av Francisella fiskepatogener? Duncan J. Colquhoun, Veterinærinstituttet Mikroorganismer er som regel plassert i en av fire biosafety kategorier når de studeres eller jobbes med i laboratorier. Disse fire katogerier dekker organismer som antas å presentere ingen eller svært lavt risiko for mennesker (biosafety nivå 1) til organismer som utgjør en svært høy risiko for mennesker (biosafety nivå 4). Bakterier er plassert innen dette system etter en skjønnsmessige riskovurdering som inkluderer patogenese av agenten for mennesker, infeksjonsrute, stabilitet osv. Det finnes ingen klar entydige regler for plassering av bakterier innenfor dette systemet. Ifølgende Granum og Kapperud (1996) kan næringsmiddelbårne sykdommer årsaket av bakterier skilles i to typer dvs. inntoksikasjoner og infeksjoner som kan videre skilles i fem hovedgrupper basert på patogentitetsmekanismene og graden av interaksjonen med verten. Disse grupperinger er som følgende: Gruppe 1: bakterier som produserer toksiner under vekst i matvarer. Gruppe 2: bakterier som produserer enterotoksiner under vekst eller sporulering i tarm hulen uten kolonisering av verten. Gruppe 3: bakterier som produserer enterotoksiner etter adheranse og kolonisering av tarmen. Gruppe 4: Invasive bakterier som begrenser kolonisering til tarmen og tilhørende lymfatiske vev. Gruppe 5: Invasive bakterier som vanligvis spres via blodet og årsaker systemiske infeksjoner. 33

Francisella spp. er stort sett tilpasset en intracellulært vekstmiljø og krever tilgang til visse næringsstoffer, som gjør at de vokser dårlig utenfor vertscellene. Ingen Francisella spp. er så langt forbundet med sykdommer karakterisert som grupper 1, 2, 3 eller 4. Derfor finnes det ingen beviser eller mistanke om at fiskepatogen Francisella utgjøre noen form for trussel i forbindelse med slike sykdommer. Etter den opprinelige identifisering av torskepatogen Francisella (philomiragia subsp. noatunensis a.k.a. F. piscicida) ble den mistenkeliggjort som en gruppe 5 patogen pga. nært slektskap til den opportunistisk menneskepatogen F. philomriagia, og ett noe mer fjern slektskap til den alvorlige menneskepatogen F. tularensis. Denne uroen ble forholdsvis fort lagt død etter nærmere studie av bakterien. Grunnene til at de kjente fiskepatogene artene av Francisella (som inkluder F. philomiragia subsp.noatunensis/f. piscicida og den tilapia patogen F. asiatica/orientalis ) er ikke vurdert å utgi noen reelle fare for mennesker er som følgende: Bakteriene vokser best ved 22-25 o C og har en øvre veksttemperatur i laboratoriemedier ved ca 30 o C (F. philomiragia subsp. noatunensis vokser veldige dårlige, hvis i det hele tatt, på dette temperatur, mens F. asiatica har en øverst vekst temperatur av rundt 30 o C). Denne øvre veksttemperaturen ligger godt under kroppstemperaturen hos varmblodige dyr. Francisella bakterier som er patogene for varmblodige dyr er kjent til å ha en forholdsvis lavt infeksiøs dose. Ved Veterinærinstituttet har det blitt utført ett kontrollert laboratoriesmitteforsøk i mus med Francisella isolert fra både torsk og tilapia. I disse eksperimentene ble mus inokulert intraperitonealt med forholdsvis store mengder av levende bakterier. Disse mus ble observert i en måned etter inokulering uten at de viste noen tegn til sykdom. Patologisk og bakteriologisk undersøkelse etter en måned viste ingen tegn til patologi eller bakteriekolonisering. Det kan alltid argumenteres at vekst på laboratoriemedier og evnen til å smitte mus er ikke presis målestokk i forhold til en bakteries evne til å gi sykdom i mennesker, siden det er teoretisk mulige at en patogenbakterie kunne vokse på høyere temperaturer gitt viss forutsetninger, for eksempel tilgang til spesielle næringsstoffer osv, og at mus er ikke en egnet art. Derfor.den sterkest indikator av ufarlighet er da historisk epidemiologisk data. I vårt laboratorie har vi nylige bekreftet (Zerihun et al., manus under foreberedelse) at en sykdom som har affisert villtorsk i høyprevalens, i den sydlige del av Nordsjøen, og kjent da som mycobacteriose var faktisk forårsaket av Francisella. Dette viser at infeksjonen har eksistert i villtorsk over lengre tid og infisert fisk har mest sannsynligvis blitt spist i store mengder. I den perioden har ingen infeksjoner eller sykdom blitt rapportert i forbindelse med spising av infisert torsk. Enda sterkere epidemiologisk bevis for at fiskepatogen Francisella ikke utgjør en zoonotisk trussel representeres av den tilapia patogen variant. Tilapia har som kjent skarpe piggfinner og hudskader forårsaket av disse piggene er veldige vanlige blant folk som håndterer dem. Andre bakterieinfeksjoner forårsaket av f.eks Streptococcus inaie er kjent å smitte over fra tilapia til menneske via håndterings sårer. Slike infeksjoner er ikke rapportert med Francisella. I 34

tillegg har Francisella infisert tilapia mest sannsynligvis blitt spist i mange år uten at sykdom er rapportert. Det er sannsynlig at ingen enkelte gen (innen slekten Francisella) er ansvarlige for at en bakterie kan eller kan ikke forårsake sykdom i mennesket. At de fiskepatogen og menneskepatogen arter har en felles forgjenger er det ingen tvil om, men det har antagelige gått lange tid siden de skilte lag. Siden har de spesialisert seg for forskjellige nisjer. Snart vil hele genomsekvenser for en rekke fiskepatogene Francisella fra være tilgjengelige (VI, UiB). Ved sammenligning av disse sekvensene med sekvenser fra andre patogene bakterier bør vi kunne snart si mer om hvorfor disse bakteriene ikke utgjør en zoonotisk trussel. REFERANSER: 1. Birkbeck H., Bordevik M., Frøystad M.K. and Baklien Å. (2007) Identification of Francisella sp. From Atlantic salmon, salmo salar., in Chile. Journal of Fish Diseases. 30: 505-507. 2. Mikalsen J, Olsen A.B., Rudra H., Moldal T., Lund H., Djønne B.,Bergh Ø., and Colquhoun D.J. (In press) Virulence and pathogenicity of Francisella philomiragia subsp. noatunensis for Atlantic cod (Gadus morhua) and laboratory mice. Journal of Fish Diseases. 3. Nylund A., Ottem K.F., Watanabe K., Karlsbakk E. and Krossøy B. (2006) Francisella sp. (Family Francisellaceae) causing mortality in Norwegian cod (Gadus morhua) farming. Archives in Microbiology. 185: 383-392. 4. Næringsmiddelbårne infeksjoner og intoksikasjoner: en introduksjon (1996) In: P.E. Granum, Editor, Smittsomme Skydommer fra mat. Næringsmiddelbårne Infeksjoner og Intoksikasjoner, Høyskoleforlaget, Kristiansand S (1996), pp. 69 81 5. Ottem K.F., Nylund A., Isaksen T.E., Karlsbakk E. and Bergh Ø. (2008). Occurrence of Francisella piscicida in farmed and wild Atlantic cod, Gadus morhua L., in Norway. Journal of Fish Diseases. 31(7): 525-534. 14. Oppdretternes erfaringer Grethe Adoff, Norsk Sjømatsenter Produksjons strategier: Det var i 2008 15 torskeyngelanlegg i Norge som produserte ca 15 mill yngel til utsett (Fig.1) Hovedtyngden av yngel produksjonen er i Sør Norge, mens matfiskproduksjonen har beveget seg stadig mer nordover (Fig 3). Yngelen selges fra yngelanleggene ca 3 5 gram. Denne størrelsen er uegnet til utsett i sjøen og det er derfor oppstått et behov for en settefiskfase hvor yngelen fores opp til 50 100 gram og er klar til utsett i sjøen. Fisk transporters fra yngelanlegget til settefiskanlegg hovedsakelig i landbaserte anlegg. Det er varierende praksis med hensyn på å holde produksjonsgrupper fra hverandre og det er eksempler på hvor fisk fra 35

flere yngelanlegg blandes i ett settefiskanlegg. Dette har medført transport stor spredning av yngelen og vanskelig å spore fisk tilbake til klekkeri og stamfisk. Fisk som ble slaktet i 2008 / 2009 ble satt ut i sjøen i 2006 og 2007. Fig 2 viser at matfisk produksjonen har hovedvekt i Sogn og Fjordane / Møre og Romsdal som også har flest tilfeller av utbrudd av francisellose. En del av denne fisken er vanskelig å spore tilbake til settefisk og yngelanlegg og kan være årsak til ukjente smittekilder av sykdom. Fig.1 Torskeyngelproduksjon 2008 5 anlegg Ca 1 mill 4 anlegg Ca 5 mill Troms Marin Yngel AS Cod farmers Vikholmen Nordland Marin Yngel (NMY) Lofilab AS Bremar Yngel Profunda AS Havlandet Marin Yngel AS Atlantic Cod Farming 6 anlegg Ca 9 mill Raunes Fiskefarm Grieg Cod Farming Sagafjord Sea Farm Havforskningsinstituttet Marine Harvest Cod Tunsbergpollen Rognprodusentene har varierende rutiner dår det gjelder screening av stamfisken som brukes i avl. Økt fokus på francisellose har medført at en større andel av stamfisk som brukes i rognproduksjonen testes for Francisella og andre sykdommer og smitterisikoen er derfor mindre. Dagens regelverk når det gjelder francisellose tilsier at fisk som skal flyttes må være frisk, og dersom det er mistanke om sykdom skal den ikke tas ut av anlegget. Enkelte anlegg praktiserer obduksjon av død stamfisk, men ikke screening av fisk som tas inn i anlegget som stamfisk / stamfiskrekrutter. Det brukes både villfisk og oppdrettsfisk som stamfisk. Anleggene selv utøver den sykdomskontrollen av stamfisken som kreves ved oppfølging av tilsynsveterinær, men ikke nødvendigvis screening av stamfisk på individnivå. Oppdrettsfisk som brukes kommer enten fra avlsstasjonene eller fra egen produksjon og har en kjent sykdomshistorikk. 36

Produksjonsstrategier fra yngel til matfisk. Uheldig med blanding av fisk fra flere produsenter Yngekanlegg 1 Yngekanlegg 2 Yngekanlegg 3 Yngekanlegg 4 Settefisk 1 Settefisk 2 Settefisk 3 Matfisk 1 Matfisk 2 Matfisk 3 Matfisk 4 Matfisk 5 Matfisk 6 Matfisk 7 De fleste yngelanleggene kjøper rogn eksternt i perioder. Selv om de har egen stamfisk er det perioder hvor de ikke er selvforsynt med rogn. Francisella kan overføres vertikalt selv om det ikke er dokumentert hvordan det skjer. Fig 2 (Jarle Mikalsen). Utbrudd av francisellose Fig 3. Matfiskproduksjon torsk Oppdrettere melder om at utbrudd har startet ved stigende temperatur i juni juli og utbruddet har vart utover høsten. Flere har meldt om utbrudd som har startet etter andre året i sjøen hos fisk som er 1 kg og større. I et tilfelle ble det tatt ut fisk til stamfisk og screenet for Francisella uten at det kunne påvises noe. Samme gruppe fikk utbrudd 4 måneder senere med påfølgende stor dødelighet. Det har ikke vært dokumentert hvor smitten kom fra, men opprinnelsen til settefisken er noe usikker. Det meldes om utbrudd i en av merdene i et anlegg, gjerne over lengre tid (uker) før fisken smitter til andre deler av anlegget. Hvis anlegget er plassert slik at strømretningen går gjennom anlegget vil det være vanskelig å unngå å smitte hele anlegget. Utbrudd har vært meldt i flere anlegg i samme region omtrent samtidig i perioder med sterk temperaturøkning. 37

Oppdretters teorier og utsagn om smitteveier: Horisontal smitte gjennom anlegget. Begynner i en del først og sprer seg til hele anlegget over tid. Utbrudd oppdaget på samme tidspunkt som anlegg i nærheten tyder på felles smittekilde Sykdommen påvist ved obduksjon av fisk uten ytre sykdomstegn Smitten kommer fra villfisk eller rømt oppdrettsfisk i området Bruk av liftup til å samle opp dødfisk i merdene bidrar til å bre smitten med bakterieinfiskert vann. Ulike dødelighets mønster i hver av merdene. Utbruddene er av varierende grad i hver enkelt merd Dårlig fôropptatk i merder med syk fisk Mulighet for at fôrbåter, ensilasjebåter og brønnbåter kan være smittespredere. Fisk som får påvist Francisella blir slaktet så snart som mulig etter oppnådd slaktestørrelse ( 2 kg +). Problemet er fisk under 1 kg og som trenger en sommer og høst i sjøen før den kan slaktes. Fisk som har påvist Francisella har ikke større nedklassering på slakteriet enn ved ordinær slakt. Det er i enkelte tilfeller er fisk nedklassert på grunn av lesjoner i muskulaturen ved langvarig utbrudd. Destruering av fisk har store økonomiske konsekvenser for torskeoppdrettere. Dersom det er nødvendig at fisk som får påvist Francisella blir destruert vil det være behov for å diskutere tilskudds ordninger som gjør at oppdretterne kan gjennomføre slike tiltak. 15. Erfaringer med francisellose i Nordland Av veterinær Karianne Jakobsen, Labora Analyselaboratorium og Fiskehelsetjeneste AS Torskeoppdrett har vært under stor utvikling i Nordland de siste 5 årene. Tall fra Fiskeridirektoratet Francisella sp. detected in farmed 2006 viser en økning i antall torsk fish in Nordland 2007 utsatt i sjø i Nordland fra 465 2007 000 i 2002 til 6,5 millioner i 2007. På grunn av mangel på 2009 yngelleverandører i Nord- Norge, har de fleste matfiskoppdrettere kjøpt og Kartet viser påvisningen av hentet torskeyngel fra francisellose i produsenter på sørvest og Nordland. Vestlandet. Til tross for dette har det til nå vært få utbrudd av francisellose i nordnorske oppdrettsanlegg. Med bakgrunn i de hyppige utbruddene av francisellose i oppdrettanlegg i Sør-Norge, er de få 38