Eksamen i emnet KJ 2053; KROMATOGRAFI

Kandidat-nr.:... NRGES TEKNISK- NATURVITENSKAPELIGE UNIVERSITET INSTITUTT FR KJEMI Studieprogr.:... (frivillig) Faglig kontakt under eksamen: Institutt for kjemi; Professor Anne Fiksdahl, tel. 735 94094 (Faglærer F.-Aman. Rudolf Schmid (evt. M.: 913 75 546)) MED LØSNINGSFRSLAG Eksamen i emnet KJ 2053; KRMATGRAFI Mandag 22. mai 2012, kl. 9.00 13.00 (4 timer) Bokmål med rettelser / forbedrings-ideer Skriftlig svar på oppgavene 1 6 7 skal gis på oppgavearkene bak som skal innleveres (bruk ekstra ark om nødvendig) Hjelpemidler: D Ingen trykte eller håndskrevne hjelpemidler tillatt. Bestemt (godkjent) enkel kalkulator tillatt. Dette oppgavesett består av tretten - 13 - sider : 1 forside (s. 1), 12 sider med 6 oppgaver (s. 2-13) Vektingen av hver (del-)oppgave er oppgitt. Maks. poengtall er 102. Karakterskalaen (100%) tar utgangspunkt i 100 poeng. Det skal ikke skrives med blyant, fordi du ikke kan ha med deg gjennomslag av svarene dine (sikkerhetskopi)... Rudolf Schmid Eksamensansvarlig faglærer ppgavesettet er kontrollert : Morten Martinsen Sensor Sensurdato : Fredag, 12.06.2012

Side 2 av 14 ppgave 1-6 Besvares på oppgavearket og innleveres ppgave 1. (19 p.) a.) Skriv ned formelen til den forenklede "van Deemter-ligningen", (1+10 p.) h = A + B/u + C u = A + B/u + C MF u + C smf u + C SF u (= H E + H L + H MF + HC smf + H SF ) el. evt. h = B/u + ( 1/A + 1/(C u) ) -1 og benevn og forklar kort leddene i ligningen. (i) A = Eddy Diff. =c A d p d p =Partikkeldiameter (ii) B/u = bidrag fra Longitudinal diffusjon B = c B D x,mf D x,mf = Diff konst av analytt X I MF (iii) C = massetransfer-termen (= C t mt(sf-mf-sf ) eller oppdelt : C MF = bidrag fra massetransfer i mobil fase = c MF d p 2 / D MF (iv) C smf = bidrag fra massetransfer i stillestående mobil fase = 2 c smf d p / D MF (v) C SF = bidrag fra massetransfer i stasjonær fase 2 = c SF d f / D SF = Diff.-konst. av analytt X I SF D x,mf 1.b.) (2p) Illustrer v.h.a. en skisse av "van Deemter-kurven" ( bruk som eksempel gasskromatografi. og / eller kombinert med vandeemter-kurve for GC Vers.18.06.2012 01:43:00 p.m. ; prt. 03.05.2013, 11:13:38

Side 3 av 14 1.c) Hva er sammenhengen (1p) (i) mellom k, t R og t 0? k = t R -t 0 /t 0 eller t R = t 0 (1+k) (1p) (ii) mellom k og R? k = (1-R) / R = (1/R) -1 R = = 1/ (1+k) og /eller (2p) (iii) mellom N og N eff? N = 5,54(t R /w 0,5) 2 N eff = 5,54(t R /w 0,5) 2 = 5,54 ((t R t 0 ) / w 0,5) 2 N / N eff = (t / t ) 2 = ((k+1)t 0 / k t 0 ) 2 N = N eff (( k+1) / k ) 2 ; N = N eff = N (k / ( k+1) ) 2 (2p) (iv). mellom N og R S? og evt. R S = ¼ k / (1 + k) N ½ (α - 1) / α N req = 16 (R S ) 2 ) (α /(α - 1 )) 2 ((k + 1)/ k) 2 = ¼ N eff 1/2 (α - 1) / α (1p) (v) Hvordan kvantifiseres topp-asymmetri i et kromatogram (gi en formel, evt. med en forklarende skisse)? Asymmetri-parameter (blant flere mulige) : f.eks. AS = b / a (a, b, jfr. figuren, c = 0,1 h max ) Vers.18.06.2012 01:43:00 p.m. ; prt. 03.05.2013, 11:13:38

Side 4 av 14 ppgave 2. ( xx p) 2.a (8p) (3p) (i) Forklar og skissér hvordan en kvantitativ analyse utføres v.h.a. intern standard, IS : Innledningsvis settes en standardkurve opp på grunnlag av en serie analyser av stoffet i ulike kjente konsentrasjoner tilsatt en (helst fast) kjent mengde IS. Integralforholdet (areal/evt. topphøyde) stoff/is plottes mot vektforhold av prøve (evt. mot vekt når tilsatt mengde IS er konstant, se lærebok, s. 292, fig. 16.4) Tilsats av en kjente mengde (gjerne den samme) IS til den ukjente prøven gir oss integralforholdet ukjent prøve/is. Standardkurven tillater deretter avlesning av mengde/konsentrasjon stoff i prøven. (2p) (ii) Hvilke krav stilles til en intern standard, IS? Nevn flest mulig. IS må: - gi en topp nær, men sep. fra analysert stoff (og evt. andre stoff i prøven), - ha like kjemiske og fysikalske egenskaper med analysert stoff, - ikke finnes i prøven eller overlappe med andre stoff i prøven, - være stabil, - være tilgjengelig i ren form, - tilsettes i en kons. sammenlignbar med kons. i prøven. (1p) (iii) Hvilke feilkilder elimineres særlig ved denne metoden, IS? Bruk av IS eliminerer feil pga.: - unøyaktighet i injisert volum, - ustabile kromatografiske betingelser, - stofftap i prøveopparbeidelse (dersom IS tilsettes før prøveopparb., ( surrogat-is )) (2p) (iv) Hva er sammenhengen mellom Intern standard metoden og den Relative responsfaktoren (RRF)? Sett opp formelen for utregning av RRF (med en kort forklaring). RRF-metoden er forenklet ISTD-metode m. bruk av ett-punkts-kalibrering (Forutsetter lineær kalibrering og at kurven går gjennom origo) og Vers.18.06.2012 01:43:00 p.m. ; prt. 03.05.2013, 11:13:40

Side 5 av 14 2.b) (1p) (i) Hva er det lineære område av en detektor. (IUPAC) mrådet av konsentrasjonen - eller massestrømmen (mass flow) - av et stoff i mobilfasen i detektoren, innenfor hvilket følsomheten (responsfaktoren, sensitivity, S) av detektoren er konstant innenfor spesifiserte grenser ± x (vanligvis ± 5 %). Innenfor det lineære området øker detektor-signalet y lineært (proporsjonalt) med konsentrasjonen c eller massestrømmen dm/dt - "detektoren er lineær". (1p) (ii) Hva er det dynamiske området av en detektor? Er det dynamiske området anvendbar for kvantitative analyser? (IUPAC) det dynamiske området, (Dynamic Range) for en detektor er mrådet av konsentrasjonen - eller massestrømmen (mass-flow) - av et stoff i mobilfasen i detektoren, innenfor hvilket en liten økning i konsentrasjon eller massestrøm produserer en økning i detektorsignal; ikke (nødvendigvis) lineær. Detektoren kan brukes til kvantitativ analyse innenfor det dynamiske område. Men kalibreringen blir mer krevende; særlig kan IKKE ett-punktkalibrering brukes. (Det dynamiske området er alltid større enn det lineære området.) Når det diskuteres usikkerhet av et analyseresultat: (1p) (iii) Hva menes med presisjonen av et analyseresultat? Hvordan rapporteres den i resultatet? Presisjonen er måleusikkerheten i et analyseresultat som er bestemt av tilfeldige feil den bestemmer reproduserbarhet/repeterbarhet av resultatet (f.eks. av t R, h max, toppareal). Kontroll med tilfeldige feil fås ved å gjenta målingene slik at det blir grunnlag til å kunne vurdere presisjonen v.h.a. statistikk : Mål for presisjon er ofte : standardavvik (med antall målinger oppgitt) av måleresultatene. (eller f.eks. konfidensintervall). (2p) (iv) Hva menes med nøyaktighet av et analyseresultat? Hvilke metoder kan brukes for å sjekke nøyaktigheten til resultatene av en kromatografisk analyse? Nøyaktigheten bestemmes av systematiske feil (eng.: accuarcy). Systematiske feil kan skyldes "personlige feil", instrumentelle feil, metode-feil; oppdages ikke ved gjentak av analysen. Nøyaktighetssjekk: bl.a. analyse av standarder, blindprløver, spikede prøver (gjenvinning), sertifiserte refereansematerialer (med nøyaktig kjent innehold), sammenligne egne resultater med andre lab er s resultater. Vers.18.06.2012 01:43:00 p.m. ; prt. 03.05.2013, 11:13:41

Side 6 av 14 (1+2p) ppgave 3. (yy p) 3.a) (i) Navngi og beskriv kort hovedkomponentene til en ionebytter (generelt). (2p) - Matriksen: (funksjonalisert) materiale som ioner eller ionogene grupper (ioniserbare funksjonelle grupper) er bundet til, (for ionebyttere for kro.: ikke-løselig, partikkelformet) - Faste ioner (/ funksjonelle grupper): med ladning, kovalent bundne til matriksen - Motioner : ioner av motsatt ladning som kompenserer ladningene til de faste ionene, elektrostatisk bundet, eller oppløst og flyttbar i elektrolytt, innenfor ionebytteren. - Evt. elektrolytt : ion-solvatiserende løsningsmiddel med oppløste ioner/salt (4p) (ii) Tegn de kjemiske strukturene til retensjonspunktene for hhv. kationer og anioner i ionebytterkromatografi, IEC (2 for hver ion-type) for kationer : - R-S 2 R-C - (sterkt sur) (svakt sur) for anioner: R-N + HR 2 R-N + (R 3 ) R = metyl el. etyl (svakt basisk) (sterkt basisk) eller andre ammonium-/amingrupper 3.b Når det i superkritisk fluid kromatografi, SFC, brukes gradienter kan dette typisk gjøres på flere ulike måter. Hvilke parametre kan varieres, nevn minst 3? (3p) 1) tetthets-gradient, (trykk-gradient, restriktor-gradient (?)) 2) modifikator-gradient, 3) temperatur-gradient Vers.18.06.2012 01:43:00 p.m. ; prt. 03.05.2013, 11:13:41

Side 7 av 14 3.c (2p) (i) Når det anvendes Fastfase-ekstraksjon (SPE, Solid Phase Extraction), hvilke to fordeler kan særlig oppnås med det i forhold til væske-væske ekstraksjon? - tidsforbruk redusert - og ii) - - løsningsmiddelforbruk redusert - (evt. høyere utbytte/gjenvinning + evt. bedre reproduserbarhet) (3p) (ii) Nevn tre viktige typer sorbenter som benyttes til fastfase ekstraksjon, og deres aktuelle kromatografiske separasjonsmekanismer. - normal fase / silica - omvendt fase / C18 (silica modifiserte silyl-ethere) - ionebyttere (alle typer silica baserte kation/anion, svake/sterke) 3.d For kromatografiske analyser brukes derivatisering av analytter av og til. (i) På hvilke måter kan derivatisering forbedre det kromatografiske resultatet? (2p) Nevn 2 generelle (strategier for) derivatisering: - detektor-orientert: skape, eller øke signalet av en analytt i en gitt detektor, når følsomheten ellers er for dårlig. - kolonne-orientert. muliggjøre eller forbedre elueringen av analytten fra en gitt kolonnetype. F.eks. øke flyktigheten for å muliggjøre GC-analyser (4p) (ii) Gi et eksempel hver (for 3.d.(i)) som illustrerer bruk av derivatisering: ppgi analytt-stoffgruppe, derivatiseringsreaksjon/-reagens-type og hvordan derivatisering forbedrer konkret det kromatografiske resultat. Rel. generelle svar godtas (ikke detaljert gjennomgått i pensum) Detektor-orientert: f.eks. binde fluorescenrende grupper eller UV-absorberende grupper til stoffer uten egen kromofor : f.eks. aminiosyrer, (reaksjon på aminogruppen eller på karboksylgruppen mulig). gir respons i Fluo-Det eller i UV-det. Kolonneorientert: f.eks. silylering eller acetylering av karbohydrater (H-grupper) for sukkeranalyse v.h.a. GLC, nedsatt polaritet og kokepunkt etter acetylering eller silylering. Vers.18.06.2012 01:43:00 p.m. ; prt. 03.05.2013, 11:13:41

Side 8 av 14 ppgave 4. (xxp) 4.a (i) Hva er den mest benyttede stasjonærfasen ved omvendt fase (RP) HPLC, (2p) angi spesifikt navn og delstruktur. eller ktadekyl-silika (monomer ( brush )) Silika Si(R ) 2 n-c 18 H 37 H 3 C n-c Si H 18 37 Si CH 3 H Si H 3 C CH 3 Si Si CH 3 Si H Si CH 3 Si n-c 18 H 37 CH 3 Si H R er oftest Metyl (Her med én end-capped-gruppe (TMS) i midten (ikke nødvendig for å få 2 p)) (2p) (ii) Hva er den mest benyttede stasjonærfasen ved gass-væske-kromatografi, GLC, angi navn og delstruktur. f.eks. H CH 3 C 3 Si Si n Si CH 3 H 3 C CH 3 H 3 C CH CH 3 3 Eksempelet er en metyl-silikon : PDMS = PolyDiMetylSiloksan (også PolyDiMetylSilikon ) (alternative produkt-navn : V-1, V-101, SE-30, SP-2100, CP-Sil 5, m.fl.! ). (1p) (1p) (iii) Hva betyr end-capped / end-capping og hvor blir det anvendt? Anvendes for alkylsilan-hplc-stasjonærfaser: restlilanolgruppene som ikke har reagert med dimetyl-oktadekylsilan ettersilaniseres med trimetylklorsilan el.l.: derivatiserer de mest lett-tilgjenglige H-gruppene til upolare TMS-grupper. Gir bedre toppsymmetri for polare analytter som ellers vekselvirker med rest-silanolene stoffer. Forlenger muligens brukstiden til kolonnene noe, ved å øke stabiliteten i basisk miljø. (hindrer/bremser hydrolyse). (iv) Hvilke fordeler har en automatisk prøvegiver/prøveinjektor (Auto(matic) sampler) ved kromatografiske analyser? Nevn 2 og grunngi kort. - Forbedrer som regel reproduserbarheten av injeksjoner (i f.t. manuell inj.) - Sparer/frisetter arbeidstid fordi kromatografisystemet kan selv injisere/gjennomføre analyse-serier uten at mennesket trenger å være konstant el. jevnlig tilstede. Vers.18.06.2012 01:43:00 p.m. ; prt. 03.05.2013, 11:13:41

Side 9 av 14 4.c Enten Beskriv kort en splitløs injeksjon, hvor og når den brukes, fremgangsmåten, fordeler og ulemper, og lag en skisse over utstyret (4p) Eller Beskriv hvilke 2 vanlige injeksjonsmetoder som kan anvendes for kapillærsoneelektroforese. Ad splitløs injektor - Gjerne enkel skisse - GC-kapillærkolonne teknikk, m. fordampningsinjekter (omtrent som en split-injektor), for sterkt fortynnede prøveløsninger - hele prøven fordampes og sendes inn i kolonna, over en lengre periode (ca. minuttet). - godt resultat er avhengig av solvent effect (løsningsmiddeleffekt) for å unngå toppspredning (i tid og i rom): kald kolonne ved injeksjon som gjør at lsm. kondenserer i kolonneinngangen. - Evt. bruk av retensjons-gap (for kondenseringssone, også som ( guard -)forkolonne). - Tillater maksimal utnyttelse av veldig fortynnede prøver, litt mindre diskriminering (enn split) - begrensninger: i prøvestørrelse (0,7 1,5 ul), i starttemperatur (lavere enn lsm-kp.), krever svært rene lsm. Ad CZE-injeksonsmetoder: - Hydrodynamisk injeksjon: væskeinjeksjon ifra prøveglasset v.h.a. trykkforskjell (overtrykk, vakuum el. nivåforskjell mellom inn- og ut-gang), udiskriminert transport av hele prøven inn i kapillæren (representativ (sub-)prøve). - Elektrokinetisk injeksjon: ion-injeksjon ifra prøveglasset v.h.a. elektrisk spenning / elektroforetisk transport av prøven inn i kolonne (evt. hjulpet, eller motarbeidet, av elektroosmosebasert væsketransport). Rel. mengder ulike analyttioner i kolonna avviker frå kons. i prøven - er avhengig av deres relative elektroforetiske mobilitet (størst (og i riktig retning) gir størst prøvemengde i kolonna). 4.c) (i) Nevn den viktigste ioniserings-teknikken for GC-MS og skisser (grafisk) ionekildeprinsippet. (2p) (i) GC/MS: EI = Elektron Ionisering (Electron Ionisation) er typisk. En energirik elektronstråle med høy energi ioniserer analytt-molekyler til radikalkationer, som i mer eller mindre stor grad fragmenterer (fragment-ioner kan gi ekstra struktur-informasjon, utover evt. synlig ufragmentert molekyl-ion). Vers.18.06.2012 01:43:00 p.m. ; prt. 03.05.2013, 11:13:41

Side 10 av 14 4.c (ii) Skisser og sammenlign kort typiske UV-detektorer som brukes i hhv. HPLC og CZE (4p) (en av hver); vær spesifikt m.h.t detektorens UV-celle. HPLC : Variabel bølgeølengde-detektor UV-detektor- Flow- celle typisk Z-celle I vanlig HPLC er detektoren etter kolonna (unntak noen kapillær-hplc-systemer), og detektorcellen er som regel noen mm lang og ligger i fokus av en monokrom (vanlig det.) eller polykrom (DiodeArray det.) lysstråle. Rel. lang lysvei i prøven gir rel. god følsomhet (jfr CE), men for lang lysvei gir trang celle med lite lysgjennomgang p.g.a. trang åpning ( liten blender ). CZE : UVdetektor- Flowcelle = Kapillæren typisk on-column/incolumn I vanlig CZE skjer UV-deteksjonen typisk inne på fused silica kapillæren på-kolonna, og detektorcellen er da bare 30-100 mikrometer lang og ligger i fokus av en monokrom (vanlig detektor) eller polykrom (DiodeArray-det.) lysstråle. Rel. kort lysvei i prøven gir lav konsentrasjonsfølsomhet (kompenseres delvis av høy kolonneeffektivitet: veldig små toppvolum og dermed høy lokal prøve-konsentrasjon). (Ett nytt system bruker Z-cellen (som er vanlig i HPLC)). (3p) (iii) Ranger HPLC-detektorene basert på fluorescens, brytningsindeks (RI) og UV/synlig lys fra minst til mest følsom: RI-D < UV-D < Fluoresc-D (for analytter som faktisk gir respons (i UV el. Fluoresc.) minst til mest selektiv: RI-D < UV-D < Fluoresc-D (RI-D universell, UV-abs er rel.. utbredt, Fluoresc. sjeldent) minst til mest lettbrukt/ukomplisert : RI-D < Fluoresc-D < UV-D - RI-D - trykk-, temp.- & gradient-følsom; - Fluoresc. - følsom mot quenching (bl.a. v. 2, også flere parametre (eksitasjons-lys), metningsproblem (indre filter-problem)); - UV-D - rel. ukomplisert, Vers.18.06.2012 01:43:00 p.m. ; prt. 03.05.2013, 11:13:42

Side 11 av 14 ppgave 5. (10p) 5.a Du ønsker å anvende en isokratisk kiral HPLC-separasjon for å isolere preparativt én av enatiomerene i en nesten rasemisk blanding (nært like mye av begge enantiomerene). Du har en publikasjon som inneholder ingen kromatogram, bare teoretiske vurderinger og noen avledede parametre. Men du trenger konkrete praksisnære tall om kromatogrammet, bl.a. for vurdering av tidsforbruk, løsningsmiddelforbruk, og om separasjonen blir godt nok for isolering ved gjentatt injeksjon med fraksjonsoppsamling av R-(-)-enantiomeren (topp nr. 1). Selve kolonneformat brukt i publikasjonen er ikke kommersielt tilgjengelig, men en noe mindre kolonne med samme pakningsmaterial kan du kjøpe. Publiserte data: Kolonna 30 x 0,46 cm, lineær MF-hastighet 7,5 cm/min, N = 12000, k (topp 1) = 7,7, separasjonsfaktor = 1.1, asymmertri ca. 1,2. Tverrsnittareal-andel MF:SF = 40% : 60%. Din tilgjengelige kolonne er: 22 x 0,46 cm. (Anbefaling: Sett opp dine utregninger først med algebraiske formler her før du setter inn tallene, som forsikring mot numeriske regnefeil) Regn ut : 1p (i) volumetrisk pumpehastighet (i ml/min) på din kolonne, som skal være samme lineære hastigheten som på kolonna i litteraturen: Kolonnediameter og tverrsnitt er lik på begge kolonner lik volumetrisk hastighet, F =u A = u π r 2 = 7,5 3,14 0,23 0,23 =1,2 ml/min: men denne verdien er faktisk FEIL : den forutsetter åpent rør uten pakningsmaterial i kolonna: Med pakningsmaterialet tilstede i røret trengs opplysning om Interstitial porosity, d.v.s andelen som opptas av MF av det totale tverrsnitsarealet: det er ca. 0,4 (=40 %, U.Neue HPLC Columns 1997, p.30). F korrig for pakning: 1,2 0,4= 0,48 ml/min. 1p (ii) Anslag for platetall på din kolonne. Antall er ca. proporsjonalt med kolonnelengden N = 22 x 12000 / 30 = 8800 (Kan evt. utregnes via platehøyde el. plater/meter) 2p (iii) bservert oppløsning, R S, på litteratur-kolonna, og forvented oppløsning på din kolonne (regn uten asymmetri). Resultatene varierer litt, avhengig av hvilke form av foremlen som brukes: Rs = ¼ (k/(1+k)) N 1/2 (α - 1 )/ α, eller = ¼ (k/(1+k)) N 1/2 (α - 1 ), og om det brukes k 1 eller k = (k 1 +k 2 )/2 med k 1 pprinnelig kol. = 0,25 (7,7 / 8,7) ((1,1 1)/1,1) 12000 1/2 = 0,25 x 0,885 x 0,091 x 110 = 2,21 egen, ny kol. = 0,25 (7,7 / 8,7) ((1,1 1)/1,1) 8800 1/2 = 0,25 x 0,885 x 0,091 x 94 = 1,89 med k pprinnelig kol. = 0,25 (8,2 / 9,2) ((1,1 1)/1,1) 12000 1/2 = 0,25 x 0,89 x 0,09 x 110 = 2,19 egen, ny kol. = 0,25 (8,2 / 9,2) ((1,1 1)/1,1) 8800 1/2 = 0,25 x 0,89 x 0,09 x 94 = 1,88 med (α-1)& k 1: oppr.kol. = 0,25 (7,7 / 8,7) (1,1 1)) 12000 1/2 = 0,25 x 0,885 x 0,1 x 110 = 2,42 egen, ny kol. = 0,25 (7,7 / 8,7) (1,1 1) 8800 1/2 = 0,25 x 0,885 x 0,1 x 94 = 2,08 Vers.18.06.2012 01:43:00 p.m. ; prt. 03.05.2013, 11:13:42

Side 12 av 14 2p (iv) Beregnede retensjonstider for topp 1 og topp 2 på din 22cm-kolonne: Topp 1: egen, ny kol. t R,1 = (1+k 1) t 0 = (1+k 1) L / u = (1 + 7,7) x 22 / 7,5 = 25,5 min opprinn.kol. = analog regning: (1 + 7,7) x 30 / 7,5 = 34,8 min, Topp 2: egen, ny kol. k 2 = k 1 x = 7,7 1,1 = 8,47 8,5; t R,2 = (1+k 2) L/u = (1 + 8,5) 22 / 7,5 = 27,85 min opprinnelig kol. = analog regning: og for topp 2 : = (1 + 8,5) 30 / 7,5 = 38,0 min)) 1p (v) basert på tallene du har nå, og med den angitte asymmetrien, forventer du på din kolonne en god nok separasjon mellom toppene for preparativ isolering av topp 1? (Grunngi kort) ppløsningen ideal er 1,9, som er bedre enn basislinjeseparert. Asymmetri 1,2 betyr svak tailing, betyr at baksiden av toppen blir ca. 20 % bredere enn forsiden, dvs. noe mindre enn 20% av basisbredden (klart mindre enn en σ, som er 25 %) Rs = 1,9 betyr at avstanden mellom toppene er 1,9 ganger større enn gjennomsnits-basisbredden av toppene: en økning i toppbredden med maks. 20% på den ene halvparten reduserer da oppløsningen til ca. 1,9/1,2 = 1,6 (worst-case scenario), som fortsatt er bedre enn 1,5, som er grensen for basislinjeseparasjon. Separasjonen er forventet å være (mer enn) godt nok. Alternativ: regn ut basisbredden fra t R og N: for t R2 : w b2 =4 t R2 / n 1/2 =4 x 28/94 = 1,20 min Toppavstand t 2 t 1 = 27,85 25,5 = 2,35 min. Basislinjesep. krever minst 1,5 x w b = 1,8 min, som tåler en økning med nærmere 30% før bredden har nådd 2,35 min. 2p (vi) Hva er svitsj-tidspunktene for fraksjons-oppsamleren (i minutt fra t R = 0, din kolonne) du vill anbefale:start/stopp av oppsamling av topp 1 (én fraksjon for toppen). 1p t R (1) = 25,5 min (se (iv)) konservativt kutt, ved ca. basisbredde endpunktene (evt. avrundet litt oppover ettersom det er rapportert basislinjeseparasjon. Fra N= 16 (t R /w b ) 2 : 2 w b = (16 t R / N ) 1/2 = (16 25,5 2 / 8800) 1/2 = 1,09 min, halv basisbredd : 0,55 min Svitsjpunkt før : 25,5 0,55 min : avrundet ca. 24,8 min Svitsjpunkt etter : 25,5 + (1,2 0,55) min : avrundet ca. 26,2 min (vii) Antatt din topp 2, den uinteressante isomeren, er siste topp som elueres, hvor mye MF forbruker du pr. injeksjon ved gjentatt preparativ oppsamling av topp 1. t R (2) = (1+k) t 0 = (1+ (k(1) α) L / u = (1 + (7,7 1,1) 22 / 7,5 = 27,8 min 2 w b (2)= (16 t R / N ) 1/2 = (16 27,8 2 / 8800) 1/2 = 1,19 min avrundes oppover : tr(2) + asymmetri-korrig halv basisbredde (alternativ 2 x halvbredde ) 27,8 + 0,6 x 120/100 = 28,5 min; avrundes til ca. 29-30 min. Lsm-forbruk = F x sluttid = 1,2 ml/min * 30 min = 36 ml/ analyse. Vers.18.06.2012 01:43:00 p.m. ; prt. 03.05.2013, 11:13:42

Side 13 av 14 ppgave 6. (20p) Gi Ja/ svar pluss (nødvendig!) kort forklaring ("fordi "): (1 poeng pr. riktig og grunngitt svar : uten forklaring ansees ja/nei som potensielt tipping og telles som følger : riktig svar gir + 0,2 poeng, feil svar gir -0,2 poeng (trekk!). 1. Er kolonneblødning et typisk problem ved GLC? 2. I TLC brukes tilsats-stoffet F 254 som moderator for aktiviteten av plata Ja/ Ja nei, fordi. SF væske har alltid litt damptrykk, og når kolonne-temperaturen øker kraftig øker også innholdet af SF i bæregassen. Denne transporteres da ut av kolonna = kolonnebløding, til detektoren som detekterbart konstant signal. F254 er det fluorescerende stoff i sjiktet for fluoresiserer ved bestråling med UV-lys (m.fluorec.lampe) 3. Ved superkritisk fluid kromatografi brukes restriktoren bak (nedstrøms for) flammeioniseringsdetektoren 4. Brukes C 2 som mobil fase mer innen SFC enn innen GLC? 5. Større Elektroosmose gir større separasjonen av analyttene i kapillærsoneelektroforese. 6. Eddy-diffusjon gir et viktig sonespredningsbidra i CZE. Ja FID er GC-detektor, derfor skal fluidet være avspennt til gass for å ufngere. restriktoren er mellom kolonna og før FID C2 brukes praktisk talt ikke ved GC (mest H2, He evt. N2 ved GC), men brukes mye i SFC Elektroosmose flytter alle analytter like fort, bidrar ikke aktiv til separasjon (evt. forkorter eller forlenger separasjonstid, og nedkorter (evt.forlenger) den tiden elektroforesen kan aktivt separere Eddy diff. finnes bare i pakkede systemer og CZE er åpen kolonne - ingen Eddy diff. 7. En molekylærsikt-plt-kolonne brukes til GSC. 8. Elektronaffinitetsdetektoren (ECD) har høy følsomhet for polyklorerte dibenzo-dioksiner (PCDD er). 9. Cellulose-TLC gir bedre separsjon enn papirkromatografi. 10. Aromatiske løsningsmidler er særlig egnet som HPLCelueringsmiddel for fluorescensdetektoren. Ja Ja Ja nei PLT er faststoff (molekylærsiktpulver) lagt på kolonnevegg i et kapillærrør, Gass faststoff Kro = GSC. ECD har god følsomhet på bl.a. klorerete og særlig på polklorerte forbondelser. Papir har grovere fibre, TLC har finere partikler, derfor mindre effektiv partikkeldiametetr og mindre sonespredning. Aromatiske lsm. har selv fluorescens i UV-område; der fluorescensdetektoren oftest har eksiterings-lyset fra, og aromatiske løsningsmidler absorberer sterkt eksistasjonslyset fungerer som filter, at det ikke blir nok lys igjen til analytt. fortsetter på neste side Vers.18.06.2012 01:43:00 p.m. ; prt. 03.05.2013, 11:13:42

Side 14 av 14 (ppgave 7 fortsetter) Gi Ja/ svar pluss (nødvendig!) kort forklaring ("fordi "): (1 poeng pr. riktig og grunngitt svar: uten forklaring ansees ja/nei som potensielt tipping og telles som følger : riktig svar gir + 0,2 poeng, feil svar gir -0,2 poeng (trekk!). 11. Dersom t 0 = 0.75 min og forbindelse A eluerer ut med retensjonstid t R,A = 2,25 min, betyr det at ca 67 % av stoffet foreligger i mobil fase (MF). 12. Hydrofob(isk) interaksjonskromatografi (HIC) brukes hovedsakelig på små peptider og aminosyrer. Ja/Ne i, fordi. k = ( tr to) / to k= = 2,25 0,75 / 0,75 = 2 = n MF /N SF andel stoff i mobilfase det er 33 % (= R in %) HIC brukes typisk på makromolekyler som proteiner,evt (større) peptider, mindre anvendt for småmolekyler 13. En stasjonær GLC-fase med CPindex 85 er ganske upolar. 14. Platehøyden i kapillær-gc er mye lavere enn i pakket kolonne-gc og hovedårsak for den høye effektiviteten i kapillær-gc. 15. Når du bytter 0,1 M HCl ut med 0,1 M KCl som MF ved (kation-)ionebytterkromatografi på en sterk sur kationbytter reduseres retensjonen 16. En SF med konveks adsorpsjonsisoterm gir haledannelse (tailing) ved bruk i kromatografi 17. I GLC gir økt filmtykkelse av SF økt retensjon (andre parametre konstant) 18. Gradient-eluering i RP-LC skjer typisk ved lineær hastighetsøkning av MF-hastigheten. 19. Ved Ved HPLC bør det brukes eluenter med høy viskositet. 20. Er retensjonen av en dialkohol ved RP-HPLC sterkt avhengig av ph til mobilfasen Ja Ja ja CP=0 er upolar (som squalan) CP = 100 er veldig polar ( som V-275) CP= 85 må da vurderes som ganske polar Platehøyden er noe lavere, men ikke MYE lavere, og hovedårsaken for det store platetallet er primært da mye større kolonnelengden av WCT-kolonnen. Ved samme konsentrasjon og ladning av kationene i bufferen er det ionets selektivitet (rel. affinitet til fastionet) som bestemmer rel. retensjon av analyttionene. K binder sterkere enn H (er et større nakent ion) og har dermed større elueringsstyrke. (BS: Noen bruker surhet av 0,1M HCl som protonerer baser og øker retensjon på kationbyttere: Godtatt som 80% riktig. Men: bare liten uttelling for: syre pluss (svak) anionbytter = nøytralisering. Konveks isoterm betyr høyere adsorpsjon ved lavere konsetrasjoner enn ved høyere: Ved avtagende kons. ettter toppmaksimum øker da adsorpsjonen jo lengere etter maksimum - tailing Økt filmtykkelse (øvrige dimensjoner like) gjør k (som er = K*V SF /V MF ) Gradienteluering skjer typisk ved økning i elueringsstyrke / f.eks. lineært. Viskositeten skaper høyt mottrykk og er uønsket. Høy viskositet gir for de fleste analyser ingen fordel.. Alkoholgrppen er ikke så sterkt sur (eller basisk)at ph-variasjoner innenfor RP-HLC-området endrer retensjonen noe vesentlig. Vers.18.06.2012 01:43:00 p.m. ; prt. 03.05.2013, 11:13:43