COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, version 2.0

Transkript

1 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, version 2.0 FOR BRUK TIL IN VITRO-DIAGNOSTIKK. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV V Tests P/N: HBV Test, v2.0 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan PG WR 5.1 Liter P/N: Wash Reagent TILTENKT BRUK COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-test, versjon 2.0 (v2.0), er en in vitro nukleinsyreamplifikasjonstest for kvantitering av hepatitt B-virus (HBV)-DNA i humant plasma og serum ved hjelp av COBAS AmpliPrep-instrumentet for automatisk prøvebehandling og COBAS TaqMan -analysatoren eller COBAS TaqMan 48-analysatoren for automatisk amplifikasjon og deteksjon. Testen skal brukes som et hjelpemiddel i utredning av pasienter med kronisk HBV-infeksjon som får antiviral behandling. Analysen kan brukes til å måle HBV DNA-nivåene ved baseline og under behandling som en hjelp for å vurdere respons på behandling. Resultatene fra COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, må tolkes i sammenheng med alle relevante kliniske funn og laboratoriefunn. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, skal ikke brukes som screeningtest for tilstedeværelse av HBV i blod eller blodprodukter eller som en diagnostisk test for å bekrefte tilstedeværelse av HBV-infeksjon. SAMMENDRAG OG BESKRIVELSE AV TESTEN Hepatitt B-virus (HBV) er ett av flere virus som er årsak til virushepatitt. Mer enn to milliarder mennesker i verden er infisert med HBV, og mer enn 350 millioner av disse er kronisk infiserte bærere 1,2. Kroniske bærere har høy risiko for å utvikle komplikasjoner av infeksjonen på lengre sikt, inkludert kronisk hepatitt, cirrhose og hepatocellulært karsinom 3,4,5. Serologiske markører er ofte brukt som diagnostiske og/eller prognostiske indikatorer for akutt eller kronisk HBV-infeksjon. Den vanligste markøren på HBV-infeksjon er tilstedeværelsen av HBV-overflateantigen (HBsAg). Selv om bærere kan bli kvitt HBsAg og utvikle antistoff mot HBsAg, ser det ut til fortsatt å være en risiko for alvorlige leverkomplikasjoner senere i livet 6,7. HBV e-antigen (HBeAg) brukes generelt som en sekundær markør som indikator på aktiv HBV-replikering som er forbundet med progressiv leversykdom. Hvis HBeAg ikke forsvinner, økes risikoen for å få kronisk leversykdom 8,9. Varianter av HBV-stammer kan enten produsere HBeAg som ikke kan påvises i serum, eller stammen kan miste evnen til å fremstille HBeAg, selv om det er en aktiv infeksjon til stede 10. Derfor kan bruken av denne markøren til monitorering av sykdomsprogresjon ha begrenset nytte 11. Evnen til å påvise HBV DNA i serum har vist seg å ha en prognostisk verdi for utfallet av akutte og kroniske HBVinfeksjoner Metoden gjør det mulig å påvise HBV-DNA etter HBsAg-clearance 16 eller påvise HBV ved manglende serologiske markører 17. Et forhold mellom serologiske markører og HBV-DNA-nivåer er imidlertid ennå ikke etablert. Effekten av antiviral behandling av pasienter med HBV kan også vurderes med serologiske markører eller ved måling av leverenzymfunksjon. Den mest direkte og pålitelige målingen av virusreplikering anses imidlertid å være kvantitering av HBV-virus-DNA i serum eller plasma 14, Et raskt og vedvarende fall i HBV-DNA-nivåene hos pasienter som mottar behandling med alfainterferon, lamivudin, ganciklovir eller adefovir dipivoxil, har vist seg å være en prediktiv faktor for et gunstig behandlingsutfall 11, Monitorering av HBV-DNA-nivåer kan predikere utviklingen av lamuvidinresistens 26. En kvantitativ test til måling av HBV-DNA er derfor et verdifullt verktøy som kan brukes sammen med andre serologiske markører ved behandlingen av HBV-infeksjon. HBV-DNA i plasma kan kvantiteres ved hjelp av nukleinsyreamplifikasjon, som for eksempel polymerasekjedereaksjon (PCR) COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-test, v2.0, bruker PCRteknologi for å oppnå maksimal sensitivitet og dynamisk område for kvantitativ påvisning av HBV-DNA i plasma og serum antikoagulert med EDTA NO 1

2 TESTPRINSIPPER COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, er en nukleinsyreamplifikasjonstest for kvantitering av hepatitt B-virus (HBV)-DNA i humant plasma og serum. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, er basert på to hovedprosesser: (1) prøvepreparering for å isolere HBV-DNA og (2) samtidig PCR-amplifikasjon 27 av mål-dna og deteksjon av splittede dobbelmerkede og målspesifikke oligunukleotiddeteksjonsprober. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, muliggjør automatisk prøvepreparering etterfulgt av automatisk PCR-amplifikasjon og deteksjon av mål-hbv-dna og HBV-kvantiteringsstandard (QS)-DNA. Master Mix-reagenset inneholder primerpar og prober som er spesifikke for både HBV-DNA og HBV-QS- DNA. Master Mix er utviklet for å sikre en likeverdig kvantitering av HBV-genotypene A til H. Deteksjonen av amplifisert DNA utføres ved hjelp av en målspesifikk og en kvantiteringsstandardspesifikk dobbelmerket oligonukleotidprobe som gir uavhengig identifisering av HBV-amplicon og HBV-QS-amplicon. Kvantiteringen av HBV-virus-DNA utføres ved hjelp av HBV-QS. Kvantiteringsstandarden kompenserer for hemmingseffekter og kontrollerer preparerings- og amplifikasjonsprosessene slik at kvantiteringen av HBV-DNA blir korrekt i hver prøve. Den er en ikke-infeksiøs DNA-konstruksjon som inneholder HBVsekvenser med identiske primerbindingsregioner som mål-hbv-dna, og en unik probebindingsregion som gjør det mulig å skille HBV-QS-amplicon fra HBV-amplicon. Et kjent kopiantall av HBV-QS tilsettes i hver prøve og medføres gjennom trinnene med prøvepreparering, samtidig PCR-amplifikasjon og deteksjon av splittede dobbelmerkede oligonukleotiddeteksjonsprober. COBAS TaqMan -analysatoren eller COBAS TaqMan 48-analysatoren beregner HBV-DNA-nivåene i testprøvene ved å sammenligne HBV-signalet med HBV-QS-signalet for hver prøve og kontroll. Valg av mål Valget av mål-dna-sekvensen for HBV avhenger av identifisering av regioner innen HBV-genomet som viser maksimal sekvenskonservering mellom de ulike HBV-genotypene. Generisk silisiumbasert prøvepreparering blir benyttet til å binde HBV-DNA og HBV-QS-DNA, og definerte oligonukleotider brukes som primere ved amplifikasjon av HBV-DNA og HBV-QS-DNA. En målspesifikk og en QS-spesifikk dobbelmerket oligonukleotidprobe muliggjør uavhengig identifisering av HBV-amplicon og HBV-QSamplicon. Derfor er riktig valg av primere og dobbelmerket oligonukleotidprobe avgjørende for testens evne til å amplifisere og detektere HBV-genotypene. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, bruker tre amplifikasjonsprimere for PCR. En signalgenererende dobbelmerket probe hybridiserer til "anti-sense"-tråden og splittes av Z05 DNA-polymerase under forlenging av primerne. Amplicon av genotypene A F og H består av en sekvens på 145 nukleotider. Genotype G-amplicon består imidlertid av en sekvens på 181 nukleotider. Et innskudd på 36 baser innen den enkelttrådete høykonserverte precore/core-regionen i HBV-genomet gir et større amplicon for genotype G 31. Prøvepreparering COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, benytter automatisert prøvepreparering i COBAS AmpliPrep-instrumentet ved hjelp av en generisk silisiumbasert bindingsteknikk. I prosedyren blir 500 μl plasma eller serum bearbeidet. HBV-viruspartiklene lyseres gjennom inkubasjon ved forhøyet temperatur med en protease og kaotropisk lyserings-/bindingsbuffer som frigjør nukleinsyrer og beskytter det frigjorte HBV-DNA fra DNaser i plasma og serum. Protease og et kjent antall HBV-QS-DNA-molekyler tilsettes til hver prøve sammen med lyseringsreagens og magnetiske glasspartikler. Deretter blir blandingen inkubert, og HBV-DNA og HBV-QS-DNA bindes til overflaten av de magnetiske glasspartiklene. Ubundne substanser, slik som salter, proteiner og andre cellulære forurensninger, fjernes ved å vaske de magnetiske glasspartiklene. Etter separasjon av mikropartiklene og fullføring av vasketrinnene elueres de adsorberte nukleinsyrene ved forhøyet temperatur i en vandig løsning. Den preparerte prøven, som inneholder magnetiske glasspartikler i tillegg til det frigjorte HBV-DNA og HBV- QS-DNA, tilsettes til amplifikasjonsblandingen og overføres til COBAS TaqMan -analysatoren eller COBAS TaqMan 48-analysatoren NO

3 PCR-amplifikasjon The PCR-amplifikasjonsreaksjonen utføres med det termostabile rekombinante enzymet Thermus specie Z05 DNA Polymerase (Z05). I nærvær av mangan (Mn 2+ ) og under passende bufferforhold har Z05 DNApolymeraseaktivitet 32, 33. Dermed kan PCR-amplifikasjon finne sted sammen med sanntidsdeteksjon av ampliconet. Preparerte prøver tilsettes amplifikasjonsblandingen i amplifikasjonsrør (K-rør) der PCR-amplifikasjon skjer. I nærvær av Mn 2+ og deoksynukleotidtrifosfater (dntp) i overskudd, inkludert deoksyadenosin-, deoksyguanosin-, deoksycytidin- og deoksyuridintrifosfater, forlenger Z05 DNA-polymerasen de hybridiserte primerne og danner en DNA-tråd. Målamplifikasjon Termocycleren i COBAS TaqMan -analysatoren eller COBAS TaqMan 48-analysatoren varmer opp reaksjonsblandingen for å denaturere det dobbelttrådete DNA-et og eksponere de spesifikke primermålsekvensene i det sirkulære HBV-DNA-genomet og HBV-QS-DNA. Når blandingen kjøles ned, hybridiseres primerne til mål-dna. I nærvær av Mn 2+ og deoksynukleosidtrifosfater (dntp) i overskudd, inkludert deoksyadenosin-, deoksyguanosin-, deoksycytidin- og deoksyuridintrifosfater (i stedet for tymidintrifosfater), forlenger termostabilt Thermus specie Z05 DNA Polymerase (Z05) de hybridiserte primerne langs måltemplaten og produserer et dobbelttrådet DNA-molekyl som kalles et amplicon. COBAS TaqMan -analysatoren eller COBAS TaqMan 48-analysatoren gjentar denne prosessen automatisk i et bestemt antall sykluser, der hver syklus skal doble mengden amplicon-dna. Ønsket antall sykluser er forhåndsprogrammert i COBAS TaqMan -analysatoren eller COBAS TaqMan 48- analysatoren. Amplifikasjonen skjer kun i HBV-genomets region mellom primerne. Hele HBV-genomet amplifiseres ikke. Selektiv amplifikasjon Selektiv amplifikasjon av målnukleinsyre fra prøven oppnås i COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBVtesten, v2.0, ved hjelp av AmpErase-enzym (uracil-n-glykosylase) og deoksyuridintrifosfat (dutp). AmpErase-enzymet gjenkjenner og katalyserer destruksjon av DNA-tråder som inneholder deoksyuridin 34, men ikke DNA som inneholder deoksytymidin. Deoksyuridin finnes ikke i naturlig forekommende DNA, men finnes alltid i amplicon på grunn av bruken av deoksyuridintrifosfat som en av dntp-ene i Master Mix-reagenset. Det er derfor kun amplicon som inneholder deoksyuridin. Deoksyuridin gjør kontaminerende amplicon mottakelig for destruksjon av AmpErase-enzymet forut for amplifikasjon av mål- DNA. I tillegg vil uspesifikke produkter som oppstår etter innledende aktivering av Master Mix med mangan, ødelegges av AmpErase-enzymet. AmpErase-enzymet, som inngår i Master Mix-reagenset, katalyserer nedbrytningen av DNA som inneholder deoksyuridin, ved å bryte deoksyuridingruppens deoksyribosekjede ved C1-posisjonen. Ved temperaturøkning i det første varmetrinnet brytes amplicon- DNA-kjeden der deoksyuridinet finnes, noe som igjen fører til at DNA ikke lenger er amplifiserbart. AmpErase-enzymet forblir inaktivt i lengre tid når det utsettes for temperaturer over 55 ºC, dvs. gjennom alle termosykliske trinn, og derfor blir ikke målamplicon som dannes under amplifikasjonen, ødelagt. Deteksjon av PCR-produkter i en COBAS TaqMan -test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, anvender sanntids 27,28 PCR-teknologi. Bruken av dobbel-fluoroscensmerkede prober sørger for sanntidsdeteksjon av akkumulert PCR-produkt ved å måle emisjonsintensiteten av rapporteringsfluorescensen som frigjøres under amplifikasjonsprosessen. Probene består av HBV- og HBV-QS-spesifikke oligonukleotidprober med en rapporteringsfluorofor og en slukkerfluorofor. I COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, er HBV- og HBV-QS-probene merket med ulike rapporteringsfluoroforer. Når disse probene er intakte, undertrykkes rapporteringsfluoroforenes fluorescens på grunn av nærheten til slukkerfluoroforen gjennom energioverføringer av Förster-type. Under PCR hybridiserer proben til en målsekvens og splittes av 5' 3' nukleaseaktivitet hos den termostabile Z05 DNA-polymerasen. Så snart rapporterings- og slukkerfluoroforene er frigjort og separert, forekommer det ikke lenger slukking, og rapporteringsfluoroforenes fluorescensaktivitet øker. Amplifikasjonen av HBV-DNA og HBV-QS-DNA måles uavhengig av hverandre og ved ulike bølgelengder NO 3

4 Denne prosessen gjentas et visst antall sykluser, der hver syklus effektivt øker emisjonsintensiteten hos de individuelle rapporteringsfluoroforene og gir en uavhengig identifikasjon av HBV og HBV-QS-DNA. Den PCR-syklusen hvor starten på en eksponensiell vekstkurve inntreffer, er relatert til mengden kildemateriale ved starten av PCR-reaksjonen. Grunnleggende informasjon om kvantitering med COBAS TaqMan -testen COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, gir et nøyaktig kvantitativt resultat i et stort dynamisk område ettersom måling av amplicon utføres under amplifikasjonens eksponentielle fase. Jo høyere HBV-titer i prøven, jo tidligere øker fluorescenssignalet fra HBV-probens rapporteringsfluorofor ut over fluorescensnivåets baseline (se figur 1). Ettersom mengden av HBV-QS-DNA er konstant i alle prøver, skal HBV-QS-probens rapporteringsfluorescens bli påvisbar i samme syklus for alle prøver (se figur 2). I tilfeller der QS-fluorescensen påvirkes justeres konsentrasjonen tilsvarende. Påvisningen av de spesifikke fluorescenssignalene rapporteres som en kritisk terskelverdi (Ct). Ct defineres som det relative syklusnummeret der rapporteringsfluorescensen overskrider en forhåndsbestemt terskelverdi (det tillagte fluorescens-terskelnivået) og starter signalets eksponensielle vekstfase (se figur 3). En høyere Ct-verdi indikerer et lavere titer av det introduserte mål-hbv-materialet. En 2-folds økning i titer korrelerer med en reduksjon på 1 Ct for mål-hbv-dna, mens en 10-folds økning i titer korrelerer med en reduksjon på 3,3 Ct. Figur 1 viser målvekstkurvene for en fortynningsserie som spenner over et område på 5-log 10. Når viruskonsentrasjonen øker, forskyves vekstkurvene mot tidligere sykluser. Derfor tilsvarer vekstkurven lengst til venstre det høyeste virustiternivået, mens vekstkurven helt til høyre tilsvarer det laveste virustiternivået. Figur 1 Målvekstkurvene for en fortynningsserie av virus som spenner over et område på 5-Log 10 9,00 8,00 7,00 Normalisert fluorescens 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 Høyeste titer Laveste titer -1, Syklusnummer NO

5 Figur 2 viser vekstkurvene for kvantiteringsstandarden for prøver fra en fortynningsserie av virus som spenner over et område på 5-log 10. Mengden kvantiteringsstandard som tilsettes hver prøve, er konstant for hver reaksjon. Kvantiteringsstandardens Ct-verdi er lik uavhengig av virustiter. Figur 2 Vekstkurvene for kvantiteringsstandarden for en fortynningsserie av virus som spenner over et område på 5-Log 10 35,00 30,00 25,00 Laveste titer Normalisert fluorescens 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 Høyeste titer -5, Syklusnummer Figur 3 viser et eksempel på hvordan fluorescensverdiene i hver syklus normaliseres for hver vekstkurve. Det relative syklusnummeret (Ct) beregnes når fluorescenssignalet krysser det tillagte fluorescensterskelnivået. Figur 3 Fluorescensverdier i hver syklus normaliseres for hver vekstkurve 1 0,9 Normalisert fluorescens 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 Tilordnet fluorescens-terskelnivå Ct-verdi = 27,1 0,1 0-0,1-0, Syklusnummer NO 5

6 HBV-DNA-kvantitering COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, foretar en kvantitering av HBV-viralt DNA ved å utnytte en annen målsekvens (HBV-kvantiteringsstandard), som tilsettes prøven i kjent konsentrasjon. HBV-QS er en ikke-infeksiøs DNA-konstruksjon som inneholder fragmenter av HBV-sekvenser med primerbindingsregioner som er identiske med dem i mål-hbv-sekvensen. HBV-QS inneholder HBVprimerbindingsregioner og genererer et amplifikasjonsprodukt av tilsvarende lengde og basesammensetning som mål-hbv-dna. HBV-kvantiteringsstandardens deteksjonsprobebindingsregion er modifisert for å kunne skille HBV-QS-amplicon fra mål-hbv-amplicon. Under PCR-hybridiseringsfasen i COBAS TaqMan -analysatoren eller COBAS TaqMan 48- analysatoren, blir prøvene belyst og eksitert med filtrert lys, og filtrerte emisjonsfluorescensdata registreres for hver prøve. Avlesningene fra hver prøve korrigeres deretter for instrumentvariasjoner. Instrumentet sender disse fluorescensavlesningene til AMPLILINK-programvaren, og de blir lagret i en database. Forhåndsdefinerte kontrollkriterier brukes for å avgjøre om resultatsettene for HBV-DNA og HBV-QS-DNA kan aksepteres som valide resultater. Dersom resultatsettene ligger utenfor de forhåndsbestemte akseptkriteriene, vil de bli flagget. Etter at alle forhåndskontroller er fullført og godkjent, behandles fluorescensresultatene for å generere Ct-verdier for HBV-DNA og HBV-QS-DNA. De lotspesifikke kalibreringsverdiene som leveres sammen med COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, brukes til å beregne titerverdier for prøver og kontroller basert på HBV-DNAs og HBV-QS-DNAs Ctverdier. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, er standardisert i henhold til WHO International Standard for Hepatitis B Virus DNA for Nucleic Acid Technology (NAT) Assays Testing (NIBSC 97/746) 29, og titerresultater rapporteres i internasjonale enheter (IU/ml) NO

7 REAGENSER COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 (P/N: ) HBV2 CS1 (HBV-reagenskassett med magnetiske glasspartikler) Magnetiske glasspartikler 93 % isopropanol Xi 93 % (vekt per vekt) isopropanol HBV V tester 1 x 72 tester 1 x 7,0 ml Irriterende F 93 % (vekt per vekt) isopropanol Meget brannfarlig HBV2 CS2 (HBV lyseringsreagenskassett) Natriumsitratdihydrat 42,5 % guanidintiocyanat < 5 % polydocanol 0,9 % ditiotreitol Xn 42,5 % (vekt per vekt) guanidintiocyanat 1 x 72 tester 1x 78 ml Helseskadelig N < 5 % polydokanol (vekt per vekt) Miljøfarlig HBV2 CS3 HBV multireagenskassett inneholder: Pase (proteinaseløsning) Tris-buffer < 0,05 % EDTA Kalsiumklorid Kalsiumacetat 7,8 % proteinase Glyserol Xn 7,8 % (vekt per vekt) proteinase 1 x 72 tester 1 x 3,8 ml Helseskadelig EB, v2.0 (Elueringsbuffer, v2.0) Tris-base-buffer 0,2 % metylparaben 1 x 7,3 ml NO 7

8 HBV2 CS4 HBV testspesifikk reagenskassett inneholder: HBV QS, v2.0 (HBV kvantiteringsstandard, v2.0) Tris-HCl-buffer EDTA < 0,005 % Poly ra RNA (syntetisk) < 0,001 % ikke-infeksiøs, linearisert, dobbelttrådet plasmid-dna som inneholder et område med HBV-primerbindende sekvenser og en unik probebindende region 0,05 % natriumazid HBV MMX, v2.0 (HBV Master Mix, v2.0) Trisinbuffer Kaliumacetat Kaliumhydroksid 0,09 % natriumazid Glyserol < 0,04 % datp, dctp, dgtp, dutp < 0,003 % HBV oppstrøms- og nedstrømsprimere < 0,003 % oligonukleotidaptamer < 0,003 % fluoroformerkede oligonukleotidprober spesifikke for HBV og HBV-kvantiteringsstandard < 0,05 % Z05 DNA-polymerase (mikrobiell) < 0,1 % AmpErase (uracil-n-glykosylase) enzym (mikrobiell) HBV Mn 2+ (HBV manganløsning) < 0,5 % manganeseacetat Isedikk 0,09 % natriumazid HBV H(+)C, v2.0 (HBV høy positiv kontroll, v2.0) < 0,001 % linearisert, dobbelttrådet plasmid-dna som inneholder HBV-sekvenser Negativt humant plasma, ikke-reaktivt med tester for antistoff mot HCV, antistoff mot HIV-1/2, HIV p24-antigen og HBsAg; HIV-1-RNA, HCV-RNA og HBV-DNA ikke detekterbart med PCR-metoder 0,1 % ProClin 300 konserveringsvæske HBV L(+)C, v2.0 (HBV lav positiv kontroll, v2.0) < 0,001 % linearisert, dobbelttrådet plasmid-dna som inneholder HBV-sekvenser Negativt humant plasma, ikke-reaktivt med tester for antistoff mot HCV, antistoff mot HIV-1/2, HIV p24-antigen og HBsAg; HIV-1-RNA, HCV-RNA og HBV-DNA ikke detekterbart med PCR-metoder 0,1 % ProClin 300 konserveringsvæske 1 x 72 tester 1 x 3,6 ml 1 x 3,4 ml 1 x 19,8 ml 6 x 1,0 ml 6 x 1,0 ml NO

9 CTM ( ) C [COBAS TaqMan negativ kontroll (humant plasma)] Negativt humant plasma, ikke-reaktivt med tester for antistoff mot HCV, antistoff mot HIV-1/2, HIV p24-antigen og HBsAg; HIV-1-RNA, HCV-RNA og HBV-DNA ikke detekterbart med PCR-metoder 0,1 % ProClin 300 konserveringsvæske HBV H(+)C, v2.0 Clip (strekkodeklips for HBV høy positiv kontroll, v2.0) HBV L(+)C, v2.0 Clip (strekkodeklips for HBV lav positiv kontroll, v2.0) HBV (-) C Clip (strekkodeklips for HBV negativ kontroll) 6 x 1,0 ml 1 x 6 klips 1 x 6 klips 1 x 6 klips COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Wash Reagent COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan vaskereagens (P/N: ) PG WR (COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan vaskereagens) Natriumsitratdihydrat < 0,1 % N-metylisotiazolon-HCl PG WR 1 x 5,1 l ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER A. FOR BRUK TIL IN VITRO-DIAGNOSTIKK. B. Denne testen skal brukes til humane serum- eller plasmaprøver med EDTA som antikoagulant. C. Ikke pipetter med munnen. D. Ikke spis, drikk eller røyk i laboratoriets arbeidsområder. Bruk beskyttende engangshansker, laboratoriefrakk og vernebriller når du håndterer prøver og reagenser. Vask hendene nøye etter håndtering av prøver og reagenser. E. Unngå mikrobiell kontaminering og ribonukleasekontaminering av reagensene når du pipetterer ut porsjoner fra kontrollflasker. F. Bruk av sterile engangspipetter og DNase-frie pipettespisser anbefales. G. Kontroller fra ulike lot eller ulike flasker fra samme lot må ikke blandes sammen. H. Reagenskassetter eller kontroller fra ulike kit må ikke blandes. I. COBAS AmpliPrep-kassetter må ikke åpnes, og flasker må ikke byttes om, fjernes eller settes til. J. Kast ubrukte reagenser, avfall og prøver i henhold til nasjonalt, regionalt og lokalt regelverk. K. Kit som er utgått på dato, må ikke brukes. L. Dataark om materialsikkerhet (MSDS) kan på forespørsel sendes fra ditt lokale Roche-kontor NO 9

10 M. Prøver og kontroller må håndteres som infeksiøse, og sikre laboratorierutiner må følges. Disse er beskrevet i Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 35 og i CLSI-dokument M29-A3 36. Rengjør og desinfiser alle arbeidsoverflater nøye med en nylaget løsning av 0,5 % natriumhypokloritt i deionisert eller destillert vann. Merk: Kommersielt tilgjengelig blekemiddel til husholdningsbruk inneholder normalt natriumhypokloritt med en konsentrasjon på 5,25 %. En fortynning i forholdet 1:10 med et slikt blekemiddel gir en 0,5 % natriumhypoklorittløsning. N. ADVARSEL: CTM ( ) C, HBV L(+)C, v2.0 og HBV H(+)C, v2.0 inneholder humant plasma utskilt fra humant blod. Kildematerialet er testet og har vist seg å være ikke-reaktivt for hepatitt B overflateantigen (HBsAg), antistoffer mot HIV-1/2 og HCV og HIV p24-antigen. Testing av negativt humant plasma med PCR-metoder viste ikke detekterbart HIV-1-RNA, HCV-RNA eller HBV-DNA. Ingen kjente testmetoder kan fullstendig garantere at produkter fra humant blod ikke vil kunne overføre infeksiøse agens. Derfor må alt humant materiale betraktes som potensielt infeksiøst. CTM ( ) C, HBV L(+)C, v2.0 og HBV H(+)C, v2.0 må håndteres som infeksiøst materiale, og sikre laboratorierutiner må følges. Disse er beskrevet i Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 35 og i CLSI-dokumentet M29-A3 36. Rengjør og desinfiser alle arbeidsoverflater nøye med en nylaget løsning av 0,5 % natriumhypokloritt i deionisert eller destillert vann. O. HBV QS, v2.0, HBV Mn 2+ og HBV MMX, v2.0 inneholder natriumazid. Natriumazid kan reagere med bly- og kobberrør og danne svært eksplosive metallazider. Hvis løsninger som inneholder natriumazid, helles ned i avløp i laboratoriet, må de skylles ned med store mengder vann for å unngå azidoppbygging. P. Bruk vernebriller, laboratoriefrakk og engangshansker ved håndtering av reagenser. Unngå kontakt med hud, øyne eller slimhinner. Skyll umiddelbart med mye vann hvis slik kontakt oppstår. Hvis kontaktstedet ikke blir behandlet, kan det oppstå brannskade. Fortynn med vann før du tørker opp eventuelt søl fra reagensene. Q. Ikke la HBV2 CS2 og flytende avfall fra COBAS AmpliPrep-instrumentet, som inneholder guanidintiocyanat, komme i kontakt med natriumhypoklorittløsning (blekemiddel). Disse blandingene kan produsere en svært giftig gass. R. Ved avhending av brukte COBAS AmpliPrep SPU-er (Specimen Processing Units), som inneholder guanidintiocyanat, må du unngå enhver kontakt med natriumhypoklorittløsning (blekemiddel). Disse blandingene kan produsere en svært giftig gass. OPPBEVARING OG HÅNDTERING A. Ikke frys reagenser eller kontroller. B. Oppbevar HBV2 CS1, HBV2 CS2, HBV2 CS3 og HBV2 CS4 ved 2-8 ºC. Når disse reagensene er uåpnet, er de stabile til utløpsdato. Når de er åpnet, er disse reagensene stabile i 63 dager ved 2 8 C eller til utløpsdato, avhengig av hva som kommer først. HBV2 CS1, HBV2 CS2, HBV2 CS3 og HBV2 CS4 kan brukes i maksimalt 64 timer til sammen i COBAS AmpliPrep-instrumentet. Reagenser må oppbevares ved 2 8 C mellom instrumentsykluser. C. Oppbevar HBV H(+)C, v2.0; HBV L(+)C, v2.0 og CTM ( ) C ved 2-8 ºC. Disse kontrollene er stabile til angitt utløpsdato. Etter åpning må alle ubrukte rester kastes. D. Oppbevar strekkodeklips [HBV H(+)C, v2.0 Clip, HBV L(+)C, v2.0 Clip og HBV ( ) C Clip] ved 2-30 C. E. Oppbevar PG WR ved 2-30 C. PG WR er stabilt til angitt utløpsdato. Etter åpning er dette reagenset stabilt i 28 dager ved 2 30 C eller til utløpsdato, avhengig av hva som kommer først NO

11 MATERIELL SOM MEDFØLGER A. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Test, v2.0 (P/N: ) HBV V2.0 HBV2 CS1 (HBV-reagenskassett med magnetiske glasspartikler)) HBV2 CS2 (HBV lyseringsreagenskassett) HBV2 CS3 (HBV-multireagenskassett) HBV2 CS4 (HBV-testspesifikk reagenskassett) HBV H(+)C, v2.0 (HBV høy positiv kontroll, v2.0) HBV L(+)C, v2.0 (HBV lav positiv kontroll, v2.0) CTM ( ) C [COBAS TaqMan negativ kontroll (humant plasma)] HBV H(+)C, v2.0 Clip (HBV høy positiv kontroll, v2.0 strekkodeklips) HBV L(+)C, v2.0 Clip (HBV lav positiv kontroll, v2.0 strekkodeklips) HBV ( ) C Clip (HBV negativ kontroll strekkodeklips) B. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Wash Reagent COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan vaskereagens (P/N: ) PG WR PG WR (COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan vaskereagens) MATERIELL SOM KREVES, MEN SOM IKKE MEDFØLGER Instrumentering og programvare COBAS AmpliPrep-instrument COBAS TaqMan -analysator eller COBAS TaqMan 48-analysator Tilleggsutstyr: dokkingstasjon Tilleggsutstyr: cobas p 630-instrument AMPLILINK-programvare versjon 3.2-serien eller 3.3-serien Datastasjon for AMPLILINK-programvare, med skriver NO 11

12 Manualer for AMPLILINK-programvaren v3.2 eller v3.3 Series: COBAS AmpliPrep-instrument Instrumentmanual for bruk med COBAS TaqMan - analysatoren, COBAS TaqMan 48-analysatoren, COBAS AMPLICOR -analysatoren eller cobas p 630-instrumentet, og AMPLILINK-programvaren, versjon 3.2- og 3.3-serien Instrumentmanual for COBAS TaqMan -analysator (pluss evt. dokkingstasjon) for bruk sammen med applikasjonsmanual for AMPLILINK-programvaren, versjon 3.2- og 3.3-serien Instrumentmanual for COBAS TaqMan 48-analysator for bruk sammen med applikasjonsmanualen for AMPLILINK-programvaren, versjon 3.2- og 3.3-serien Applikasjonsmanual for AMPLILINK-programvaren, versjon 3.2-serien for bruk sammen med COBAS AmpliPrep-instrumentet, COBAS TaqMan -analysator, COBAS TaqMan 48-analysator og COBAS AMPLICOR -analysator Applikasjonsmanual for AMPLILINK-programvaren, versjon 3.3-serien for bruk med COBAS AmpliPrep-instrumentet, COBAS TaqMan -analysator, COBAS TaqMan 48-analysator, COBAS AMPLICOR -analysator og cobas p 630-instrumentet Tilleggsutstyr: Operatørmanual til cobas p 630-instrumentet, programvareversjon 2.0 Engangsartikler Prøveprepareringsenheter: SPUs eller Rør for innmating av prøver (S-rør) med strekkodeetiketter K-spiss rack K-rør, eske med 12 x 96 ANNET MATERIELL SOM KREVES, MEN SOM IKKE MEDFØLGER Prøvestativ (SK24-stativ) Reagensstativ SPU-stativ K-carrier K-carrier, løfteverktøy K-carrier, rack Pipetter med aerosolbarriere- eller "positive displacement" DNase-frie spisser (kapasitet 1000 μl)* Engangshansker, uten pudder Vortexmikser * Pipettene må ha en nøyaktighet innenfor 3 % av angitt volum. Aerosolbarriere- eller "positive displacement" DNase-frie spisser må brukes der dette er angitt for å hindre krysskontaminering av prøver og amplicon NO

13 PRØVETAKING, TRANSPORT OG OPPBEVARING Merk: Alle prøver og kontroller må behandles som om de er potensielt infeksiøse. Merk: Denne testen er kun validert for bruk sammen med humant serum eller plasma med EDTA som antikoagulant. Testing av andre prøvematerialer kan føre til feil resultat. A. Prøvetaking COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, skal brukes for serum- eller plasmaprøver. Blodprøver må tas i sterile rør med EDTA (lyselilla topp) som antikoagulant eller i SST serumseparatorrør. Oppbevar fullblod ved 2-25 C i maksimalt 24 timer. Separer plasma eller serum fra fullblod innen 24 timer etter prøvetaking ved å sentrifugere ved x g i 20 minutter i romtemperatur (15-30 C). Overfør plasma eller serum til et sterilt polypropylenrør. Figur 4 og 5 viser holdbarhetsdata for prøver fra undersøkelser om prøveholdbarhet utført med COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0. Figur 4 HBV-stabilitet i fullblod; (tatt på rør for EDTA-plasma) Titerlogg 10 (IU/ml) Prøve 2-8 C < 1 t C, 24 t. 2-8 C, 24 t. Figur 5 HBV-stabilitet i fullblod; (tatt på serumseparatorrør) Titerlogg 10 (IU/ml) Prøve 2-8 C < 1 t C, 24 t. 2-8 C, 24 t NO 13

14 B. Transport av prøver Transport av fullblod, plasma eller serum må skje i henhold til nasjonalt, regionalt og lokalt regelverk for transport av biologisk materiale 37. Fullblod må transporteres ved 2 25 C og sentrifugeres innen 24 timer etter prøvetaking. Plasma eller serum kan transporteres ved 2 8 C eller nedfrosset ved -20 C til -80 C. C. Oppbevaring av prøver Plasma- eller serumprøver kan oppbevares ved C i inntil 3 dager, ved 2-8 C i inntil 7 dager eller nedfrosset ved -20 C til -80 C i minst seks uker. Det anbefales at prøvene oppbevares i porsjoner à μl i sterile 2,0 ml polypropylenrør med skrukork (for eksempel Sarstedt ). Figur 6 og 7 viser holdbarhetsdata for prøver fra undersøkelser om prøveholdbarhet utført med COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0. Figur 6 HBV-stabilitet i EDTA-plasma Titerlogg 10 (IU/ml) Prøve 2-8 C < 2 t C, 3 d. 2-8 C, 7 d. -20 C, 6 u. -70 C, 6 u. Figur 7 HBV-stabilitet i serum Titerlogg 10 (IU/ml) Prøve 2-8 C < 2 t C, 3 d. 2-8 C, 7 d. -20 C, 6 u. -70 C, 6 u NO

15 Plasma- og serumprøver kan fryses ned og tines inntil fem ganger uten tap av HBV-DNA. Figur 8 og 9 viser data fra fryse/tine-studier utført på COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0 Figur 8 HBV-resultater etter inntil fem fryse-tine-sykluser (F-T-sykluser) (EDTA-plasma) Titerlogg 10 (IU/ml) Prøve 0x Fryse/tine 3x Fryse/tine 5x Fryse/tine Figur 9 HBV-resultater etter inntil fem fryse-tine-sykluser (F-T-sykluser) (serum) Titerlogg 10 (IU/ml) 0x Fryse/tine Prøve 3x Fryse/tine 5x Fryse/tine NO 15

16 BRUKSANVISNING Merk: For mer detaljert informasjon, en detaljert beskrivelse av de mulige konfigurasjonene, utskrift av resultat og tolking av flagg, kommentarer og feilmeldinger, se (1) instrumentmanualen for COBAS AmpliPrep-instrument for bruk sammen med COBAS TaqMan -analysatoren, COBAS TaqMan 48-analysatoren, COBAS AMPLICOR -analysatoren eller cobas p 630-instrumentet og AMPLILINK-programvaren, versjon Series; (2) instrumentmanualen for COBAS TaqMan -analysatoren (pluss ev. dokkingstasjon) for bruk sammen med applikasjonsmanualen for AMPLILINK-programvaren, versjon Series; (3) instrumentmanualen for COBAS TaqMan 48-analysatoren for bruk sammen med applikasjonsmanualen for AMPLILINKprogramvaren, versjon ; (4) applikasjonsmanualen for AMPLILINK-programvaren, versjon 3.2 Series for bruk sammen med COBAS AmpliPrep-instrumentet, COBAS TaqMan - analysatoren, COBAS TaqMan 48-analysatoren og COBAS AMPLICOR -analysatoren eller applikasjonsmanualen for AMPLILINK-programvaren, versjon 3.3 Series for bruk sammen med COBAS AmpliPrep-instrumentet, COBAS TaqMan -analysatoren, COBAS TaqMan 48-analysatoren, COBAS AMPLICOR -analysatoren og cobas p 630-instrumentet; (5) valgfritt: Operatørmanual til cobas p 630-instrument, programvareversjon 2.0. Størrelse på analyseserie Hvert kit inneholder reagenser som er tilstrekkelig for 72 tester, og disse kan utføres i analyseserier på 12 til 24 tester. Minst ett replikat av henholdsvis CTM ( ) C, HBV L(+)C, v2.0 og HBV H(+)C, v2.0 må tas med i hver analyseserie (se "Kvalitetskontroll"). Arbeidsflyt Analyseringen i COBAS TaqMan -analysatoren eller COBAS TaqMan 48-analysatoren må startes innen 120 minutter etter at preparering av prøver og kontroller er fullført. Merk: Preparerte prøver og kontroller må ikke fryses ned eller oppbevares ved 2 8 C. Prøve- og kontrollpreparering Merk: Ved bruk av frosne prøver må prøvene stå i romtemperatur (15-30 C) til de er helt tinte og deretter vortexes i 3-5 sekunder før bruk. Kontrollene skal tas ut fra kjølelagringen på 2-8 C og oppnå romtemperatur før bruk. Klargjøring av COBAS AmpliPrep-instrumentet Del A. Vedlikehold og gjennomskylling A1. COBAS AmpliPrep-instrumentet er klart for drift i stand-by-modus. A2. Slå datastasjonen for AMPLILINK-programvaren på (ON). Klargjør datastasjonen på følgende måte: a. Logg på operativsystemet Windows XP. b. Dobbeltklikk på ikonet for AMPLILINK-programvaren. c. Logg deg på AMPLILINK-programvare ved å taste inn tildelt bruker-id og passord. A3. Kontroller beholdningen av PG WR ved hjelp av skjermbildet Status. Skift ut om nødvendig. A4. Utfør alle vedlikeholdsprosedyrer som er angitt på fliken Due. COBAS AmpliPrep-instrumentet vil automatisk skylle igjennom ("prime") systemet NO

17 Del B. Lasting av reagenskassetter Merk Alle reagenskassetter skal tas ut fra 2 8 C lagringsstedet, umiddelbart lastes inn i COBAS AmpliPrep-instrumentet og skal stå i romtemperatur i instrumentet i minst 30 minutter før den første prøven skal analyseres. Ikke la reagenskassettene oppnå romtemperatur utenfor instrumentet, da det kan forårsake kondens på strekkodeetikettene. Ikke tørk av kondens fra strekkodeetikettene hvis dette skulle forekomme. B1. Plasser HBV2 CS1 i et reagensstativ. Plasser HBV2 CS2, HBV2 CS3 og HBV2 CS4 i et eget reagensstativ. B2. Sett inn reagensstativet som inneholder HBV2 CS1 i posisjon A i COBAS AmpliPrep-instrumentet. B3. Sett inn reagensstativet som inneholder HBV2 CS2, HBV2 CS3 og HBV2 CS4, i posisjon B, C, D eller E i COBAS AmpliPrep-instrumentet. (Se tabell 1 for ytterligere informasjon.) Del C. Lasting av engangsartikler Merk: Bestem antall COBAS AmpliPrep-reagenskassetter, prøveprepareringsenheter (SPU-er), Input S-rør, K-spisser og K-rør som skal brukes. Én SPU, ett Input S-rør, én K-spiss og ett K-rør er nødvendig for hver prøve eller kontroll. Det finnes flere mulige arbeidsflyter for bruk av COBAS AmpliPrep-instrumentet med COBAS TaqMan - analysatoren eller COBAS TaqMan 48-analysatoren. Se tabell 1 under som referanse. Avhengig av den valgte konfigurasjonen settes det inn passende antall reagenskassettstativer, prøvestativer med Input S-rør, SPU-stativer, K-spiss racks, K-rør racks og K-carriers på K-carrier racks i de respektive stativposisjonene i COBAS AmpliPrep-instrumentet (se tabell 1 for ytterligere informasjon). C1. Plasser SPU-ene i SPU-stativene, og sett stativene i posisjon J, K eller L i COBAS AmpliPrepinstrumentet. C2. Avhengig av den valgte arbeidsflyten settes fylte K-rør rack(s) i posisjon M, N, O eller P i COBAS AmpliPrep-instrumentet. C3. Plasser fylte K-spiss rack(s) i posisjon M, N, O eller P i COBAS AmpliPrep-instrumentet. C4. Til arbeidsflyt 3 med COBAS TaqMan 48-analysatoren, settes K-carriers på K-carrier-stativ(er) i posisjon M, N, O eller P i COBAS AmpliPrep-instrumentet NO 17

18 Tabell 1 Mulige arbeidsflyter ved bruk av COBAS AmpliPrep-instrumentet med COBAS TaqMan -analysator eller COBAS TaqMan 48-analysator Arbeidsflyt COBAS AmpliPrepinstrument pluss Dokkingstasjon pluss COBAS TaqMan - analysator COBAS AmpliPrepinstrument pluss COBAS TaqMan - analysator COBAS AmpliPrepinstrument pluss COBAS TaqMan 48-analysator(er) Overføringsmodus for COBAS TaqMan - analysator eller COBAS TaqMan 48- analysator Automatisert overføring av K-carrier Manuell overføring av K-rør via prøvestativ til COBAS TaqMan -analysator Manuell overføring av K-carrier via K-carrier-stativ til COBAS TaqMan 48-analysator Stativer og engangsartikler K-rør i fulle K-rør racks K-spisser i fulle K-spiss rack Input S-rør med prøver og kontroller i prøvestativ SPU-er i SPU-stativ CS1 i kassettstativ CS2, CS3, CS4 i kassettstativ K-rør i fulle K-rør rack K-spisser i fulle K-spiss rack Input S-rør med prøver og kontroller i prøvestativ SPU-er i SPU-stativ CS1 i kassettstativ CS2, CS3, CS4 i kassettstativ Etter fullført prøvepreparering: K-rør i prøvestativ (klar for manuell overføring) K-rør i prøvestativ K-spisser i fulle K-spiss rack Input S-rør med prøver og kontroller i prøvestativ SPU-er i SPU-stativ CS1 i kassettstativ CS2, CS3, CS4 i kassettstativ Tom, strekkodemerket K-carrier i K-carrier rack Etter fullført prøvepreparering: K-rør i K-carrier i K-carrier rack Posisjon på COBAS AmpliPrepinstrumentet M P M P F H J L A B E M P M P F H J L A B E Samme som over (F H) F H M P F H J L A B E M P Samme som over (M P) NO

19 Del D. Bestilling og innlasting av prøver D1. Klargjør prøvestativene på følgende måte: Fest en strekkodeklips til hver prøvestativposisjon der en prøve (S-rør) vil bli plassert. Fest en av de spesifikke strekkodeklipsene for kontrollene [CTM ( ) C, HBV L(+)C, v2.0 og HBV H(+)C, v2.0] i hver prøvestativposisjon der kontrollene (S-rør) skal plasseres. Kontrollenes strekkodeklips skal ha samme kontrollotnummer som lotnummeret på kontrollflaskene i kitet. Sørg for å sette riktig kontroll i posisjonen med tilsvarende kontrollstrekkodeklips. Plasser ett Input S-rør i hver posisjon som har en strekkodeklips. D2. Bruk AMPLILINK-programvaren til å opprette prøvebestillinger for hver prøve og kontroll i vinduet Orders i mappen Sample. Velg den korrekte testfilen, og avslutt med å lagre. D3. Tildel prøve- og kontrollbestillinger til prøvestativposisjoner i vinduet Orders i mappen Sample Rack. Prøvestativnummeret må stemme overens med det stativet som ble klargjort i trinn D1. D4. Skriv ut rapporten Sample Rack Order og bruk den som arbeidsark. D5. Klargjør prøve- og kontrollstativ i det reserverte området for tilsetting av prøver og kontroller på følgende måte: Vortex hver prøve og kontroll [CTM ( ) C, HBV L(+)C, v2.0 og HBV H(+)C, v2.0] i 3 til 5 sekunder. Vær forsiktig, slik at hanskene ikke kontamineres når prøver og kontroller behandles. D6. Overfør 650 μl av hver prøve og kontroll [CTM ( ) C, HBV L(+)C, v2.0 og HBV H(+)C, v2.0] til det korresponderende strekkodemerkede Input S-røret ved hjelp av en mikropipette med aerosolbarriere- eller "positive displacement" DNase-fri spiss. Unngå å overføre partikler og/eller fibrinklumper fra den opprinnelige prøven til input S-røret. Prøver og kontroller må overføres til de rørposisjonene som er tildelt og registrert på arbeidsarket i trinn D4. Kontrollenes strekkodeklips skal ha samme kontrollotnummer som lotnummeret på kontrollflaskene i kitet. Sørg for å sette riktig kontroll i posisjonen med tilsvarende kontrollstrekkodeklips. Vær forsiktig, slik at den øvre delen av S-rørene ikke kontamineres av prøver eller kontroller. D7. Se i operatørmanualen til cobas p 630-instrumentet ved bruk av cobas p 630-instrumentet til klargjøring av prøver. D8. Til arbeidsflyt 1 og 2 settes prøvestativ med Input S-rør i posisjon F, G eller H i COBAS AmpliPrepinstrumentet. D9. Til arbeidsflyt 3 ved bruk av COBAS TaqMan 48-analysatoren settes prøvestativ med Input S-rør og K-rør (ett til hvert Input S-rør, innsatt i riktig posisjon ved siden av Input S-rør) i posisjon F, G eller H i COBAS AmpliPrep-instrumentet. Del E. Start av kjøringen på COBAS AmpliPrep-instrumentet E1. Start COBAS AmpliPrep-instrumentet med AMPLILINK-programvaren. Del F. Avslutning av kjøringen på COBAS AmpliPrep-instrumentet og overføring til COBAS TaqMan -analysatoren eller COBAS TaqMan 48-analysatoren (kun for arbeidsflyt 2 og 3) F1. Sjekk om det kommer opp flagg eller feilmeldinger. F2. Ta ut de preparerte prøvene og kontrollene fra COBAS AmpliPrep-instrumentet på enten prøvestativ (for COBAS TaqMan -analysatoren uten dokkingstasjon) eller K-carrier racks (for COBAS TaqMan 48-analysatoren), avhengig av valgt arbeidsflyt (se del G for ytterligere informasjon). F3. Fjern avfall fra COBAS AmpliPrep-instrumentet. Merk: Preparerte prøver og kontroller må ikke utsettes for lys etter at prøve- og kontrollprepareringen er fullført NO 19

20 Amplifikasjon og deteksjon Klargjøring av COBAS TaqMan -analysatoren eller COBAS TaqMan 48-analysatoren Analyseringen i COBAS TaqMan -analysatoren eller COBAS TaqMan 48-analysatoren må startes innen 120 minutter etter at preparering av prøver og kontroller er fullført. Merk: Preparerte prøver og kontroller må ikke fryses ned eller oppbevares ved 2-8 C. Del G. Innlasting av preparerte prøver G1. Avhengig av den valgte arbeidsflyten utføres de nødvendige trinnene for å overføre K-rør til COBAS TaqMan -analysatoren eller COBAS TaqMan 48-analysatoren: Arbeidsflyt 1: Automatisk overføring av K-carrier via dokkingstasjon til COBAS TaqMan -analysatoren. Dette krever ikke manuelle inngrep fra brukeren. Arbeidsflyt 2: Manuell overføring av K-rør i prøvestativ til COBAS TaqMan - analysatoren Arbeidsflyt 3: Manuell overføring av K-carrier på K-carrier rack(s) til COBAS TaqMan 48-analysatoren. Manuell overføring av K-carriers til COBAS TaqMan 48-analysatoren ved hjelp av løfteverktøyet for K-carrier. Del H. Start av kjøringen på COBAS TaqMan -analysatoren eller COBAS TaqMan 48- analysatoren H1. Start COBAS TaqMan -analysatoren eller COBAS TaqMan 48-analysatoren ved å foreta et av valgene nedenfor avhengig av hvilken arbeidsflyt som er brukt: Arbeidsflyt 1: Arbeidsflyt 2: Arbeidsflyt 3: Krever ingen inngrep fra brukeren. Automatisk start av COBAS TaqMan -analysatoren etter innsetting av prøvestativ. Fyll K-carrier med tomme K-rør hvis det er færre enn 6 K-rør i K-carrier. AMPLILINK-programvaren veileder i fyllingen. Åpne termoblokkdekselet, sett inn K-carrier i termoblokken og steng lokket. Start kjøringen på COBAS TaqMan 48-analysatoren. Del I. Avslutning av kjøringen på COBAS TaqMan -analysatoren eller COBAS TaqMan 48- analysatoren I1. Skriv ut resultatrapporten når analyseserien i COBAS TaqMan -analysatoren eller COBAS TaqMan 48-analysatoren er fullført. Sjekk om det finnes flagg eller feilmeldinger i resultatrapporten. Prøver med flagg og kommentarer tolkes slik som beskrevet under "Resultater". Lagre dataene i arkivet når de er godkjent. I2. Ta ut brukte K-rør fra COBAS TaqMan -analysatoren eller COBAS TaqMan 48-analysatoren NO

21 RESULTATER COBAS TaqMan -analysatoren eller COBAS TaqMan 48-analysatoren beregner automatisk HBV-DNAkonsentrasjonen for prøvene og kontrollene. HBV-DNA-konsentrasjonen uttrykkes i internasjonale enheter (IU)/ml. Omregningsfaktoren mellom HBV-kopier/ml og HBV IU/ml er 5,82 kopier/iu, basert på WHO International Standard for Hepatitis B Virus DNA for Nucleic Acid Technology (NAT) Assays Testing (NIBSC 97/746) 29. Resultatene kan konverteres manuelt til kopier/ml ved bruk av omregningsformelen beskrevet under: HBV-DNA-konsentrasjon i IU/ml x 5,82 kopier/iu = HBV-DNA i kopier/ml Eksempel: 1,23E+04 IU/ml x 5,82 kopier/iu = 7,16E+04 kopier/ml Merk: Det analytiske måleområdet for analyttverdier som kan måles direkte på en prøve uten fortynning med COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, er 20 til 1,7E+08 IU/ml. Merk: Det klinisk rapporterbare området for analyttverdier som kan måles direkte på en prøve med en maksimal fortynning på én til ti ved bruk av COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, er 20 til 1,7E+09 IU/ml. AMPLILINK-programvare: Bestemmer syklusterskelverdi (Cycle Threshold, Ct) for HBV-DNA og HBV-QS-DNA. Bestemmer HBV-DNA-konsentrasjon basert på Ct-verdiene for HBV-DNA og HBV-QS-DNA samt de lotspesifikke kalibreringskoeffisientene angitt på kassettenes strekkoder. Bestemmer at beregnet IU/ml for HBV L(+)C, v2.0 og HBV H(+)C, v2.0 faller innenfor de fastsatte akseptområdene. Validering av analyseserie AMPLILINK versjon 3.2 Series For å sikre at analyseserien er gyldig, sjekk i resultatvinduet i AMPLILINK-programvaren eller på utskriften om det finnes flagg og kommentarer. For kontroller blir det foretatt en sjekk for å bestemme om IU/mlverdien for kontrollen er innenfor det angitte akseptområdet. Hvis IU/ml-verdien for kontrollen ligger utenfor akseptområdet, blir det opprettet et flagg for å angi at kontrollen har feilet. Analyseserien er gyldig hvis det ikke fremkommer flagg for kontrollene [HBV L(+)C, v2.0; HBV H(+)C, v2.0 og CTM ( ) C]. Analyseserien er ikke gyldig hvis noen av de følgende flaggene vises for HBV-kontrollene: Negativ kontroll Flagg Resultat Tolkning _N_NC_INVALID Invalid Et ugyldig resultat eller et "gyldig" resultat som ikke var negativt for mål-hbv NO 21

22 HBV lav positiv kontroll, v2.0 Flagg Resultat Tolkning _L_LPCINVALID <2.00E+01 IU/mL Kontroll under akseptområdet _L_LPCINVALID Target Not Detected Kontroll under akseptområdet _L_LPCINVALID Et numerisk titer, X.XXE+XX IU/ml Kontroll utenfor akseptområdet _L_LPCINVALID > 1.70E+08 IU/ml Kontroll over akseptområdet _L_LPCINVALID Invalid Et ugyldig resultat HBV høy positiv kontroll, v2.0 Flagg Resultat Tolkning _H_HPCINVALID <2.00E+01 IU/ml Kontroll under akseptområdet _H_HPCINVALID Target Not Detected Kontroll under akseptområdet _H_HPCINVALID Et numerisk titer, X.XXE+XX IU/ml Kontroll utenfor akseptområdet _H_HPCINVALID > 1.70E+08 IU/ml Kontroll over akseptområdet _H_HPCINVALID Invalid Et ugyldig resultat Hvis analyseserien er ugyldig, må hele oppsettet gjentas, inkludert preparering av prøver og kontroller, amplifikasjon og deteksjon. Validering av analyseserie AMPLILINK versjon 3.3 Series For å sikre at analyseserien er gyldig, sjekk i resultatvinduet i AMPLILINK--programvaren eller på utskriften om det finnes flagg og kommentarer. For kontroller blir det foretatt en sjekk for å bestemme om IU/mlverdien for kontrollen er innenfor det angitte akseptområdet. Hvis IU/ml-verdien for kontrollen ligger utenfor akseptområdet, blir det opprettet et flagg for å angi at kontrollen har feilet. Analyseserien er gyldig hvis det ikke fremkommer flagg for kontrollene [HBV L(+)C, v2.0; HBV H(+)C, v2.0 og CTM ( ) C]. Analyseserien er ikke gyldig hvis noen av de følgende flaggene vises for HBV-kontrollene. Negativ kontroll: Flagg Resultat Tolkning NC_INVALID Invalid Et ugyldig resultat eller et "gyldig" resultat som ikke var negativt for mål-hbv HBV lav positiv kontroll, v2.0: Flagg Resultat Tolkning LPCINVALID Invalid Et ugyldig resultat eller kontroll utenfor akseptområdet HBV høy positiv kontroll, v2.0: Flagg Resultat Tolkning HPCINVALID Invalid Et ugyldig resultat eller kontroll utenfor akseptområdet NO

23 Hvis analyseserien er ugyldig, må hele oppsettet gjentas, inkludert preparering av prøver og kontroller, amplifikasjon og deteksjon. Tolking av resultater For å validere analyseserien må hvert prøvesvar kontrolleres for å se om det finnes noen flagg eller kommentarer på resultatutskriften. Tolk resultatene på følgende måte: En gyldig analyseserie kan inkludere både gyldige og ugyldige prøveresultater, avhengig av om flagg og/eller kommentarer er kommet opp for de ulike prøvene. Prøveresultater tolkes på følgende måte: Titerresultat Tolkning Target Not Detected Ct-verdi for HBV er høyere enn analysens måleområde, eller ingen Ct-verdi for HBV er påvist. Rapporter resultatene som "HBV-DNA ikke detektert". < 2.00E+01 IU/mL Beregnet IU/ml er lavere enn analysens deteksjonsgrense. Rapporter resultater som HBV-DNA detektert, mindre enn 20 HBV-DNA IU/ml. 2.00E+01 IU/mL og 1.70E+08 IU/mL Beregnet resultat er større enn eller lik 20 IU/ml og mindre enn eller lik 1,70E+08 IU/ml, og ligger innenfor analysens lineære område. > 1.70E+08 IU/mL Beregnet IU/ml ligger over analysens måleområde. Rapporter resultater som "større enn 1,70E+08 HBV DNA IU/ml". Om et kvantitativt resultat er ønskelig, må originalprøven fortynnes med HBV-negativt humant serum eller EDTA-plasma, avhengig av originalprøvens matriks, og analysen må repeteres. Multipliser det rapporterte resultatet med fortynningsfaktoren. Merk: Prøver som ligger høyere enn analysens måleområde og som gir et ugyldig resultat med flagget "QS_INVALID", må ikke rapporteres som >1,70E+08 IU/ml. Originalprøven bør fortynnes med HBV-negativt humant serum eller EDTA-plasma, avhengig av originalprøvens matriks, og analysen må repeteres. Multipliser det rapporterte resultatet med fortynningsfaktoren. Merk: Titerresultat "Failed". Tolkning: Prøven er ikke behandlet på korrekt måte under klargjøring på COBAS AmpliPrep-instrumentet. Merk: Titerresultat "Invalid". Tolkning: Et ugyldig resultat KVALITETSKONTROLL Ett replikat hver av COBAS TaqMan negativ kontroll, HBV lav positiv kontroll, v2.0, og HBV høy positiv kontroll, v2.0, må tas med i hver analyseserie. Analyseserien er gyldig hvis det ikke fremkommer flagg for kontrollene [HBV L(+)C, v2.0; HBV H(+)C, v2.0 og CTM ( ) C]. Det finnes ingen krav til kontrollenes posisjon i prøvestativet. Kontroller om det finnes flagg og kommentarer i analyseutskriften for å sikre at analyseserien er gyldig. Negativ kontroll CTM ( ) C skal vise resultatet "Target Not Detected". Hvis CTM ( ) C flagges som ugyldig, er hele analyseserien ugyldig. Gjenta hele prosessen (prøve- og kontrollpreparering, amplifikasjon og deteksjon). Kontakt det lokale Roche-kontoret for teknisk hjelp hvis CTM ( ) C er ugyldig i flere gjentatte analyseserier NO 23

24 Positive kontroller De fastsatte titerområdene for HBV L(+)C, v2.0 og HBV H(+)C, v2.0 er angitt på strekkodene for reagenskassettene for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0. HBV-DNA IU/mL for HBV L(+)C, v2.0 og HBV H(+)C, v2.0 må ligge innenfor de fastsatte titerområdene. Hvis en av eller begge de positive kontrollene flagges som ugyldige, er hele analyseserien ugyldig. Gjenta hele prosessen (prøve - og kontrollpreparering, amplifikasjon og deteksjon). Kontakt det lokale Rochekontoret for teknisk hjelp hvis HBV-DNA-titer for en av eller begge de positive kontrollene konsekvent er utenfor akseptområde i flere analyseserier. FORSIKTIGHETSREGLER Som for andre laboratorieprosedyrer, er god laboratorieteknikk essensielt for å sikre optimal ytelse for denne analysen. TESTENS BEGRENSNINGER 1. Denne testen er validert for bruk sammen med humant serum eller plasma med EDTA som antikoagulant. Testing av andre prøvematerialer kan føre til feil resultat. 2. Pålitelige resultater er avhengig av adekvat prøvetaking, transport, oppbevaring og håndtering. 3. Tilstedeværelsen av AmpErase-enzymet i COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV Master Mix, v2.0, reduserer risikoen for kontaminasjon fra amplicon. Men kontaminering fra HBV-positive kontroller og kliniske prøver kan kun unngås gjennom gode laboratorierutiner og ved å følge anvisningene i dette pakningsvedlegget nøye. 4. Dette produktet må kun brukes av personell som er opplært i PCR-teknikk. 5. Dette produktet kan kun brukes sammen med COBAS AmpliPrep-instrumentet og COBAS TaqMan -analysatoren eller COBAS TaqMan 48-analysatoren. 6. Selv om det er sjelden, kan mutasjoner innenfor den høyt konserverte regionen av virusgenomer som er dekket av COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0 primere og/eller prober, føre til manglende evne til å påvise viruset. 7. Deteksjon av HBV-DNA er avhengig av antall viruspartikler som er til stede i prøven, og kan påvirkes av metoden for prøvetaking og pasientfaktorer (dvs. alder, tilstedeværelse av symptomer og/eller infeksjonsstadium). 8. På grunn av de naturlige forskjellene mellom teknologier anbefales det at brukerne utfører metodekorrelasjonsstudier i laboratoriet for å kvantifisere de teknologiske forskjellene før en ny teknologi tas i bruk NO

25 INTERFERERENDE SUBSTANSER Det er vist at forhøyede nivåer av triglycerider, bilirubin og albumin i prøver ikke interferer med kvantiteringen av HBV-DNA med denne testen. Det er vist at forhøyede nivåer av hemoglobin i prøver inntil en konsentrasjon på 250 mg/dl ikke interfererer med kvantiteringen av HBV-DNA med denne testen. Følgende medikamenter som er testet ved 3 ganger av høyeste plasmanivå (C max ) er vist å ikke interferere i kvantiteringen av HBV-DNA med COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0: Nukleotide DNA polymerasehemmere Tenofovir Adefovir dipivoxil Telbivudin HIV proteasehemmere Indinavir Saquinavir Ritonavir Amprenavir Lopinavir/ritonavir Immunitetsmodulatorer Interferon alfa-2a Ribavirin Interferon alfa-2b Peginterferon alfa-2a Peginterferon alfa-2a + ribavirin Interferon alfa-2b + ribavirin Peginterferon alfa-2b Nukleosid revers transkriptase- og DNApolymerasehemmere Lamivudin Zidovudin Stavudin Abacavir Didanosin Entecavir Ikke-nukleosid HIV revers transkriptasehemmere Nevirapin Efavirenz HIV-fusjonshemmere Enfurvitid Antidepressiva Paroxetin HCl Fluoxetin Sertralin Preparater for behandling av herpesvirus Ganciklovir Valganciklovir HCl Acyklovir NO 25

26 VURDERING AV ANALYTISK YTELSE A. Deteksjonsgrense med WHOs internasjonale standard Deteksjonsgrensen for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, ble bestemt gjennom analyse av HBV-DNA i fortynninger for WHO International Standard for Hepatitis B Virus DNA for Nucleic Acid Technology (NAT) Assays Testing (NIBSC 97/746) 29, genotype A i HBV-negativt humant EDTA-plasma eller serum. Tre fortynningsserier ble analysert for hvert av prøvematerialene. Et samlet antall på 72 replikater per konsentrasjon ble testet for hvert prøvemateriale. Konsentrasjonen av HBV-DNA som kan detekteres med en positivitetsrate på mer enn 95 % bestemt ved PROBIT-analyse, er 9 IU/ml for EDTA-plasma (se tabell 2) og 19 IU/ml for serum (se tabell 3). Tabell 2 Deteksjonsgrense i EDTA-plasma for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, bestemt med WHOs internasjonale standard Nominell input Antall replikater Antall positive Positivitetsrate (HBV DNA IU/ml) % % % % 2, % PROBIT 95 % treffrate 9 IU/ml (95 % konfidensintervall: 6,8 12,1 IU/ml) Tabell 3 Deteksjonsgrense i serum for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, bestemt med WHOs internasjonale standard Nominell input Antall replikater Antall positive Positivitetsrate (HBV DNA IU/ml) % % % % 2, % PROBIT 95 % treffrate 19 IU/ml (95 % konfidensintervall: 11,0 107,1 IU/ml) NO

27 B. Deteksjonsgrense ved bruk av kliniske prøver over alle genotyper I tillegg ble fortynninger av kliniske prøver i HBV-negativt humant EDTA-plasma eller serum som representerte genotypene A-H analysert. Analysering av hitrate viser en positiv rate på mer enn 95 % for alle subtyper ved 20 IU/ml i både EDTA-plasma og serum (se tabell 4). Det ble testet 56 replikater per nivå, genotype og matrise. Tabell 4 Deteksjonsgrense i EDTA-plasma og serum for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, bestemt med genotype A-H Hitrate [%] ved 24 IU/ml Hitrate [%] ved 22 IU/ml Hitrate [%] ved 20 IU/ml EDTA-plasma Serum EDTA-plasma Serum EDTA-plasma Serum Genotype A Genotype B ,21 98, Genotype C ,21 Genotype D Genotype E , , Genotype F Genotype G ,21 Genotype H ,21 96, C. Presisjon Presisjonen for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, ble bestemt gjennom analyse av serielle fortynninger av kliniske HBV-prøver (genotype A) i HBV-negativt humant EDTA-plasma og serum. Fastsettelsen av titer for de kliniske prøvene (stamkonsentrasjoner) ble utført med en metode som sikrer sporbarhet i forhold til WHO International Standard for Hepatitis B Virus DNA for Nucleic Acid Technology (NAT) Assays Testing (NIBSC 97/746) 29. Det ble utført 15 analyseringer per matriks, og og hver inneholdt 6 fortynningsnivåer og 3 replikater på hvert nivå. Hver prøve gjennomgikk hele prosedyren for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, inkludert prøvepreparering, amplifikasjon og deteksjon. Derfor representerer presisjonen som er vist her, alle aspekter av testprosedyren. Studien ble utført med tre lot av testreagenser for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0. Resultatene vises i tabell 5 (EDTA-plasma) og tabell 6 (serum). Tabell 5 Presisjon for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0 (EDTA-plasmaprøver) Lot 1 Lot 2 Lot 3 Titerresultat Total SD Total SD Total SD (IU/ml) Total % CV Total % CV Total % CV i logg i logg i logg 1,00E , , ,11 1,00E , , ,09 1,00E , , ,06 1,00E ,04 8 0, ,06 1,00E , , ,05 1,00E , , , NO 27

28 Tabell 6 Presisjon for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0 (serumprøver) Lot 1 Lot 2 Lot 3 Titerresultat Total SD Total SD Total SD (IU/ml) Total % CV Total % CV Total % CV i logg i logg i logg 1,00E , , ,13 1,00E , , ,08 1,00E , , ,06 1,00E , , ,05 1,00E , , ,05 1,00E , , ,06 D. Lineært område Som vist i figur 10 og figur 11 ga COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, en lineær respons fra 20 (Log 10 = 1,30) HBV-DNA IU/ml til 1,7E+08 (Log 10 = 8,24) HBV-DNA IU/ml i både EDTAplasma og serum. Evalueringen ble utført i henhold til CLSI-retningslinje EP6-A ved bruk av to lot COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-test, v2.0-reagenser og seriefortynninger for høytiter HBV-DNA (+) EDTA-plasmaprøver eller serumprøver. Tretten konsentrasjonsnivåer for EDTA-plasma og tolv nivåer for serum ble testet, med 10 replikater per nivå. Figur 10 Linearitet for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, i EDTA-plasmaprøver Resultater for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-test, v2.0 Logg 10 (HBV-DNA IU/ml) y = 1,0183x - 0,0182 R 2 = 0, Nominell konsentrasjon Logg 10 (HBV-DNA IU/ml) Gjennomsnitt NO

29 Figur 11 Linearitet for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, i serumprøver Resultater for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-test, v2.0 Logg 10 (HBV-DNA IU/ml) y = 1,0202x - 0,1142 R 2 = 0, Nominell konsentrasjon Logg 10 (HBV-DNA IU/ml) Gjennomsnitt E. Titerkvantitering for genotyper Sålangt er åtte genotypekategorier blitt foreslått for HBV, basert på nukleotiddivergens innen genomet på mer enn 8 % 38, 39, 40. Disse genotypene er angitt med store bokstaver fra A til H. HBV-genotypene har en karakteristisk geografisk fordeling 41. Ytelsen for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, for HBV-genotyper ble evaluert ved å analysere 25 testprøver av renset, linearisert og kvantitert plasmid-dna som inneholdt representative innskutte sekvenser fra HBV-genotype A til H og den vanligste pre-core-mutanten (se tabell 7). Fastsettelsen av de nominelle konsentrasjonene i plasmidstamløsningene ble utført med PicoGreenmetoden. Hvert plasmid-dna ble fortynnet til nominelle konsentrasjoner på ca. 3,00E+03, 3,00E+05 og 3,00E+07 PicoGreen-kopier/ml i både EDTA-plasma og serum. Konsentrasjonene (IU/ml) ble deretter bestemt med COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, ved bruk av to reagenslot, og resultatene av alle analyserte plasmider ble sammenlignet. Evalueringen av alle de 25 plasmidene som ble analysert med COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, viser ekvivalent kvantifisering av genotyper for EDTA-plasma og serum NO 29

30 Tabell 7 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, Test av inklusivitet Typet plasmid-dna testet Plasmidangivelse Genotype Stamprøvens opprinnelse p8423-c1 India p1115-c1 Burundi A p3952-c1 Kamerun p4199-c2 Norge p1764-c1 Kina p1767-c1 Kina p3958-c1 B Øst-Asia p830-c1 Selskapsøyene p3982-c1 Vietnam p1786-c1 Kina C p Bangladesh p3872-c1 Iran p1103-c1 Tunis p3953-c2 Nord-Afrika D p18-c1 Sverige p Sverige p4244-c1 Danmark p3217-c1 Senegal E p3963-c2 Nigeria p9203-c1 Colombia p479-c1 F Venezuela p1009-c1 Spania p G USA pefhbv20 H Nicaragua pitmut1896 Pre-core-mutant Italia Og for åtte av disse plasmidene, som representerte alle genotyper, ble det vist inklusivitet over det lineære området (figur 12 og 13). For hver plasmid ble tre konsentrasjonsnivåer for EDTA-plasma og serum testet, med 10 replikater per nivå. Figur 12 Ytelsen for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, på HBV-genotype A til H i EDTA-plasma 0,4 0,3 Avvik Logg 10 (HBV-DNA IU/ml) 0,2 0,1 0,0-0,1-0,2 Genotype A Genotype B Genotype C Genotype D Genotype E Genotype F Genotype G Genotype H +/- 0,3 logg -0,3-0,4 2,5 3,5 4,5 5,5 6,5 7,5 Nominell konsentrasjon Logg 10 (HBV-DNA IU/ml) NO

31 Figur 13 Ytelsen for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, på HBV-genotype A til H i serum 0,4 0,3 Avvik Logg 10 (HBV-DNA IU/ml) 0,2 0,1 0,0-0,1-0,2 Genotype A Genotype B Genotype C Genotype D Genotype E Genotype F Genotype G Genotype H +/- 0,3 logg -0,3-0,4 2,5 3,5 4,5 5,5 6,5 7,5 Nominell konsentrasjon Logg 10 (HBV-DNA IU/ml) F. Klinisk spesifisitet Den kliniske spesifisiteten til COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, ble bestemt ved å analysere HBV-negative EDTA-plasma- og serumprøver fra blodgivere. Totalt 647 individuelle EDTAplasmaprøver og 649 serumprøver ble analysert. Resultatet av alle prøvene var negativt for HBV-DNA. Basert på disse resultatene er spesifisiteten for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, 100 % med et konfidensintervall på 99,54 %. G. Kryssreaktivitet Den analytiske spesifisiteten for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, ble evaluert ved å tilsette dyrkede organismer (virus, bakterier, gjærsopp) eller DNA (HTLV-2, 2,5E+07 cp/pcr) til HBVnegativt humant EDTA-plasma (se tabell 8). Ingen av de testede non-hbv-organismene var HBV-DNA-positive. Tabell 8 Prøver brukt for evaluering av analytisk spesifisitet Virus Adenovirus type 5 Cytomegalovirus Epstein-Barr-virus Humant herpesvirus, type 6 Herpes simplex-virus, type 1 Herpes simplex-virus, type 2 Humant T-celle lymfotropt virus, type 1 Humant T-celle lymfotropt virus, type 2 Influensa A Hepatitt A-virus Hepatitt C-virus HIV-1 Bakterier Staphylococcus aureus Propionibacterium acnes Gjærsopp Candida albicans NO 31

32 H. Korrelasjon mellom EDTA-plasma og serum Korrelasjonen for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, ble testet ved å analysere HBV-positive samsvarende kliniske EDTA-plasmaprøver og serumprøver. 279 samsvarende sett med prøver fra HBV-infiserte pasienter ble analysert. Resultatene med COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBVtesten, v2.0, viste en høy korrelasjon mellom EDTA-plasmaprøver og serumprøver (figur 14). Figur 14 Korrelasjon for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, på EDTA-plasmaprøver og serumprøver fra HBV-infiserte pasienter (n=279) 9 8 EDTA-plasmaprøve (logg 10 titer) y = 0,9834x + 0,0073 R 2 = 0, Serumprøve (logg 10 titer) NO

33 I. Ytelsen for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, sammenlignet med COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen Ytelsen for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, ble sammenlignet med ytelsen for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen 30 ved å analysere HBV-positive ( 54 IU/ml) kliniske prøver. Resterende EDTA-plasmaprøver fra rutinemessig diagnostikk ble analysert på to eksterne laboratorier. Prøvetitrene var fordelt over det dynamiske området for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0. Det ble utført lineær regresjonsanalyse på 275 gyldige prøver (143 ble analysert i det ene laboratoriet, og 132 ble analysert i det andre) (figur 15). Figur 15 Korrelasjon for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, og COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen på EDTA-plasmaprøver fra HBV-infiserte pasienter (n=275) 9,00 Logg 10 HBV-DNA-titer for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-test,v2.0 8,00 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 y = 0,9958x + 0,0443 R 2 = 0,9743 0,00 0,00 1.,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 Logg 10 HBV-DNA-titer for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-test NO 33

34 J. Metodekorrelasjon Ytelsen for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, ble sammenlignet med ytelsen for COBAS TaqMan HBV-testen for bruk med High Pure System (HPS HBV, figur 16 side 17), COBAS AMPLICOR HBV MONITOR-testen (COBAS AMPLICOR HBV, figur 18 og 19) og VERSANT HBV DNA 3.0-analysen (figur 20 og 21) ved regresjonsanalyse av ufortynnede klinisk karakteriserte prøver fra HBVinfiserte pasienter. Prøvene ble levert av Teragenix (Fort Lauderdale, FL, USA). Det ble utført regresjonsanalyse for serumprøver og EDTA-plasmaprøver som ga resultater innenfor det lineære området. Figur 16 Korrelasjon for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, og COBAS TaqMan HBV-testen for bruk med High Pure System på EDTA-plasmaprøver fra HBV-infiserte pasienter (n=146) 10,0 Plasmaprøve (logg 10 titer) for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-test, v2.0 9,0 8,0 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 Y = 0,974 * X + 0,107 R 2 = 0,964 0,0 0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 Plasmaprøve (logg 10 titer) for High Pure System HBV NO

35 Figur 17 Korrelasjon for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, og COBAS TaqMan HBV-testen for bruk med High Pure System på serumprøver fra HBV-infiserte pasienter (n=142) 10 Serumprøve (logg 10 titer) for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-test, v Y = 0,987 * X + 0,023 R 2 = 0, Serumprøve (logg 10 titer) for High Pure System HBV NO 35

36 Figur 18 Korrelasjon for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, og COBAS AMPLICOR HBV MONITOR-testen på EDTA-plasmaprøver fra HBV-infiserte pasienter (n=143) 5,0 Plasmaprøve (logg 10 titer) for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-test, v2.0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 Y = 0,899 * X + 0,546 R 2 = 0,872 0,0 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 Plasmaprøve (logg 10 titer) for COBAS AMPLICOR HBV NO

37 Figur 19 Korrelasjon for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, og COBAS AMPLICOR HBV MONITOR-testen på serumprøver fra HBV-infiserte pasienter (n=154) 6 Serumprøve (logg 10 titer) for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-test, v Y = 0,911 * X + 0,461 R 2 = 0, Serumprøve (logg 10 titer) for COBAS AMPLICOR HBV NO 37

38 Figur 20 Korrelasjon for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, og VERSANT HBV DNA 3.0-analysen på EDTA-plasmaprøver fra HBV-infiserte pasienter (n=138) 8,0 Plasmaprøve (logg 10 titer) for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-test, v2.0 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 Y = 0,892 * X + 0,260 R 2 = 0,810 0,0 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 Plasmaprøve (logg 10 titer) for VERSANT HBV DNA 3.0-test NO

39 Figur 21 Korrelasjon for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-testen, v2.0, og VERSANT HBV DNA 3.0-analysen på serumprøver fra HBV-infiserte pasienter (n=138) 8 Serumprøve (logg 10 titer) for COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HBV-test, v Y = 0,913 * X + 0,125 R 2 = 0, Serumprøve (logg 10 titer) for VERSANT HBV DNA 3.0-test NO 39

40 REFERANSER 1. Lee, W Hepatitis B Virus Infection. New England Journal of Medicine. 337: Beasley, R.P Hepatitis B virus - the major etiology of hepatocellular carcinoma. Cancer. 61: Wong, D.H.K., Cheung, A.M., O'Rourke, K., et al Effect of alpha-interferon treatment in patients with hepatitis B e antigen-positive chronic hepatitis B: a meta-analysis. Annals of Internal Medicine. 119: Zuckerman, A.J. and Lavanchy, D Treatment options for chronic hepatitis: antivirals look promising. British Medical Journal. 319: McMahon, B.J Chronic carriers of Hepatitis B Virus who clear hepatitis B surface antigen: Are they really "off the hook"? Hepatology. 28: Huo, T., Wu, J., Lee, P. et al Sero-clearance of hepatitis B surface antigen in chronic carriers does not necessarily imply a good prognosis. Hepatology 28: Niederau, C., Heintges, T., Lange, S. et al Long-term follow-up of HBeAg-positive patients treated with interferon alfa for chronic hepatitis B. New England Journal of Medicine. 334: Fattovich, G., Giustina, G., Realdi, G. et al Long term outcome of hepatitis B e antigen-positive patients with compensated cirrhosis treated with interferon alfa. Hepatology. 26: Brown, J.L., Carman, W.F. and Thomas, H.C The clinical significance of molecular variation within the hepatitis B virus genome. Hepatology. 15: Hoofnagle, J.H Alfa-interferon therapy of chronic hepatitis B. Current status and recommendations. Hepatology. 11:S100-S Krogsgaard, K., Kryger, P., Aldershvile, J. et al Hepatitis B virus DNA in serum from patients with acute hepatitis B. Hepatology. 5: Jardi, R., Buti, M., Rodriguez-Frias, F. et al The value of quantitative detection of HBV-DNA amplified by PCR in the study of hepatitis B infection. Journal of Hepatology. 24: Niitsuma, H., Ishii, M., Miura, M. et. al Low-level hepatitis B viremia detected by polymerase chain reaction accompanies the absence of HBe antigenemia and hepatitis in hepatitis B virus carriers. American Journal of Gastroenterology. 92: Ranki, M., Schatzl, H.M., Zachoval, R. et al Quantification of hepatitis B virus DNA over a wide range from serum for studying viral replicative activity in response to treatment and in recurrent infection. Hepatology. 21: Mason, A.L., Xu, L., Guo, L. et al Molecular basis for persistent hepatitis B virus infection in the liver after clearance of serum hepatitis B surface antigen. Hepatology. 27: Saito, T., Shinzawa, H., Uchida, T. et al Quantitative DNA analysis of low-level hepatitis B viremia in two patients with serologically negative chronic hepatitis B. Journal of Medical Virology. 58: Brunetto, M.R., Oliveri, F., Rocca, G. et al Natural course and response to interferon of chronic hepatitis B accompanied by antibody to hepatitis B e antigen. Hepatology. 10: Saracco, G., Mazzella, G., Rosina, F. et al A controlled trial of human lymphoblastoid interferon in chronic hepatitis B in Italy. Hepatology. 10: Perrillo, R., Schiff, R., Davis, G. et al A randomized controlled trial of interferon alpha-2b alone and after prednisone withdrawal for the treatment of chronic hepatitis B. New England Journal of Medicine. 323: Perez, V., Tanno, H., Villamil, F. et al Recombinant interferon alfa-2b following prednisone withdrawal in the treatment of chronic type B hepatitis. Hepatology. 11:S113-S Lai, C.-L., Ching, C.-K., Tung, S.K.-M. et al Lamivudine is effective in suppressing Hepatitis B Virus DNA in Chinese Hepatitis B surface antigen carriers: A placebo-controlled trial. Hepatology. 25: Nagata, I., Colucci, G., Gregorio, G.V. et al The role of HBV DNA quantitative PCR in monitoring the response to interferon treatment in chronic hepatitis B virus infection. Journal of Hepatology. 30: NO

41 24. Hadziyannis, S.J., Manesis, E.K., and Papakonstantinou, A Oral ganciclovir treatment in chronic hepatitis B virus infection: a pilot study. Journal of Hepatology. 31: Marcellin, P., Chang, T.-T., Lim, S.G. et al Adefovir Dipivoxil for the treatment of Hepatitis B e antigen-positive chronic hepatitis B. New England Journal of Medicine. 348: Puchhammer-Stockl, E., Mandl, C.W., Kletzmayr, J. et al Monitoring the virus load can predict the emergence of drug-resistant hepatitis B virus strains in renal transplant patients during lamivudine therapy. Journal of Infectious Diseases. 181: Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P.S., and Griffith, R Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. Bio/Technology 10: Heid, C.A., Stevens, J., Livak, J.K., and Williams, P.M Real time quantitative PCR. Genome Research 6: Saldanha, J., Gerlich, W., Lelie, N., Dawson, P., Heermann, K., Heath, A., and the WHO Collaborative Study Group An international collaborative study to establish a World Health Organization international standard for hepatitis B virus DNA nucleic acid amplification techniques. Vox Sanguinis 80: Hochberger, S., Althof, D., Gallegos de Schrott, R., Nachbaur, N., Röck, H. and Leying, H Fully automated quantitation of Hepatitis B virus (HBV) DNA in human plasma by the COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan System. Journal of Clinical Virology 35: Stuyver L, De Gendt S, Van Geyt C, Zoulim F, Fried M, Schinazi RF, Rossau R A new genotype of hepatitis B virus: complete genome and phylogenetic relatedness. Journal of General Virology 81: Smith, E.S., Li, A.K., Wang, A.M., Gelfand, D.H. and Myers, T.M Amplification of RNA: Hightemperature Reverse Transcription and DNA Amplification with a Magnesium-activated Thermostable DNA Polymerase. PCR Primer, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press: Section Meng, Q., Wong, C., Rangachari, A. et al Automated Multiplex Assay System for Simultaneous Detection of Hepatitis B Virus DNA, Hepatitis C Virus RNA, and Human Immunodeficiency Virus Type 1 RNA. Journal of Clinical Microbiology. 39: Longo, M.C., Berninger, M.S. and Hartley, J.L Use of uracil DNA glycosylase to control carryover contamination in polymerase chain reactions. Gene 93: Richmond, J.Y. and McKinney, R.W. eds Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. HHS Publication Number (CDC) Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Protection of Laboratory Workers From Occupationally Acquired Infections; Approved Guideline-Third Edition. CLSI Document M29-A3 Wayne, PA:CLSI, International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 41st Edition pp. 38. Okamoto H, Tsuda F, Sakugawa H, Sastrosoewignjo RI, Imai M, Miyakawa Y, Mayumi M Typing hepatitis B virus by homology in nucleotide sequence: comparison of surface antigen subtypes. Journal of General Virology 69: Norder H, Courouce AM, Coursaget P, Echevarria JM, Leef S-D, Mushahwar IK, Robertson BH, Locarnini S, Magnius LO Genetic Diversity of Hepatitis B Virus Strains Derived Worldwide: Genotypes, Subgenotypes, and HBsAG Subtypes. Intervirology 47: Schaefer S Hepatitis B virus taxonomy and hepatitis B virus genotypes. World J Gastroenterol 13(1): Norder H, Hammas B, Lee SD, Bile K, Courouce AM, Mushahwar IK, Magnius LO Genetic relatedness of hepatitis B viral strains of diverse geographical origin and natural variations in the primary structure of the surface antigen. Journal of General Virology 74: NO 41

42 Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ USA Medlem av Roche-gruppen Roche Diagnostics (Schweiz) AG Roche Diagnostics Industriestrasse 7 201, boulevard Armand-Frappier 6343 Rotkreuz, Switzerland H7V 4A2 Laval, Québec, Canada (For Technical Assistance call: Roche Diagnostics GmbH Pour toute assistance technique, Sandhofer Straße 116 appeler le: ) Mannheim, Germany Roche Diagnostics Roche Diagnostics, SL 2, Avenue du Vercors Avda. Generalitat, Meylan, France E Sant Cugat del Vallès Barcelona, Spain Distributore in Italia: Roche Diagnostics S.p.A. Roche Diagnóstica Brasil Ltda. Viale G. B. Stucchi 110 Av. Engenheiro Billings, Monza, Milano, Italy Jaguaré, Building São Paulo, SP Brazil Distribuidor em Portugal: Roche Sistemas de Diagnósticos Lda. Estrada Nacional, Amadora, Portugal ROCHE, AMPERASE, AMPLICOR, AMPLILINK, COBAS, AMPLIPREP, HIGH PURE, TAQMAN og COBAS P er varemerker for Roche. Armored RNA er en patentert teknologi som er utviklet i fellesskap av Ambion, Inc. og Cenetron Diagnostics, LLC. U.S. patent #5,677,124, #5,919,625, #5,939,262, #6,214,982, #6,399,307, og patentsøknader under behandling. Armored RNA er et registrert varemerke for Ambion og Cenetron. Microsoft og Windows er enten registrerte varemerker eller varemerker for Microsoft Corporation i USA og/eller andre land. ProClin er et registrert varemerke for Rohm and Haas Company. SST er et registrert varemerke for Becton Dickinson and Co. VERSANT er et registrert varemerke for Bayer Corporation NO

43 Cyaninfargestoffene i dette produktet er underlagt pasientrettighetene for GE Healthcare Bio-Sciences Corp. og Carnegie Mellon University og er lisensiert til Roche eksklustivt for innlemmelse i komponenter i kit for forskning og in vitro-diagnostikkits. Enhver bruk av slike kit til annet formål enn forskning eller in vitro-diagnostikk krever underlisenser fra GE Healthcare Bio-Sciences Corp., Piscataway, New Jersey, U.S.A. og Carnegie Mellon University, Pittsburgh, Pennsylvania, U.S.A. Enkelte komponenter av dette produktet er dekket av en eller flere US-patenter og deres utenlandske ekvivalenter utstedt til Isis Pharmaceuticals og lisensiert til Roche Molecular Systems, Inc. Teknikken til forebygging av smitte dekkes av US Patent 5,035,996, og tilsvarende utenlandske patenter eies av Life Technologies, Inc. og er lisensiert til Roche Molecular Systems, Inc. Copyright Roche Molecular Systems, Inc. Med enerett. 8/2009 ( ENGL) Doc Rev NO 43