Fastere filet - Aktivitet 2 MRI, protease og protein analyser Iciar Martinez 1,2, Rasa Slizyté 1, Pål Anders Wang 2,Stine W. Dahle 1, Michiaki Yamashita 3, Ragnar Olsen 2, Emil Veliuylin 1 og Ulf Erikson 1 (1), Brattørkaia 17B, N-7465 Trondheim, Norway (2) The Norwegian College of Fishery Science. University of Tromsø, N-9037, Norway (3) National Research Institute of Fisheries Science, 2-12-4 Fukuura, Kanazawa-ku Yokohama 236-8648, Japan May 2009 Iciar Martinez, Hell, 2009 1
Mål 1. Undersøke anatomi og fettfordeling ved MRI 2. Å identifisere forskjeller i Protein ekspresjon og Protease aktiviteter mellom bløt og Fast laksemuskel Iciar Martinez, Hell, 2009 2
Prøver B C Bløt strippet A A, B og C, uttak av prøver Iciar Martinez, Hell, 2009 3
MRI analyse: Hvit farge er fett Skinsiden Langsgående skan Ryggbeinet siden Fast Bløt Tversnitt av bløte stripen Iciar Martinez, Hell, 2009 4
Fiskeprøver for mål 2: protein og proteaser Gr n Opprinnelse Dato Gaping score Industritest kg + std cm + std II 1-5 Sør Q 26.05.08 1.6- Fast 5 3.3 + 0.9 63.2 + 5.2 VII 6-10 Nord C 27.05.08 2.8 Bløt 9 2.8 + 0.6 56.6 + 3.5 Iciar Martinez, Hell, 2009 5
Analyser Protease aktivitet (zymografi) Gelatinase aktivitet av ekstrakter Rå ekstrakter Etter gelatin-sefarose rensing Immunologiske deteksjon av Serin-proteaser Shock Protein 70 (HSP70) BRM-22 Alfa-aktinin Aktin Ubiquitin Myofibrilær protein ekspresjon Lav ionisk styrke Høy ionisk styrke Myosin tunge kjede Iciar Martinez, Hell, 2009 6
Gelatinase aktivitet RÅ ekstrakter Fast Bløt 1B 1C 2B 2C 3B 3C 4B 4C 5A 5B 5C 6B 6C 7B 7C 8B 8C 9B 9C 10A 10B 10C Iciar Martinez, Hell, 2009 7
Gelatinase aktivitet Etter gelatin-sepharose rensing Fast Bløt Iciar Martinez, Hell, 2009 8
Immunodeteksjon av 50 kda red seabream serine protease * * * * 1B 2B 3B 4B 5A 5B 6B 7B 8B 9B 10A 10B 1B 2B 3B 4B 5A 5B 6B 7B 8B 9B 10A 10B Fast Bløt Fast Bløt * * 1C 2C 3C 4C 5C 6C 7C 8C 9C 10C 1C 2C 3C 4C 5C 6C 7C 8C 9C 10C * Immunoreactive band Iciar Martinez, Hell, 2009 9
Immunodeteksjon av stressmarkører - HSP70 family 1C 2C 3C 4C 5C 6C 7C 8C 9C 10C 5A 5B 1B 2B 3B 4B 5A 5B 6B 7B 8B 9B 10A 10B Fast Bløt Fast Bløt 10A 1C 2C 3C 4C 5C 6C 7C 8C 9C 10C 10B 1C 2C 3C 4C 5C 6C 7C 8C 9C 10C Iciar Martinez, Hell, 2009 10
Immunodeteksjon av ubiquitin-ubiquitinated proteiner 3B 4B 5A 5B 8B 9B 10A 10B 3C 4C 5C 8C 9C 10C Mgst 3B 4B 5A 5B 8B 9B 10A10B 3C 4C 5C 8C 9C 10C Iciar Martinez, Hell, 2009 11
Immunodeteksjon av α-aktinin, aktin og MHC Std 10a1310b 1 21b 32b 43b 54b 65a75b 86b 97b 108b119b12 1b 2b 3b 4b 5a 5b 6b 7b 8b 9b 10a 10b Anti α-actinin 188 98 62 49 Anti-actin 38 28 17 14 6 3 Ponceau S stained blot 1b 2b 3b 4b 5a 5b 6b 7b 8b 9b 10a 10b 188 Anti-myosin heavy chain 62 Western blots from NuPage 4-12% SDS-PAGE gels probed with the indicated antibodies 6 3 Iciar Martinez, Hell, 2009 12
Protein sammensettinglav ioniskestyrke ekstrakter Fast 1B 1C 2B 2C 3B 3C 4B 4C 5A 5B 5C Iciar Martinez, Hell, 2009 Bløt 6B 6C 7B 7C 8B 8C 9B 9C 10A 10B10C 13
Protein sammensettinghøy ioniskestyrke ekstrakter Fast Bløt 6B 6C 7B 7C 8B 8C 9B 9C 10A 10B10C 1B 1C 2B 2C 3B 3C 4B 4C 5A 5B 5C Iciar Martinez, Hell, 2009 14
Ekspresjon av myosin tunge kjede isoformer Fast Bløt 1B 1C 2B 2C 3B 3C 4B 4C 5A 5B 5C 6B 6C 7B 7C 8B 8C 9B 9C 10A 10B 10C Iciar Martinez, Hell, 2009 15
Konklusjoner Det finnes individ-variasjoner i de fleste analyser Ikke synlige forskjeller mellom fast og bløt laks i immunodeteksjon av 50 kda red seabream serine protease HSP70-family Alfa-actinin, actin og MHC Ubiquitinerte proteiner Iciar Martinez, Hell, 2009 16
Konklusjoner Forskjeller mellom fast og bløt laks Gelatinase aktivitet: MMPs i bløt laks er aktivert Protein sammensetning i lav- og høy-ionisk styrke ekstrakter Ekspresjon av myosin tunge kjede Andre interessante resultater Høyre signal av ubiquitinerte proteiner i B enn i C i en utvalg av prøver Iciar Martinez, Hell, 2009 17
Informasjon Forskjeller i protein isoform ekspresjon og aktiverte MMPs kan tillegges Utviklingsstadium Rekruttering av nye muskelfibrer (aktivering av satellitt celler) Myofibrill metabolisme og ATPase aktivitet Muskel degenerering/regenerering/vekst (*) Treningsregime aktivitetsmønster(*) Christiansen, J.S., Martinez, I., Jobling, M. & Amin, A.B. (1992) Rapid somatic growth and muscle damage in a salmonid fish. Basic and Applied Myology, 2: 235-239. Iciar Martinez, Hell, 2009 18
Fremtidig arbeide Undersøke nærmere forskjeller i gelatinase aktivitetsregulering Bekrefte forskjeller i ubiquitination mellom B og C Undersøke årsaker for forskjeller i myofibrill protein ekspresjon i muskel For å: Predikere bløt tekstur i fisken (f.e. biopsiprøver) For å unngå fenomenet Iciar Martinez, Hell, 2009 19
Iciar Martinez, Hell, 2009 20