KJ2050 Analytisk kjemi, GK Kromatografi Litt skryting om kromatografi 1
(i) Extreme High Resolution LC : Proteomics (E. Coli proteome) 41,5-timers analyse (gradient)! På en monolitisk (porøs/pakket) kapillærkolonne for LC 35 cm lang, 0,1 mm indre diameter. Identifisert: 16.000 peptider og 2.200 proteiner in one single analysis - by LC/MS/MS, d.v.s. Med noe ekstrahjelp fra massespektrometri for identifikasjonsjobben I tillegg til HPLC separasonen. Fig. from Miyamato et.al. in "Extreme Chromatography Faster, Hotter, Smaller", editors Brydwell & Holcapek (2011), p.190, Fig 5.10. Iwasaki et al., 2010) = Iwasaki M, Miwa S, Ikegami T, Tomita M, Tanaka N, Ishihama Y: Analyt. CHem. (2010), 82, 2616-2620. 2 2
(ii) UHPLC analyser - raskt : For a): For b) : 90 C, 1,8 ml/min (t 0 = ca. 1,5 s ), isokratisk : Acetonitril : vann 1:1 (v/v) 90 C, 1,8 ml/min (t 0 = ca. 1,5 s ), gradient m. Acetonitril : vann 1:1 (v/v, m. 0,1% maursyre) RP-C18-kolonne: 50 mm lang, 2,1 mm i. diam, (lignende, de samme dimensjoner) 1.7 μm partikler, Prøve: "4 preservatives". Prøve: «noen steroider" Tid for separasjonen/en analyse: 10 sec (netto) Tid for : 45 sec (netto) Fig. fra Guillarme &Veuthey, in "Extreme Chromatography Faster, Hotter, Smaller", editors Brydwell & Holcapek (2011), p.16, Fig 1.6 (text in fig 1.7). (Original i : Nguyen et al., 2007) = Nguyen DDT, Guillarme D, Heinisch S, Barrioulet MP, Rocca JL, Rudaz S & Veuthey JL; J.Chro. A (2007), 1167, 76-84. N.B.: korrigert i forh. til boken: Korrekt tekst til denne figuren! 3 3
(iii) Høyhastighets GC (ikke et veldig ekstremt eksempel, faktisk) Prøve: 31 purgable organics ( løsningsmidler ). ANALYSIS TIME: in 2.5 min Temperaturprogram: 30 C(i 37s) 35 /min 90 C 2 ulike serie-koblede kolonner (begge 5m x 0,25mm med 0,25 µm film : hhv. upolar DB-5- siloksan og polar StableWax stajsonærfase. Egen trykkregulering i forbindelsespunktet, mellom kolonnene. Fig. 31F-3 fra: A.D.C. Skoog & al., FoAnCh. 8th (2004): p. 969 1003 - Ch.31. Tittel av original-artikkelen: Column Selectivity Programming and Fast Temperature Programming for High-Speed GC Analysis of Purgeable Organic Compounds 4 4
(iv) Ultra-raskt GC (dette er et ekstremt eksempel) Isotermisk analyse, (Forsknings/-demonstrasjons-eksempel), med ikkekommersielt tilgjengelig utstyr (N.B. publisert i 1988) Prøve diverse løsningsmidler ANALYSE-TID : 0,5 sec (netto) van Es &al, JHRCCC 11, 852 (1988) (som vist i Korytar & al. Trends in Analyt. Chem. 21, p.558 (2002)) 5 5
Mye større separasjonsevne tilgjengelig ved 2-dimensjonale kromatografiske separasjoner Spesielt ved fulle 2D-analyser - Comprehensive 2D separations : Små-fraksjoner fra utgangen til den første (lange, langsomme ) kolonnen blir fortløpende oppsamlet og umiddelbart overført til, og analysert i, en kort, meget rask kolonne nr. 2 (med fortrinnsvis helt andre separasjons-egenskaper). Et 2-D-kromatogram blir så "(re-)konstruert" fra rekken av kromatogrammer fra andre-dimensjons-kolonnen. Ideelt kan separasjons-evnen ( Topptall-kapasiteten, eng.: "Peak capacity") bli : n 2D n 1 x n 2 d.v.s. opptil produktet av kapasitetene av enkeltkolonnene. I tillegg, så gjør ofte 2D-analyser informasjon synlig som ikke kan vises i bare 1 dimensjon (se eksempel (vi)). Ulike kromatografiteknikker har blitt koblet slikt : LCxLC, GCxGC, LCxGC. 6 6
Mye større separasjonsevne tilgjengelig ved 2-dim. kromatografiske separasjoner (v) Comprehensive 2D LC/LC : Eksempel: Comprehensive 2-D HPLC av triglyserider (TAC, triacylglyseroler) "1.dimensjon": X-akse; sakte, nesten 6 timer : Separsjonsprinsipp = "Argentation" (Ionebytter-kolonne i sølv-form separerer etter antall C=C-dobbeltbindinger i analyttene.) "2.dimensjon": Y-akse; raskt, bare 1,2 min : Separsjonsprinsipp = omvendt-fase (RP-18- kolonne, upolar SF) (Separerer omtrent etter samlet fettsyre-kjede-lengde, "antall karbonatomer «.) Fig. 6. Contour plots of corn oil constructed on the basis of the TIC chromatogram. Dots represent peaks detected automatically by the software. (a) Total contour plot. Dots remaining unlabeled correspond to peaks that could not be identified by manual inspection of the MS. Dashed lines refer to the PN, numbers at the bottom to the DB number; (b) expansion of contour plot in (a). ( ) Adapted from: Van der Klift & al, Journ. Chromatography A 1178, 43-55 (2008) 7 7
Mye større separasjonsevne tilgjengelig ved 2-dim. kromatografiske separasjoner (vi) Comprehensive 2D GC/GC : Eksempel: Comprehensive 2-D HPLC av organo-svovel forbindelser i petrokjemi (her i FCC-diesel ) Det er brukt svovel-selektiv detektor her. "1.dimensjon": x-akse; sakte, 130 min: (Upolar GC-kolonne, separerer omtrent etter kokepunkt). "2.dimensjon": y-akse; raskt, bare 10 sek/"fraksjon": (Polar GC-kolonne, separerer etter polaritet blant komponentene med lignende kokepunkt fra kol. 1) Fig. 1: 2D-GC Contour plot detected by S-selective GC detector (SCD) of Standard compounds Lines drawn through peaks of similar chemical structures. Fig. 2: FCC Diesel, showing grouping acc. to chemical relationship: from R to L: NaphtoBenzothiophenes (NBT), DiBenzoThiophenes (DBT), BenzoThiophenes (BT), ( ). Adapted from: Hua & al., J.Chro.A (2003), vol.1019, p111 8 8
Tilleggs-hjelp - meget anvendelig og mer og mer brukt : Adapted from: J.H. Gross, Mass Spectrom. (2011) "Live" kobling av kromatografi til spektroskopi/spektrometri Hjelp til identifikasjon (fra spektra-data) Hjelp med analyse av kromatografisk ikke- (eller dårlig) separerte topper (jfr. Eksempel (i) her: LC MS) Andre etablerte koblinger: GC-MS, LC-UV, GC-IR, GC-AES, LC-ICP-MS/GC-ICP-MS, LC-NMR... 9 9