Duy Khanh Huynh. Masteroppgave ved Farmasøytisk Institutt, Det Matematisk-naturvitenskapelige Fakultet UNIVERSITETET I OSLO

Utvikling av analysemetode for måling av 4 -hydroksykolesterol og undersøkelse av 4 -hydroksykolesterol som biomarkør for CYP3A4-fenotype i kliniske materialer Duy Khanh Huynh Masteroppgave ved Farmasøytisk Institutt, Det Matematisk-naturvitenskapelige Fakultet UNIVERSITETET I OSLO November 2014

Utvikling av analysemetode for måling av 4 -hydroksykolesterol og undersøkelse av 4 -hydroksykolesterol som biomarkør for CYP3A4-fenotype i kliniske materialer Masteroppgave i farmakologi for graden Master i farmasi ved Avdeling for farmasøytisk biovitenskap, Farmasøytisk institutt, Det matematiske-naturvitenskapelige fakultet, Universitetet i Oslo Oppgaven ble utført ved Senter for Psykofarmakologi Diakonhjemmet sykehus, Oslo Veileder: Dr. scient. Espen Molden, Senter for Psykofarmakologi, Diakonhjemmet sykehus Avdeling for farmasøytisk biovitenskap, Farmasøytisk institutt, Universitetet i Oslo Duy Khanh Huynh 2014 II

Duy Khanh Huynh 2014 Utvikling av analysemetode for måling av 4β-hydroksykolesterol og undersøkelse av 4βhydroksykolesterol som biomarkør for CYP3A4-fenotype i kliniske materialer Duy Khanh Huynh http://www.duo.uio.no/ Trykk: Reprosentralen, Universitetet i Oslo III

Forkortelser 4β-HK - 4β-Hydroksykolesterol C/D-ratio Dosejustert serumkonsentrasjon SFP Senter for Psykofarmakologi CYP Cytokrom P450 TDM Terapeutisk legemiddelmonitorering GC Gass chromatography LC Liquid chromatography UPLC Ultra performance liquid chromatography APCI Atmospheric pressure chemical ionization APPI Atmospheric pressure photoionization ESI Electrospray ionization KMI - Kroppsmasseindeks IV

Sammendrag Bakgrunn: 4β-Hydroksykolesterol (4β-HK) er en lovende kandidat som endogen fenotypmarkør for CYP3A4, som er involvert i metabolismen av omtrent 50 % av alle legemidler. Hensikten med dette masterprosjektet var å utvikle en analysemetode for måling av 4β-HK, og undersøke i hvilken grad serumkonsentrasjon av 4β-HK korrelerte med i) CYP3A4-uttrykk i tarm- og leverbiopsier fra overvektige pasienter, og ii) serumkonsentrasjon av CYP3A4-substratet quetiapin i psykiatriske pasienter. Det ble også foretatt en sammenligning av 4β-HK -nivåer mellom pasienter behandlet med CYP3A4-induseren karbamazepin og levetiracetam, et antiepileptikum uten enzyminduserende egenskaper. Metode: En UPLC-APCI-MS/MS metode ble utviklet for analyse av 4β-HK i ekstraherte serumprøver. 4β-HK-d 7 ble benyttet som intern standard og prøveopparbeidelsen var basert på væske/væske-ekstraksjon (heksan/vann [2:1-forhold]). Metodens presisjon og nøyaktighet ble validert i tråd med gjeldende retningslinjer. Serumkonsentrasjon av 4β-HK ble kvantifisert i pasientprøver og korrelasjon mellom 4β-HK og i) CYP3A4-uttrykk i vevsbiopsier, og ii) dosejustert konsentrasjon (C/D-ratio) av quetiapin, ble undersøkt. Serumkonsentrasjon av 4β- HK hos karbamazepin- og levetiracetambehandlede pasienter ble evaluert ved «Mann- Whitney»-test. Resultater: Kalibreringskurven for måling av 4β-HK i serum viste god lineæritet mellom 25 og 1600 nm (r 2 >0,99). Intra- og interdag nøyaktighet og presisjon for metoden var <15 % ved 25 nm og <5 % ved 1600 nm. En signifikant, positiv korrelasjon ble observert mellom 4β-HK og totalt CYP3A4-uttrykk i tarm + lever hos overvektige pasienter (p = 0,042, r = 0,270). Videre ble det observert en signifikant korrelasjon mellom 4β-HK og C/D-ratio av quetiapin både ved univariat «Spearman» korrelasjon (p < 0,01) og multippel lineær regresjon (p= 0,025). Median serumkonsentrasjon av 4β-HK var signifikant høyere hos karbamazepinenn hos levetiracetambehandlede pasienter (653 vs. 64 nm, p<0.0001). Konklusjon: Den utviklede analysemetoden er godt egnet for måling av 4β-HK i humant serum. Analyser av aktuelle pasientprøver utført i denne oppgaven viser at 4β-HK har et stort potensial som endogen biomarkør for CYP3A4-fenotype. V

Forord Jeg vil først og fremst takke min veileder, Espen Molden, for god veiledning og nyttige innspill under hele arbeidet med oppgaven. En stor takk vil jeg også rette til Niclas Lunder, Undis Ellevog og Lene Kristin Støten for god hjelp og veiledning med analyseinstrumentene på Senter for Psykofarmakologi. Takk til alle ved Senter for Psykofarmakologi for en hyggelig tid En ekstra takk til Caroline Gjestad for godt samarbeid og gode innspill det siste året. Jeg vil også benytte anledningen til å takke venner og familie for god støtte og tålmodighet dere har vist gjennom hele studiet. 19. november 2014 Duy Khanh Huynh VI

Innholdsfortegnelse 1 Innledning... 1 1.1 Farmakologisk variasjon... 1 1.2 Farmakokinetisk variasjon... 1 1.2.1 Betydning av aldring... 2 1.2.2 Betydning av kjønn... 3 1.2.3 Betydning av overvekt og fedme... 4 1.2.4 Betydning av interaksjoner... 4 1.2.5 Betydning av genetisk polymorfisme... 5 1.3 Monitorereringsverktøy for individtilpasset behandling... 6 1.3.1 Terapeutisk legemiddelmonitorering(tdm)... 7 1.3.2 CYP-genotyping... 8 1.3.3 Potensielle CYP3A-biomarkører... 8 1.4 Hensikt... 11 2 Materiale og metoder... 12 2.1. Utvikling av analysemetode for måling av 4β-hydroksykolesterol... 12 2.2. Korrelasjon mellom CYP3A4-uttrykk og 4β-hydroksykolesterol... 15 2.3. Korrelasjon mellom dosejustert quetiapinkonsentrasjon og 4β-hydroksykolesterol... 16 2.4 Nivå av 4β-hydroksykolesterol hos karbamazepin- vs. levetiracetambehandlede pasienter... 17 2.5 Etikk og godkjenninger... 17 3 Resultater... 18 3.1. Validering av analysemetode for måling av 4β-hydroksykolesterol... 18 3.2. Korrelasjon mellom CYP3A4-uttrykk og 4β-hydroksykolesterol i overvektige pasienter... 19 3.3. Korrelasjon mellom serumkonsentrasjon av quetiapin og 4β-hydroksykolesterol... 21 3.4. 4β-Hydroksykolesterol-nivåer i pasienter behandlet med karbamazepin og levetiracetam... 25 4 Diskusjon... 26 4.1 Analysemetode for 4β-hydroksykolesterol... 26 4.2 4β-Hydroksykolesterol som biomarkør for CYP3A4... 28 Konklusjon... 31 Litteraturliste... 32 VII

1 Innledning 1.1 Farmakologisk variasjon Pasienter som får samme dose av et gitt legemiddel vil kunne respondere svært ulikt på behandlingen. Identisk legemiddelbehandling kan resultere i terapisvikt hos enkelte og uønskede effekter hos andre [1, 2]. Alvorlige bivirkninger av legemidler er opphavet til omtrent 6 % av alle sykehusinnleggelser [1, 2], og er estimert til å være en av de hyppigste årsakene til død i Amerika [3]. I tillegg er terapisvikt et vanlig problem, blant annet innen psykiatrien, hvor andelen av pasienter med terapisvikt av psykofarmakologisk behandling er mellom 30-50 % [4-6]. Det finnes en rekke faktorer som kan påvirke legemiddelets farmakologiske egenskaper og derved bidra til variabel klinisk respons. Kjønn, alder, vekt, livsstil, komorbiditet og interaksjoner med andre legemidler eller naturmidler er faktorer som i ulik grad kan bidra til farmakologisk variasjon [7]. I tillegg kan farmakogenetiske faktorer bidra til farmakokinetisk variasjon via endret metabolisme eller transport av legemidler, og farmakodynamisk variasjon via endret følsomhet i påvirkning av reseptorer eller andre målproteiner som legemidler utøver sin effekt på [8]. Generelt anses farmakokinetisk variasjon som den viktigste årsaken til individuelle forskjeller i klinisk respons, og i motsetning til farmakodynamisk variasjon, kan farmakokinetisk variasjon enkelt beskrives gjennom konsentrasjonsmålinger av legemiddelet. 1.2 Farmakokinetisk variasjon Farmakokinetikk omfatter prosesser som sammen med dose styrer eksponering/konsentrasjon av legemiddelet i kroppen. Variasjon i de farmakokinetiske prosesser, dvs. absorpsjon, distribusjon, metabolisme og ekskresjon, vil kunne påvirke legemiddelkonsentrasjonen og dermed evnen til å utøve effekt ved legemidlets aktuelle målområde. Dette kan også resultere i ulik bivirkningsrisiko ved en gitt legemiddeldose. Farmakokinetikken til et legemiddel kan bli påvirket av en rekke faktorer som alder, kjønn, vekt, interaksjoner med andre legemidler og genetisk polymorfisme i cytokrom P450 (CYP)- 1

enzymer [9]. I de påfølgende underavsnittene gis det en kortfattet oversikt over de ulike faktorene. 1.2.1 Betydning av aldring I følge Verdens Helseorganisasjons definisjon er "eldre" personer med alder >65 år. Selv om det er stor individuell variasjon i progresjon av fysiologiske aldringsprosesser hos ulike personer >65 år, er legemiddelbehandling av eldre generelt assosiert med flere utfordringer enn hos yngre personer. Økende alder gir økt forekomst av mange sykdommer, og eldre behandles i gjennomsnitt med to til fem legemidler samtidig [10]. Dette øker sjansen for ugunstige legemiddelinteraksjoner [2, 10], samtidig som fysiologiske aldringsprosesser i seg selv kan medføre endret legemiddelrespons, blant annet som følge av farmakokinetiske endringer hos eldre [10-13]. Farmakokinetiske endringer som følge av aldring kan omfatte endringer i metabolisme, distribusjon og ekskresjon (tabell 1) [12, 14, 15]. Tabell 1: Endringer i farmakokinetiske egenskaper ved aldring Farmakokinetiske egenskaper Absorpsjon Distribusjon Metabolisme Ekskresjon Betydning av aldring Upåvirket Økt distribusjonsvolum for lipofile legemidler, uendret for hydrofile legemidler. Redusert Redusert Nyre- og leverfunksjonen avtar generelt gradvis fra voksen alder, som resulterer i generelt lavere total clearance av legemidler hos eldre enn hos yngre. Nyren krymper ved økende alder, noe som reflekterer en reduksjon i antall nefroner [10-13, 16]. Redusert blodgjennomstrømning til nyrene ligger også i grunn for nedsatt renal clearance blant eldre [16]. 2

Reduksjon av leverstørrelse og blodgjennomstrømning til lever ved økende alder resulterer også ofte i en reduksjon i hepatisk clearance hos eldre [15, 16]. Aldring er assosiert med en nedgang i førstepassasje-metabolisme og dermed økt biotilgjengelighet av mange legemidler [16]. Dette kan medføre en forsterket effekt av legemidler, men også en økt risiko for alvorlige bivirkninger, hos eldre kontra yngre [10-13]. I tillegg til endret eliminasjonsevne hos eldre, kan endret kroppssammensetningen ved aldring påvirke legemiddeldistribusjonen og dermed fluktuasjonsgrad i plasma og halveringstid [10]. Total kroppsfett øker, mens total mengde kroppsvæske reduseres med økende alder [10]. Svært lipofile legemidler vil således ha et økt distribusjonsvolum, mens for mindre lipofile og hydrofile legemidler vil det motsatte forekomme [17]. Dette resulterer i at upolare legemidler, som gjelder mange substanser, får økt distribusjonsvolum og lengre halveringstid hos eldre [16]. 1.2.2 Betydning av kjønn Kjønn er også en faktor som kan ha en potensiell betydning for legemiddelrespons. Generelt sett har menn høyere kroppsvekt, lavere andel kroppsfett og høyere plasmavolum enn kvinner [18]. Konsekvensen av dette vil være endret distribusjonsvolum og halveringstid av et legemiddel. Menn har også ca. 10 % høyere renal filtrasjonshastighet, som betyr at samme dosering av legemidler som primært elimineres via renal filtrasjon, vil resultere i noe lavere serumkonsentrasjon hos menn enn hos kvinner [19]. Forskjeller i legemiddelmetabolisme mellom kvinner og menn regnes som hovedårsaken til kjønnsbetinget variasjon i farmakokinetikk [19, 20]. I flere studier er det blant annet blitt rapportert et høyere protein- og mrna-uttrykk av enzymet CYP3A4 i lever hos kvinner sammenlignet med menn [18, 20]. Dette medfører en høyere CYP3A4-aktivitet hos kvinner enn hos menn [21, 22], noe som kan resultere i lavere konsentrasjoner av aktuelle legemiddelsubstrater blant førstnevnte. Metabolisme via enzymene CYP1A2 og CYP2D6 er derimot vist å være raskere hos menn sammenlignet med kvinner [20, 23]. Ulik CYP-aktivitet mellom kjønn kan tenkes å variere på bakgrunn av variasjon i mengden av kjønnsbetingede steroidhormoner. 3

1.2.3 Betydning av overvekt og fedme Overvekt og fedme er definert som unormal eller overflødig fett akkumulert i kroppen i den grad at det kan forårsake helseskade [24]. Klassifisering av overvekt og fedme er basert på kroppsmasseindeks (KMI), der KMI 25 defineres som overvekt og 30 defineres som fedme [24]. Overvekt og fedme kan påvirke flere farmakokinetiske prosesser, inkludert eliminasjon og distribusjon[25, 26] Når det gjelder eliminasjon, så har det blant annet blitt vist av Brill et al. at glomulær filtrasjon og tubulær sekresjon er høyere hos personer som har diagnosen overvekt eller fedme [26]. Årsaken til en slik endring har vist seg å være på grunn av at størrelsen på nyren øker med økt kroppsvekt [25]. Overvekt og fedme har også blitt knyttet til endret legemiddelmetabolisme. En signifikant lavere clearance via enzymet CYP3A4 er rapportert hos overvektige, mens det motsatte ser ut til å være tilfelle for substrater som blir metabolisert via enzymene CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19 og CYP2D6 [26]. I en studie gjennomført av Ulvestad et al. ble det vist at høy KMI var assosiert med lavt CYP3A4-uttrykk både i lever og tarm hos 21 overvektige pasienter behandlet med atorvastatin [27]. Legemiddeldistribusjon kan også påvirkes ved overvekt i form av økt distribusjonsvolum for lipofile legemidler, mens for mindre lipofile og hydrofile legemidler vil være uendret [17]. Dette resulterer i at upolare legemidler, som gjelder mange substanser, får økt distribusjonsvolum og lengre halveringstid hos overvektige [16]. Halveringstiden kan imidlertid være uendret dersom clearance og distribusjonsvolum endrer seg tilsvarende, men med motsatt fortegn, ved overvekt. 1.2.4 Betydning av interaksjoner Legemiddelinteraksjoner er en av de viktigste årsakene til farmakologisk variabilitet. Utfallet av en legemiddelinteraksjon kan bli manglende terapeutisk effekt eller toksisitet, og i verstefall død [28]. Legemiddelinteraksjoner kan deles inn i farmakokinetiske og farmakodynamiske interaksjoner basert på underliggende interaksjonsmekanisme. 4

Farmakokinetiske interaksjoner innebærer en konsentrasjonsendring ved påvirkning av et legemiddels absorpsjon, distribusjon, metabolisme og/eller eliminasjon. Kunnskapsnivået for farmakokinetiske interaksjoner er høyere enn for farmakodynamiske interaksjoner på grunn av enklere påvisning og kvantifisering av farmakokinetiske interaksjoner (måling av legemiddelkonsentrasjonsendringer i plasma) [9, 28]. De vanligste mekanismene bak de farmakokinetiske interaksjonene er endret aktivitet av legemiddelmetaboliserende enzymer som følge av hemming eller induksjon. Mekanismer bak endret enzymaktivitet som følge av interaksjoner er reversibel eller irreversibel enzymhemming og enzyminduksjon. Interaksjoner forårsaket av hemmet enzymaktivitet inntrer raskt, mens de induserende effektene ikke merkes før noen dager til uker grunnet påvirkning av gentranskripsjon. Tilsvarende vil den induserende effekten også vare lengre enn den hemmede effekten etter seponering av induser eller hemmer [28]. 1.2.5 Betydning av genetisk polymorfisme Aktiviteten til metaboliserende enzymer har vist seg å kunne variere med en faktor på 10-20 ganger mellom ulike individer [29]. Variasjon i enzymaktivitet kan skyldes genetiske og/eller ikke-genetiske faktorer (miljøfaktorer) [29]. Enzymer tilhørende CYP-systemet er ansvarlige for omtrent 80 % av all fase 1 metabolisme av legemidler, og aktivitet til enkelte CYPenzymer har vist seg å være sterkt knyttet til genetikk [30]. Mens miljøfaktorer primært er årsaken til individuell variasjon i enzymaktivitet av CYP3A4 og CYP1A2, er fenotype av CYP2C9, CYP2C19 og CYP2D6 i stor grad genetisk bestemt (tabell 2) [29, 31, 32]. For sistnevnte enzymer er det vanlig å dele inn populasjonen i tre forskjellige fenotypekategorier basert på genotype; langsomme-, raske- og ultraraske omsettere, hvorav raske omsettere har det som defineres som normal metabolismekapasitet [32, 33]. Andelen av populasjonen som tilhører hver av de ulike gruppene varierer med etnisitet [20]. Blant annet er det en høy andel av langsomme CYP2D6-omsettere (eng. poor metabolizers, PMs) blant kaukasisk befolkning (5-10 %) [34], mens andelen av ultraraske omsettere (eng. ultrarapid metabolizers, UMs) er spesielt høy blant befolkningsgrupper i Nord-Afrika (28 %) [35]. 5

I motsetning til CYP2D6 der genotype er sterkt predikerende for fenotype, er det for CYP3A4 lite som tyder på at genetiske polymorfismer er av særlig betydning for den store individuelle variasjonen i enzymaktivitet [29, 31]. For CYP3A5, som har stor sekvenshomologi med CYP3A4, er imidlertid genotype sterkt bestemmende for fenotype (tabell 2) [29]. Det som er litt spesielt med CYP3A5, er at majoriteten i de fleste befolkninger har en genotype som gir fravær av enzymuttrykk (nærmere omtalt i avsnitt 1.3.3). Tabell 2: Oversikt over CYP-enzymer av stor betydning for legemiddelmetabolisme generelt. Eksempler på substrater/hemmere/indusere for det aktuelle enzymet er angitt sammen med betydning av genotype for det enkelte enzyms fenotype. Enzymer Substrat Induser Hemmer Genotype bestemmende for fenotype? CYP1A2 CYP3A4/5 CYP2C9 CYP2C19 CYP2D6 olanzapin fluvoksamin quetiapin buspiron fluoksetin valproat citalopram fenobarbital venlafaksin paroksetin rifampin tobakksrøyking karbamazepin fenobarbital karbamazepin fenobarbital karbamazepin rifampicin deksametason rifampin fluvoksamin ciprofloksasin ketokonazol erytromycin fluconazol amiodaron fluoksetin felbamat fluoksetin quinidin NEI NEI, (JA for CYP3A5) JA JA JA 1.3 Monitorereringsverktøy for individtilpasset behandling For å kunne håndtere farmakokinetisk variasjon er det behov for verktøy som kan benyttes i klinikken for å individtilpasse behandlingen. Innenfor noen terapiområder er blant annet terapeutisk legemiddelmonitorering (TDM) ansett som viktig verktøy for å optimalisere behandlingen og hindre terapisvikt eller toksisitet [7, 33]. I tillegg brukes CYP-genotyping i økende grad for å "skreddersy" valg av legemiddel og dose til den enkelte pasient. Potensielt kan måling av endogene CYP3A-biomarkører bli et framtidig monitoreringsverktøy for mange legemidler som ikke metaboliseres av de genetisk polymorfe CYP-enzymene. Avsnittene under gir en nærmere introduksjon til TDM, CYP-genotyping og potensielle CYP3A-biomarkører. 6

1.3.1 Terapeutisk legemiddelmonitorering(tdm) Serumkonsentrasjon av et legemiddel kan etter inntak av samme dose ofte variere med en faktor på mellom 10 20 ganger fra person til person. I ekstreme tilfeller har det blitt rapportert en faktor på 100 i forskjell i dosejustert serumkonsentrasjon mellom ulike personer [7, 33]. TDM er et viktig verktøy for å påvise denne variasjonen, og de vanligste kroppsvæskene (matriksene) å måle konsentrasjon i er plasma/serum, fullblod eller spytt. Legemiddelkonsentrasjonen kan benyttes for å individualisere behandlingen etter pasientens respons og tolerabilitet [36-38]. Legemiddelkonsentrasjonene i kroppsvæskene antas å være assosiert med legemiddelkonsentrasjonen på virkestedet. I mange tilfeller finnes det kjente referanseområder for de ulike legemidlene som angir en serumkonsentrasjonsverdi ved nedre og øvre grense for effekt hos gjennomsnittet [39]. Serumkonsentrasjon under nedre verdi vil i gjennomsnittet gi manglende effekt, mens over øvre verdi vil kunne føre til bivirkninger, toksisitet eller i verstefall død [39]. TDM er spesielt viktig for legemidler med smalt terapeutisk vindu (figur 1) for å hindre overnevnte episoder. Selv om det finnes referanseverdier, er det imidlertid viktig å huske at en pasient kan ha god effekt uten bivirkninger ved målinger utenfor referanseområdet. Figur 1: Terapeutisk vindu 7

TDM kan også brukes som et verktøy for å avdekke dårlig etterlevelse hos pasientene. Dårlig etterlevelse kan skyldes at pasienten selv avbryter behandlingen ved bivirkninger av legemidlene, glemmer å ta legemiddelet eller misforstår behandlingsregimet [39]. TDM er også viktig for dosejustering hos enkeltindivider for at de skal oppnå optimal effekt av behandlingen med minimal risiko for bivirkninger. Før TDM-analyser utføres er det viktig å være kjent med pasientens etterlevelse og eventuell komedikasjon som kan påvirke serumkonsentrasjonen til legemiddelet [36]. 1.3.2 CYP-genotyping CYP-systemet består av mer enn 50 isoenzymer, og er en fellesbetegnelse på en gruppe enzymer som kan omgjøre fettløselige stoffer til mer vannløselige metabolitter (aktive eller inaktive), slik at det lettere skilles ut via urin eller galle [29, 40]. Enzymene som regnes som de viktigste enzymene innen legemiddelmetabolisme er; CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6 og CYP3A. De nevnte enzymene er til en viss grad involvert i metabolisme av endogene stoffer, men metabolisme av legemidler og andre xenobiotika regnes som deres viktigste funksjon [29, 41]. CYP-enzymene er lokalisert intracellulært i endoplasmatisk retikulum i leverceller, men enkelte enzymer er også uttrykt i andre organer, som eksempelvis tynntarm og hjerne [42]. 1.3.3 Potensielle CYP3A-biomarkører CYP3A er predominant og utgjør størstedelen av CYP-innholdet i både lever og tynntarm med henholdsvis 30 % og 80 % av total CYP-mengde [43, 44]. CYP3A4 og CYP3A5 er de to hovedformene av CYP3A hos mennesker, og er involvert i metabolismen av omtrent 50 % av alle legemidler som er i bruk [45, 46]. Variasjonen i enzymaktivitet er stor for begge isoformene, mens genetisk polymorfisme er kun klinisk relevant hos CYP3A5. CYPA5*3 representerer den vanligste polymorfismen (allelvarianten) og fører til fravær av CYP3A5- aktivitet. CYP3A5-utrykk er kun funnet hos individer som er bærer av minst et CYP3A5*1 allel [47, 48]. Andelen CYP3A5 i lever er uklart, men er estimert til minst 10-20 % av den totale hepatisk CYP3A hos bærere av CYP3A5*1 [48-50]. CYP3A5*1er blitt funnet i 15 % av svenske, 33 % av koreanske og 74 % av tanzanianere [46]. 8

Selv om genetikk ikke anses som en sentral kilde til variasjon i CYP3A4-aktivitet, er mer enn 20 allelvarianter så langt blitt funnet i CYP3A4-genet [51]. Flesteparten av allelene fører til begrensede endringer i enzymaktivitet eller er veldig sjeldne, og resulterer i ubetydelig små variasjoner i CYP3A4-aktiviteten. Den hyppigste, men fortsatt sjeldne varianten, CYP3A4*1B, er blitt rapportert til å kunne påvirke legemiddelmetabolisme av simvastatin ved å gi økt serumkonsentrasjon [52]. Det er også blitt vist at serumkonsentrasjonen av takrolimus kan variere avhengig av tilstedeværelse av CYP3A4*1B [53, 54], men det er fortsatt uenigheter om serumkonsentrasjonen av legemidlene skyldes av CYP3A4*1B [53-56]. Allelvarianten som medfører redusert aktivitet av CYP3A4 er CYP3A4*22, og er funnet i 3-5 % av den kaukasiske befolkningen [57, 58]. Selv om de individuelle forskjellene i CYP3A4- fenotype er omfattende, er få assosiert med genetiske forskjeller. Genotyping er derfor et upassende verktøy for å identifisere raske eller langsomme nedbrytere av legemidler som hovedsakelig metaboliseres via CYP3A4. Ulike endogene biomarkører for CYP3A er derfor introdusert for å estimere CYP3A aktiviteten hos enkeltindivider [59]. Midazolam, et hypnotikum, er mye brukt som en eksogen biomarkør for CYP3A4 enzymaktiviteten [59]. Ulempen ved å benytte midazolam som markør er tillegeksponeringen av hypnotikumet til pasienten, noe som kan unngås ved bruk av endogene biomarkører. Flere studier har forsøkt å identifisere endogene biomarkører for CYP3A4-aktivitet in vivo [59-61]. Aktuelle kandidater har blitt målt i både urin og plasma, og tilnærmingen har stort sett vært å se på endringer i markørnivå før og etter behandling med rifampicin (CYP3A4- induser) og ketokonazol (CYP3A4-hemmer), samt korrelasjon med den eksogene markøren midazolam [59]. Av 12 potensielle biomarkører ble 4β-hydroksykolesterol vist å være den endogene biomarkøren med størst følsomhet ovenfor induksjon for CYP3A(4)-fenotyping i serum [46, 59]. I urin er det derimot vist at 6β-hydroksykortisol/kortisol-ratioen er den mest egnede [59]. En sammenligning av 4β-hydroksykolesterol og 6β-hydroksykortisol/kortisolratio som biomarkører for induksjon av CYP3A4 er blitt gjort, hvorav 4β-hydroksykolesterol viste å være mer pålitelig og prediktiv for CYP3A4-aktiviteten [60, 62]. Plasmakonsentrasjonsmåling av 4β-hydroksykolesterol kan også tenkes å være mer praktisk enn urinkonsentrasjonsmåling av 6β-hydroksykortisol/kortisol-ratio med tanke på oppsamling av urin versus plasma. 9

4β-hydroksykolesterol Diczfalusy et al. har tidligere utført flere studier der 4β-hydroksykolesterol (figur 2) har blitt undersøkt som en potensiell endogen biomarkør for CYP3A4-fenotype [63]. 4β- Hydroksykolesterol er et av de endogene oksidasjonsproduktene, oksysterol, til kolesterol som hovedsakelig dannes enzymatisk via CYP3A4/5 [61, 64-66], men også i liten grad via auto-oksidering [67, 68]. Ved enzymatisk dannelse av 4β-hydroksykolesterol vil generelt CYP3A5 være av mindre betydning enn CYP3A4 grunnet lav andel bærere av aktiv CYP3A5- genotype, CYP3A5*1, i de fleste befolkningsgrupper [47, 48]. Selv om 4β-hydroksykolesterol er en metabolitt av kolesterol, har det blitt vist at kolesterolnivå i serum ikke påvirker serumkonsentrasjon av 4β-hydroksykolesterol i særlig grad [46]. I en studie på 440 personer ble det observert at kun 9 % av variasjonen i 4β-hydroksykolesterolkonsentrasjon var assosiert med serumkolesterolnivå, mens de resterende 91 % var forklart av andre faktorer [46]. Figur 2: struktur av 4β-hydroksykolesterol Halveringstiden til 4β-hydroksykolesterol er anslått til å være 17 dager, og serumkonsentrasjonsnivået hos friske, ubehandlede, voksne personer er blitt rapportert å være i størrelsesorden 50-125 nm [68-70]. Hos pasienter behandlet med CYP3A4-induserende legemidler er serumkonsentrasjon av 4β-hydroksykolesterol vist å være økt med en faktor 10-20 [59, 61, 62, 68, 69]. Ved behandling med et CYP3A4- hemmende legemidler er det vist en viss reduksjon i serumkonsentrasjon av 4β-hydroksykolesterol, men endringen er relativt sett mye mindre enn det som har blitt observert med CYP3A4-indusere [59, 67]. 10

For kvantifisering av 4β-hydroksykolesterol både i serum og plasma er det tidligere publisert metoder med ulike deteksjonsprinsipper; GC-MS/MS [68], LC-"electrospray ionization (ESI)"- MS/MS [64] og LC-"atmospheric pressure photoionization (APPI)"- MS/MS [70]. Førstnevnte metode er den vanligste for analyse av oksysteroler i plasma [71]. Til tross for dette, finnes det noen ulemper ved bruk av GC-MS. Analysetiden ved GC-MS er relativt lang, og det er også nødvendig med et derivatiseringstrinn for å kunne analysere prøvene med GC- MS/MS. LC-ESI-MS/MS er generelt raskere og mer robust enn GC-MS, mens LC-APPI- MS/MS er den raskeste, mest robuste og selektive av de tre analysemetodene [70]. 1.4 Hensikt Hensikten med dette masterprosjektet var å utvikle en analysemetode basert på UPLC- "atmospheric pressure chemical ionization (APCI)"-MS/MS for måling av 4βhydroksykolesterol, og undersøke i hvilken grad serumkonsentrasjon av denne biomarkøren korrelerte med i) CYP3A4-uttrykk i tarm og lever hos overvektige pasienter, og ii) dosejustert serumkonsentrasjon av CYP3A4-substratet quetiapin i psykiatriske pasienter. Sekundært ble det også gjort en sammenligning av 4β-hydroksykolesterol-nivåer mellom pasienter behandlet med CYP3A4-induseren karbamazepin og levetiracetam (ikkeinduserende antiepileptikum). 11

2 Materiale og metoder 2.1. Utvikling av analysemetode for måling av 4β-hydroksykolesterol En analysemetode ble utviklet med utgangspunkt i en tidligere publisert metode for måling av 4β-hydroksykolesterol i plasma. Referansemetoden publisert av van de Merbel et al. var basert på en væske/væske-ekstraksjon etterfulgt av fast-fase ekstraksjon [70]. I metoden beskrevet av van de Merbel et al. ble 4β-hydroksykolesterol kvantifisert ved hjelp av LC- APPI-MS/MS innstilt i positiv mode [70]. Hovedendringen som ble gjort i forhold til referansemetoden var å kvantifisere 4βhydroksykolesterol basert på UPLC-APCI-MS/MS i stedet for LC-APPI-MS/MS. Videre ble prøveopparbeidelsen forenklet til å bare bestå av væske/væske-ekstraksjon, da i en modifisert form sammenlignet med metoden til van de Merbel et al. [70]. Kromatografien ble også endret ved blant annet å bytte ut acetonitril med metanol i mobilfasesammensetningen, samt endre fra ordinær væskekromatografi (LC; kolonnediameter 3 mm) til "ultra performance" LC (UPLC; kolonnediameter 1 mm). Den utviklede metoden, inkludert prøveopparbeidelse, er beskrevet i detalj under. Metodens presisjon og nøyaktighet ble etter utvikling validert i tråd med gjeldende retningslinjer [72]. Prøveopparbeidelse Opparbeidelse av prøvene var basert på væske/væske-ekstraksjon, og 500 µl serumprøve ble først tilsatt 50 µl intern standard (4β-hydroksykolesterol-d 7, Toronto Research Chemicals Inc.) i metanolløsning (500 nm). Deretter ble blandingen tilsatt 1 ml 1 M fersk natriummetoksid løst i etanol. Blandingen ble så stående på benken i 20 minutter for fullstendig hydrolysering av esterbindingen mellom 4β-hydroksykolesterol og lange fettsyrer i serum. Deretter ble prøven tilsatt 1 ml vann og 4 ml heksan for å separere hydrofile og hydrofobe stoffer fra hverandre i selve væske/væske-ekstraksjonen. Blandingen ble så vendt opp ned i to minutter for å få et godt ekstraksjonsutbytte, og deretter sentrifugert ved 2500 g i 5 minutter ved 20 C for å få et klart skille mellom de to væskefasene. Deretter ble blandingen oppbevart i fryseren ved en temperatur på -80 C i 20 minutter. Hensikten med dette trinnet var å fryse vannfasen, slik at den organiske fasen kunne helles direkte over i nye rør for inndamping, som ble forsert med en lett nitrogengass-spray ved 37 C til fullstendig tørrhet. 12

Andel (%) Inndampet prøve ble så reløst i 500 µl metanol og deretter pipettert over i 2 ml glassvialer, korket og plassert i autosampler for analyse. UPLC-APCI-MS/MS-analyse Analysen ble gjennomført ved hjelp av et Aquility ultra performance liquid chromatography (UPLC) system koblet til Micromass Quattro Premier tandem massespektrometrisk (MS/MS) detektor fra Waters (Milford, MA, USA). En Aquility UPLC BEH Shield C18-kolonne (1.7µm, 1 x 100 mm; Waters) ble benyttet for å separere stoffene fra hverandre ved en kolonnetemperatur på 40 C. Et prøvevolum på 10 µl ble injisert og analysetiden var på totalt 10 minutter per prøve. Vann og metanol ble benyttet som mobilfase under analysene, med en gradienteluering som vist i figur 3. Mobilfasehastigheten var 0,150 ml/min. 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 3 3,5 8,2 8,5 10 Tid (minutter) vann metanol Figur 3: Mobilfasesammensetning under UPLC-APCI-MS/MS-analysen. Ionekilden som var montert mellom kolonnen og MS/MS-detektoren var en APCI-probe innstilt i positiv mode (spesifikasjoner angitt i tabell 3). APCI ble benyttet for å minimalisere potensielle problemer knyttet til såkalt "signalundertrykking" (diskriminering). 13

Tabell 3: Spesifikasjoner for "atmospheric pressure chemical ionization (APCI) "-probe innstilt i positive mode ved bruk av MS/MS-detektor. Temperatur i ionekilde 130 C Temperatur ved frigjøring av analytt fra frie ioner i mobilfasen 600 C Elektrisk spenning på APCI-nålen 10 µa Gassgjennomstrømning på prøvekonen Gassgjennomstrømning ved frigjøring av analytt fra frie ioner i mobilfasen 90 L/t 600 L/t For å detektere 4β-hydroksykolesterol og intern standard (4β-hydroksykolesterol-d 7 ) ble følgende masseoverganger benyttet ved hjelp av "multiple reaction monitoring" (MRM) i MS/MS-detektoren: - 4β-hydroksykolesterol m/z 385.25 367.45-4β-hydroksykolesterol-d 7 m/z 392.30 374.50 Høyden på den kromatografiske toppen til 4β-hydroksykolesterol, justert for topphøyde til intern standard, ble benyttet som signal/responsvariabel i UPLC-APCI-MS/MS-metoden. Validering av metoden Validering av metoden ble gjennomført over seks ulike dager for å beskrive metodens nøyaktighet og presisjon (både intra- og interdag). Tre humane blankserumprøver, hvorav to var tilsatt renstandarder med konsentrasjonene 25 nm og 1600 nm av 4β-hydroksykolesterol (Toronto Research Chemicals Inc.), ble benyttet som kvalitetskontrollprøver hver dag under valideringen. Disse prøvene ble laget hver dag sammen med en kalibreringskurve med forskjellige konsentrasjoner av 4β-hydroksykolesterol i metanol tilsatt en fast konsentrasjon av intern standard. Konsentrasjonene som ble benyttet under valideringen var 25, 50, 100, 200, 400, 800, 1200 og 1600 nm for 4β-hydroksykolesterol og 500 nm for den interne standarden. Intern standard ble tilsatt for å korrigere for eventuelt tap under prøveopparbeidelsen. Konsentrasjon av 4β-hydroksykolesterol i serumprøver ble kalkulert basert på en lineær standardkurve ved bruk av programvaren Masslynx versjon 4.1 (Waters, Milford, MA, USA). Programvaren utformet en funksjon, y=ax+b, for den lineære standardkurven, slik at man ved 14

hjelp av topphøydeforholdet i prøven (y) kunne kalkulere konsentrasjonen i prøven (x). Matrikseffekter ble også undersøkt under valideringsprosedyren ved at 4β-hydroksykolesterol i seks tilfeldige pasientprøver ble analysert før og etter tilsetting av renstandard med 100 nm av 4β-hydroksykolesterol. Eventuell signalundertrykking ble vurdert basert på sammenligning av MS/MS-signal (topphøyde) i en renstandardprøve løst i metanol og signaldifferansen mellom opparbeidede serumprøver med og uten tilsatt renstandard. Dersom signaldifferensen i opparbeidede serumprøver var vesentlig mindre enn signalet i renstandarden, ble dette tolket som signalundertrykking av matrikskomponenter. I tillegg til den ordinære metodevalideringen ble det gjort en sammenligning av analysesvar fra den utviklede UPLC-APCI-MS/MS-metoden med konsentrasjonsbestemmelser utført ved GC-MS/MS-analyser ved Karolinska Institutet i Stockholm. Totalt 10 pasientprøver som allerede var analysert med GC-MS/MS ved Karolinska Institutet ble sendt med budpost til Senter for Psykofarmakologi (Diakonhjemmet) for reanalyse med den utviklede metoden. For å beskrive samsvaret mellom metodene ble prosentvis avvik beregnet for hver enkelt pasientprøve. 2.2. Korrelasjon mellom CYP3A4-uttrykk og 4β-hydroksykolesterol Lagrede serumprøver fra overvektige pasienter (n= 16) samlet inn i en klinisk studie i samarbeid mellom Senter for sykelig overvekt, Sykehuset i Vestfold HF, og Farmasøytisk institutt, Universitetet i Oslo, var tilgjengelig for reanalyse av 4βhydroksykolesterolkonsentrasjon. Fra disse pasientene fantes det fra en tidligere publisert artikkel målinger av CYP3A4-uttrykk (nivå) i biopsier fra tarm og lever [27]. Det ble derfor undersøkt om det fantes en korrelasjon mellom totalt CYP3A4-uttrykk i biopsiene og 4βhydroksykolesterolkonsentrasjon i serum. Det ble gjort korrelasjonsanalyser av 4βhydroksykolesterolkonsentrasjon mot både CYP3A4-uttrykk i tarm, lever, og tarm + lever, ved hjelp av ikke-parametrisk, to-halet Spearmans rank test (GraphPadPrism versjon 6, GraphPadSoftware, Inc, San Diego, CA, USA). P-verdier under 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. 15

2.3. Korrelasjon mellom dosejustert quetiapinkonsentrasjon og 4βhydroksykolesterol Serumprøver fra quetiapinbehandlede pasienter, der serumkonsentrasjon av quetiapin og metabolitten N-dealkylquetiapin (norquetiapin) hadde blitt målt, ble lagt til side i perioden 1.-31. august 2013 for reanalyse av 4β-hydroksykolesterol. Legemiddelmonitoreringsdatabasen SWISS-lab ved Senter for Psykofarmakologi, Diakonhjemmet Sykehus, ble deretter benyttet for å hente ut en liste over serumkonsentrasjonsmålinger av quetiapin hos de aktuelle pasientene. Serumprøvene hos de som oppfylte inklusjonskriteriene (se under), ble oppbevart ved -20 C fram til senere reanalyse av 4β-hydroksykolesterol. Følgende kriterier ble fulgt for inklusjon av serumprøver fra quetiapinbehandlede pasienter: Det skulle foreligge informasjon om døgndose quetiapin og tablettformulering. Prøven skulle være tatt 10-14 timer etter siste doseinntak hos pasienter behandlet med tabletter, mens 12-24 timer hos pasienter som stod på depottabletter. Antatt steady state-betingelser for quetiapin ved prøvetaking. Videre ble listen over inkluderte pasienter overført til Microsoft Excel 2010 (Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA) hvor data ble sortert og systematisert. Deretter ble rekvisisjonene til de inkluderte serumprøvene gjennomgått i SWISS-lab for å framskaffe følgende tilleggsinformasjon: Komedikasjon Pasientens alder og kjønn Tablettformulering av quetiapin (depot- eller rask frisettingstablett) Etter serumkonsentrasjonsbestemmelse av 4β-hydroksykolesterol i de lagrede serumprøvene, ble sammenheng mellom 4β-hydroksykolesterol og dosejustert serumkonsentrasjon av quetiapin i pasienpopulasjonen undersøkt ved univariat korrelasjonsanalyse (Spearmans signed rank test) og multivarit regresjonsanalyse (multippel lineær regresjon). Tilsvarende sammenhenger mellom 4β-hydroksykolesterol og hhv. dosejustert serumkonsentrasjon av metabolitten norquetiapin og norquetiapin/quetiapin-ratio (metabolsk ratio) ble også 16

undersøkt. To-halet Spearmans rank test ble utført ved bruk av GraphPad, mens multivariatanalysene ble utført i statistikkprogrammet Minitab versjon 17 (Minitab inc. State College, PA, USA). I multivariatanalysene ble alder (år), kjønn, tablettformulering av quetiapin, og tidspunkt mellom siste doseinntak og prøvetaking (timer), inkludert som potensielle kovariater sammen med serumkonsentrasjon av 4β-hydroksykolesterol. 2.4 Nivå av 4β-hydroksykolesterol hos karbamazepin- vs. levetiracetambehandlede pasienter Serumprøver fra pasienter som hadde målt konsentrasjon av karbamazepin eller levetiracetam ved Senter for Psykofarmakologi i perioden 1.-30. april 2014 ble lagret for reanalyse av 4βhydroksykolesterol. Serumprøvene ble oppbevart i fryseren ved en temperatur på -20 C før reanalyse av 4β-hydroksykolesterol. Serumkonsentrasjoner av 4β-hydroksykolesterol hos pasienter behandlet med karbamazepin eller levetiracetam ble sammenlignet med en ikkeparametrisk, to-halet «Mann-Whitney» test (GraphPad). P-verdi under 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. 2.5 Etikk og godkjenninger De delene av prosjektet som omfattet reanalyse av 4β-hydroksykolesterol i pasientprøver var forhåndsgodkjent av Regional komité for medisinsk og helsefaglig forskningsetikk (REKreferansenr.: 2014/1191-1) og Forskningsutvalget ved Diakonhjemmet Sykehus. Under prosjektet fikk prosjektmedlemmer tilgang til pasienters legemiddelbruk i pasientdatabasen SWISS-LAB. Personlige opplysninger som ikke var anonymisert ble imidlertid kun brukt og oppbevart på lokal PC ved Senter for Psykofarmakologi for å forhindre at sensitiv informasjon kom på avveie. 17

3 Resultater 3.1. Validering av analysemetode for måling av 4β-hydroksykolesterol Metoden hadde en gjenfinning av den interne standarden på mellom 70 til 100 %. Den deutererte internstandarden hadde like fysikalsk-kjemiske egenskaper som analytten, og oppførte seg derfor likt under prøveopparbeidelsen. Den kromatografiske retensjonstiden var også tilnærmet lik for 4β-hydroksykolesterol og den d7-merkede internstandarden (ca. 3,1 minutter), se figur 4. Total analysetid per prøve var på 10 minutter. Figur 4: UPLC-APCI-MS/MS-kromatogrammer av opparbeidede serumprøver tilsatt 25 og 1600 nm 4β-hydroksykolesterol før væske/væske-ekstraksjon (to øverste kromatogrammer), og tilsvarende for 500 nm 4β-hydroksykolesterol-d7 (intern standard, nederste kromatogram). 18

Kalibreringskurven for 4β-hydroksykolesterol (25-1600 nm) viste god linearitet under hele valideringsperioden med en gjennomsnittlig r 2 -verdi >0,997. Tabell 4 viser at intra- og interdag nøyaktighet for metoden var <15 % ved 25 nm og <2 % ved 1600 nm, mens tilsvarende resultater for presisjon var < 8 % ved 25 nm og <4 % ved 1600 nm. Tabell 4: Inter- og intradag nøyaktighets- og presisjonsdata oppnådd under valideringen av UPLC-APCI-MS/MS-metoden for analyse av 4β-hydroksykolesterol i serum ved hhv. høy tilsatt (1600 nm) og lav tilsatt (25 nm) konsentrasjon. Nøyaktighet (%) Presisjon (%) Intradag Interdag Intradag Interdag 25 nm 6,9 14,2 5,2 8,1 1600 nm 1,4 0,2 1,4 3,7 Det ble også undersøkt om det var noen matrikseffekter som kunne undertrykke responsen av analytten ved analyse. De seks serumprøvene som ble tilsatt 100 nm 4β-hydroksykolesterol viste en differanse på <10 % i signal mellom renstandardprøve løst i metanol og opparbeidede serumprøver med og uten tilsatt renstandard. Denne lave signaldiffereansen indikerte at potensielle matrikseffekter ikke var et problem for metoden. 3.2. Korrelasjon mellom CYP3A4-uttrykk og 4β-hydroksykolesterol i overvektige pasienter Figur 5a illustrerer korrelasjonen mellom serumkonsentrasjon av 4β-hydroksykolesterol og total CYP3A4-uttrykk i tarm og lever hos overvektige personer. Spearmans rank test viste at det var en signifikant, positiv korrelasjon mellom de to variablene (r 2 = 0,270; p = 0,042). Det ble også observert en signifikant, positiv korrelasjon mellom serumkonsentrasjon av 4βhydroksykolesterol og CYP3A4-uttrykk i tarm hos de samme pasientene (r 2 = 0,260; p = 0,046; figur 5b). Korrelasjonen mellom serumkonsentrasjon av 4β-hydroksykolesterol og CYP3A4-uttrykk i lever var også positiv, men ikke statistisk signifikant (r 2 = 0,185; p = 0,097; figur 5c). 19

A B C Figur 5: Spearmans korrelasjon mellom serumkonsentrasjon 4β-hydroksykolesterol og totalt CYP3A4-uttrykk i tarm og lever (a), samt CYP3A4-uttrykk i tarm (b) og lever (c) alene, hos overvektige personer (n =16). CYP3A4-uttrykk er i pmol CYP3A4/mg total protein. P-verdier og r 2 - verdier for hver figur er indikert på de enkelte figurene. Lineære trendlinjer er lagt til for å visualisere sammenhengene. 20

3.3. Korrelasjon mellom serumkonsentrasjon av quetiapin og 4βhydroksykolesterol Etter å ha søkt opp serumkonsentrasjonsmålinger av quetiapin i perioden 1.-31. august 2013 ble til sammen 192 serumprøver vurdert for inklusjon, se tabell 5. Totalt var det bare 72 av de 192 prøvene som oppfylte kravene for inklusjon. Prøver tatt utenfor kravet til tidsintervall mellom siste dose av quetiapin og blodprøvetaking var den vanligste årsaken til eksklusjon. Tabell 5: Oversikt over eksklusjonsårsaker og antall ekskluderte serumprøver blant de quetiapinbehandlende pasientene. Antall pasientprøver etter innledende søk 192 Eksklusjonsårsaker Serumkonsentrasjon under kvantifiseringsgrense for quetiapin (<40 nm) 19 Ikke påvist quetiapin 4 Utenfor tidsintervall 10-14 (tabletter) og 12-24 timer (depottabletter) 32 Manglende informasjon om tablettformulering 28 For lite serum til analyse 15 Prøver som ikke ble funnet 22 Antall inkluderte quetiapinprøver 72 Det var ingen signifikante forskjeller i serumkonsentrasjon av 4β-hydroksykolesterol mellom pasienter behandlet med quetiapin depottablett eller vanlig tablettformulering, men det var signifikant større andel kvinner og signifikant lavere alder blant pasientene i førstnevnte gruppe (se tabell 6). 21

Tabell 6: Deskriptive data knyttet til bruk av depottabletter (depot) eller vanlige tabletter (tablett) blant de inkluderte quetiapinbehandlende pasientene. Variabel Depot, n= 20 Tablett, n= 52 P-verdi* Kvinner, n (%) 15 (75 %) 20 (38,5 %) 0,008 Alder, median (spredning) Tidspunkt prøvetaking, median (spredning) 4β-hydroksykolesterol, median (spredning) 36,5 år (22 71 år) 15,4 t (12-24 t) 77,4 nm (25,8-164,8 nm) 45 år (18-83 år) 12,0 t (10-14 t) 75,8 nm (23-273 nm) 0,032 < 0.0001 0,646 *P-verdier estimert med Fisher's exact -test eller Mann-Whitney -test ved bruk av GraphPad prism versjon 6. Figur 6a illustrerer korrelasjonen mellom C/D-ratio av quetiapin og serumkonsentrasjon av 4β-hydroksykolesterol i quetiapinbehandlende pasienter. Det var en signifikant, negativ korrelasjon mellom 4β-hydroksykolesterolkonsentrasjon og C/D-ratio av quetiapin (r 2 = 0,119; p=0,0030). Tilsvarende var det en signifikant, positiv korrelasjon mellom metabolsk-ratio og 4β-hydroksykolesterol (r 2 = 0,209; p= <0,0001, Figur 6b), mens korrelasjonen mellom C/Dratio av norquetiapin og 4β-hydroksykolesterol var ikke-signifikant (r 2 = 0,003; p=0,6462, Figur 6c). 22

A B C Figur 6: Korrelasjon mellom C/D-ratio av quetiapin (a), metabolsk-ratio (norquetiapin/quetiapin) (b) og C/D-ratio norquetiapin (c) og serumkonsentrasjon av 4β-hydroksykolesterol blant quetiapinbehandlende pasienter. P-verdier og r 2 -verdier er indikert i figurene. Lineære trendlinjer er lagt til for å visualisere sammenhengene. Sammenhengen mellom serumkonsentrasjonsvaraibler av quetiapin og metabolitten ble også undersøkt ved multippel lineær regresjonsanalyse. De uavhengige variablene som ble inkludert for å potensielt forklare variasjon i C/D-ratio av quetiapin, C/D-ratio av norquetiapin og metabolsk ratio, var alder, serumkonsentrasjon av 4β-hydroksykolesterol, kjønn, tidsintervall mellom siste dose og prøvetaking og tablettformulering. Resultatene fra analysene er oppsummert i tabell 7. Serumkonsentrasjon av 4β-hydroksykolesterol var signifikant assosiert med C/D-ratio quetiapin og metabolsk ratio, men ikke C/D-ratio av norquetiapin. Alder hadde ingen signifikant innvirkning på hverken C/D-ratio av quetiapin, C/D-ratio av norquetiapin eller metabolsk ratio. Kjønn og tablettformulering var signifikant assosiert med C/D-ratio av quetiapin, men ikke norquetiapin eller metabolsk ratio. 23

Tabell 7: Effekter av ulike variabler på C/D-ratio av quetiapin og norquetiapin, samt metabolsk ratio (norquetiapin/quetiapin) estimert i multivariatanalyser (multippel lineær regresjon). Variabel C/D-ratio C/D-ratio norquetiapin/ quetiapin norquetiapin quetiapin 2.92* P 2.22* P -0,72* P Alder i +0,0050 0,359 +0,0065 0,141-0,0176 0,201 4β-hydroksykolesterol ii -0,0045 0,025 +0,0021 0,181-0,0129 0,047 Kvinne -0,4160 0,022-0,0910 0,523-0,7570 0,173 Tidsintervall iii -0,0004 0,624-0,0010 0,094-0,0003 0,900 Rask frisettingtablett -0,5550 0,033-0,362 0,081 1,0470 0,190 * = estimert populasjonsgjennomsnitt i fra multivariat analyse i = alder fra 18 år ii = per nm økning i serumkonsentrasjon fra 23,0 nm iii = per time fra 10 timer 24

3.4. 4β-Hydroksykolesterol-nivåer i pasienter behandlet med karbamazepin og levetiracetam Det ble i alt inkludert 40 serumprøver fra pasienter som enten hadde målt serumkonsentrasjon av karbamazepin (n=14) eller levetiracetam (n=26) ved Senter for Psykofarmakologi, Diakonhjemmet Sykehus. Figur 7 illustrerer fordeling av 4β-hydroksykolesterolkonsentrasjon i serum hos hhv. karbamazepin- og levetiracetambehandlede pasienter. Median serumkonsentrasjon av 4βhydroksykolesterol var 10 ganger høyere hos karbamazepinbehandlede pasienter sammenlignet med levetiracetambehandlede pasienter (653 mot 64 nm, p<0.0001). Som illustrert i figur 7, var det en mer enn 50 ganger spredning fra laveste måling levetiracetamgruppen (25 nm) til høyeste måling i karbamazepingruppen (2100 nm). Figur 7: Målte konsentrasjoner av 4β-hydroksykolesterol i serum hos pasienter behandlet med levetiracetam (n=26) eller karbamazepin (n=14). Stiplede linjer indikerer medianverdier, som var signifikant forskjellige mellom gruppene (karbamazepin 653 nm vs. levetiracetam 64 nm, p<0.0001). 25

4 Diskusjon I denne oppgaven ble det utviklet en ny metode for kvantifisering av 4β-hydroksykolesterol i humant serum med væske/væske-ekstraksjon etterfulgt av analyse basert på UPLC-APCI- MS/MS-deteksjon. Metoden ble benyttet til kvantifisering av 4β-hydroksykolesterol i pasientprøver for å evaluere denne substansen som endogen biomarkør for CYP3A4- fenotype. 4.1 Analysemetode for 4β-hydroksykolesterol Metoden i denne oppgaven ble utviklet med utgangspunkt i en tidligere publisert metode for kvantifisering av 4β-hydroksykolesterol i humant serum [70]. Sammenlignet med referansemetoden til van de Merbel et al. [70] var det et ønske å oppnå enklere prøveopparbeidelse og kortere analysetid med den nye metoden. Forenklinger av den opprinnelige prøveopparbeidelsen til van de Merbel et al. omfattet modifikasjoner i den innledende hydrolyseprosessen og væske/væske-ekstraksjonstrinnet, mens trinnet med fast fase-ekstraksjon ble utelatt i den reviderte opparbeidelsen. I trinnet for hydrolyse av esterbindingene mellom 4β-hydroksykolesterol og de lange fettkjedene i serum ble konsentrasjonen av natriummetoksid (CH 3 NaO) i etanolløsning endret fra 2 M til 1 M. Endringen i konsentrasjon av CH 3 NaO i etanol ble utført grunnet utfelling av CH 3 NaO ved oppgitt konsentrasjon (2 M) i den publiserte metoden [70]. Til tross for en halvering i CH 3 NaO-konsentrasjonen, ble det konstatert likt ekstraksjonsutbytte av 4βhydroksykolesterol. Det ble også undersøkt om andre sterke basiske kjemikalier i etanol, KOH og NaOH, ga bedre ekstraksjonsutbytte enn CH 3 NaO i etanol, men dette var ikke tilfellet. 4β-Hydroksykolesterol er en lipofil substans som vil ha størst distribusjon/affinitet til den organiske fasen i en væske/væske-ekstraksjon. I referansemetoden var ekstraksjonsutbyttet av 4β-hydroksykolesterol noe begrenset, dvs. rundt 50 %. For å øke ekstraksjonsutbyttet ble derfor forholdet organisk fase:vann økt til 2:1 sammenlignet med 1:1 i referansemetoden. Med en dobling i heksanmengden ble ekstraksjonsutbytte på mer enn 80 %, noe som generelt regnes som godt. 26

I denne oppgaven ble prøveglassene fryst ned etter væske/væske-ekstraksjon ved en temperatur på -80 C. Allerede etter 20 minutter ble det observert at vannfasen var totalt nedfryst. Dette muliggjorde dekantering av den organiske fasen innen en halvtime etter ekstraksjon. Til sammenligning krevde referansemetoden at prøveglassene ble lagret i fryser ved en temperatur på -20 C over natten før dekantering og inndamping av heksanfasen [70]. I den utviklede metoden ble UPLC benyttet for å separere substanser i de opparbeidede serumprøvene. Ved bruk av UPLC oppnår man generelt bedre separasjon mellom kromatografiske topper/substanser i prøven og dermed kortere analysetid. Det ble observert at tid per analyse i den modifiserte metoden (UPLC) var ca. 30 % kortere sammenlignet med referansemetoden [70]. Tidligere LC-MS/MS-metoder har benyttet mobilsammensetningen acetonitril og vann for analyse av 4β-hydroksykolesterol [70]. I denne oppgaven falt valget til slutt på en mobilfasesammensetning bestående av metanol og vann etter forsøk med acetonitril og vann innledningsvis, noe som ikke er blitt beskrevet i tidligere metoder for kvantifisering av 4βhydroksykolesterol. Grunnen til dette var en lavere deteksjonsgrense med metanol og vann som mobilfase sammenlignet med acetonitril og vann. Det ble også observert en høyere separasjonsselektivitet av 4β-hydroksykolesterol med metanol som en del av mobilfasen. En ulempe som kan oppstå ved bruk av metanol og vann som mobilfase er et høyere kolonnetrykk. Dette ble delvis kompensert ved å bruk av UPLC fremfor LC, da UPLC instrumentet tåler et trykk som er dobbelt så høyt som LC. Dette resulterte i at mobilfasehastigheten kunne forbli lik som tidligere LC-MS/MS-metoder [64, 70, 73, 74]. Metanol som komponent i mobilfasen gir også høyere elueringsgrad enn acetonitril. Dette resulterte i raskere analysetid av 4β-hydroksykolesterol enn tidligere metoder [64, 70, 73, 74]. Tidligere LC-MS/MS-metoder for analyse av 4β-hydroksykolesterol har benyttet ESI eller APPI-deteksjon i masseanalysatoren [70, 74]. I denne oppgaven falt valget til slutt på APCI etter forsøk med ESI innledningsvis. Den nye metoden viste seg å ha en høyere nedre kvantifiseringsgrense (25 nm) enn tidligere publiserte metoder med ESI-basert deteksjon (ca. 12 nm) [64, 73, 74]. Bakgrunnen for at ESI likevel ikke ble valgt i denne oppgaven var behov for et ekstra derivatiseringstrinn i prøveopparbeidelsen, samt at det ble observert signalundertrykking og dannelse av natriumaddukter i kromatogrammet ved ESI-deteksjon. APPI er også blitt vist å ha en lavere deteksjonsgrense enn APCI som ionekilde, men førstnevnte var ikke tilgjengelig ved Senter for Psykofarmakologi. 27