COBAS TaqMan MTB Test

COBAS TaqMan MTB Test FOR BRUK TIL IN VITRO-DIAGNOSTIKK. COBAS TaqMan MTB Test CTM MTB 48 Tests P/N: 04803531 190 AMPLICOR Respiratory Specimen Preparation Kit RSP PREP 100 Tests P/N: 20756903 122 ART: 07 5690 3 US: 83267 TILTENKT BRUK COBAS TaqMan MTB-testen er en in vitro nukleinsyreamplifikasjonstest til kvalitativ deteksjon av Mycobacteria tuberculosis (MTB)-kompleks-DNA i humane luftveisprøver som er gjort flytende, dekontaminert og oppkonsentrert, inkludert sputum og BAL (bronkeoalveolære utskyllinger). Testen benytter AMPLICOR Respiratory Specimen Preparation Kit for manuell prøvepreparering og COBAS TaqMan 48-analysatoren for automatisert amplifikasjon og deteksjon. SAMMENDRAG OG FORKLARING AV TESTEN De ulike medlemmene av Mycobacterium-genuset er syrefaste, ikke-motile aerobe bakterier som ikke danner sporer. De omfatter flere arter som er patogene for mennesker. Mange mykobakteriearter er jord- og vannsaprofytter. De viktigste humanpatogenene er arter innen M. tuberculosis-komplekset (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum og M. microti) og M. leprae. M. tuberculosis er det viktigste mykobakterielle patogenet og finnes kun hos mennesker. Tuberkulose (TB) er en smittsom sykdom. Den spres i luften på samme måte som vanlig forkjølelse. Kun mennesker som har TB i lungene er smittebærere. Når smittebærende personer hoster, nyser, snakker eller spytter, skytes tuberkelbasiller ut i luften. En person trenger bare å inhalere en liten mengde av disse for å smittes. Totalt er en tredel av jordens samlede befolkning smittet av tuberkulosebakterien. Av de personene som er smittet med tuberkelbasiller, blir 5 10 % syke eller smittebærende på et eller annet tidspunkt i livet. Det antas at 1,7 millioner dødsfall i 2004 skyldtes tuberkulose. Det høyeste antallet sykdomstilfeller og estimerte dødsfall er i Sørøst-Asia-regionen, mens den høyeste dødeligheten i forhold til innbyggertallet finnes i Afrika-regionen, hvor HIV har ført til rask økning i prevalensen av tuberkulose og en økning i sannsynligheten for å dø av tuberkulose. WHOs mål, ratifisert av World Health Assembly i 1991, er å oppdage 70 % av nye tilfeller av infeksiøs tuberkulose og å helbrede 85 % av tilfellene som oppdages, innen 2005. Atten land oppnådde disse målene allerede i 2002 1-5. På grunn av risikoen for spredning av sykdommen, faren for at det skal utvikles medikamentresistente stammer samt sykdommens alvorlighetsgrad hos HIV-1-smittede pasienter, er rask diagnose av M. tuberculosiskomplekset svært viktig. En definitiv tuberkulosediagnose krever isolering av en organisme fra M. tuberculosis-komplekset. Rutinemessig dyrkning er tidkrevende, og det kan ta opptil åtte uker. En mikroskopisk undersøkelse av utstryk av syrefaste bakterier er den raskeste metoden for deteksjon av mykobakterier, men den er lite sensitiv og uspesifikk. Immunologiske og serologiske teknikker er begrenset på grunn av dårlig sensitivitet og/eller spesifisitet 6,7. Utviklingen av PCR-baserte tester som er spesifikke for mykobakterier, har vist seg å gi en ytterligere forbedring av rask diagnostikk av tuberkulose ved at de muliggjør direkte deteksjon av mykobakterier i kliniske prøver 8-14. TESTPRINSIPPER COBAS TaqMan MTB-testen er basert på to hovedprosesser: (1) manuell prøvepreparering for å isolere MTB DNA, (2) samtidig PCR-amplifikasjon av mål-dna ved hjelp av komplementære primere og deteksjon av mål-dna gjennom splitting av dobbel-fluoroformerkede oligonukleotidprober 15,16. Sammen muliggjør disse prosessene deteksjon av det amplifiserte produktet av mål-mtb (amplikon) og Mycobacteriuminternkontroll-DNA, som amplifiseres og detekteres samtidig med prøven. Master Mix-reagenset inneholder et primerpar som brukes for å amplifisere en genusspesifikk region av kromosomet, og spesifisitet for M. tuberculosis-komplekset (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum og M. microti) oppnås ved hjelp av en dobbelmerket deteksjonsprobe for målsekvensen. Det samme primerparet brukes for å amplifisere internkontroll-dna. Deteksjonen av amplifisert DNA utføres ved å benytte målspesifikke og internkontrollspesifikke dobbelmerkede oligonukleotidprober som gir uavhengig identifisering av MTB-amplicon og Mycobacterium-internkontrollamplicon. Avsnittet for informasjon om dokumentrevisjon er plassert ved slutten av dette dokumentet. 05175020001-04NO 1 Doc Rev. 4.0

Prøvepreparering Sputum- og BAL-prøver som er gjort flytende og dekontaminerte i NALC/NaOH 17 vaskes med vaskeløsning for respiratoriske prøver. Organismene lyseres ved inkubasjon i lyseringsreagens for respiratoriske prøver, og prøven gjøres klar til amplifikasjon ved at det tilsettes nøytraliseringsreagens for respiratoriske prøver. PCR-amplifikasjon Valg av mål Mycobacterium-genomet inneholder en høykonservert region på cirka 1500 nukleotider som koder genet for 16S rrna. COBAS TaqMan MTB-testen benytter Mycobacterium-genusspesifikke primere som definerer en sekvens innenfor denne regionen 18. Målamplifikasjon PCR-amplifikasjon finner sted i K-rør eller K-trays hvor preparerte prøver tilsettes til amplifikasjonsblandingen. Reaksjonsblandingen varmes opp for å denaturere det dobbelttrådede DNA og eksponere primermålsekvensene. Når blandingen kjøles ned, hybridiserer primerne til målsekvensene. I nærvær av Mg 2+ og deoksynukleotidtrifosfater (dntp) i overskudd forlenger Z05 DNA-polymerasen de hybridiserte primerne langs måltemplatene og produserer et dobbelttrådet DNA-molekyl som kalles et amplicon. COBAS TaqMan 48- analysatoren gjentar denne prosessen automatisk i et bestemt antall sykluser, der hver syklus skal doble mengden amplicon-dna. Ønsket antall sykluser er forhåndsprogrammert i COBAS TaqMan 48- analysatoren. Amplifikasjonen skjer kun i området mellom primerne på MTB-genomet. Hele MTB-genomet amplifiseres ikke. Internkontrollamplifikasjon I enzymbaserte amplifikasjonsprosesser som PCR, kan hemmere som kan finnes i den kliniske prøven, redusere effektiviteten. Internkontrollen gir mulighet til å identifisere preparerte prøver som inneholder substanser som kan interferere i PCR-amplifikasjonen. Mycobacterium-internkontrollen er et ikke-infeksiøst, rekombinant linearisert plasmid-dna med primerbindende regioner identiske med dem i M. tuberculosismålsekvensen, en randomisert intern sekvens med tilsvarende lengde og basesammensetning som M. tuberculosis-målsekvensen, og en unik probebindende region som gjør det mulig å skille Mycobacteriuminternkontrollen fra målamplicon. Disse egenskapene er valgt for å sikre en likeverdig amplifikasjon av Mycobacterium-internkontrollen og mål-dna fra M. tuberculosis. Mycobacterium-internkontrollreagenset er inkludert i COBAS TaqMan MTB-testen og tilsettes til hver amplifikasjonsreaksjon og koamplifiseres med MTB-DNA fra den kliniske prøven. Mycobacterium-internkontrollen er utviklet for å sikre identifikasjon av prøver som inneholder hemmere som kan interferere i amplifikasjon og deteksjon av MTB-målsekvensen. Selektiv amplifikasjon Selektiv amplifikasjon av målnukleinsyre fra prøven oppnås i COBAS TaqMan MTB-testen ved hjelp av AmpErase (uracil-n-glykosylase)-enzymet 19 og deoksyuridintrifosfat (dutp). AmpErase-enzymet gjenkjenner og katalyserer destruksjon av DNA-tråder som inneholder deoksyuridin, men ikke DNA som inneholder tymidin. Deoksyuridin finnes ikke i naturlig forekommende DNA, men finnes alltid i amplicon på grunn av bruken av deoksyuridintrifosfat som en av dntp-ene i Master Mix-reagenset. Det er derfor kun amplicon som inneholder deoksyuridin. Deoksyuridin gjør kontaminerende amplicon mottakelig for destruksjon av AmpErase-enzymet forut for amplifikasjon av mål-dna. Uspesifikke produkter som oppstår etter innledende aktivering av Master Mix med magnesium, ødelegges av AmpErase-enzymet. AmpErase-enzymet, som inngår i Master Mix-reagenset, katalyserer nedbrytning av DNA som inneholder deoksyuridin, ved å bryte deoksyuridingruppens deoksyribosekjede ved C1-posisjonen. Ved temperaturøkningen i det første varmetrinnet ved alkalisk ph i Master Mixen, brytes amplicon-dna-kjeden der deoksyuridinet finnes, noe som fører til at DNA ikke lenger er amplifiserbart. AmpErase-enzymet er inaktivt ved temperaturer over 55 ºC, dvs. gjennom alle termosykliske trinn, og derfor blir ikke målamplicon som dannes under amplifikasjon ødelagt. Deteksjon av PCR-produkter i COBAS TaqMan -testen COBAS TaqMan MTB-testen anvender sanntids PCR-teknologi. Bruken av dobbel-fluoroformerkede prober sørger for sanntidsdeteksjon av akkumulert PCR-produkt ved å måle emisjonsintensiteten av rapporteringsfluorescensen som frigjøres under amplifikasjonsprosessen. Probene består av MTB- og Mycobacteriuminternkontrollspesifikke oligonukleotider merket med en rapporteringsfluorofor og en slukkerfluorofor. I COBAS TaqMan MTB-testen er probene for henholdsvis MTB og Mycobacterium-internkontroll merket med forskjellige rapporteringsfluoroforer. Når de dobbel-fluoroformerkede probene er intakte, undertrykkes rapporteringsfluorescensen på grunn av nærheten til slukkerfluoroforen gjennom energioverføringer av Förster-type. Under PCR hybridiserer proben til en målsekvens og splittes av 5' til 3' eksonukleaseaktivitet hos den termostabile Z05 DNA-polymerasen. Så snart rapporterings- og slukkerfluoroforene er frigjort og separert, forekommer det ikke lenger slukking, og rapporteringsfluoroforens fluorescerensaktivitet øker. Amplifikasjonen av MTB-DNA og Mycobacterium-internkontroll-DNA måles uavhengig av hverandre ved ulike bølgelengder. Denne prosessen gjentas et visst antall sykluser, der hver syklus effektivt øker emisjonsintensiteten hos de individuelle rapporteringsfluoroforene og gir en uavhengig identifikasjon av MTB-DNA og internkontroll-dna. 05175020001-04NO 2 Doc Rev. 4.0

REAGENSER AMPLICOR Respiratory Specimen Preparation Kit RSP PREP AMPLICOR prepareringskit for respiratoriske prøver (P/N: 20756903 122; ART: 07 5690 3; US: 83267) RW (vaskeløsning for respiratoriske prøver) Tris-HCl buffer < 1 % solubiliserende middel EDTA 0,05 % natriumazid RL (lyseringsreagens for respiratoriske prøver) 0,2 % natriumhydroksid < 1 % solubiliserende middel EDTA 0,05 % natriumazid RN (nøytraliseringsreagens for respiratoriske prøver) Tris-HCl-buffer Magnesiumklorid 0,05 % natriumazid COBAS TaqMan MTB Test CTM MTB (P/N: 04803531 190) Kontrollreagenser MYCO IC (Mycobacterium-internkontroll) Tris-HCl-buffer < 0,001 % ikke-infeksiøst plasmid-dna (mikrobielt) som inneholder Mycobacterium-primerbindende sekvenser og en unik probebindende region < 0,005 % Poly ra RNA (syntetisk) EDTA Amarantfarge 0,05% natriumazid MTB (+) C [M. tuberculosis positiv kontroll] Tris-HCl-buffer < 0,001 % ikke-infeksiøst plasmid-dna (mikrobielt) som inneholder MTB-sekvenser < 0,005 % Poly ra RNA (syntetisk) EDTA 0,05 % natriumazid MYCO ( ) C [Mycobacterium negativ kontroll] Tris-HCl-buffer < 0,005 % Poly ra RNA (syntetisk) EDTA 0,05 % natriumazid 100 tester 2 x 25 ml 3 x 6 ml 2 x 5 ml 48 tester 4 x 0,1 ml 1 x 0,75 ml 1 x 0,75 ml 05175020001-04NO 3 Doc Rev. 4.0

Amplifikasjons- og deteksjonsreagenser MTB MMX (COBAS TaqMan MTB Master Mix) 4 x 12 tester Tricinbuffer 4 x 0,46 ml Kaliumacetat Kaliumhydroksid Dimetylsulfoksid Glyserol < 0,001 % datp, dctp, dgtp, dutp < 0,001 % MTB-primere < 0,001 % fluoroformerkede oligonukleotidprober spesifikke for MTB og Mycobacterium-internkontroll < 0,001 % oligonukleotid aptamer < 0,05 % Z05 DNA-polymerase (mikrobiell) < 0,1 % AmpErase (uracil-n-glykosylase)-enzym (mikrobielt) 0,09% natriumazid MYCO Mg 2+ (Mycobacterium magnesiumreagens) 4 x 12 tester < 1,0 % magnesiumacetat 4 x 0,2 ml 0,09 % natriumazid ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER A. FOR BRUK TIL IN VITRO-DIAGNOSTIKK. B. Denne testen skal kun brukes sammen med sputum eller BAL som er gjort flytende, dekontaminert og oppkonsentrert ved hjelp av NALC-NaOH 17 -metoder. C. Ikke pipetter med munnen. D. Ikke spis, drikk eller røyk i laboratoriets arbeidsområder. Bruk beskyttende engangshansker, laboratoriefrakk og vernebriller når du håndterer prøver og reagenser. Vask hendene nøye etter håndtering av prøver og reagenser. E. Unngå mikrobiell kontaminering av reagensene når du pipetterer ut porsjoner fra reagensflasker. F. Bruk av sterile engangspipetter og pipettespisser anbefales. G. Reagenser fra ulike lot eller ulike flasker innen samme lot må ikke slås sammen. H. Reagenser fra ulike kit må ikke blandes. I. Kast ubrukte reagenser, avfall og prøver i henhold til nasjonalt, regionalt og lokalt regelverk. J. Kit som er utgått på dato må ikke brukes. K. Dataark om materialsikkerhet (MSDS) kan på forespørsel sendes fra ditt lokale Roche-kontor. L. Prøver og kontroller må håndteres som infeksiøse, og sikre laboratorierutiner må følges. Disse er beskrevet i Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 20 og CLSI-dokumentet M29-A3 21. Rengjør og desinfiser alle arbeidsoverflater nøye med en nylaget løsning av 0,5 % natriumhypokloritt i deionisert eller destillert vann. MERK: Kommersielt tilgjengelig blekemiddel til husholdningsbruk inneholder normalt natriumhypokloritt med en konsentrasjon på 5,25 %. En fortynning i forholdet 1:10 med et slikt blekemiddel gir en 0,5 % natriumhypoklorittløsning. M. RW, RL, RN, MTB MMX, MYCO Mg 2+, MYCO IC, MTB (+) C og MYCO ( ) C inneholder natriumazid. Natriumazid kan reagere med bly- og kobberrør og danne svært eksplosive metallazider. Hvis løsninger som inneholder natriumazid helles ned i avløp i laboratoriet, må de skylles ned med store mengder vann for å unngå azidoppbygging. N. Rør med skrukork må brukes til preparering av prøver og kontroller for å forhindre søl og mulig krysskontaminering av prøver. Ikke bruk rør med snapplokk. O. Bruk vernebriller, laboratoriefrakk og engangshansker ved håndtering av reagenser. Unngå kontakt med hud, øyne eller slimhinner. Skyll umiddelbart med mye vann hvis slik kontakt oppstår. Hvis kontaktstedet ikke blir behandlet, kan det oppstå brannskade. Fortynn med vann før du tørker opp eventuelt søl fra reagensene. P. Hvis et K-rør eller K-tray åpner seg etter amplifikasjon, må K-carrier, brønner og væskeutslipp behandles med klor (effektiv konsentrasjon er 5000 ppm; 0,5 %) over natten for å bryte ned det frigjorte ampliconet. 05175020001-04NO 4 Doc Rev. 4.0

OPPBEVARING OG HÅNDTERING Ikke frys reagenser eller kontroller. A. Oppbevar RW, RL og RN ved 2 25 C. Når disse reagensene er uåpnet, er de stabile til angitt utløpsdato. B. Oppbevar MTB MMX, MYCO Mg 2+, MYCO IC, MTB (+) C og MYCO ( ) C ved 2 8 C. Når disse reagensene er uåpnet, er de stabile til utløpsdato. C. Oppbevar delvis brukte MTB (+) C og MYCO ( ) C ved 2 8 C mellom serier. Kontroller utløpsdatoen for åpnede kontroller før bruk. MTB (+) C og MYCO ( ) C kan brukes opptil fire ganger. Så snart de er åpnet, må MTB (+) C og MYCO ( ) C brukes innen 4 uker eller før utløpsdatoen, avhengig av hva som kommer først. D. MTB MMX, MYCO Mg 2+ og MYCO IC leveres i rør for engangsbruk for serier à 12 reaksjoner. Eventuelt ubrukt materiale må kastes. E. Working Master Mix (preparert ved å tilsette MYCO Mg 2+ og MYCO IC til MTB MMX) kan lagres mørkt ved 2 8 C i opptil 2 timer. F. Preparerte prøver og kontroller må tilsettes til Working Master Mix innen 2 timer etter preparering ved lagring ved romtemperatur eller innen 8 timer ved lagring ved 2 8 C. G. Amplifikasjon må startes innen 90 minutter fra det tidspunktet de preparerte prøvene og kontrollene er tilsatt til Working Master Mix. MATERIELL SOM MEDFØLGER Prøveprepareringsreagenser A. AMPLICOR Respiratory Specimen Preparation Kit AMPLICOR prepareringskit for respiratoriske prøver (P/N: 20756903 122; ART: 07 5690 3; US: 83267) RW (vaskeløsning for respiratoriske prøver) RL (lyseringsreagens for respiratoriske prøver) RN (nøytraliseringsreagens for respiratoriske prøver) RSP PREP Amplifikasjons- og deteksjonsreagenser B. COBAS TaqMan MTB Test (P/N: 04803531 190) MYCO IC (Mycobacterium-internkontroll) MTB (+) C [M. tuberculosis positiv kontroll] MYCO ( ) C [Mycobacterium negativ kontroll] MTB MMX (COBAS TaqMan MTB Master Mix) MYCO Mg 2+ (Mycobacterium magnesiumreagens) CTM MTB 05175020001-04NO 5 Doc Rev. 4.0

MATERIELL SOM KREVES, MEN SOM IKKE MEDFØLGER Instrumentering og programvare COBAS TaqMan 48-analysator AMPLILINK-programvare, Version 3.2 Series eller 3.3 Series Datastasjon for AMPLILINK-programvaren COBAS TaqMan 48-analysator for bruk sammen med applikasjonsmanualen for AMPLILINK software, version 3.2 + 3.3 Series Applikasjonsmanual for AMPLILINK Software Version 3.2 Series for bruk sammen med COBAS AmpliPrep-instrumentet, COBAS TaqMan -analysator, COBAS TaqMan 48-analysator og COBAS AMPLICOR -analysator eller Applikasjonsmanual for AMPLILINK software version 3.3 Series for bruk sammen med COBAS AmpliPrep-instrument, COBAS TaqMan -analysator, COBAS TaqMan 48-analysator, COBAS AMPLICOR -analysator og cobas p 630-instrument K-rør åpner/lukker (P/N: 03516539001) Påkorkingsverktøy for K-tray (P/N: 03339904001) K-carrier for COBAS TaqMan 48-analysatoren (P/N: 28150397001) K-tray carrier for COBAS TaqMan 48-analysatoren (P/N: 03341488001) Engangsartikler K-rør (P/N: 03137082001) K-trays for COBAS TaqMan 48-analysatoren (P/N: 03343146001) ANNET MATERIELL SOM KREVES, MEN SOM IKKE MEDFØLGER Vortexmikser Pipettefyller: Drummond (P/N: 4-000-100) eller tilsvarende 1,5 ml polypropylenrør med skrukork, sterile, ikke silikonbehandlede, koniske (for eksempel Sarstedt 72.692.105)** Rørstativ (f.eks. Sarstedt 93.1428) Pipetter (kapasitet 50 µl, 100 µl, 200 µl, 250 µl, 500 µl og 1000 µl)* med aerosolbarriere- eller positive displacement -spisser Sterile overføringspipetter med fin spiss Mikrosentrifuge (maks. RCF 16 000 x g, min. RCF 12 500 x g); Eppendorf 5415C, HERMLE Z230M, eller tilsvarende 60 C ± 2 C varmeblokk Termometer Absorberende papir Engangshansker, uten pudder Kabinett for biologisk sikkerhet, med negativt trykk * Pipettene må ha en nøyaktighet innenfor 3 % av angitt volum. Aerosolbarriere- eller positive displacement DNasefrie (eller nukleasefrie) spisser må brukes der dette er angitt for å hindre krysskontaminering av prøver og amplicon. ** Rør med skrukork må brukes til prøve- og kontrollpreparering for å forhindre søl og mulig krysskontaminering av prøver og kontroller. Ikke bruk rør med snapplokk. TAKING, TRANSPORT OG OPPBEVARING AV PRØVER MERK: Alle prøver og kontroller må behandles som om de er potensielt infeksiøse. A. Taking av prøver De eneste godkjente respiratoriske prøvematerialer er ekspektorert og indusert sputum eller BAL. Prøvematerialet må gjøres flytende, dekontamineres og oppkonsentreres ved hjelp av NALC-NaOH 17 -metoder. B. Transport av prøver Dekontaminerte prøver må transporteres til laboratoriet ved 2 25 C innen 24 timer etter prøvetaking. Hvis prøvene ikke kan transporteres innenfor 24 timer, må de oppbevares og transporteres ved 70 C. Prøver må transporteres i henhold til nasjonalt, regionalt og lokalt regelverk for transport av biologisk materiale 22. C. Oppbevaring av prøver Dekontaminerte prøver kan oppbevares ved 20 C i opptil 2 uker. 05175020001-04NO 6 Doc Rev. 4.0

BRUKSANVISNING MERK: For mer detaljert informasjon, en detaljert beskrivelse av de mulige konfigurasjonene, utskrift av resultater og tolkning av flagg, kommentarer og feilmeldinger, se instrumentmanualen for COBAS TaqMan 48-analysator for bruk sammen med applikasjonsmanual for AMPLILINK software, version 3.2 og 3.3 Series og enten (1) applikasjonsmanual for AMPLILINK Software version 3.2 Series for bruk sammen med COBAS AmpliPrepinstrument, COBAS TaqMan -analysator, COBAS TaqMan 48-analysator og COBAS AMPLICOR -analysator eller (2) applikasjonsmanual for AMPLILINK software, version 3.3 Series for bruk sammen med COBAS AmpliPrep-instrument, COBAS TaqMan - analysator, COBAS TaqMan 48-analysator, COBAS AMPLICOR -analysator samt cobas p 630-instrument. MERK: Hvis prøvepreparering, amplifikasjon og deteksjon utføres i løpet av én arbeidsdag, følg testprosedyren som beskrevet nedenfor. Hvis prøvepreparering utføres på en annen dag enn amplifikasjon og deteksjon, må reagenstillagingen utføres på samme dag som amplifikasjon og deteksjon. MERK: Alle amplifikasjons- og deteksjonsreagenser må ha romtemperatur før bruk. Ta dem ut fra kjølelagringen på 2 8 C, minst 30 minutter før bruk. MERK: Prøver må tines (hvis frosne), stå i romtemperatur i 15 30 minutter og blandes før bruk. MERK: Bruk pipetter med aerosolbarriere- eller positive displacement spiss der dette er angitt. Vær svært forsiktig og varsom for å unngå kontaminering. Størrelse på analyseserier: Hvert COBAS TaqMan MTB-testkit inneholder tilstrekkelig reagens til fire analyseserier á 12 tester. Disse kan utføres separat eller samtidig. Et replikat hver av MYCO ( ) C og MTB (+) C må inkluderes i hver analyseserie på opptil 48 prøver og kontroller (se avsnittet Kvalitetskontroll ). Amplifikasjons- og deteksjonsreagensene er pakket i flasker á 12 tester for engangsbruk. For å få en mest mulig effektiv bruk av reagenser, bør prøver og kontroller kjøres i analyseserier bestående av et antall som er multipler av 12. A. Prøve- og kontrollpreparering Utføres i: Preamplifikasjon prøve- og kontrollprepareringsområdet 1. Fastslå hvor mange prøver som skal testes og plasser tilstrekkelig antall 1,5 ml polypropylenrør med skrukork i arbeidsområdet, slik at du har ett rør for hver prøve og ett rør for hver kontroll. Ikke bruk rør med snapplokk. Se Advarsler og forholdsregler. Merk hvert prøveprepareringsrør med prøveidentifikasjonsnummeret. 2. Tilsett 500 µl RW til hvert prøverør. 3. Bruk en pipette med aerosolbarrierespiss og tilsett 100 µl flytende, dekontaminert og oppkonsentrert respiratorisk prøve til korresponderende merket rør med RW. Bruk en ny pipettespiss med aerosolbarriere for hver prøve. Kork rørene og vortex i 5 sekunder. 4. Sentrifuger ved 12 500 x g i 10 minutter. 5. Aspirer supernatanten ved hjelp av en overføringspipette med fin spiss, og tilsett 100 µl RL til cellepelleten ved hjelp av en ny pipettespiss med aerosolbarriere for hver prøve. Vortex røret i 5 sekunder for å resuspendere pelleten. 6. Klargjør arbeidskontrollene på følgende måte: MERK: Arbeidskontroller må tillages ferskt hver dag testen utføres, og kastes ved arbeidsdagens slutt. MERK: MTB (+) C- og MYCO ( ) C-reagensene i COBAS TaqMan MTB-testkit er utviklet for å kunne brukes opptil fire ganger til preparering av MTB (+)- og MYCO ( )-arbeidskontroller. Etter åpning må MTB (+) C og MYCO ( ) C brukes innen 4 uker eller før utløpsdatoen, avhengig av hva som kommer først. a. Vortex MYCO ( ) C-røret i 5 sekunder. Pipetter 50 µl MYCO ( ) C i et 1,5 ml polypropylenrør ved hjelp av en pipette med en aerosolbarrierespiss. Tilsett 200 µl RL. Vortex i 5 sekunder. Dette er Mycobacterium ( )-arbeidskontrollen. b. Vortex MTB (+) C-røret i 5 sekunder. Pipetter 50 µl MTB (+) C i et 1,5 ml polypropylenrør ved hjelp av en pipette med en aerosolbarrierespiss. Tilsett 200 µl RL. Vortex i 5 sekunder. Dette er M. tuberculosis (+)-arbeidskontrollen. c. Pipetter 100 µl fra hver arbeidskontroll i et 1,5 ml polypropylenrør med skrukork til preparering parallelt med de kliniske prøvene. 7. Inkuber prøvene og kontrollene i en varmeblokk ved 60 C ± 2 C i 45 minutter. 8. Fjern rørene fra varmeblokken, og pulssentrifuger rørene i 5 sekunder for å fjerne kondens fra korken. 05175020001-04NO 7 Doc Rev. 4.0

9. Bruk en pipette med aerosolbarrierespiss og tilsett 100 µl RN til hvert prøve- og kontrollrør. Vortex i 5 sekunder ved halv hastighet. Bruk en ny pipettespiss med aerosolbarriere for hver prøve og kontroll. 10. Flytt de preparerte prøvene (pasientprøver og kontroller) til amplifikasjons-/deteksjonsområdet. B. Reagenstillaging og innlasting av K-carrier Utføres i: Preamplifikasjon reagenstillagingsområdet MERK: COBAS TaqMan MTB Master Mix (MTB MMX), Working Master Mix (Working MMX) og Working MMX tilsatt preparerte prøver og kontroller er lyssensitive. Beskytt disse reagensene mot lys. MERK: COBAS TaqMan MTB Master Mix (MTB MMX) og COBAS TaqMan Mycobacterium internkontroll (MYCO IC) og COBAS TaqMan Mycobacterium magnesiumreagens (MYCO Mg 2+ ) må stå i romtemperatur i minst 30 minutter før tillaging av Working Master Mix. MERK: Gjør klar Working MMX etter at manuell preparering av prøver og kontroller er fullført. MERK: Preparerte prøver er stabile i opptil 4 timer ved romtemperatur eller opptil 4 dager ved 2 8 C før tilsetting til Working Master Mix. MERK: Working MMX må oppbevares ved 2 8 C og brukes innen 2 timer etter tillaging. MERK: Preparerte prøver kan oppbevares ved -70 C i opptil 6 måneder. MERK: Når preparerte prøver og kontroller er tilsatt til Working MMX, må amplifikasjonen startes innen 90 minutter. 1. La ett rør med MTB MMX, ett rør med MYCO Mg 2+ og ett rør med MYCO IC stå i romtemperatur i minst 30 minutter. 2. Plasser en K-carrier i en K-carrier-holder. 3. Plasser K-rør eller et nytt K-tray i K-carrier uten å berøre sidene på K-rørene eller K-tray-brønnene. MERK: Hvis det er færre enn 24 rør som skal analyseres, må K-rørposisjonene 1, 2, 5, 20, 23 og 24 benyttes for å balansere K-carrier i termocycleren. 4. Ta av lokkene ved hjelp av verktøyet for K-rør åpning/lukking om nødvendig. Plasser lokkene i oppbevaringsbeholderen for lokk til K-rør. 5. Klargjør Working MMX på følgende måte: Tilsett 200 µl MYCO Mg 2+ og 50 µl MYCO IC til ett rør med MTB MMX. Sett korken på røret og bland ved å vende opp-ned 10 ganger. Ikke vortex Working MMX. Working Master Mix må beskyttes mot lys og brukes innen 2 timer. 6. Pipetter 50 µl Working MMX til hvert K-rør eller relevant K-tray-brønn. MERK: Working MMX er svært lyssensitiv. Utsett K-rør eller K-tray som inneholder Working MMX for så lite lys som mulig. 7. Tilsett 50 µl av hver preparerte prøve eller kontroll til det aktuelle K-røret eller K-traybrønn som inneholder Working MMX, ved hjelp av en mikropipette med aerosolbarriere- eller positive displacement -spiss. Bland hver prøve eller kontroll med mikropipetten ved å trekke prøve- /reagensblandingen tre ganger opp og ned uten å generere bobler. 8. Gjenta trinn 7 for hver preparerte prøve og kontroll til alle er overført til K-rør eller K-trays. Bruk en ny spiss for hver prøve og kontroll. Inspiser visuelt at det ikke finnes bobler. Fjern dem ved behov. Kork K-rørene/K-trays ved hjelp av et åpne-/lukkeverktøy for K-rør / påkorkingsverktøy for K-tray. Verifiser visuelt at korrekt volum er tilsatt i alle K-rør. 9. Oppbevar PCR-klargjort K-carrier på et mørkt sted ved 15 30 C hvis amplifikasjonen ikke startes umiddelbart. Amplifikasjonen må startes innen 90 minutter etter at de preparerte prøvene og kontrollene ble tilsatt til K-rørene eller K-trays med Working MMX. C. Amplifikasjon og deteksjon Utføres i: Postamplifikasjon amplifikasjons-/deteksjonsområdet Innlasting og betjening av COBAS TaqMan 48-analysatoren 1. Slå på arbeidsstasjonens datamaskin, og logg deg på Windows XP med aktuell bruker-id og passord. 2. Slå på COBAS TaqMan 48-analysatoren minst 30 minutter før analyseserien starter. Kontroller at instrumentet initialiseres og er klart til bruk. Hvis K-carriers fra tidligere analyseserier fortsatt befinner seg i noen av termoblokkene, må de fjernes ved hjelp av løfteverktøyet for K-carrier. 3. Åpne AMPLILINK-programvaren på datamaskinen. Logg deg på med aktuell bruker-id og passord. 05175020001-04NO 8 Doc Rev. 4.0

4. Klikk på Orders-ikonet for å opprette K-carrier-testbestillinger for prøvene som skal analyseres. Velg fliken Sample, og klikk deretter på knappen New. Legg inn bestillingsnummeret for hver prøve ved hjelp av tastaturet eller strekkodeleseren. Velg testdefinisjonen for COBAS TaqMan MTBtesten. Gjenta denne prosedyren for hver prøve. Klikk på knappen Save. MERK: Hvis det er færre enn 24 rør som skal analyseres, må K-rørposisjonene 1, 2, 5, 20, 23 og 24 benyttes for å balansere K-carrier i termocycleren. 5. Angi informasjon for kvalitetskontroller ved å velge fliken Quality Control i vinduet Orders. Klikk på New-knappen og legg inn informasjon fra verdikortet for COBAS TaqMan MTB-testen som følger med kitet, ved hjelp av tastaturet eller strekkodeleseren. Angi lotnummer, utløpsdato, akseptgrenser for lav (+) kontroll for COBAS TaqMan MTB-testen, i tillegg til kalibreringskoeffisienter i de angitte feltene. Klikk på OK. 6. Legg inn oppsettets K-carrier-nummer ved å klikke på fliken K-Carrier i vinduet Orders. Klikk på New i vinduet K-Carrier. Angi K-carriernummeret fra strekkoden på K-carrier eller K-tray i feltet til høyre for K-Carrier ID ved hjelp av tastaturet eller strekkodeleseren. Velg testdefinisjon for COBAS TaqMan MTB-testen fra testpanelet nederst i vinduet. 7. Velg den første raden i kolonnen Type (T) i Worklist. Marker dette feltet for å åpne rullegardinmenyen. Velg deretter ønsket kontrolltype. Dobbeltklikk i feltet Sample ID på samme rad. Vinduet LookUp Control vises med alle tilgjengelige kontroller. Når kontrollen er valgt, vises de tilhørende kalibrerings- og kontrollverdiene i informasjonspanelet nede til høyre. Gjenta denne prosedyren for alle kontroller det er behov for. 8. For å legge til prøver i Worklist dobbeltklikker du på den første posisjonen (raden) for innlegging av prøver. Vinduet Lookup Sample som inneholder de tildelte prøvebestillingene, vil vises. Bruk Skift- + Pil-tastene for å merke mer enn ett nummer. Kontroller at alle bestillinger er tildelt testdefinisjonen for COBAS TaqMan MTB-testen. 9. Klikk på Save for å lagre bestillingen for K-carrier. 10. Velg ikonet Systems på fliken System. Klikk på Open for å åpne termocycleren. Når dekselet på termocycleren har åpnet seg helt og Ready to Load vises i vinduet Systems, løfter du opp og holder lokket til termocycleren åpent. Bruk løfteverktøyet for K-carrier til å overføre K-carrier som inneholder de lukkede K-rørene med Working Master Mix, prøver og kontroller inn i termocycleren. Lukk lokket på termocycleren. 11. Klikk på Start i vinduet Systems under TC-ikonet for å lukke dekselet på termocycleren og starte analysen. 12. Amplifikasjon og deteksjon utføres automatisk av COBAS TaqMan 48-analysatoren. RESULTATER Kalkulering av resultater AMPLILINK version 3.2 series COBAS TaqMan 48-analysatoren bestemmer automatisk om MTB-DNA er detektert for prøven eller kontrollen. Med introduksjonen av AMPLILINK 3.3 series brukes en ny kvalitativ resultatfunksjon for COBAS TaqMan MTB-test. Resultatpresentasjonen er forskjellig på AMPLILINK version 3.2 series og AMPLILINK version 3.3 series. COBAS TaqMan 48-analysator: Bestemmer syklusterskelverdi (Cycle Threshold, Ct) for MTB-DNA og Mycobacteriuminternkontroll-DNA. Bestemmer om MTB-DNA er detektert basert på Ct-verdiene for MTB-DNA og MYCOinternkontroll-DNA. Bestemmer om MTB (+) C og MYCO ( ) C er gyldige. Validering av analyseserie på AMPLILINK version 3.2 Series For å sikre at analyseserien er gyldig, sjekk i AMPLILINK-resultatvinduet eller på utskriften om det finnes flagg og kommentarer. Analyseserien er gyldig hvis det ikke vises noen flagg for COBAS TaqMan MTB-kontrollene. For en gyldig analyseserie fremkommer følgende resultater: Kontroll Resultat Tolkning Negativ kontroll Target Not Detected Kontrollen er innenfor akseptområdet Positiv kontroll 1 Positive Kontrollen er innenfor akseptområdet 05175020001-04NO 9 Doc Rev. 4.0

Analyseserien er ikke gyldig hvis noen av de følgende flaggene vises for COBAS TaqMan MTB-kontrollene: MYCO negativ kontroll: Flagg Resultat Tolkning _N_NC_INVALID Invalid Kontaminasjon eller intet IC-signal MTB positiv kontroll: Flagg Resultat Tolkning _L_LPC_INVALID Invalid Kontrollen er ikke innenfor akseptområdet, intet målsignal eller intet IC-signal MERK: MTB PC er også kalt lav positiv kontroll (LPC) Hvis analyseserien er ugyldig, må hele analyseserien gjentas, inkludert preparering av prøver og kontroller, amplifikasjon og deteksjon. Tolking av resultater: For å validere analyseserien må hvert prøvesvar kontrolleres for å se om det finnes noen flagg eller kommentarer på resultatutskriften. Tolk resultatene på følgende måte: En gyldig analyseserie kan inkludere både gyldige og ugyldige prøveresultater, avhengig av om flagg og/eller kommentarer er kommet opp for de ulike prøvene. Prøveresultater tolkes på følgende måte: Flagg Resultat Tolkning M. tuberculosis DNA ikke detektert. Prøven er antatt Ingen flagg Target Not negativ for M. tuberculosis. Et negativt resultat utelukker Detected ikke M. tuberculosis-infeksjon fordi resultatene er avhengig av korrekt prøvetaking, fravær av hemmere og tilstrekkelig DNA til at det kan detekteres. Ingen flagg 1 Positive M. tuberculosis DNA detektert. Prøven er positiv for M. tuberculosis. _Q_RFITOOLOW > 1 Positive M. tuberculosis DNA detektert. Prøven er positiv for eller M. tuberculosis. Ingen flagg Inhibert prøve. M. tuberculosis-dna kan, om det er til stede, ikke detekteres. Preparer en ny utpipettering av originalprøven, _Q_QS_INVALID Invalid og gjenta testen. Hemmere er ofte labile, og en prøve som i første omgang er inhibert, er kanskje ikke inhibert når den analyseres på nytt. Hvis originalprøven ikke er tilgjengelig, må det tas en ny prøve. Merk: AMPLILINK-programvaren flagger internkontroll (IC)-feil som en ugyldig QS (_Q_QS_INVALID). 05175020001-04NO 10 Doc Rev. 4.0

Kalkulering av resultater AMPLILINK version 3,3 series COBAS TaqMan 48-analysatoren bestemmer automatisk om MTB-DNA er detektert for prøven eller kontrollen. Med introduksjonen av AMPLILINK version 3.3 series brukes en ny kvalitativ resultatfunksjon for COBAS TaqMan MTB-test. Resultatpresentasjonen er forskjellig på AMPLILINK version 3.3 series og AMPLILINK version 3.2 series. COBAS TaqMan 48-analysator: Bestemmer syklusterskelverdi (Cycle Threshold, Ct) for MTB-DNA og Mycobacterium IC-DNA. Bestemmer om MTB-DNA er detektert basert på Ct-verdiene for MTB-DNA og MYCO IC-DNA. Bestemmer om MTB (+) C og MYCO ( ) C er gyldige. Validering av analyseserie på AMPLILINK version 3,3 Series For å sikre at analyseserien er gyldig, sjekk i AMPLILINK-resultatvinduet eller på utskriften om det finnes flagg og kommentarer. Analyseserien er gyldig hvis det ikke vises noen flagg for COBAS TaqMan MTB-kontrollene. For en gyldig analyseserie fremkommer følgende resultater: Kontroll Resultat Tolkning Negativ kontroll Negative Kontrollen er innenfor akseptområdet Positiv kontroll Positive Kontrollen er innenfor akseptområdet Analyseserien er ikke gyldig hvis noen av de følgende flaggene vises for COBAS TaqMan MTB-kontrollene: MYCO negativ kontroll: Flagg Resultat Tolkning NC_INVALID Invalid No IC-signal eller IC-signal akseptområdet MTB positiv kontroll: Flagg Resultat Tolkning PC_INVALID Invalid Kontrollen er ikke innenfor akseptområdet, intet målsignal eller intet IC-signal Hvis en kontroll er ugyldig, vil alle prøver i analyseserien rapporteres som INVALID. Repeter hele analyseserien inkludert prøver og kontrollpreparering, amplifikasjon og deteksjon. Tolking av resultater: For å validere analyseserien må hvert prøvesvar kontrolleres for å se om det finnes noen flagg eller kommentarer på resultatutskriften. Tolk resultatene på følgende måte: En gyldig analyseserie kan inkludere både gyldige og ugyldige prøveresultater, avhengig av om flagg og/eller kommentarer er kommet opp for de ulike prøvene. 05175020001-04NO 11 Doc Rev. 4.0

Prøveresultater tolkes på følgende måte: Kontroll- Prøve- Flagg- Tolkning resultat resultat merknad(er) PC_INVALID Ugyldig Invalid og/eller Kontroller er ikke gyldig, alle prøver i analysen NC_INVALID merket ugyldig. M. tuberculosis DNA ikke detektert. Prøve er presumtiv negativ for M. tuberculosis. Et negativt Positiv for PC ( ) Ingen flagg resultat utelukker ikke M. tuberculosis-infeksjon fordi Negativ for NC resultatene avhenger av tilstrekkelige prøver, mangel på inhibitorer og tilstrekkelig DNA som kan detektert. Positiv for PC M. tuberculosis DNA detektert. Prøve er positiv Negativ for NC MTB Ingen flagg på M. tuberculosis. Positiv for PC Prøveresultat er ugyldig. Høyreklikk på flagg- Negativ for NC Invalid S_INVALID merknaden for å se detaljert informasjon. (1) Den interne kontrollsignal er unormalt høyt, prøven rapporteres som ugyldig. Preparer en ny utpipettering av originalprøven og gjenta testen. Hvis originalprøven Positiv for PC Invalid QS_INVALID ikke er tilgjengelig, må en ny prøve tas. Negativ for NC Merk: AMPLILINK v3.3 software flagger IC-feil på grunn av høy IC Ct som QS_INVALID. (1) Se kapitlet Flags i AMPLILINK software Version 3.3 Series applikasjonsmanual for bruk sammen med COBAS AmpliPrep-instrument, COBAS TaqMan -analysator, COBAS TaqMan 48-analysator, COBAS AMPLICOR - analysator og cobas p 630-instrument, for mer informasjon om flaggmerknader og detaljer ved flagg. KVALITETSKONTROLL Ett replikat av MYCO ( )-kontroll og MTB (+)-kontroll må være inkludert i hver analyseserie. Som for alle nye laboratorieprosedyrer, bør nye operatører vurdere bruk av ytterligere interne kontroller hver gang testen utføres, inntil man har oppnådd ønsket grad av trygghet for at testen utføres på riktig måte. Det finnes ingen krav til kontrollenes posisjoner i K-carrier. Sjekk om det finnes flagg og kommentarer i analyseutskriften for å sikre at analyseserien er gyldig. Negativ kontroll MYCO ( ) C må gi resultatet Target Not Detected (ved bruk av AMPLILINK v3.2 software), eller resultatet Negative (ved bruk av AMPLILINK v3.3 software), dvs. Ct-verdien for MTB-DNA var over grensen for analysen eller ingen Ct-verdi for MTB-DNA ble skaffet, men en gyldig Ct-verdi ble skaffet for Mycobacteriuminternkontroll-DNA. Hvis MYCO ( ) C ikke oppfyller dette kriteriet, er hele analyseserien ugyldig. Gjenta hele prosessen (prøve- og kontrollpreparering, amplifikasjon og deteksjon). Kontakt det lokale Roche-kontoret for teknisk assistanse hvis MYCO ( ) C er ugyldig ved gjentatte tilfeller. Positiv kontroll For AMPLILINK v3.2 software er det tildelte akseptområdet for MTB (+) C angitt i COBAS TaqMan MTBtestverdikortet. Resultatet for MTB (+) C må ligge innenfor området som er angitt på verdikortet for COBAS TaqMan MTB-testen for at en analyseserie skal være gyldig. Det korrekte resultatet vil bli vist som 1 Positive. Hvis den positive kontrollen ikke oppfyller dette kriteriet, er hele analyseserien ugyldig. Gjenta hele prosessen (prøve- og kontrollpreparering, amplifikasjon og deteksjon). Kontakt det lokale Rochekontoret for teknisk hjelp hvis resultatet for den positive kontrollen gjentatte ganger er utenfor angitt område. For AMPLILINK v3.3 software er det tildelte akseptområdet for MTB (+) C angitt i Test Definition File for COBAS TaqMan MTB-test. Resultatet for MTB (+) C må være innenfor det tildelte akseptområdet for å være gyldig. Det riktige resultatet vises som Positive. Hvis resultatet for MTB (+) C faller utenfor det tildelte akseptområdet, vil resultatet på den positive kontrollen være Invalid med en flaggmerknad PC_INVALID. Hvis den positive kontrollen ikke møter dette kravet, er hele analysen ugyldig. Gjenta hele prosessen (prøveog kontrollpreparering, amplifikasjon og deteksjon). Hvis resultatet for den positive kontrollen er konstant utenfor det tildelte akseptområdet, ta kontakt med ditt lokale Roche-kontor for teknisk støtte. 05175020001-04NO 12 Doc Rev. 4.0

MTB (+)-kontrollen inneholder cirka 20 kopier/test av en M. tuberculosis-plasmid-dna-sekvens. Dette er cirka fire ganger nedre deteksjonsgrense for analysen, bestemt med Poisson-analyse. Amplifikasjon og deteksjon av MTB (+)-kontrollen beviser at amplifikasjon har funnet sted. MTB (+)-kontrollen vil ikke gjenspeile amplifikasjonseffektiviteten eller deteksjonsnivået for testen. Internkontroll Internkontrollen er beregnet for identifikasjon av prøver som inneholder polymerasehemmere. Bruk av internkontroll vil ikke eliminere alle falske negative testresultater. FORSIKTIGHETSREGLER Som for andre laboratorieprosedyrer, er god laboratorieteknikk essensielt for å sikre optimal ytelse for denne analysen. På grunn av testens høye analytiske sensitivitet må det utvises stor grad av varsomhet for å bevare reagensenes og amplifikasjonsblandingens renhet. Alle reagenser må inspiseres nøye for å være sikker på at de er rene. Kast eventuelle tvilsomme reagenser. TESTENS BEGRENSNINGER 1. Denne testen har kun blitt validert for ekspektorert og indusert sputum- og BAL-prøver som er blitt gjort flytende, dekontaminert og konsentrert ved hjelp av NALC-NaOH. Testing av andre prøvematerialer kan føre til falske negative eller falske positive resultater. 2. Deteksjon av M. tuberculosis er avhengig av antallet organismer som er til stede i prøven, og kan påvirkes av metoder for prøvetaking, pasientfaktorer (dvs. alder, tilstedeværelse av symptomer) og/eller infeksjonsstadium for M. tuberculosis. 3. Falske negative resultater kan forekomme som følge av polymerasehemming. Mycobacteriuminternkontrollen er blitt tilsatt til COBAS TaqMan MTB-testen for å muliggjøre en identifikasjon av preparerte prøver som inneholder substanser som kan interferere i PCR-amplifikasjon av mer enn 20 kopier/test. 4. Falske negative resultater kan forekomme ved tilstedeværelse av høyt titer av Mycobacterium-arter forskjellige fra M. tuberculosis (MTB)-kompleks, hvis MTB er tilstede i et lavere titer enn den interfererende Mycobacterium-arten. 5. Pålitelige resultater avhenger av prosedyrene for prøvetaking, transport, oppbevaring og håndtering. Variabler som skyldes oppbevaring er ikke blitt fullstendig definert. 6. Tilsetning av AmpErase-enzym til Master Mix muliggjør selektiv amplifikasjon av mål-dna. Kontaminering av reagensene kan imidlertid bare unngås gjennom gode laboratorierutiner og ved å følge prosedyrene spesifisert i dette pakningsvedlegget nøye. 7. Denne testen kan ikke gi svar på om behandlingen lykkes eller ikke. 8. Som for alle diagnostiske tester må resultatene fra COBAS TaqMan MTB-testen tolkes i sammenheng med alle kliniske og laboratoriemessige funn. 9. Dette produktet må kun brukes av personell som er opplært i PCR-teknikk. 10. COBAS TaqMan MTB-testen gir kvalitative resultater. Det kan ikke utledes noen korrelasjon mellom størrelsesorden av en positiv COBAS TaqMan MTB-Test terskelverdi og antallet av M. tuberculosis-celler i en infisert prøve. 11. Dette produktet kan kun brukes sammen med COBAS TaqMan 48-analysatoren. 12. Tilstedeværelsen av PCR-hemmere kan føre til falske negative eller ugyldige resultater. 13. Selv om det er sjelden, kan mutasjoner innenfor den høykonserverte regionen av bakteriegenomet som testens primere og/eller probe er rettet mot, føre til manglende evne til å påvise bakterien. 14. På grunn av de naturlige forskjellene mellom teknologier, anbefales det at brukerne utfører metodekorrelasjonsstudier i laboratoriet for å gjøre seg kjent med de teknologiske forskjellene før en ny teknologi tas i bruk. 05175020001-04NO 13 Doc Rev. 4.0

VURDERING AV ANALYTISK YTELSE Analytisk spesifisitet Den analytiske spesifisiteten til COBAS TaqMan MTB-testen ble evaluert ved å teste følgende bakterier, virus og fungus. Mange av disse er normalflora eller alminnelige patogener i luftveiene. Ingen av følgende organismer viste reaktivitet i COBAS TaqMan MTB-testen: Mykobakterielle arter Mycobacterium abscessus Mycobacterium neoaurum Mycobacterium asiaticum Mycobacterium nonchromogenicum Mycobacterium avium Mycobacterium phlei Mycobacterium chelonae Mycobacterium scrofulaceum Mycobacterium chitae Mycobacterium senegalens Mycobacterium fallax Mycobacterium shimoidei Mycobacterium flavescens Mycobacterium simiae Mycobacterium fortuitum Mycobacterium smegmatis Mycobacterium gastri Mycobacterium sphagni Mycobacterium gordonae Mycobacterium szulgai Mycobacterium intracellulare Mycobacterium terriae Mycobacterium kansasii Mycobacterium thermoresistibile Mycobacterium komassense Mycobacterium triviale Mycobacterium malmoense Mycobacterium vaccae Mycobacterium marinum Mycobacterium xenopi Ikke-mykobakterielle arter Acinetobacter calcoaceticus Corynebacterium xerosis Actinomadura madurae Cryptococcus neoformans Actinomyces pyogenes Deinococcus radiodurans Actinoplanes italicus Dermatophilus congolensis Aeromonas hydrophila Derxia gummosa Arthrobacter oxydans Eikenella corrodens Bacillus subtilis Enterobacter aerogenes Bacteriodes fragilis Enterobacter cloacae Blastomyces dermatitidis Enterococcus faecalis Bordetella parapertussis Enterococcus faecium Bordetella pertussis Escherichia coli Branhamella (Moraxella) catarrhalis Fusobacterium nucleatum Brevibacterium linens Gordona sputi Campylobacter jejuni Haemophilus influenzae Candida albicans Herpes simplex virus type 1 Chlamydia trachomatis Histoplasma capsulatum Chromobacterium violaceum Human adenovirus Citrobacter freundii Human cytomegalovirus Clostridium perfringens Human enterovirus Coccidioides immitis Human rhinovirus 14 Corynebacterium aquaticum Influenza virus B Corynebacterium diphtheriae Klebsiella pneumoniae Corynebacterium flavescens Klebsiella pneumoniae subsp. ozaenae Corynebacterium glutamicum Lactobacillus casei Corynebacterium jeikeium Legionella micdadei Corynebacterium minutissimum Legionella pneumophila Corynebacterium pseudodiphtheriticum Mycoplasma hominis Corynebacterium pseudotuberculosis Mycoplasma pneumoniae Corynebacterium renale Neisseria gonorrhoeae Corynebacterium striatum Neisseria lactamica Neisseria meningitidis Respiratory syncytial virus Nocardia asteroides Rhodococcus aichiensis Nocardia brasiliensis Rhodococcus chubuensis Nocardia farcinica (W5218) Rhodococcus equi Nocardia nova (W5194) Salmonellacholeraesus subsp Choleraesuis Nocardia otitidiscaviarum Serratia marcescens Nocardia transvalensi Staphylococcus aureus Oerskovia turbata Staphylococcus epidermidis Parainfluenza 2 virus Streptococcus agalactiae 05175020001-04NO 14 Doc Rev. 4.0

Peptococcus niger Peptostreptococcus anaerobius Peptostreptococcus magnus Porphyromonas asaccharolytica Porphyromonas gingivalis Prevotella melaninogenica Propionibacterium acnes Proteus mirabilis Pseudomonas aeruginosa Streptococcus gordonii Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes Streptomyces griseinus Veillonella atypica Veillonella parvula Vibrio parahaemolyticus Xanthomonas maltophilia Yersinia enterocolitica Analytisk sensitivitet: M. tuberculosis-celler Deteksjonsgrensen for COBAS TaqMan MTB-testen ble etablert ved å bestemme det laveste antall M. tuberculosis-kolonidannede enheter (CFU) som kan detekteres reproduserbart ( 95 % positive resultater) av COBAS TaqMan MTB-testen. En dekontaminert kultur av MTB ble fortynnet i negativ sputum gjort flytende ved hjelp av NALC/NaOH, og det ble satt opp et panel på 7 nivåer som inneholdt 10, 5, 1, 0,5, 0,25, 0,1 og 0 MTB CFU/PCR. Dette panelet ble preparert uavhengig hver dag i tre dager. Femtifire replikater av hvert panel ble testet med tre lot av COBAS TaqMan MTB-testreagenser. Resultater fra probit-analyse (tabell 1) indikerer at deteksjonsgrensen for COBAS TaqMan MTB-testen er 0,46 CFU/PCR eller cirka 18 CFU/ml i sputumprøver. Tabell 1 Deteksjonsgrense for COBAS TaqMan MTB-test med M. tuberculosis-celler Prøve Nominal input # ugyldig # gyldig # pos # forsøk % treff 95 % Cl CFU/PCR 1 10 0 54 54 54 100,0 % 94,6 100 % 2 5 0 54 54 54 100,0 % 94,6 100 % 3 1 0 54 54 54 100,0 % 94,6 100 % 4 0,5 0 54 51 54 94,4 % 84,6 98,8 % 5 0,25 0 54 46 54 85,2 % 72,9 93,4 % 6 0,1 0 54 33 54 61,1 % 46,9 74,0 % 7 0 0 54 0 54 0,0 % 0,0 5,4 % 95 % LOD av PROBIT = 0,46 CFU/PCR 95 % konfidensintervall = 0,33 0,83 CFU/PCR Inklusivitet COBAS TaqMan MTB-testen ble evaluert med alle arter av mykobakterier som forekommer i MTBkomplekset (M. tuberculosis, M. bovis, M. microti og M. africanum). Kvantifiserte genomiske DNAprepareringer (10 kopier/pcr) og bakteriekulturer ble undersøkt. Ved et input-konsentrasjonsnivå på 10 genomiske kopier/pcr, ble alle 4 prøver i MTB-komplekset identifisert som positive. I tillegg ble 169 kulturer av MTB-komplekset (M. tuberculosis = 159, M. bovis = 6, M. microti = 3 og M. africanum = 1) analysert med COBAS TaqMan MTB-testen. Én kultur av M. microti og én kultur av M. tuberculosis testet negativt, noe som gir en samlet inklusivitetsrate på 99 %. Reproduserbarhet COBAS TaqMan MTB-testen ble evaluert for reproduserbarhet gjennom analyse av dag-til-dag-, lot-til-lotog operatør-til-operatør-resultater. Dag-til-dag-studien (tabell 2) ble utført av én operatør med én COBAS TaqMan MTB Test reagenslot i 15 dager ved hjelp av MYCO negativ kontroll (NC), MTB positiv kontroll (PC) og MTB positiv kontroll fortynnet med negativ kontroll (1/2 PC). Lot-til-lot-studien (tabell 3) ble utført av én operatør på én dag med tre lot av COBAS TaqMan MTB Test reagenser ved hjelp av MYCO negativ kontroll (NC), MTB positiv kontroll (PC) og MTB positiv kontroll fortynnet med negativ kontroll (1/4 PC og 1/2 PC). Operatør-til-operatør-studien (tabell 4) ble utført av tre operatører over tre dager med én lot av COBAS TaqMan MTB Test reagenser ved hjelp av MYCO negativ kontroll (NC), MTB positiv kontroll (PC) og MTB positiv kontroll fortynnet med negativ kontroll (1/2 PC). De 720 resultatene fra disse tre studiene er oppsummert i tabell 2 til 4. Negative resultater ble oppnådd i 100 % av de 132 testede NC-replikatene. Alle de 588 positive replikatene, som varierte i området 20 til 5 kopier av MTB-målsekvens/PCR testet positivt. I alle tre studiene var %CV på 2,4 eller lavere, noe som demonstrerer god reproduserbarhet for kvalitative resultater oppnådd med denne testen. 05175020001-04NO 15 Doc Rev. 4.0

Tabell 2 Dag-til-dag-reproduserbarhet for COBAS TaqMan MTB-testen MTB-målsekvens Totalt antall gyldige replikater NC (0 c/pcr) PC (~20 c/pcr) 1/2 PC (~10 c/pcr) 60 60 60 % positive resultater 0 % 100 % 100 % Gjennomsnittlig MTB-terskelverdi N/A 39,4 41,1 Minimumsverdi N/A 38,3 39,9 Maksimumsverdi N/A 40,8 42,8 Standardavvik N/A 0,5 0,7 Variasjonskoeffisient N/A 1,3 % 1,7 % Tabell 3 Lot-til-lot-reproduserbarhet for COBAS TaqMan MTB-testen MTB-målsekvens Totalt antall gyldige replikater NC (0 c/pcr) PC (~20 c/pcr) 1/2 PC (~10 c/pcr) 1/4 PC (~5 c/pcr) 36 36 36 324 % positive resultater 0 % 100 % 100 % 100 % Gjennomsnittlig MTB-terskelverdi N/A 39,6 40,7 41,6 Minimumsverdi N/A 38,5 39,1 39,5 Maksimumsverdi N/A 41,3 42,3 48,0 Standardavvik N/A 0,8 0,7 1,0 Variasjonskoeffisient N/A 1,9 % 1,7 % 2,4 % 05175020001-04NO 16 Doc Rev. 4.0

Tabell 4 Operatør-til-operatør-reproduserbarhet for COBAS TaqMan MTB-testen MTB-målsekvens NC (0 c/pcr) PC (~20 c/pcr) 1/2 PC (~10 c/pcr) Totalt antall gyldige replikater 36 36 36 % positive resultater 0 % 100 % 100 % Gjennomsnittlig MTB-terskelverdi N/A 39,6 40,8 Minimumsverdi N/A 38,4 39,2 Maksimumsverdi N/A 41,5 42,6 Standardavvik N/A 0,8 0,8 Variasjonskoeffisient N/A 1,9 % 2,0 % Korrelasjon Det ble utført en korrelasjonsstudie for å sammenligne ytelsen for COBAS TaqMan MTB-testen med COBAS AMPLICOR MTB-testen. Totalt 769 sputumprøver og 186 BAL-prøver ble analysert i denne studien. Prøvene ble innhentet enten fra nedfryste arkiver eller fra nylig innsamlet nedfrosset materiale. Tre ulike lot av COBAS TaqMan MTB-testreagenser ble brukt i studien. Den positive korrelasjonsraten for sputumprøver (tabell 5) var på 96,2 %, og den negative korrelasjonsraten var på 99,1 %, noe som resulterte i en total overenstemmelse på 98,3 % for sputumprøver mellom COBAS TaqMan MTB-testen og COBAS AMPLICOR MTB-testen. Den positive korrelasjonsraten for BAL-prøver (tabell 6) var på 97,1 %, og den negative korrelasjonsraten var på 99,3 %, noe som resulterte i en total overensstemmelse på 98,9 % for BAL-prøver mellom COBAS TaqMan MTB-testen og COBAS AMPLICOR MTB-testen. Tabell 5 Korrelasjon mellom COBAS TaqMan MTB-testen og COBAS AMPLICOR MTB-testen Samlede resultater sputum Resultater sputum N = 769 COBAS TaqMan MTB-test COBAS AMPLICOR MTB-test + Totalt + 207 5 212 8 549 557 Totalt 215 554 769 Positiv prosent overenstemmelse Negativ prosent overenstemmelse Total overensstemmelse Ratio % overensstemmelse 95 % konfidensintervall 207/215 96,2 % 92,8 98,4 549/554 99,1 % 97,9 99,7 756/769 98,3 % 97,1 99,1 05175020001-04NO 17 Doc Rev. 4.0

Tabell 6 Korrelasjon mellom COBAS TaqMan MTB-testen og COBAS AMPLICOR MTB-testen Samlede resultater BAL Resultater BAL N = 186 COBAS TaqMan MTB-test Positiv prosent overenstemmelse Negativ prosent overenstemmelse Total overensstemmelse Ratio COBAS AMPLICOR MTB-test + Totalt + 34 1 35 1 150 151 Totalt 35 151 186 % overensstemmelse 95 % konfidensintervall 34/35 97,1 % 85,1 99,9 150/151 99,3 % 96,4 99,9 184/186 98,9 % 98,9 99,9 Systemfeil Systemfeilfrekvensen ble bestemt for COBAS TaqMan MTB-testen ved å undersøke prosentandelen av positive resultater fra 100 replikater av negativ sputum spiket med MTB-kultur til en endelig konsentrasjon på 60 CFU/ml, eller ~3 ganger deteksjonsgrensen for testen (se avsnittet Deteksjonsgrense ovenfor). Positive resultater ble oppnådd for 99 av de 100 replikatene, noe som ga en systemfeilfrekvens på 1,0 % og en systemsuksessfrekvens på 99 % for COBAS TaqMan MTB-testen. Interferens COBAS TaqMan MTB-testen ble evaluert for endogen hemoglobininterferens ved å teste negativ sputum spiket med MTB positiv kontroll (25 kopier/pcr) og hemoglobin fra 0,52 til 5,2 mg/ml. Ingen nivåer av spiket hemoglobin ga interferens i COBAS TaqMan MTB-testen. COBAS TaqMan MTB-testen ble evaluert for interferens fra seks vanlig brukte medikamenter mot tuberkulose. De seks medikamentene (tabell 7) ble testet ved 1 x C Max og 3 x C Max ved å spike medikamenter inn i negativ sputum som inneholdt MTB positiv kontroll-plasmid (~17 kopier/pcr). Ingen av de seks medikamentene virket inn på COBAS TaqMan MTB-testytelsen, verken ved 1 x C Max eller 3 x C Max. Tabell 7 Antituberkulose-medikamenter og C Max -nivåer Medikament Kjemisk navn Forkortelse C Max (µg/ml) Isoniazid Isokonitinsyrehydrazid INH 5 7 Etambutol Etambutoldihydroklorid ETH 1,7 Rifampicin Rifadin Rimactan RIF 7,99 Pyrazinamid Pyrazinkarboksamid PZA 30 35 Kanamycin Kanamycinmonosulfat KM 2,0 Streptomycin Streptomycinsulfatsalt SM 25 30 Hemming Hemmingsfrekvensen (ugyldig internkontroll) for COBAS TaqMan MTB-testen ble bestemt gjennom analyse av flere studier med bruk av sputum- og BAL-prøver samt panelmaterialer av MTB-kultur, noe som samlet ga 1094 datapunkter. Samlet hemmingsfrekvens for COBAS TaqMan MTB-testen for alle analyserte studier (prøver og panelmaterialer av MTB-kultur) var på 0,0 % (0/1094). 05175020001-04NO 18 Doc Rev. 4.0

REFERANSER 1. World Health Organization Fact Sheet Nº 104 Revised April 2005. 2. Tuberculosis Elimination Revisited: Obstacles, Opportunities, and a Renewed Commitment Advisory Council for the Elimination of Tuberculosis (ACET). Morbidity and Mortality Weekly Reports 1999. (RR09): 1-13. 3. Metchock, B.G., Nolte, F.S. and Wallace, R.J. 1999. Mycobacterium, pp. 339-437: In: Manual of Clinical Microbiology, 7th ed., eds. Murray, P.R., Baron, E.J., Pfaller, M.A. et al. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 4. Bloom, B.R. and Murray, C.J.L. 1992. Tuberculosis: commentary on a re-emergent killer. Science 257:1055-1063. 5. Böttger, E.C. 1991. Detection, differentiation, and systematics of bacterial pathogens - the family Mycobacteriaceae. Immunitat und Infection 19:143-152. 6. Daniel, T.M. 1990. The rapid diagnosis of tuberculosis: a selective review. Journal of Laboratory Clinical Medicine 116:277-282. 7. Hermans, P.W.M., Schuitema, A.R.J., Soolingen, D.V. et al. 1990. Specific detection of Mycobacterium tuberculosis complex strains by polymerase chain reaction. Journal of Clinical Microbiology 28:1204-1213. 8. CDC. Nucleic Acid Amplification tests for Tuberculosis. MMWR 2000:49. 9. Pfyffer, G.E., Kissling, P., Jahn, E.M.I. et al. 1996. Diagnostic performance of amplified Mycobacterium tuberculosis direct test with cerebrospinal fluid, other nonrespiratory, and respiratory specimens. Journal of Clinical Microbiology 34:834-841. 10. Miller, N., Hernandez, S.G. and Cleary, T.J. 1994. Evaluation of Gen-Probe amplified Mycobacterium tuberculosis direct test and PCR for direct detection of Mycobacterium tuberculosis in clinical specimens. Journal of Clinical Microbiology 32:393-397. 11. Bergmann, J.S., Keating W.E., Woods G.L. 2000. Clinical evaluation of the BDProbeTec ET system for rapid detection of Mycobacterium tuberculosis. Journal of Clinical Microbiology 38:863-865. 12. Yuen, K., Yam, W., Wong, L. et al. 1997. Comparison of two automated DNA amplification systems with a manual one-tube nested PCR assay for diagnosis of pulmonary tuberculosis. Journal of Clinical Microbiology 35:1385-1389. 13. J. C. Palomino. 2005. Nonconventional and new methods in the diagnosis of tuberculosis: feasibility and applicability in the field. European Respiratory Journal 26:339-350. 14. Ichiyama, S., Iinuma, Y., Tawada, Y. et al. 1996. Evaluation of Gen-Probe amplified Mycobacterium tuberculosis direct test and Roche PCR-microwell plate hybridization method (AMPLICOR Mycobacterium) for direct detection of mycobacteria. Journal of Clinical Microbiology 34:130-133. 15. Saiki, R. K., S. Scharf, F. Faloona, K. B. Mullis, G. T. Horn, H. A. Erlich, and N. Arnheim. 1985. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science, 230:1350-1354. 16. Mullis, K. B. and F. A. Faloona. 1987. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods in Enzymology, 155:335-350. 17. Kent, P.T. and Kubica, G.P. 1985. US DHHS. Public Health Mycobacteriology. A guide for the level III laboratory. Centers for Disease Control, Atlanta, GA. 18. Böddinghaus, B., Rogall, T., Flohr, T. et al. 1990. Detection and identification of mycobacteria by amplification of rrna. Journal of Clinical Microbiology 28:1751-1759. 19. Longo, M. C., M. S. Berninger, and J. L. Hartley. 1990. Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions. Gene, 93:125-128. 20. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 1999. Richmond, J.Y. and McKinney, R.W. eds. 4th Edition. HHS Publication Number (CDC) 93-8395. 21. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Protection of Laboratory Workers from Occupationally Acquired Infections. Approved Guideline-Third Edition. CLSI Document M29-A3 Wayne, PA:CLSI, 2005. 22. International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 41st Edition. 2000. 704 pp. 05175020001-04NO 19 Doc Rev. 4.0

Informasjon om dokumentrevisjon Doc Rev. 4.0 5/2010 Doc Rev. 3.1 11/2009 Harmonisering av terminologien for beskrivelse av ekstraherte prøver før tilsetting til Working Master Mix. Ekstraherte prøver før tilsetting til MMX blir nå bare kalt preparerte prøver gjennom hele pakningsvedlegget. Oppbevaringsparameterne for oppbevaring av Preparerte prøver blir oppdatert til nøyaktig beskrivelse av de riktige oppbevaringsparameterne. Denne reviderte teksten vil vise: Preparerte prøver er stabile i opptil 4 timer ved romtemperatur eller opptil 4 dager ved 2 8 C før tilsetting til Working Master Mix. I avsnittet VURDERING AV ANALYTISK YTELSE - Korrelasjon, er plasseringen av data korrigert for tabell 4 og 6 Kontakt din lokale Roche-representant om du har noen spørsmål. 05175020001-04NO 20 Doc Rev. 4.0