Bestillingsinformasjon AMPLICOR Respiratory RSP PREP 100 Tests P/N: Specimen Preparation Kit ART: US: 83267

Transkript

1 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosistest MTB FOR BRUK TIL IN VITRO-DIAGNOSTIKK. Bestillingsinformasjon AMPLICOR Respiratory RSP PREP 100 Tests P/N: Specimen Preparation Kit ART: US: AMPLICOR M. tuberculosis MTB CTL 10 Sets P/N: Positive Control Kit ART: US: AMPLICOR Mycobacterium MYCO AMP 96 Tests P/N: Amplification Kit ART: US: COBAS AMPLICOR MTB DK 100 Tests P/N: M. tuberculosis Detection Kit ART: US: COBAS AMPLICOR DK 100 Tests P/N: Detection Reagents Kit ART: US: COBAS AMPLICOR CN4 200 Tests P/N: Conjugate Detection Reagent ART: US: COBAS AMPLICOR 500 Tests P/N: WB Wash Buffer ART: US: Følgende kit kan brukes til deteksjon av Mycobacterium-internkontroll som er amplifisert med AMPLICOR Mycobacterium Amplification Kit. Deteksjon av internkontroll er valgfri for brukeren. COBAS AMPLICOR 100 Tests P/N: IC DK Internal Control Detection Kit ART: US: /2007, Revision 4.0 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 1/30 P/N:

2 Tiltenkt bruk COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis (MTB)-testen er en kvalitativ in vitro-test for deteksjon av organismer tilhørende M. tuberculosiskomplekset i kliniske prøver med COBAS AMPLICOR -analysatoren. Testen benytter nukleinsyreamplifikasjonsteknikken polymerasekjedereaksjon (PCR) og nukleinsyrehybridisering for deteksjon av organismer tilhørende M. tuberculosiskomplekset fra humane luftveisprøver, som er gjort flytende, dekontaminert og oppkonsentrert, inkludert ekspektorat og indusert sputum, bronkiale utskyllinger og bronkoalveolære utskyllinger (BAL). Oppsummering og forklaring av testen Testprinsipper Mykobakterier er syrefaste, ikke-motile, stavformede aerobe bakterier som ikke danner sporer. De omfatter flere arter som er patogene for mennesker. Mange mykobakteriearter er jord- og vannsaprofytter. De viktigste humanpatogenene er arter innen Mycobacterium tuberculosis-komplekset (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum og M. microti) og M. leprae. M. tuberculosis er det viktigste mykobakterielle patogenet. M. tuberculosis finnes kun hos mennesker, der bakterien kan ligge i dvale, og som kan overføre tuberkelbasillen fra person til person via dråpesmitte. Cirka en tredel av verdens befolkning har M. tuberculosis og står i fare for å utvikle sykdommen. Bare i USA er det estimert at 15 millioner mennesker er infisert av tuberkelbasillen, og det registreres over tilfeller av aktiv tuberkulose årlig. 1 M. tuberculosis kan føre til kronisk lungesykdom, men kan også infisere andre organer i kroppen. På grunn av risikoen for spredning av sykdommen, faren for at det skal utvikles medikamentresistente stammer samt sykdommens alvorlighetsgrad hos HIV-1-smittede pasienter, er rask diagnose av M. tuberculosis-komplekset svært viktig. På verdensbasis er tuberkulose årsaken til 3 millioner dødsfall i året og 26 % av unngåelige dødsfall blant voksne i utviklingsland 1-5. En definitiv tuberkulosediagnose krever isolering av en organisme fra M. tuberculosis-komplekset. Rutinemessig dyrkning er tidkrevende, og det kan ta opptil åtte uker før endelig diagnose kan stilles. En mikroskopisk undersøkelse av utstryk av syrefaste bakterier er den raskeste metoden for deteksjon av mykobakterier, men den er lite sensitiv og uspesifikk. Immunologiske og serologiske teknikker er begrenset på grunn av dårlig sensitivitet og/eller spesifisitet 6,7. Analyse av mykolsyrer fra mykobakterier ved hjelp av væskekromatografi (highperformance liquid chromatography) er et nyttig tilleggsverktøy til dyrkning og biokjemisk testing 8. Artsspesifikke nukleinsyreprober har signifikant forbedret muligheten for rask bekreftelse av dyrkningsresultater for flere mykobakteriearter. 9 Utviklingen av PCR-baserte tester som er spesifikke for mykobakterier, har vist seg å gi en ytterligere forbedring av rask diagnostikk av tuberkulose ved at de muliggjør direkte deteksjon av mykobakterier i kliniske prøver COBAS AMPLICOR MTB-testen er basert på fire hovedprosesser: prøvepreparering, PCR-amplifikasjon 23,24 av mål-dna ved hjelp av biotinylerte primere, hybridisering av de amplifiserte produktene til oligonukleotidprober som er målspesifikke, og deteksjon av probebundne amplifiserte produkter ved kolorimetrisk bestemmelse. 2/30 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 6/2007, Revision 4.0

3 Mycobacterium tuberculosis Test COBAS AMPLICOR MTB-testen muliggjør samtidig amplifikasjon av mål- DNA i M. tuberculosis-komplekset og Mycobacterium-internkontroll-DNA. Master Mix-reagenset inneholder et biotinylert primerpar som er spesifikt for MTB og Mycobacterium-internkontrollen. Deteksjon av DNA fra amplifisert Mycobacterium-internkontroll utføres etter brukerens ønske. Prøvepreparering NALC-NaOH 25, NaOH 25 eller SDS-NaOH 26,27 -løste, dekontaminerte og oppkonsentrerte humane luftveisprøver, inkludert ekspektorat og indusert sputum, bronkiale utskyllinger og BAL (bronkoalveolære utskyllinger), vaskes med vaskeløsning for respiratoriske prøver. Organismene lyseres ved inkubasjon i lyseringsreagens for respiratoriske prøver, og prøven gjøres klar til amplifikasjon ved at det tilsettes nøytraliseringsreagens for respiratoriske prøver. PCR-amplifikasjon Valg av mål Valget av mål-dna-sekvensen avhenger av identifisering av regioner innen det mykobakterielle genomet som viser maksimal sekvenskonservering blant artene i M. tuberculosis-komplekset. Derfor er riktig valg av primere og probe avgjørende for testens evne til å detektere alle organismene i M. tuberculosis-komplekset. Mycobacterium-genomet inneholder en region på cirka 1500 nukleotider som koder genet for 16S rrna. COBAS AMPLICOR MTB-testen bruker de Mycobacterium-genusspesifikke biotinylerte primerne KY18 og KY75 som definerer en sekvens på cirka 584 nukleotider innen denne regionen. 28, 29,30 Målamplifikasjon Preparerte prøver tilsettes amplifikasjonsblandingen i amplifikasjonsrør (A-rør) der PCR skjer. Reaksjonsblandingen varmes opp for å denaturere den dobbelttrådede DNA-heliksen og eksponere primermålsekvensene. Når blandingen avkjøles, hybridiserer de biotinylerte primerne KY18 og KY75 til mål-dna. I nærvær av Mg 2+ og deoksynukleosidtrifosfater (dntp) i overskudd, inkludert deoksyadenosin-, deoksyguanosin-, deoksycytidin- og deoksyuridin- (i stedet for deoksytymidin-) trifosfater, forlenger den termostabile Thermus aquaticus DNA-polymerasen (Taq pol) de hybridiserte primerne langs måltemplatene og produserer en DNA-sekvens som kalles et amplicon. COBAS AMPLICOR -analysatoren gjentar denne prosessen automatisk i et bestemt antall sykluser, der hver syklus effektivt dobler mengden amplicon-dna. Internkontrollamplifikasjon I enzymbaserte amplifikasjonsprosesser som PCR, kan hemmere som kan finnes i den kliniske prøven, redusere effektiviteten. Mycobacterium-internkontrollen er kommet som et tillegg til COBAS AMPLICOR MTB-testen for å gi mulighet for å identifisere preparerte prøver som inneholder substanser som kan interferere i PCR-amplifikasjonen. Mycobacterium-internkontroll er plasmid-dna med primerbindende regioner identiske med dem i mål-mtb-dna-sekvensen, en randomisert intern sekvens med tilsvarende lengde og basesammensetning som mål-mtb-sekvensen, og en unik probebindende region som gjør det mulig å skille Mycobacterium-internkontroll fra målamplicon. Disse egenskapene ble valgt for å sikre en likeverdig amplifikasjon av Mycobacterium-internkontroll og mål-mtb-dna. Mycobacterium-internkontrollen tilsettes hver amplifikasjonsreaksjon og koamplifiseres sammen med mål-dna fra den kliniske prøven. Deteksjon av MTB-internkontroll utføres etter brukerens ønske. 6/2007, Revision 4.0 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 3/30

4 Selektiv amplifikasjon Selektiv amplifikasjon av mål-dna fra den kliniske prøven oppnås i COBAS AMPLICOR MTB-testen ved hjelp av AmpErase LD (uracil-n-glykosylase)- enzym 31. AmpErase LD-enzym er renset for å fjerne potensielt kontaminerende bakterielt DNA. AmpErase LD-enzymet gjenkjenner og katalyserer destruksjon av DNA-tråder som inneholder deoksyuridin, men ikke DNA som inneholder deoksytymidin. Deoksyuridin finnes ikke i naturlig forekommende DNA, men finnes alltid i amplicon på grunn av bruken av deoksyuridintrifosfat i stedet for deoksytymidintrifosfat som en av dntp-ene i Master Mix-reagenset. Derfor er det kun amplicon som inneholder deoksyuridin. Deoksyuridin gjør kontaminerende amplicon mottakelig for destruksjon ved hjelp av AmpErase LD-enzymet forut for amplifikasjon av mål-dna. AmpErase-enzymet katalyserer nedbryting av DNA som inneholder deoksyuridin, ved å bryte deoksyuridingruppens deoksyribosekjede ved C1-posisjonen. Ved temperaturøkning i det første varmetrinnet ved alkalisk ph i Master Mixen, brytes amplicon-dna-kjeden der deoksyuridinet finnes, noe som fører til at DNA ikke lenger er amplifiserbart. AmpErase LD-enzymet er inaktivt ved temperaturer over 55 ºC, dvs. gjennom alle termosykliske trinn, og derfor blir ikke målamplicon ødelagt. Etter amplifikasjon denatureres eventuelle rester av enzymet ved å tilsette denatureringsløsning, og dermed hindres nedbryting av målamplicon. AmpErase-enzym i COBAS AMPLICOR MTB-testen har vist seg å kunne inaktivere minst 10 3 kopier av deoksyuridin-inneholdende MTB-amplicon per PCR. Hybridiseringsreaksjon Etter PCR-amplifikasjonen tilsetter COBAS AMPLICOR -analysatoren automatisk denatureringsløsning i A-rørene for kjemisk denaturering av MTBamplicon og Mycobacterium-internkontrollamplicon for å danne enkelttrådet DNA. Porsjoner av denaturert amplicon overføres deretter til deteksjonskoppene (D-kopper). En suspensjon av magnetiske partikler som er belagt med en oligonukleotidprobe som er spesifikk for M. tuberculosis-komplekset (KY172T3) eller Mycobacterium-internkontrollen (SK535), tilsettes til hver enkelt D-kopp. Det biotinmerkede MTB- og Mycobacterium-internkontrollampliconet hybridiseres til de målspesifikke oligonukleotidprobene som er bundet til magnetpartiklene. Denne hybridiseringen av amplicon til den målspesifikke proben øker testens samlede spesifisitet. Deteksjonsreaksjon Etter hybridiseringsreaksjonen vasker COBAS AMPLICOR -analysatoren de magnetiske partiklene i D-koppen for å fjerne ubundet materiale, og deretter tilsettes avidin-hrp-konjugat (Avidin-Horseradish-Peroxidase Conjugate). Avidin-HRP binder seg til det biotinmerkede ampliconet som er hybridisert til de målspesifikke oligonukleotidprobene bundet til de magnetiske partiklene. COBAS AMPLICOR -analysatoren fjerner ubundet konjugat ved å vaske de magnetiske partiklene og tilsetter deretter en substratløsning som inneholder hydrogenperoksid og 3,3',5,5'-tetrametylbenzidin (TMB) til hver D-kopp. I nærvær av hydrogenperoksid katalyserer det partikkelbundne HRP oksidering av TMB, som danner et farget kompleks, og absorbansen av dette måles av COBAS AMPLICOR -analysatoren ved en bølgelengde på 660 nm. 4/30 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 6/2007, Revision 4.0

5 Mycobacterium tuberculosis Test Reagenser AMPLICOR Respiratory RSP PREP 100 tester P/N: Specimen Preparation Kit ART: AMPLICOR prepareringskit for respiratoriske prøver US: RW (vaskeløsning for respiratoriske prøver) Tris-HCl-buffer < 1 % solubiliserende middel EDTA 0,05 % natriumazid RL (lyseringsreagens for respiratoriske prøver) 0,2 % natriumhydroksid < 1 % solubiliserende middel EDTA 0,05 % natriumazid RN (nøytraliseringsreagens for respiratoriske prøver) Tris-HCl-buffer Magnesiumklorid 0,05 % natriumazid 2 x 25 ml 3 x 6 ml 2 x 5 ml AMPLICOR M. tuberculosis MTB CTL 10 sett P/N: Positive Control Kit ART: AMPLICOR M. tuberculosis positiv kontroll-kit US: MTB (+) C [M. tuberculosis (+)-kontroll] Tris-HCl-buffer < 0,001 % ikke-infeksiøst plasmid-dna (mikrobielt) som inneholder M. tuberculosis-sekvenser < 0,005 % Poly ra RNA (syntetisk) EDTA 0,05 % natriumazid 10 x 0,75 ml AMPLICOR Mycobacterium MYCO AMP 96 tester P/N: Amplification Kit ART: AMPLICOR Mycobacterium amplifikasjonskit US: MYCO MMX (Mycobacterium Master Mix) Tris-HCl-buffer Glyserol < 0,01 % AmpliTaq (Taq DNA-polymerase, mikrobiell) < 0,001 % datp, dctp, dgtp, dutp < 0,005 % KY18- og KY75-primere, biotinylerte 0,05 % natriumazid 3 x 1,7 ml 6/2007, Revision 4.0 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 5/30

6 AmpErase LD-enzym (lav-dna uracil-n-glykosylase) Tris-HCl-buffer < 0,01 % uracil-n-glykosylase (mikrobiell) EDTA Ditiotreitol Glyserol < 1 % solubiliserende middel Natriumklorid 0,05 % natriumazid 3 x 0,1 ml MYCO IC 3 x 0,1 ml (Mycobacterium-internkontroll) Tris-HCl-buffer < 0,001 % ikke-infeksiøst plasmid-dna (mikrobielt) som inneholder Mycobacterium-bindingssekvenser identiske med mål-mtb-dna og en unik probebindende region < 0,005 % Poly ra RNA (syntetisk) EDTA Amarantfarge 0,05 % natriumazid MYCO ( ) C [Mycobacterium ( )-kontroll] Tris-HCl-buffer < 0,005 % Poly ra RNA (syntetisk) EDTA 0,05 % natriumazid 1 x 0,75 ml COBAS AMPLICOR MTB DK 100 tester P/N: M. tuberculosis Detection Kit ART: COBAS AMPLICOR M. tuberculosis deteksjonskit US: MT PS1 1 x 100 tester (MTB probesuspensjon 1) MES-buffer < 0,3 % suspensjon av Dynabeads (paramagnetiske partikler) belagt med MTB-spesifikk oligonukleotid-bindingsprobe (KY172T3) 0,09 % natriumazid MT4 (MTB probesuspensjon 2) Natriumfosfatbuffer 29,9 % natriumtiocyanat Natriumklorid < 0,2 % solubiliserende middel 1 x 100 tester + Xn 29,9 % (v/v) natriumtiocyanat Helseskadelig 6/30 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 6/2007, Revision 4.0

7 Mycobacterium tuberculosis Test COBAS AMPLICOR DK 100 tester P/N: Detection Reagents Kit ART: COBAS AMPLICOR deteksjonsreagenskit US: DN4 (denatureringsløsning) 1,6 % natriumhydroksid EDTA Tymolblått 1 x 100 tester + Xi 1,6 % (v/v) natriumhydroksid Irriterende CN4 (avidin-hrp-konjugat) Tris-HCl-buffer < 0,001 % avidin-hrp-konjugat Bovint serumalbumin (pattedyr) Emulsit 25 (Dai-ichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.) 0,1 % fenol 1 % ProClin 150 konserveringsvæske SB3 (substrat A) Sitratløsning 0,01 % hydrogenperoksid 0,1 % ProClin 150 konserveringsvæske SB (substrat B) 0,1 % 3,3',5,5'-tetrametylbenzidin (TMB) 40 % dimetylformamid (DMF) 1 x 100 tester 5 x 75 tester 5 x 5 ml T 40 % (v/v) dimetylformamid (DMF) Giftig R: 61-20/21-36 Kan gi fosterskader. Farlig ved innånding og hudkontakt. Irriterer øynene. S: Unngå direkte kontakt innhent spesielle opplysninger før bruk. Ved uhell eller illebefinnende er omgående legebehandling nødvendig; vis etiketten om mulig. 6/2007, Revision 4.0 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 7/30

8 COBAS AMPLICOR CN4 200 tester P/N: Conjugate Detection Reagent ART: COBAS AMPLICOR konjugatedeteksjonskit US: CN4 (avidin-hrp-konjugat) Tris-HCl-buffer < 0,001 % avidin-hrp-konjugat Bovint serumalbumin (pattedyr) Emulsit 25 (Dai-ichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.) 0,1 % fenol 1 % ProClin 150 konserveringsvæske 2 x 100 tester COBAS AMPLICOR WB 500 tester P/N: Wash Buffer ART: COBAS AMPLICOR vaskebuffer US: WB (10X-vaskekonsentrat) < 2 % fosfatbuffer < 9 % natriumklorid EDTA < 2 % detergent 0,5 % ProClin 300 konserveringsvæske 2 x 250 tester Advarsler og forholdsregler For bruk til in vitro-diagnostikk. Denne testen skal kun brukes til humane luftveisprøver, som er gjort flytende, dekontaminert og oppkonsentrert, inkludert ekspektorat og indusert sputum, bronkiale utskyllinger og BAL som er gjort flytende, dekontaminert og oppkonsentrert ved hjelp av NALC-NaOH 25 -, NaOH 25 - eller SDS-NaOH 26,27 -metoder. Ikke pipetter med munnen. Ikke spis, drikk eller røyk i laboratoriets arbeidsområder. Bruk beskyttende engangshansker, laboratoriefrakk og vernebriller når du håndterer prøver og reagenser. Vask hendene nøye etter håndtering av prøver og reagenser. Unngå mikrobiell kontaminering av reagensene når du pipetterer ut porsjoner fra reagensflasker. Bruk av sterile engangspipetter og pipettespisser anbefales. Reagenser fra ulike lot eller ulike flasker innen samme lot må ikke slås sammen. Kast ubrukte reagenser og avfall i henhold til nasjonalt, regionalt og lokalt regelverk. Kit som er utgått på dato må ikke brukes. Dataark om materialsikkerhet (MSDS) kan på forespørsel sendes fra ditt lokale Rochekontor. 8/30 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 6/2007, Revision 4.0

9 Mycobacterium tuberculosis Test Arbeidsflyten på laboratoriet må være unidireksjonal og starte i preamplifikasjonsområdet og fortsette videre til postamplifikasjonsområdet (amplifikasjon/ deteksjon). Preamplifikasjonsaktiviteter må starte med reagenstillaging og fortsette med prøvepreparering. Forbruksmateriell og utstyr må være dedikert for hver preamplifikasjonsaktivitet og må ikke brukes til andre aktiviteter eller flyttes mellom områdene. Hansker må brukes i alle områder og må byttes før området forlates. Utstyr og forbruksmateriell som brukes til reagenstillaging, må ikke brukes til prøvepreparering eller pipettering eller bearbeiding av amplifisert DNA eller andre kilder for mål-dna. Forbruksmateriell og utstyr for postamplifikasjon skal forbli i postamplifikasjonsområdet. Prøver må håndteres som smittebærende, og sikre laboratorierutiner må følges. Disse er beskrevet i Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 32 og CLSI-dokumentet M29-A3 33. Alle arbeidsoverflater må rengjøres og desinfiseres med et egnet desinfiserende middel. RW, RL, RN, MYCO MMX, AmpErase LD-enzym, MYCO IC, MTB (+) C, MYCO ( ) C og MT PS1 inneholder natriumazid. Natriumazid kan reagere med bly- og kobberrør og danne svært eksplosive metallazider. Hvis løsninger som inneholder natriumazid helles i avløp i laboratoriet, må de skylles ned med store mengder vann for å unngå azidoppbygging. Bruk vernebriller, laboratoriefrakk og engangshansker ved håndtering av RW, RL, RN, MYCO MMX, MT4, DN4, CN4, SB3, SB og aktivt substrat (blandede SB3- og SB-reagenser). Unngå kontakt med hud, øyne eller slimhinner. Skyll umiddelbart med mye vann hvis slik kontakt oppstår. Hvis kontaktstedet ikke blir behandlet, kan det oppstå brannskade. Fortynn med vann før du tørker opp eventuelt søl fra reagensene. Unngå at SB eller det aktive substratet kommer i kontakt med hud og slimhinner. Skyll umiddelbart med mye vann hvis slik kontakt oppstår. SB og aktivt substrat inneholder dimetylformamid som er rapportert å være giftig i høye orale doser og som kan gi fosterskader. Unngå hudkontakt, innånding av damp og svelging. Ved hudkontakt må du vaske grundig med såpe og vann og oppsøke lege umiddelbart. Rør med skrukork må brukes til preparering av prøver og kontroller for å forhindre søl og mulig krysskontamintering av prøver. Ikke bruk rør med snapplokk. Krav til oppbevaring og håndtering Ikke frys reagenser. Oppbevar RW, RL og RN ved 2 25 C. Når disse reagensene er uåpnet, er de stabile til angitt utløpsdato. Oppbevar MYCO MMX, AmpErase LD-enzym og MYCO IC ved 2 8 C. Når disse reagensene er uåpnet, er de stabile til angitt utløpsdato. Når Working Master Mix er åpnet (tillaget ved å tilsette AmpErase LD-enzym og MYCO IC til MYCO MMX), må den oppbevares ved 2 8 ºC hvor den er stabil i 4 uker. 6/2007, Revision 4.0 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 9/30

10 Materiell som medfølger Oppbevar MTB (+) C og MYCO ( ) C ved 2 8 C. Disse reagensene er stabile til angitt utløpsdato. Oppbevar MT PS1 og MT4 ved 2 8 C. Disse reagensene er stabile til angitt utløpsdato. Så snart MT PS1 og MT4 er blandet, er det aktive reagenset stabilt i 30 dager ved 2 8 C. Det aktive reagenset kan brukes i maks. seks instrumentsykluser (12 timer per syklus) og må oppbevares ved 2 8 C mellom instrumentsyklusene. Oppbevar DN4 ved 2 25 C. DN4 er stabil til angitt utløpsdato. Så snart DN4 er åpnet, er den holdbar i 30 dager ved 2 8 C eller til utløpsdato, avhengig av hva som kommer først. DN4 kan brukes i maks. seks instrumentsykluser (12 timer per syklus) og må oppbevares ved 2 8 C mellom instrumentsyklusene. Oppbevar CN4 ved 2 8 C. CN4 er stabil til angitt utløpsdato. Så snart CN4 er åpnet, er den holdbar i 30 dager ved 2 8 C eller til utløpsdato, avhengig av hva som kommer først. CN4 kan brukes i maks. seks instrumentsykluser (12 timer per syklus) og må oppbevares ved 2 8 C mellom instrumentsyklusene. Oppbevar SB3 og SB ved 2 8 C. Når disse reagensene er uåpnet, er de stabile til angitt utløpsdato. Aktivt substrat må tillages hver dag ved å blande SB3 og SB. Det aktive substratet er stabilt i 16 timer i COBAS AMPLICOR -analysatoren. SB3, SB eller det aktive substratet må ikke utsettes for metaller, oksideringsmidler eller direkte lys. Oppbevar WB ved 2 30 C. WB er stabil til angitt utløpsdato. Inspiser WB, og om nødvendig, varm opp til C for å løse opp ev. bunnfall. Aktiv vaskebuffer (1X), som tillages ved å fortynne WB med destillert eller deionisert vann, må oppbevares ved 2 25 C i COBAS AMPLICOR -vaskebufferreservoaret og er stabil i 2 uker fra tillagingsdato. Oppbevar delvis brukte deteksjonsreagenser ved 2 8 C mellom analyseseriene. Sjekk utløpsdatoen til åpnede eller aktive reagenser før de settes i COBAS AMPLICOR -analysatoren. AMPLICOR Respiratory RSP PREP P/N: Specimen Preparation Kit ART: AMPLICOR prepareringskit for respiratoriske prøver US: RW (vaskeløsning for respiratoriske prøver) RL (lyseringsreagens for respiratoriske prøver) RN (nøytraliseringsreagens for respiratoriske prøver) AMPLICOR M. tuberculosis MYCO CTL P/N: Positive Control Kit ART: AMPLICOR M. tuberculosis positiv kontroll-kit US: MTB (+) C [M. tuberculosis (+)-kontroll] 10/30 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 6/2007, Revision 4.0

11 Mycobacterium tuberculosis Test AMPLICOR Mycobacterium MYCO AMP P/N: Amplification Kit ART: AMPLICOR Mycobacterium amplifikasjonskit US: MYCO MMX (Mycobacterium Master Mix) AmpErase LD-enzym (lav-dna uracil-n-glykosylase) MYCO IC (Mycobacterium-internkontroll) MYCO ( ) C [Mycobacterium ( )-kontroll] COBAS AMPLICOR MTB DK P/N: M. tuberculosis Detection Kit ART: COBAS AMPLICOR M. tuberculosis deteksjonskit US: MT PS1 (MTB probesuspensjon 1) MT4 (MTB probesuspensjon 2) COBAS AMPLICOR DK P/N: Detection Reagents Kit ART: COBAS AMPLICOR deteksjonsreagenskit US: DN4 (denatureringsløsning) CN4 (avidin-hrp-konjugat) SB3 (substrat A) SB (substrat B) COBAS AMPLICOR CN4 P/N: Conjugate Detection Reagent ART: COBAS AMPLICOR konjugatdeteksjonskit US: CN4 (avidin-hrp-konjugat) COBAS AMPLICOR WB P/N: Wash Buffer ART: COBAS AMPLICOR vaskebuffer US: WB 10X-vaskekonsentrat 6/2007, Revision 4.0 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 11/30

12 Materiell som kreves, men som ikke medfølger Preamplifikasjon reagenstillagingsområdet COBAS AMPLICOR A-ring utstyrt med 12 A-rør COBAS AMPLICOR -A-ringholder Eppendorf Multipette -pipette med 1,25 ml Combitip -reservoar (steril, enkeltpakket) Pipette (kapasitet 100 µl)* med aerosolbarriere- eller positive displacement -spisser Engangshansker, uten pudder Preamplifikasjon prøve- og kontrollprepareringsområdet 1,5 ml polypropylenrør med skrulokk, sterile, ikkesilikonbehandlede, koniske (Sarstedt eller tilsvarende)** Rørstativ (for eksempel Sarstedt ) Sterile overføringspipetter med fin spiss Pipetter (kapasitet 50 µl, 100 µl, 400 µl, 500 µl og 1000 µl)* med aerosolbarriere- eller positive displacement -spisser Mikrosentrifuge (maks. RCF x g, min. RCF x g); Eppendorf 5415C, HERMLE Z230M, eller tilsvarende Vortexmikser 60 ºC ± 2 ºC varmeblokk Engangshansker, uten pudder Postamplifikasjon amplifikasjons-/deteksjonsområdet COBAS AMPLICOR -analysator og skriver Operatørmanual for COBAS AMPLICOR -analysatoren Valgfritt: AMPLILINK-programvare, inkludert: Datastasjon for AMPLILINK-programvare, med skriver Operatørmanualen for AMPLILINK Software version 2.4 Series for bruk sammen med COBAS AMPLICOR - analysatoren (for bruk sammen med AMPLILINK Software, v2.41) eller applikasjonsmanualen for AMPLILINK Software Version 3.2 Series for bruk sammen med COBAS AmpliPrepinstrumentet, COBAS TaqMan -analysatoren, COBAS TaqMan 48-analysatoren og COBAS AMPLICOR - analysatoren (for bruk sammen med AMPLILINK Software, v3.2 Series) Metodemanual for COBAS AMPLICOR MTB-testen Stativ med D-kopper Destillert eller deionisert vann 5 ml serologiske pipetter Målesylinder (minimum 1 liter) Vortexmikser Engangshansker, uten pudder * Pipettene må ha en nøyaktighet innenfor 3 % av angitt volum. Aerosolbarriere- eller positive displacement -spisser må brukes der dette er angitt for å hindre krysskontaminering mellom prøver og amplicon. ** Rør med skrukork må brukes til preparering av prøver for å forhindre søl og mulig krysskontamintering av prøver og kontroller. Ikke bruk rør med snapplokk. 12/30 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 6/2007, Revision 4.0

13 Mycobacterium tuberculosis Test Prøvetaking, transport og oppbevaring Merk: Prøvetaking Prøvetransport Oppbevaring av prøver Alle prøver må behandles som om de er potensielt infeksiøse. De eneste godkjente prøvene er: (a) ekspektorat og indusert sputum; (b) bronkiale utskyllinger og (c) BAL tatt i sterile plastbeholdere. Disse prøvene må gjøres flytende, dekontamineres og oppkonsentreres ved hjelp av NALC-NaOH 25 -, NaOH 25 - eller SDS-NaOH 26,27 -metoder. Dekontaminerte prøver må transporteres til laboratoriet ved 2 25 C forutsatt at de vil ankomme laboratoriet innen 24 timer etter prøvetaking. Hvis prøvene ikke vil ankomme laboratoriet innen 24 timer etter prøvetaking, må de oppbevares ved 70 C og transporteres på tørris. Transport av prøver må skje i henhold til nasjonalt, regionalt og lokalt regelverk for transport av biologisk materiale 34. Dekontaminerte prøver kan oppbevares ved 70 C i opptil 8 måneder. Preparerte prøver kan oppbevares ved 70 C i opptil 6 måneder eller ved 2 8 C i opptil 4 dager. Bruksanvisning Merk: Merk: Merk: Merk: Reagenstillaging For mer detaljert informasjon, utskrift av resultater og tolkning av flagg og kommentarer, se (1) operatørmanualen for COBAS AMPLICOR - analysatoren og, (2) hvis du bruker AMPLILINK Software, v2.41, se operatørmanualen for AMPLILINK Software version 2.4 Series for bruk sammen med COBAS AMPLICOR -analysatoren eller, hvis du bruker AMPLILINK Software, v3.2 Series, se applikasjonsmanualen for AMPLILINK Software Version 3.2 Series for bruk sammen med COBAS AmpliPrepinstrumentet, COBAS TaqMan -analysatoren, COBAS TaqMan 48- analysatoren og COBAS AMPLICOR -analysatoren. Hvis prøvepreparering, amplifikasjon og deteksjon utføres i løpet av én arbeidsdag, følg testprosedyren som beskrevet nedenfor. Hvis prøvepreparering utføres på en annen dag enn amplifikasjon og deteksjon, må reagenstillagingen utføres på samme dag som amplifikasjon og deteksjon. Alle reagenser må ha romtemperatur før bruk. Bruk pipetter med aerosolbarriere- eller positive displacement -spiss der dette er angitt. Vær svært forsiktig for å sikre selektiv amplifikasjon. Rør med skrukork må brukes til preparering av prøver og kontroller for å forhindre søl og mulig krysskontamintering av prøver. Ikke bruk rør med snapplokk. Utført i: Preamplifikasjon reagenstillagingsområdet 1. Bestem antall A-ringer som er nødvendig for analysering av pasientprøver og kontroller. Én M. tuberculosis (+)-kontroll og én Mycobacterium ( )-kontroll må være inkludert i hver PCR-analyseserie (se Kvalitetskontroll ). Plasser A-ringen i A-ringholderen. 6/2007, Revision 4.0 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 13/30

14 Merk: Selv om det ikke utføres deteksjon av MYCO IC, må det tilsettes MYCO IC til Master Mix. 2. Vortex MYCO IC-røret i 5 sekunder. Klargjør Working Master Mix ved å tilsette 100 µl MYCO IC og 100 µl AmpErase LD-enzym til en flaske MYCO MMX (denne blandingen er tilstrekkelig til 32 amplifikasjoner). Det er ikke nødvendig å måle Master Mix-volumet. Tilsett 100 µl MYCO IC og 100 µl AmpErase LD-enzym til hele flasken med MYCO MMX. Sett på korken og bland godt ved å vende røret opp-ned ganger. Ikke vortex Working Master Mix. Noter datoen for tillaging på flasken. Kast de tomme MYCO IC- og AmpErase LD-enzym-flaskene. Working Master Mix er stabil i 4 uker ved 2 8 C. 3. Tilsett 50 µl Working Master Mix i hvert A-rør ved hjelp av en multisteppipette med et 1,25 ml Combitip-reservoar eller en pipette med aerosolbarriereeller positive displacement -spiss. Ikke sett på lokkene på A-rørene i dette trinnet. 4. Plasser A-ringen som inneholder Working Master Mix, i en forseglbar plastpose, og lukk plastposen godt. Flytt A-ringen(e) til preamplifikasjon prøve- og kontrollprepareringsområdet. Oppbevar A-ringen(e) som inneholder Working Master Mix, ved 2 8 C i preamplifikasjon prøve- og kontrollprepareringsområdet til prøve- og kontrollprepareringen er fullført. Working Master Mix er stabil i 24 timer ved 2 8 C når A-rørene oppbevares i den forseglede plastposen. Prøve- og kontrollpreparering Merk: Utført i: Preamplifikasjon prøve- og kontrollprepareringsområdet For å amplifisere tidligere preparerte prøver og kontroller, utfør først trinnene under Reagenstillaging. Tin preparerte prøver og kontroller i romtemperatur, og fortsett med Prøve- og kontrollpreparering, trinn Merk ett 1,5 ml polypropylenrør med skrukork for hver prøve og kontroll. Ikke bruk rør med snapplokk. Merk hvert prøveprepareringsrør med prøveidentifikasjonsnummeret. 2. Tilsett 500 µl RW til hvert prøverør. 3. Tilsett 100 µl av flytende, dekontaminert og oppkonsentrert luftveisprøve til røret som inneholder RW. Kork røret og vortex i 5 sekunder. 4. Sentrifuger ved x g i 10 minutter. 5. Aspirer supernatanten ved hjelp av en overføringspipette med fin spiss, og tilsett 100 µl RL til cellepelleten ved hjelp av en ny pipettespiss med aerosolbarriere for hver prøve. Vortex røret i 5 sekunder for å resuspendere pelleten. 6. Klargjør arbeidskontrollene på følgende måte: Merk: Arbeidskontroller må tillages ferskt hver dag testen utføres, og kastes ved arbeidsdagens slutt. 14/30 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 6/2007, Revision 4.0

15 Mycobacterium tuberculosis Test a. Vortex MYCO ( ) C i 5 sekunder. Pipetter 100 µl MYCO ( ) C i et 1,5 ml polypropylenrør med skrukork ved hjelp av en pipette med en aerosolbarrierespiss. Tilsett 400 µl RL. Vortex i 5 sekunder. Dette er Mycobacterium ( )-arbeidskontrollen. b. Vortex MTB (+) C i 5 sekunder. Pipetter 100 µl MTB (+) C i et 1,5 ml polypropylenrør med skrukork ved hjelp av en pipette med en aerosolbarrierespiss. Tilsett 400 µl RL. Vortex i 5 sekunder. Dette er M. tuberculosis (+)-arbeidskontrollen. c. Pipetter 100 µl fra hver arbeidskontroll i et 1,5 ml polypropylenrør med skrukork til preparering parallelt med de kliniske prøvene. 7. Inkuber prøvene og kontrollene i en varmeblokk ved 60 C ± 2 C i 45 minutter. 8. Fjern rørene fra varmeblokken, og pulssentrifuger rørene i 5 sekunder for å fjerne kondens fra korken. 9. Bruk en pipette med aerosolbarrierespiss til å overføre 100 µl RN til hvert prøve- og kontrollrør. Vortex i 5 sekunder ved halv hastighet. Bruk en ny pipettespiss med aerosolbarriere for hver prøve og kontroll. 10. Bruk pipette(r) med aerosolbarrierespiss(er) til å overføre 50 µl av hver preparerte pasientprøve, M. tuberculosis (+)-arbeidskontroll og Mycobacterium ( )-arbeidskontroll til et korresponderende A-rør som inneholder Working Master Mix. Vær nøye med ikke å overføre eventuelt materiale som ikke er resuspendert. Kork rørene. Noter ned posisjonene for pasientprøvene og kontrollene på A-ring-kartet. 11. Flytt de preparerte prøvene (pasientprøver og kontroller) i A-ringene til amplifikasjons-/deteksjonsområdet. Preparerte prøver kan oppbevares ved 2 8 C i opptil 8 timer. Amplifikasjon og deteksjon Utført i: Postamplifikasjon amplifikasjons-/deteksjonsområdet Utfør daglig vedlikehold av instrumentet, inkludert: Tørk av initialiseringsposten med en lofri og fuktig klut. Tørk av griperedskapet for D-kopper med en lofri og fuktig klut. Kontroller vaskebufferreservoaret og etterfyll ved behov. Klargjør aktiv vaskebuffer (1X) på følgende måte. Inspiser WB, og om nødvendig, varm opp til C for å løse opp ev. bunnfall. Klargjør aktiv vaskebuffer ved å tilsette 1 del WB til 9 deler destillert eller deionisert vann. Bland godt. Sørg for at det alltid er minst 3 4 liter vaskebuffer (1X) i systemets vaskebufferreservoar. Tøm avfallsbeholderen. Prime COBAS AMPLICOR -analysatoren. Kontroller sprøyter og slanger under primingen. Kontroller pipetteringsnålen under primingen. 6/2007, Revision 4.0 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 15/30

16 Før hver analyseserie: Kontroller avfallsbeholderen og tøm ved behov. Kontroller vaskebufferreservoaret og tilsett buffer ved behov. Bytt ut brukte D-koppstativer. Prime COBAS AMPLICOR -analysatoren. Oppstart og kjøring av COBAS AMPLICOR -analysatoren 1. Sjekk hvor mye reagens som står i COBAS AMPLICOR -analysatoren. Gjør klar reagenskassettene som trengs for å fullføre analyseserien. 2. Bland MT PS1 godt ved vortexing. Tilsett 2,5 ml MT PS1 til én MT4- kassett. Plasser kassetten på det testspesifikke reagensstativet. Kast den brukte MT PS1-flasken. Noter datoen for reagenstillaging på MT4- kassetten. Merk: Gå til trinn 4 hvis deteksjon av internkontroll ikke utføres. Fortsett ellers med trinn Bland IC PS1 godt ved vortexing. Tilsett 2,5 ml IC PS1 til IC4-kassetten. Plasser kassetten på det testspesifikke reagensstativet. Kast den tomme IC PS1-flasken. Noter datoen for reagenstillaging på IC4-kassetten. 4. Klargjør det aktive substratet ved å pipettere 5 ml SB til en SB3-kassett. Bland ved å pipettere opp og ned. Kast den åpne SB-flasken. Noter datoen for tillaging på SB3-kassetten. 5. Plasser det aktive substratet i SB3-kassetten i stativet for generisk reagens. 6. Plasser DN4- og CN4-kassetter i stativet for generisk reagens. Noter datoen på kassetten for hver kassett som åpnes. 7. Identifiser reagensstativene som generiske eller testspesifikke ved hjelp av tastaturet, strekkodeleseren eller AMPLILINK-programvaren. 8. Konfigurer reagensstativene ved å legge inn reagensposisjoner og lotnummer i COBAS AMPLICOR -analysatoren ved hjelp av tastaturet, strekkodeleseren eller AMPLILINK-programvaren. 9. Last inn reagensstativet i COBAS AMPLICOR -analysatoren ved hjelp av tastaturet, strekkodeleseren eller AMPLILINK-programvaren. Sjekk at hver reagenskassett står i sin tildelte posisjon og at hver kassett sitter godt på plass i stativet. 10. Plasser stativet for D-kopper på D-kopp-plattformen. Det trengs én D-kopp for hver deteksjonsreaksjon og to D-kopper for hver kassett med aktivt substrat for at COBAS AMPLICOR -analysatoren skal kunne kjøre substratblank. 11. Plasser A-ringen(e) i termoblokksegmentene i COBAS AMPLICOR - analysatoren. 16/30 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 6/2007, Revision 4.0

17 Mycobacterium tuberculosis Test 12. Last inn A-ringene i COBAS AMPLICOR -analysatoren ved hjelp av tastaturet, strekkodeleseren eller AMPLILINK-programvaren. 13. Opprett en A-ringarbeidsliste. 14. Lukk lokket på termoblokksegmentene godt. 15. Start COBAS AMPLICOR -analysatoren. 16. Vent til COBAS AMPLICOR -analysatoren angir at load check er godkjent. Merk: COBAS AMPLICOR -analysatoren kan utføre 6 separate deteksjoner av innholdet i hvert A-rør. Analysatoren beregner den påkrevde mengden av hvert deteksjonsreagens, og det utføres en load check ved starten av hver analyseserie som kontrollerer om det finnes nok tilgjengelig reagens til å utføre de ønskede testene. Kvalitetskontroll 17. Amplifikasjon og deteksjon utføres automatisk av COBAS AMPLICOR - analysatoren. Resultatene uttrykkes som absorbansverdi ved 660 nm og som positive eller negative. Minst ett replikat av M. tuberculosis (+)-kontrollen og ett replikat av Mycobacterium ( )-kontrollen må inngå i hver analyseserie. Som for alle nye laboratorieprosedyrer, bør nye operatører vurdere bruk av ytterligere positive og negative kontroller hver gang testen utføres inntil man har oppnådd ønsket grad av trygghet for at testen utføres på riktig måte. Det finnes ingen krav til kontrollenes posisjon i A-ringen(e). Kontroller om det finnes flagg og kommentarer i analyseutskriften for å sikre at analyseserien er gyldig. Negativ kontroll Absorbansen for Mycobacterium ( )-kontrollen må være mindre enn 0,25 ved 660 nm. Hvis absorbansen for Mycobacterium ( )-kontrollen er større enn eller lik 0,25, er hele analyseserien ugyldig. Gjenta hele testprosedyren (prøvepreparering, amplifikasjon og deteksjon). Kontakt det lokale Rochekontoret for teknisk hjelp hvis absorbansen for Mycobacterium ( )-kontrollen gjentatte ganger er større enn 0,25. Positiv kontroll Absorbansen for M. tuberculosis (+)-kontrollen må være større enn eller lik 2,0 ved 660 nm. Hvis absorbansen for M. tuberculosis (+)-kontrollen er mindre enn 2,0, er hele analyseserien ugyldig. Gjenta hele testprosedyren (prøvepreparering, amplifikasjon og deteksjon). Kontakt det lokale Roche-kontoret for teknisk hjelp hvis absorbansen for M. tuberculosis (+)-kontrollen gjentatte ganger er mindre enn 2,0. Prøvepreparering For å teste effektiviteten av prøveprepareringen (det anbefales at dette gjøres månedlig) skal 10 4 M. tuberculosis-celler behandles som beskrevet i avsnittet Prøve- og kontrollpreparering og deretter testes på samme måte som en klinisk prøve. Det skal oppnås en absorbansverdi større enn eller lik 0,35 ved 660 nm med COBAS AMPLICOR MTB-testen hvis prøven er blitt behandlet riktig. 6/2007, Revision 4.0 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 17/30

18 Resultater Tolking av resultater Uten deteksjon av internkontroll 1. Kontroller om det finnes flagg (FLG) og kommentarer i analyseutskriften for å sikre at analyseserien er gyldig. Hvis analyseserien er ugyldig, må hele oppsettet gjentas (preparering av prøver, amplifikasjon og deteksjon). 2. Prøveresultater fra gyldige analyseserier tolkes på følgende måte: A 660 Kommentar Tolkning < 0,35 NEGATIVE MTB-DNA ikke detektert. Prøven er antatt negativ for M. tuberculosis. Et negativt resultat utelukker ikke tilstedeværelsen av MTB-infeksjon fordi resultatene avhenger av korrekt prøvetaking, fravær av hemmere og tilstrekkelig DNA til at det kan detekteres. 0,35 POSITIVE MTB-DNA detektert. Prøven er positiv for tilstedeværelse av M. tuberculosis. Tolking av resultater Med deteksjon av internkontroll 1. Kontroller om det finnes flagg (FLG) og kommentarer i analyseutskriften for å sikre at analyseserien er gyldig. Hvis analyseserien er ugyldig, må hele oppsettet gjentas (preparering av prøver, amplifikasjon og deteksjon). 2. Prøveresultater fra gyldige analyseserier tolkes på følgende måte: MTB-prøveresultat IC-prøveresultat Tolkning A 660 Kommentar A 660 Kommentar < 0,35 NEGATIVE 0,35 POSITIVE MTB-DNA ikke detektert. Prøven er antatt negativ for M. tuberculosis. Et negativt resultat utelukker ikke tilstedeværelsen av MTB-infeksjon fordi resultatene er avhengig av korrekt prøvetaking, fravær av hemmere og tilstrekkelig DNA til at det kan detekteres. < 0,35 NEGATIVE < 0,35 NEGATIVE Ugyldig negativt resultat. Preparer en ny utpipettering av originalprøven. Hvis originalprøven ikke er tilgjengelig, må en ny prøve tas. 0,35 POSITIVE ALLE ALLE MTB-DNA detektert. Prøven er positiv for tilstedeværelse av MTB. 18/30 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 6/2007, Revision 4.0

19 Mycobacterium tuberculosis Test Forsiktighetsregler Testens begrensninger Arbeidsflyten på laboratoriet må være unidireksjonal, starte i preamplifikasjonsområdet og fortsette videre til postamplifikasjonsområdet (amplifikasjon/ deteksjon). Preamplifikasjonsaktiviteter må starte med reagenstillaging og fortsette med prøvepreparering. Forbruksmateriell og utstyr må være spesielt dedikert til hver preamplifikasjonsaktivitet og ikke brukes til andre aktiviteter eller flyttes mellom områdene. Hansker må brukes i alle områder og må byttes før området forlates. Utstyr og forbruksmateriell som brukes til reagenstillaging, må ikke brukes til prøvepreparering eller pipettering eller bearbeiding av amplifisert DNA eller andre kilder for mål-dna. Forbruksmateriell og utstyr for postamplifikasjon skal forbli i postamplifikasjonsområdet. Som for andre laboratorieprosedyrer, er god laboratorieteknikk essensielt for å sikre optimal ytelse for denne analysen. På grunn av testens høye analytiske sensitivitet må det utvises stor grad av varsomhet for å bevare reagensenes og amplifikasjonsblandingens renhet. Alle reagenser må inspiseres nøye for å være sikker på at de er rene. Kast eventuelle tvilsomme reagenser. Denne testen er validert for flytende, dekontaminerte og oppkonsentrerte humane luftveisprøver, inkludert ekspektorat og indusert sputum, bronkiale utskyllinger og BAL som er gjort flytende, dekontaminert og oppkonsentrert ved hjelp av NALC-NaOH 25 -, NaOH 25 - eller SDS-NaOH 26,27 -metoder. Testing av andre prøvematerialer kan føre til falske negative eller falske positive resultater. Pålitelige resultater er avhengig av adekvat prøvetaking, transport, oppbevaring og håndtering. Deteksjon av M. tuberculosis-komplekset er avhengig av antallet organismer som er til stede i prøven, og kan påvirkes av metoder for prøvetaking, pasientfaktorer (dvs. alder, tilstedeværelse av symptomer) og/eller infeksjonsstadium. Falske negative resultater kan forekomme som følge av hemming av polymerase. Mycobacterium-internkontrollen er blitt inkludert i COBAS AMPLICOR MTB-testen, v2.0 for å gi mulighet for å identifisere preparerte prøver som inneholder substanser som kan interferere i PCR-amplifikasjonen. Tilstedeværelsen av AmpErase LD-enzymet i Master Mix reduserer risikoen for kontaminasjon fra amplicon. Kontaminering av MTB-positive kontroller og kliniske prøver kan kun unngås gjennom gode laboratorierutiner og ved å følge anvisningene i dette pakningsvedlegget nøye. Som for alle tester må resultatene fra COBAS AMPLICOR MTB-testen tolkes i sammenheng med alle kliniske og laboratoriemessige funn. Dette produktet bør kun brukes av personell som er opplært i PCR-teknikk. Dette produktet kan kun brukes sammen med COBAS AMPLICOR - analysatoren. 6/2007, Revision 4.0 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 19/30

20 Ytelseskarakteristika Analytisk spesifisitet: Den analytiske spesifisiteten til COBAS AMPLICOR MTB-testen ble evaluert ved å teste følgende bakterier og virus. Mange av disse er normalflora eller alminnelige patogener i luftveiene. Alle bakterielle isolater ble testet ved 10 6 celler/ml eller 10 5 kopier nukleinsyre/pcr. Virusisolater ble testet ved PFU/mlverdiene angitt nedenfor. Ingen av de testede isolatene var positive med COBAS AMPLICOR MTB-testen. Mykobakterielle arter Mycobacterium asiaticum Mycobacterium aurum Mycobacterium avium Mycobacterium chitae Mycobacterium cookii Mycobacterium fallax Mycobacterium flavescens Mycobacterium fortuitum Mycobacterium gastri Mycobacterium gordonae Mycobacterium intracellulare Mycobacterium kansasii Mycobacterium komassense Mycobacterium malmoense Mycobacterium marinum Mycobacterium neoaurum Mycobacterium nonchromogenicum Mycobacterium phlei Mycobacterium scrofulaceum Mycobacterium senegalens Mycobacterium simiae Mycobacterium smegmatis Mycobacterium sphagni Mycobacterium szulgai Mycobacterium terrae Mycobacterium thermoresistibile Mycobacterium triviale Mycobacterium xenopi 20/30 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 6/2007, Revision 4.0

21 Mycobacterium tuberculosis Test Ikke-mykobakterielle arter Acinetobacter calcoaceticus Actinomadura madurae Actinomyces pyogenes Actinoplanes italicus Aeromonas hydrophila Arcanobacterium haemolyticum Arthrobacter oxydans Bacillus subtilis Bacteriodes fragilis Blastomyces dermatitidis Bordetella parapertussis Bordetella pertussis Branhamella (Moraxella) catarrhalis Brevibacterium linens Campylobacter jejuni Candida albicans Chromobacterium violaceum Citrobacter freundii Clostridium perfringens Coccidioides immitis Corynebacterium aquaticum Corynebacterium diphtheriae Corynebacterium flavescens Corynebacterium glutamicum Corynebacterium jeikeium Corynebacterium minutissimum Corynebacterium pseudodiphtheriticum Corynebacterium pseudotuberculosis Corynebacterium renale Corynebacterium striatum Corynebacterium xerosis Cryptococcus neoformans Deinococcus radiodurans Dermatophilus congolensis Eikenella corrodens Enterobacter cloacae Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Escherichia coli Fusobacterium nucleatum Gordona sputi Haemophilus influenzae Haemophilus parainfluenzae Histoplasma capsulatum Klebsiella pneumoniae Klebsiella pneumoniae subsp. ozaenae Lactobacillus casei Legionella micdadei Legionella pneumophila Microbacterium lactamicum Neisseria gonorrhoeae Neisseria lactamica Neisseria meningitidis Nocardia asteroides Nocardia brasiliensis Nocardia farcinica Nocardia nova Nocardia otitidiscaviarum Nocardia transvalensis Oerskovia turbata Peptococcus niger Peptostreptococcus anaerobius Peptostreptococcus magnus Porphyromonas asaccharolytica Porphyromonas gingivalis Prevotella melaninogenica Propionibacterium acnes Pseudomonas aeruginosa Rhodococcus aichiensis Rhodococcus bronchialis Rhodococcus chubuensis Rhodococcus equi Salmonella choleraesuis subsp. choleraesuis Serratia marcescens Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis Streptococcus agalactiae Streptococcus gordonii Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes Streptomyces griseus Veillonella atypica Veillonella parvula Vibrio parahaemolyticus Xanthomonas maltophilia Yersinia enterocolitica 6/2007, Revision 4.0 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 21/30

22 Virusisolater Virus PFU/PCR testet Adenovirus 3,2 x 10 5 Cytomegalovirus 98 Herpes Simplex I 5,6 x 10 5 Herpes Simplex II N/A Influensa type B Ukjent* Parainfluensa 2 2,8 x 10 5 Respiratorisk syncytialt virus 28 * Denne prøven var en halsprøve fra en pasient Chlamydiaisolater Chlamydiaarter IFU/PCR testet Chlamydia pneumoniae 188 Chlamydia trachomatis 88 Analytisk sensitivitet: Renset DNA Deteksjonsgrensen for COBAS AMPLICOR MTB-testen ble etablert ved å bestemme det laveste antall kopier av M. tuberculosis-mål-dna som kan detekteres reproduserbart ved hjelp av prosedyren. Dette ble utført ved å analysere serielle fortynninger av renset mål-dna. Resultatene viste at COBAS AMPLICOR MTB-testen kunne detektere 1 kopi av M. tuberculosis kompleks- DNA per PCR-reaksjon og at 5 eller flere kopier av renset M. tuberculosis- DNA per PCR-reaksjon ble detektert i 100 % av tilfellene. Fem kopier av M. tuberculosis-kompleks-dna per PCR-reaksjon tilsvarer 1000 kopier av M. tuberculosis-kompleks-dna per ml prøve. Analytisk sensitivitet: Deteksjonsgrensen for COBAS AMPLICOR MTB-testen ble etablert ved å M. tuberculosis-celler bestemme det laveste antall M. tuberculosis-kolonidannende enheter (CFU) som kan detekteres reproduserbart ved hjelp av prosedyren. Dette ble utført ved å analysere serielle fortynninger av titrerte stamløsninger av kulturer fra hver av tolv M. tuberculosis-isolater. Resultatene viser at COBAS AMPLICOR MTB-testen kan detektere én CFU per PCR-reaksjon og at 40 CFU per PCRreaksjon ble detektert i 100 % av tilfellene for hver av de tolv M. tuberculosiskompleksisolatene. Én CFU M. tuberculosis per PCR-reaksjon tilsvarer 40 CFU M. tuberculosis per ml prøve. Presisjon Innen serie-, mellom serie-, mellom dag- og total presisjon for COBAS AMPLICOR MTB-testen ble evaluert i samsvar med metodene definert i retningslinjene fra CLSI (EP5-A2), Evaluation of Performance of Clinical Chemistry Devices. 36 Denne prosedyren tillater bestemmelse av presisjon innen serie, mellom serier, mellom dager og total presisjon ved hjelp av en studie utført av flere operatører over flere dager. Studien ble utført i laboratoriene til Roche Molecular Systems Diagnostic Development ved hjelp av en enkelt lot av COBAS AMPLICOR MTB-testen. I denne studien ble Mycobacterium (+)- kontrollen preparert og videre fortynnet med prøveprepareringsbuffere til konsentrasjoner på 10 og 20 DNA-kopier/amplifikasjonsreaksjon. En analyseserie bestående av 24 tester ble utført hver dag i 10 dager av 2 operatører. Hver analyseserie omfattet 8 replikater av hver av de 2 Mycobacterium (+)- kontrollkonsentrasjonene og Mycobacterium ( )-kontrollen. Resultatene fra denne studien er vist i tabell 1. 22/30 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 6/2007, Revision 4.0

23 Mycobacterium tuberculosis Test Tabell 1. Presisjon for COBAS AMPLICOR MTB-testen MÅL-MTB KOPIANTALL/PCR-REAKSJON Kopier/PCR-reaksjon Kopier/PCR-reaksjon Kopier/PCR-reaksjon Totalt antall replikater Gjennomsnittlig absorbans 0,017 3,746 3,889 Minimumsverdi 0,007 1,316 3,334 Maksimumsverdi 0,029 4,000 4,000 Mellom dager Standardavvik 0* 0,218 0* Variasjonskoeffisient 0* 5,8 % 0* Mellom serier Standardavvik 0,007 0,185 0,139 Variasjonskoeffisient 40,5 % 4,9 % 3,6 % Innen-serie Standardavvik 0,0017 0,373 0,081 Variasjonskoeffisient 10,1 % 10,0 % 2,1 % Totalt Standardavvik 0,007 0,470 0,161 Variasjonskoeffisient 41,7 % 12,6 % 4,1 % * Den estimerte varianskomponenten var negativ og ble derfor satt til null. Klinisk ytelse COBAS AMPLICOR MTB-testen ble evaluert i en multisenterstudie utført ved 7 klinikker i USA, Canada og Europa. For å evaluere den kliniske nytteverdien til COBAS AMPLICOR MTB-testen ble resultatene sammenlignet med MTB-dyrkningsresultater og med utredete testresultater, som inkluderte resultater fra MTB-dyrkning og gjennomsyn av pasientjournaler (tabell 2 og 3). Det ble registrert resultater fra AFB-utstryk og mykobakteriell dyrkning og COBAS AMPLICOR MTB-testen for 5430 prøver. Av disse prøvene var 271 AFB-utstryk positive, og 5159 AFB-utstryk var negative. Av de 271 prøvene som var positive ved AFB-utstryk var 200 positive ved MTB-dyrkning og ved COBAS AMPLICOR MTB-testen, og åtte prøver var positive ved MTBdyrkning og negative med COBAS AMPLICOR MTB-testen. Sekstitre (63) av prøvene som var positive ved AFB-utstryk, var negative ved MTB-dyrkning. Sytten (17) av disse var dyrkningspositive for ikke-tuberkuløse mykobakterier, og førtiseks (46) var dyrkningsnegative for alle mykobakterier. Prevalensen av MTB i den totale prøvepopulasjonen, basert på dyrkningsresultater, var 6,5 % (352/5430). Prevalensen av MTB i den utstrykspositive og den utstryksnegative prøvepopulasjonen var henholdsvis 76,8 % (208/271) og 2,8 % (144/159). Når det ble brukt internkontroll for å vurdere testresultatene, ble 2,8 % (155/5430) av prøvene funnet å være gjentatt inhibert overfor PCR. Når det ble brukt internkontroll til tolking av testresultater, var den kliniske sensitiviteten til COBAS AMPLICOR MTB-testen versus dyrkning i prøvepopulasjonen med positive utstryk 96,2 % (200/208), og den kliniske spesifisiteten var 73,8 % (45/61). Sammenlignet med de utredede testresultatene var den kliniske sensitiviteten til COBAS AMPLICOR MTB-testen 96,4 % (217/225), og den kliniske spesifisiteten var 100 % (45/45). I prøvepopulasjonen med negative utstryk var den kliniske sensitiviteten til COBAS AMPLICOR 6/2007, Revision 4.0 COBAS AMPLICOR Mycobacterium tuberculosis Test 23/30