Fastsetting av brytningspunkt ved resistensbestemmelse Villtypepopulasjon, Mikrobiologiske, Farmakologiske og kliniske kriterier Martin Steinbakk Avdeling for bakteriologi og infeksjonsimmunologi Divisjon for smittevern FHI, AFA Forelesning AFA-kurs 2015
Antibiotikaresistens og resistensbestemmelse. Noen begreper MIC Minimum inhibitory concentration MBC Minimum bactericidal concentration Agardiffusjon (hemningssone i mm) Resultatet tolkes som S, I eller R Sensitiv Midlet er aktivt ved vanlig dosering (tolkning: det er stor sannsynlighet for at mikroben vil svare på terapi med midlet) Resistent Midlet er ikke aktivt mot mikroben (tolkning: det er liten sannsynlighet for at mikroben vil svare på terapi med midlet) Intermediært følsom (el. usikkert resultat) Midlet er aktivt dersom det kan gis høye doser eller midlet konsentreres i infeksjonsfokus Usikkert resultat (teknisk buffersone )
Resistensbestemmelse MIC-bestemmelse Buljong-fortyning med MH (micro broth dilution) Referansemetode for resistensbestemmelse (ISO 20776-1 Part 1: Reference method for testing the in vitro activity of antimicrobial agents against rapidly growing aerobic bacteria involved in infectious diseases), 2006 Agar-fortynning Agar-gradientdiffusjon (Etest, MIC Test Strip, MICE ) Beregnet IC (fra brytningspunkt-metoder og automatiserte systemer) Agar-diffusjon Standard betingelser og gode tolkningskriterier (ie. EUCAST disk diffusion) Ficks diffusjonslover Beregnet IC (fra regresjonsligning) Resultatet tolkes som S, I eller R
Sammenhengen mellom mm hemningssone og MIC Fick s diffusjonslov Diffusjonskonstanten for et middel bestemmes av molekylstørrelse og mediets viskositet Temperatur Dannelse av hemningssone IC (inhibitory concentration) Kritisk tid (avhengig av inokulat og veksthastighet) Antibiotikakonsentrasjonen i agaren er omvendt proporsjonal med kvadratet av avstand fra diffusjonsentrum. For de fleste mikrober og antibiotika finnes det en IC som akkurat hemmer veksten og her vil hemningssonen dannes. Litteratur: Bakteriologiske undersøkelsesmetoder Kapittel 38, s 355-395. FADL,s Forlag 1979
EUCAST suggested updated definitions 2015
Hvordan bestemmer vi bakteriers følsomhet for antibiotika? Villtype-populasjoner Resistensmekanismer Definere følsomme og resistente populasjoner Farmakokinetikk og farmakodynamikk (PK/PD) Mikrobiologisk respons Klinisk respons Tolkning baseres på brytningspunkt (BP) S, I eller R som indikerer sannsynlighet for et gitt utfall
Wild type MIC distributions of target organisms and epidemiological cut-off values Wild type (WT) - EUCAST definition A micro-organism is defined as wild type (WT) for a species by the absence of acquired and mutational resistance mechanisms to the drug in question. A micro-organism is categorized as wild type (WT) for a species by applying the appropriate cut-off value in a defined phenotypic test system. The cut-off value will not be altered by changing circumstances Wild type micro-organisms may or may not respond clinically to antimicrobial treatment.
25 20 The tentative epidemiological breakpoint Canada E.coli and ciprofloxacin in ECO SENS 25 20 Sweden 15 15 10 10 5 5 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 25 20 Spain 25 20 E.coli ATCC 25933 vs Ciprofloxacin 10 µg 15 15 10 10 5 5 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 Slide by Gunnar Kahlmeter 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
Noof obs S.aureus- clinical isolatesvss.aureusatcc29213 125clinical isolatesvs. 125determinationsof onetypestrain 36 33 30 27 24 21 Linezolid S.aureus- clinical isolates S.aureusATCC29213 18 15 12 9 6 3 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 Zonediameter ( m) Slide by Gunnar Kahlmeter
Hvordan karakterisere mikrobers antibiotikafølsomhet? Påvise resistensmekanisme Populasjonsstudier (histogram) kan skille følsom og resistent bakteriepopulasjon Helbredelse versus MIC Mikrobiologisk effekt (mikroben blir borte) Klinisk effekt (pasienten blir bra)
Clinical classification Susceptible Intermediate Resistent No. of isolates MIC Low High Microbiological classification Susceptible Resistant Low-level Intermediate High-level Hypotethical distribution of MICs among strains of bacteria from infected patients classified as Clinically suscpetible, Intermediate or Resistant and Microbiologically Susceptible or Low-level, Moderately or Hig-level Resistant
Påvisning av resistensfaktor påvisning av resistens-gen eller resistens-protein Enkelt faktor som gir resistens Penicillinase hos S. auerus og andre mikrober (penicillinaseømfindtlige penicilliner) meca-protein hos S. aureus (penicilliner, cefalosporiner og karbapenemer) rpob-gen hos M. tuberculosis (rifampicin) Samspill mellom flere faktorer (i samme gen eller mellom ulike gener) gir samlet høy MIC-verdi Kinolonresistens (ofte flere mutasjoner i gyra, parc eller andre gener (qnr) ) Efflux (gir ofte lavgradig resistens når eneste faktor) Porintap (kan gi både lavgradig og høygradig resistens)
BP basert på MIC-fordeling (populasjonsbasert) Godt egnet ved bimodal fordeling med god separasjon av følsom og resistent populasjon (eller unimodal fordeling som for S. pyogenes og penicillin) Reduserer metodefeil ved resistensbestemmelse Skiller følsom vill-type populasjonen (WT) fra annen og mer resistent populasjon Bør danne basis for følsomhetskategorisering ved diffusjonsmetode
NORM Blood cultures E. coli 2002 (n=959)
BP- basert på farmakokinetikk og farmakodynamikk Farmakokinetikk og dyreeksperimentelle studier viser antibiotikas (og bakterienes) skjebne i vev (oftest hos mus) Tar også i betraktning ulike vertsfaktorer for å bestemme brytningspunkt (f. eks. må serumkonsentrasjonen av beta-laktamantibiotika overstige MIC i 40-50% av doseintervallet) Tar ikke hensyn til fordeling av bakteriepopulasjonen og kan introdusere metodefeil (BP som deler villtypepopulasjonen)
Pharmakodynamic parameters for Ciprofloxacin Enterobacteriaceae P. aeruginosa S. pneumoniae fauc/mic bacteriostasis fauc/mic 2 log drop fauc/mic clinical data 30-40 30-40 80-100 80-100 100 30-40 Cmax/MIC 12.2 EUCAST Rational document Ciprofloxacin v 1.9
fauc/mic Probabilities of Target Attainment (PTA) for 500 mg x 2 oral 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 Ciprofloxacin 500 mg x 2 oral 95% percentile 99% percentile mean 0 0.25 0.5 1 2 4 8 MIC mg/l 2 teoretiske mål (target attainment), 35 og 20 The following pharmacokinetic parameters were used to obtain the PTA: Volume of Distribution (Vd): 180L, CV 17% Clearance (Cl): 31 L/h, CV 17%Fraction unbound (Fu): 70% Absorption rate coefficient (Ka): 2h-1 Bioavailability (F): 0.8, CV 12 % Results of simulations for the 400 mg x 2 iv dose do not markedly influence conclusions. EUCAST Rational document Ciprofloxacin v 1.9
fauc/mic fauc/mic 4. Using available Pk/Pd data, Monte Carlo simulations are performed and a Pk/Pd breakpoint calculated based on conventional dosing regimens 200 180 ciprofloxacin 500 mg q12h oral 160 140 120 100 80 60 99% CI Average 40 20 0 0.25 0.5 1 2 4 8 MIC mg/l 200 180 levofloxacin 500 mg q24h oral 160 140 120 100 80 60 99% CI Average 40 20 0 0.25 0.5 1 2 4 8 MIC mg/l S < 0.25 mg/l For S. pneumoniae Pk/Pd S < 1 mg/l
4. Using available Pk/Pd data, Monte Carlo simulations are performed and a Pk/Pd breakpoint calculated based on conventional dosing regimens
S < 0,125 mg/l R > 2 mg/l
BP basert på bakteriologisk respons Proof of the pudding? Mikroben forsvinner hvordan har pasienten det? Oppfølgende prøve er ofte vanskelig el. uetisk å få tatt Hvilken mikrobe er årsak til infeksjonen? Luftveisinfeksjoner Må baseres på gode kvantitative data (mm eller MIC) SIR-kategorier ikke godt nok
Sammenheng mellom mikrobiologisk respons og MIC ved nosokomial pneumoni et eksempel
BP basert på klinisk respons Proof of the pudding? Pasienten blir bra av infeksjonen, men hva skjedde med mikroben og hadde antibiotika noe med resultatet å gjøre F. eks LVI, H. influenzae og makrolider Det er jo bakterien vi måler (resistens-bestemmer) og ikke egenskaper ved pasienten Vanskelig å skaffe gode data Krever gode kvantitative resistensdata Slike data er avgjørende for evaluering av behandlingseffekt (og indirekte resultat av resistensbestemmelse)
Percent Relationship Between Ciprofloxacin AUC:MIC and Efficacy in Treating Bacterial Pneumonia Forrest, AAC 37:1073. 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Clinical Cure Eradication 0-62.5 62.5-125 125-250 250-500 >500 24 hr AUC:MIC
NF-M 2001 Dicloxacillin dose vs. Time > MIC of free (non-proteinbound) concentration Dose Time > MIC in h in % of dosing interval 1 g x 3 1.8 2.8 23-35 % 1 g x 4 - - 30-47 % 2 g x 3 2.4 3.6 30-45 % 2 g x 4 - - 40-60 % T½ = 0.6-0.8 h; Vd= 0,13-0,19 l/kg; Prot.bind.= 91-98 %; MIC-s.a.= 0,4
Treatment and outcome of S. aureus bacteremia: A prospective study of 278 cases Jensen AG et al. Arch Intern Med, 2002, 162: 25-32. + Risk factor Died/total,% -Risk factor Died/total,% Univariate P Focus not eradicated 42/125 34% 4/61 7% 7.2 <0.001 Septic shock 18/38 47% 28/148 19% 3.9 0.001 Diclox daily dose < 4g 40/142 28% 6/44 14% 2.5 0.02 Age > 60 y 32/96 33% 14/90 16% 2.7 0.006 NF-M 2001
Momenter ved valg av metode for resistensbestemmelse Biologisk variasjon innen en gruppe, slekt eller art mellom bakterieslekter Metodens egnethet Valgt metode må kunne skille mellom følsomme og resistente stammer Enkelte midler er bedre egnet til å påvise følsomhet enn andre innen samme legemiddelgruppe
0.064 0.125 0.25 0.5 1 2 4 8 16 32 64 128 No of isolates Måleunøyaktighet og biologisk variasjon - MIC for WT viser genusspesifikk variasjon Distribution of MIC-values 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 E. coli P. aeruginosa MIC (mg/l) Gentamicin
Relationship between max. Peak/MIC ratio and the rate of clinical response for aminoglycosides Response rate, % Moore et.al. J Infect Dis, 1987, 155: 93 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 2 4 6 8 10 12 NF-M 2001 Maximum Peak/MIC ratio
ant. Måleunøyaktighet og biologisk variasjon - gjentatte analyser gir ulike svar, WT (Wild type) Ampicillin 10 ug 15 Ampicillin 10 ug lapp 10 5 0 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 WT -5-10 H. influenzae BLNAR ATCC WT mm hemningssone
Cefuroxim 30 ug lapp Cefuroxime 10 8 6 WT 4 CXM 2 CXM atcc 0 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52-2 -4 H. influenzae BLNAR -6
Blood cultures E. coli 2002 (n=959) Beta-laktamase-positive isolat
Blood cultures E. coli 2002 (n=959)
Blood cultures E. coli 2002 (n=959) BP basert på Pk/PD
Blood cultures Klebsiella spp 2002 (n=352) R Alle Klebsiella spp har kromosomal kl A bla og er resistente for Ampicillin
EUCAST definitions of clinical breakpoints Clinically Susceptible (S) a microorganism is defined as susceptible if inhibited in-vitro by a concentration of an antimicrobial agent that is associated with a high likelihood of therapeutic success a microorganism is categorized as susceptible (S) by applying the appropriate breakpoint in a defined phenotypic test system. Clinically Intermediate (I) a microorganism is defined as intermediate by a level of antimicrobial agent activity associated with uncertain therapeutic effect. - It implies that an infection due to the isolate may be appropriately treated in body sites where the drugs are physically concentrated or when a high dosage of drug can be used; -it also indicates a buffer zone that should prevent small, uncontrolled, technical factors from causing major discrepancies in interpretations. a microorganism is categorized as intermediate (I) by applying the appropriate breakpoints in a defined phenotypic test system Clinically Resistant (R) a microorganism is defined as resistant if inhibited in-vitro by a concentration of an antimicrobial agent that is associated with a high likelihood of therapeutic failure a microorganism is categorized as resistant (R) by applying the appropriate breakpoint in a defined phenotypic test system. Clinical breakpoints may be altered with legitimate changes in circumstances Clinical breakpoints are presented as S<x mg/l; I>x, <y mg/l; R>y mg/l
EUCAST wild type MIC distributions and epidemiological cut-off values the concept EUCAST developed the concept of antimicrobial wild type MIC distributions and epidemiological cut-off values (JAC 52:145-148, 2003). Software was created to receive and display large volumes of MIC data for bacteria and fungi over the internet. It is freely available at http://www.eucast.org. Distributions are displayed in an aggregated format. Tables and graphs show the part of the MIC distribution which, when EUCAST has defined the epidemiological cut-off value, is considered the wild type distribution. The epidemiological cut-off value separating microorganisms without (wild type) and with acquired or mutational resistance (non-wild type) and clinical breakpoints are shown on the bottom line of the graph. The epidemiological cut-off value (left lower corner) is shown as WT X mg/l. The clinical breakpoints (right lower corner) are shown as S Y mg/l and R> Z mg/l.
MIC Error rate method fra MIC til mm ved regresjonsanalyse 8 R MiE Very Major Errors, VME R 4 2 I 1 MiE I 0,5 Minor Errors, MiE 0,25 S 0,12 Major 0,06 MiE S Errors 0,03 14 16 18 20 24 28 30 36 38 40 42 44 46 48 mm
Brytningspunkt ~ tolkningskriterier ved resistensbestemmelse S - indikerer stor sannsynlighet for terapeutisk suksess R - indikerer stor sannsynlighet for manglende terapeutisk suksess Kunnskap om mikrobe og antibiotikum MIC-distribusjon (histogram) er nødvendig Kunnskap om antibiotikums farmakokinetikk og dynamikk Monte Carlo simulering Kunskap om terapirespons Mikrobiologisk respons og klinisk respons Kunnskap om en metodes egnethet til å måle mikrobers antibiotikafølsomhet eller påvise resistens
EUCAST NordicAST og AFA The EUCAST websites are accessed via www.eucast.org This is a section of the official ESCMID website giving details of all EUCAST activities including - constitution, organisation, committee members, meetings - EUCAST documents - clinical MIC breakpoint tables - MIC distributions for wild type bacteria and fungi - epidemiological MIC cut-off values NordicAST http://www.nordicast.org www.antibiotikaresistens.no Direkte til AFA http://www.unn.no/afa/category10274.html
Antimicrobial concentration (mg/l) 0 32 16 8 4 2 1 0,5 0,25
Agar gradient-diffusjon