For Use With The High Pure System

Transkript

1 COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 For Use With The High Pure System FOR IN VITRO-DIAGNOSTIKK. COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 HCV HPS V2 48 Tests P/N: High Pure System Viral Nucleic Acid Kit 48 Tests P/N: TILTENKT BRUK COBAS TaqMan HCV-test, v2.0 til bruk sammen med High Pure System (HPS) er en in vitro nukleinsyreamplifikasjonstest for kvantitering av hepatitt C-virus (HCV) RNA-genotype 1 til 6 i humant serum eller plasma. Testen bruker High Pure System Viral Nucleic Acid-kit for manuell preparering av prøver og COBAS TaqMan 48-analysator for automatisk amplifikasjon og deteksjon. Testen skal brukes sammen med kliniske funn og andre laboratoriemarkører som hjelp til å følge virusresponsen med antiviral behandling, ved å måle HCV-RNA-nivåer i plasma/serum. Aktuelle studier tyder på at tidlige endringer i HCV-RNA-nivåer i serum/plasma kan forutsi langsiktig prognose av interferonbehandling 1. COBAS TaqMan HCV-test, v2.0 skal ikke brukes som screeningtest av blod eller blodprodukter for forekomst av HCV eller som en diagnostisk test for å bekrefte forekomst av HCV-infeksjon. SAMMENDRAG OG FORKLARING AV TESTEN Hepatitt C-viruset anses å være etiologisk agens og ansvarlig for % av tilfellene av posttransfusjon non-a og non-b hepatitt 2 4. HCV er et enkelttrådet, "positive sense" RNA-virus med et genom som består av ca nukleotider, som koder for 3000 aminosyrer. HCV er et blodbåret virus som kan overføres via blod og blodprodukter. Det er nå svært vanlig med HCV-blodscreening, og dette har redusert risikoen for transfusjonsassosiert hepatitt. Forekomsten av HCV-infeksjon er størst i forbindelse med intravenøst stoffmisbruk og litt mindre ved annen perkutan eksponering 4. Den globale utbredelsen av HCV-infeksjon, vurdert ut fra immunserologi, varierer mellom 1,0 % i Europa til 5,3 % i Afrika 5. Forekomsten av anti-hcv-antistoffer hos pasienter som er smittet med HCV, har ført til utviklingen av immunserologiske prøver som er spesifikke for disse antistoffene. Forekomsten av anti-hcv-antistoffer er imidlertid et mål på tidligere eksponering for HCV-infeksjon, men kan ikke betraktes som en markør for en pågående infeksjon. Det finnes heller ikke direkte deteksjon gjennom virusdyrkning. Måling av alanin aminotransferase-verdier (ALT) regnes også som en surrogatmarkør på HCV-infeksjon, men er ikke et direkte mål på viremi. Graden av ALT-forhøyning kan ikke korreleres direkte til nivået av HCV-infeksjon. ALT kan være forhøyet på grunn av ulike typer leverbetennelse, inkludert, men ikke begrenset til, virushepatitt. Derimot gir deteksjon og kvantitering av HCV-RNA ved hjelp av polymerasekjedereaksjon (PCR) en teknikk for nukleinsyreamplifikasjon et mål på aktiv viremi 6 8. Med PCR-teknikk er det mulig å detektere HCV-viremi før immunologisk serokonversjon 9 10 og detektere forandringer i virusmengden hos antistoffpositive kronisk HCV-smittede pasienter som gjennomgår behandling med interferon 1. TESTPRINSIPP COBAS TaqMan HCV-test, v2.0 er basert på tre hovedprosesser: (1) manuell preparering av prøver for å ekstrahere HCV-RNA; (2) automatisert revers transkripsjon av mål-rna for å produsere komplementært DNA (cdna); (3) PCR-amplifikasjon av mål-cdna med HCV-spesifikke komplementære primere og samtidig deteksjon av splittede dobbel-fluoroformerkede oligonukleotidprober som gir kvantitering av det amplifiserte produktet (amplicon) av mål-hcv. Master Mix-reagens inneholder primerpar og prober som er spesifikke for både HCV-RNA og HCV-kvantiteringsstandard-RNA. Deteksjonen av amplifisert DNA utføres ved å benytte 1

2 målspesifikke og kvantiteringsstandardspesifikke dobbelmerkede oligonukleotidprober som gir uavhengig identifisering av HCV-amplicon og HCV-kvantiteringsstandardamplicon. Kvantiteringen av HCV-virus-RNA utføres ved å benytte HCV-kvantiteringsstandarden. HCV-kvantiteringsstandarden er en ikke-infeksiøs Armored ("pansret") RNA-konstruksjon som inneholder HCV-sekvenser med identiske primerbindingsregioner som mål-hcv-rna, og en unik probebindingsregion som gjør det mulig å skille HCV-kvantiteringsstandardamplicon fra mål-hcv-amplicon. Et kjent kopiantall av HCV-kvantiteringsstandarden tilsettes i hver individuelle prøve- og kontroll, og går gjennom trinnene med prøvepreparering, revers transkripsjon, PCR-amplifikasjon og deteksjon sammen med mål-hcv. COBAS TaqMan 48-analysator beregner HCV-RNA-titer i testprøvene ved å sammenligne HCV-signalene med HCV-kvantiteringsstandardsignalene for hver prøve og kontroll. HCV-kvantiteringsstandarden kompenserer for hemmingseffekter og kontrollerer preparerings- og amplifikasjonsprosessene slik at kvantiteringen av HCV-RNA blir korrekt i hver prøve. Valg av mål Valg av mål-rna-sekvensen for HCV er gjort på bakgrunn av kartlegging av regioner av HCV-genomet som viser maksimal sekvenskonservering mellom de ulike HCV-genotypene 11,12. Den 5' ikke-translaterte regionen av HCV-genomet har vist seg å ha maksimal konservering av RNA-sekvenser mellom kjente HCV-genotyper 13. COBAS TaqMan HCV-test, v2.0 bruker revers transkripsjon og PCR-amplifikasjonprimere som definerer en sekvens i den høyt konserverte 5' ikke-translaterte regionen av HCV-genomet. Prøvepreparering COBAS TaqMan HCV-test, v2.0 bearbeider EDTA-plasma og serumprøver og isolerer HCV-RNA gjennom en generisk manuell prøvepreparering basert på nukleinsyrebinding til glassfiber. HCV-viruspartiklene lyseres gjennom inkubasjon ved en forhøyet temperatur med en protease og kaotropisk lyserings-/bindingsbuffer som frigjør nukleinsyrer og beskytter det frigjorte HCV-RNA fra RNaser i plasma og serum. Et kjent antall HCV-kvantiteringsstandard RNA-molekyler tilsettes hver prøve sammen med lyseringsreagenset. Deretter tilsettes isopropanol til lyseringsblandingen som så sentrifugeres gjennom en kolonne med et glassfiberfilter. Under sentrifugeringen bindes HCV-RNA og HCV-kvantiteringsstandard-RNA til overflaten på glassfiberfilteret. Ubundede substanser, slik som salter, proteiner og andre cellulære forurensninger, fjernes under sentrifugeringen. De adsorberte nukleinsyrene vaskes og elueres med en vandig løsning. Engangsartiklene gjør det mulig med parallell prosessering av 12 prøver eller multipler derav. De bearbeidede prøvene som inneholder HCV-RNA og HCV-kvantiteringsstandard-RNA, tilsettes i amplifikasjons-/deteksjonsblandingen. Mål-HCV-RNA og HCV-kvantiteringsstandard-RNA amplifiseres og detekteres deretter i COBAS TaqMan 48-analysatoren ved hjelp av amplifikasjons- og deteksjonsreagensene som finnes i testkitet. Revers transkripsjon og PCR-amplifikasjon Revers transkripsjon Revers transkripsjon, PCR-amplifikasjon og deteksjonsreaksjoner utføres med det termostabile rekombinante enzymet Thermus specie Z05 DNA Polymerase (Z05). I nærvær av mangan (Mn 2+ ) og under passende bufferforhold, har Z05 både revers transkriptase og DNA-polymeraseaktivitet 14,15. Dermed kan revers transkripsjon, PCR-amplifikasjon og deteksjon forekomme i samme reaksjonsblanding. Bearbeidede prøver tilsettes amplifikasjonsblandingen i amplifikasjonsrør (K-rør) der både revers transkripsjon og PCR-amplifikasjon skjer. Reaksjonsblandingen varmes opp for å gjøre det mulig for en nedstrømsprimer å hybridisere spesifikt til mål-hcv-rna og til HCV-kvantiteringsstandard-RNA. I nærvær av Mn 2+ og deoksynukleotidtrifosfater (dntp) i overskudd, inkludert deoksyadenosin, deoksyguanosin, deoksycytidin og deoksyuridintrifosfater, forlenger Z05-polymerasen den hybridiserte primeren og danner en DNA-tråd (cdna) som er komplementær til mål-rna. Målamplifikasjon Etter revers transkripsjon av mål-hcv-rna og HCV-kvantiteringsstandard-RNA, varmes reaksjonsblandingen opp for å denaturere RNA:cDNA-hybriden og eksponere primermålsekvensene. Når blandingen kjøles ned, hybridiserer oppstrømsprimere spesifikt til cdna-tråden, Z05 forlenger 2

3 primeren, og en ny DNA-tråd syntetiteres. Dette avslutter den første PCR-syklusen og gir en dobbelttrådet DNA-kopi av HCV-RNAs og HCV-kvantiteringsstandard-RNAs målregion. Reaksjonsblandingen varmes opp på nytt for å separere dette dobbelttrådete DNA-et og eksponere primermålsekvensene. Når blandingen kjøles ned, hybridiseres primerne til mål-dna. I nærvær av Mn 2+ og ved dntp i overskudd forlenger Z05 de hybridiserte primerne langs måltemplatene og produserer et dobbelttrådet DNA-molekyl som kalles et amplicon. COBAS TaqMan 48-analysator gjentar denne prosessen automatisk i et bestemt antall sykluser, der hver syklus skal doble mengden amplicon-dna. Ønsket antall sykluser er forhåndsprogrammert i COBAS TaqMan 48-analysator. Amplifikasjonen skjer kun i HCV-genomets region mellom primerne; hele HCV-genomet amplifiseres ikke. Selektiv amplifikasjon Selektiv amplifikasjon av målnukleinsyre fra prøven oppnås i COBAS TaqMan HCV-test, v2.0 ved hjelp av AmpErase (uracil-n-glykosylase)-enzym og deoksyuridintrifosfat (dutp). AmpErase-enzymet gjenkjenner og katalyserer destruksjon av DNA-tråder som inneholder deoksyuridin 16, men ikke DNA som inneholder deoksytymidin. Deoksyuridin finnes ikke i naturlig forekommende DNA, men finnes alltid i amplicon på grunn av bruken av deoksyuridintrifosfat, som en av dntp-ene i Master Mix-reagenset. Det er derfor kun amplicon som inneholder deoksyuridin. Deoksyuridin gjør kontaminerende amplicon følsomme for destruksjon av AmpErase-enzymet forut for amplifisering av mål-rna. I tillegg vil uspesifikke produkter som oppstår etter innledende aktivering av Master Mix med mangan, ødelegges av AmpErase-enzymet og derigjennom økes sensitivitet og spesifisitet. AmpErase-enzymet, som inngår i Master Mix-reagenset, katalyserer nedbrytning av DNA som inneholder deoksyuridin, ved å bryte deoksyuridingruppens deoksyribosekjede ved C1-posisjonen. Ved temperaturøkningen i det første varmetrinnet, brytes amplicon-dna-kjeden der deoksyuridinet finnes, noe som igjen fører til at DNA ikke blir amplifiserbar. AmpErase-enzymet er inaktivt ved temperaturer over 55 ºC, d.v.s. gjennom alle termosykliske trinn, og derfor blir ikke målamplicon som dannes under amplifikasjon ødelagt. Deteksjon av PCR-produkter i COBAS TaqMan -test COBAS TaqMan HCV-test, v2.0 anvender 17,18 sanntids-pcr-teknologi. Bruken av dobbel-fluoroformerkede prober sørger for sanntidsdeteksjon av akkumulert PCR-produkt ved å måle emisjonsintensiteten av rapporteringsfluorescensen som frigjøres under amplifikasjonsprosessen. Probene består av HCV- og HCV-kvantiteringsstandardsspesifikke oligonukleotider merket med en rapporteringsfluorofor og en slukkerfluorofor. I COBAS TaqMan HCV-test, v2.0, er probene for henholdsvis HCV og HCV-kvantiteringsstandard merket med forskjellige rapporteringsfluoroforer. Når de dobbel-fluoroformerkede probene er intakte, undertrykkes rapporteringsfluorescensen på grunn av nærheten til slukkerfluoroforen gjennom energioverføringer av Förster-type. Under PCR hybridiseres proben til en målsekvens og splittes av 5' 3' nukleaseaktivitet hos den termostabile Z05 DNA-polymerasen. Så snart rapporterings- og slukkerfluoroforene er frigjort og separert, forekommer det ikke lenger slukking, og rapporteringsfluoroforens fluorescerensaktivitet øker. Amplifikasjonen av HCV-RNA og HCV-kvantiteringsstandard-RNA måles uavhengig av hverandre og ved ulike bølgelengder. Denne prosessen gjentas et visst antall sykluser, der hver syklus effektivt øker emisjonsintensiteten hos de individuelle rapporteringsfluoroforene og gir en uavhengig identifikasjon av HCV-RNA og HCV-kvantiteringsstandard-RNA. Signalenes intensitet er relatert til mengden utgangsmateriale ved starten på PCR. Grunnleggende informasjon om kvantitering med COBAS TaqMan HCV-test, v2.0 COBAS TaqMan HCV-test, v2.0 gir et nøyaktig kvantitativt resultat i et stort dynamisk område ettersom måling av amplicon utføres under amplifikasjonens eksponentielle fase. Jo høyere HCV-titer i prøven, jo tidligere øker signalet av HCV-proben over fluorescensnivåets baseline (se figur 1). Ettersom mengden av HCV-kvantiteringsstandard (QS) RNA er konstant i alle prøver, skal HCV QS-probens rapporteringsfluorescens bli påvisbar i samme syklus for alle prøver (se figur 2). I tilfeller der QS-amplifikasjon og -deteksjon påvirkes av hemming eller dårlig prøvegjenfinning, vil fluorescensreaksjonen bli forsinket, og dermed blir det mulig å justere beregnet HCV mål-rna-titer tilsvarende. Påvisningen av de spesifikke fluorescenssignalene rapporteres som en kritisk terskelverdi (Ct). Ct defineres som det relative syklusnummeret der rapporteringsfluorescensen overskrider en forhåndsbestemt terskelverdi (det tillagte fluorescens-terskelnivået) og starter begynnelsen på signalets eksponentielle vekstfase (se figur 3). En høyere Ct-verdi indikerer et lavere 3

4 titer av det introduserte mål-hcv-rna. En 2-folds økning av titer korrelerer med en reduksjon på 1 Ct for mål-hcv-rna, mens en 10-folds økning av titer korrelerer med en reduksjon på 3,3 Ct. Figur 1 viser målvekstkurvene for en fortynningsserie av virus som spenner over et område på 5-log 10. Når viruskonsentrasjonen øker, forskyves vekstkurvene mot tidligere sykluser. Derfor tilsvarer vekstkurven lengst til venstre det høyeste virustiternivået, mens vekstkurven helt til høyre tilsvarer det laveste virustiternivået. 45,00 Figur 1 40,00 Normalisert fluorescens 35,00 30,00 25,00 20,00 15,00 Høyeste titer 10,00 5,00 Laveste titer 0, Syklusnummer Figur 2 viser vekstkurvene for kvantiteringsstandarden for prøver fra en fortynningsserie av virus som spenner over et område på 5-log 10. Mengden kvantiteringsstandard som tilsettes hver prøve er konstant for hver reaksjon. Kvantiteringsstandardens Ct-verdi er lik uavhengig av virustiter. 12,00 Figur 2 Normalisert fluorescens 10,00 8,00 6,00 4,00 2,00 Like HCV QS Ct-verdier uavhengig av HCV-titer Laveste titer Høyeste titer 0, Syklusnummer Figur 3 viser et eksempel på hvordan fluorescensverdiene i hver syklus normaliseres for hver vekstkurve. Det relative syklusnummeret (Ct) beregnes når fluorescenssignalet krysser det tillagte fluorescens-terskelnivået. 4

5 Figur 3 2,80 Normalisert fluorescens 2,60 2,40 2,20 2,00 1,80 1,60 1,40 1,20 1,00 Bestemt fluorescens-terskelnivå Ct-verdi = 17,4 KVANTITERING AV HCV-RNA COBAS TaqMan HCV-test, v2.0 kvantiterer HCV-viralt RNA ved å benytte en annen målsekvens (kvantiteringsstandard for HCV) som tilsettes hver prøve i kjent konsentrasjon. HCV-kvantiteringsstandard er en ikke-infeksiøs Armored ("pansret") RNA-konstruksjon som inneholder fragmenter av HCV-sekvenser med primerbindingsregioner som er identiske med dem i mål-hcv-sekvensen. HCV-kvantiteringsstandarden produserer et amplifikasjonsprodukt av samme lengde- og basesammensetning som mål-hcv-rna. HCV-kvantiteringsstandardens deteksjonsprobebindende region er modifisert for å differensiere HCV-kvantiteringsstandardamplicon fra mål-hcv-amplicon. Under PCR-hybridiseringsfasen i COBAS TaqMan 48-analysatoren, blir prøvene belyst og eksitert med filtrert lys, og filtrert emisjonsfluorescensdata registreres for hver prøve. Avlesningene fra hver prøve korrigeres deretter for instrumentvariasjoner. Instrumentet sender disse fluorescensavlesningene til AMPLILINK-programvaren, og de blir lagret i en database. Forhåndsdefinerte kontrollkriterier brukes for å avgjøre om resultatsettene for HCV-RNA og HCV-kvantiteringsstandard-RNA kan aksepteres som valide resultater. Dersom resultatsettene ligger utenfor de forhåndsbestemte akseptkriteriene, vil de bli flagget. Etter at alle forhåndskontroller er fullført og godkjent, behandles fluorescensresultatene for å generere Ct-verdier for HCV-RNA og HCV-kvantiteringsstandard-RNA. De lotspesifikke kalibreringsverdiene som leveres sammen med COBAS TaqMan HCV-test, v2.0 brukes til å beregne titerverdier for prøver og kontroller basert på HCV-RNAs og HCV-kvantiteringsstandard-RNAs Ct-verdier. COBAS TaqMan HCV-test, v2.0 er standardisert i henhold til WHOs Second WHO International Standard for HCV-RNA-NAT-analyser (NIBSC-kode 96/798) 19 og titerresultater rapporteres i internasjonale enheter (IU/ml). REAGENSER High Pure System Viral Nucleic Acid Kit 48 tester High Pure System Viral Nucleic Acid-kit (P/N: ) LYS 2 x 25 ml (Lyserings-/bindingsbuffer) Tris 52 % guanidin-hcl < 1 % urea 20 % triton X-100 Xn 52 % (w/w) guanidin-hcl + Helseskadelig CAR (RNA, lyofilisert) 0, Syklusnummer 2 x 2 mg 5

6 PK (Proteinase K, lyofilisert) + 99 % proteinase K, lyofilisert Xn 99 % proteinase K, lyofilisert Helseskadelig IRB (Buffer for fjerning av hemmere) Tris 65 % guanidin-hcl Xn 65 % (w/w) guanidin-hcl + Helseskadelig WASH (Vaskebuffer) Tris NaCl (tilsett 50 ml etanol og 30 ml deionisert vann) ELB (Elueringsbuffer) RS (Stativ for High Pure System Viral Nucleic Acid-kit) Lyseringsstativ Filterrørstativ med påmontert avfallsstativ Elueringsstativ Stativdeksel Griperedskap WR (Avfallsstativ for High Pure System Viral Nucleic Acid) COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 HCV HPS V2 (P/N: ) Prøveprepareringsreagenser og kontrollreagenser HCV QS (COBAS TaqMan HCV-kvantiteringsstandard) Natriumfosfatbuffer EDTA < 0,005 % Poly ra RNA (syntetisk) < 0,001 % Armored ("pansret") RNA-konstruksjon som inneholder et område med HCV primerbindende sekvenser og en unik probebindende region (ikke-infeksiøs RNA i MS2 bakteriofag) Amarantfarge 0,1 % ProClin 300 konserveringsvæske Xi ProClin inneholder en (3:1) blanding av 5-kloro-2-metyl- 2H-isotiazol-3-en og 2-metyl-2H-isotiazol-3-en Irriterende R43: Kan gi allergi ved hudkontakt. + 2 x 100 mg 1 x 33 ml 1 x 20 ml 1 x 30 ml 4 stk. 8 stk. 48 tester 2 x 1,0 ml 6

7 HCV H(+)C, v2.0 [HCV høy (+) kontroll, v2.0] < 0,001 % Armored ("pansret") RNA-konstruksjon som inneholder HCV-sekvenser (ikke-infeksiøs RNA i MS2 bakteriofag) Negativt humant plasma, ikke-reaktivt ved tester for antistoff mot HCV, antistoff mot HIV-1/2, HIV p24-antistoff og HBsAg; HIV-1-RNA, HCV-RNA og HBV-DNA ikke detekterbart med PCR-metoder. 0,1 % ProClin 300 konserveringsvæske Xi ProClin inneholder en (3:1) blanding av 5-kloro-2-metyl- 2H-isotiazol-3-en og 2-metyl-2H-isotiazol-3-one Irriterende R43: Kan gi allergi ved hudkontakt. + HCV L(+)C, v2.0 [HCV lav (+) kontroll, v2.0] < 0,001 % Armored ("pansret") RNA-konstruksjon som inneholder HCV-sekvenser (ikke-infeksiøs RNA i MS2 bakteriofag) Negativt humant plasma, ikke-reaktivt ved tester for antistoff mot HCV, antistoff mot HIV-1/2, HIV p24-antistoff og HBsAg; HIV-1-RNA, HCV-RNA og HBV-DNA ikke detekterbart med PCR-metoder. 0,1 % ProClin 300 konserveringsvæske Xi ProClin inneholder en (3:1) blanding av 5-kloro-2-metyl- 2H-isotiazol-3-en og 2-metyl-2H-isotiazol-3-en Irriterende R43: Kan gi allergi ved hudkontakt. + CTM ( ) C [COBAS TaqMan negativ kontroll (humant plasma)] Negativt humant plasma, ikke-reaktivt ved tester for antistoff mot HCV, antistoff mot HIV-1/2, HIV p24-antistoff og HBsAg; HIV-1-RNA, HCV-RNA og HBV-DNA ikke detekterbart med PCR-metoder. 0,1 % ProClin 300 konserveringsvæske Xi ProClin inneholder en (3:1) blanding av 5-kloro-2-metyl- 2H-isotiazol-3-en og 2-metyl-2H-isotiazol-3-en Irriterende R43: Kan gi allergi ved hudkontakt. + Amplifikasjons- og deteksjonsreagenser HCV MMX (COBAS TaqMan HCV Master Mix) Tricinbuffer Kaliumhydroksid Kaliumacetat < 20 % dimetylsulfoksid Glyserol < 0,001 % datp, dctp, dgtp, dutp < 0,001 % oppstrøms- og nedstrømsprimere til den 5'-ikke translaterte HCV-regionen < 0,001 % fluoroformerkede oligonukleotidprober spesifikke for HCV og HCV-kvantiteringsstandard < 0,05 % Z05 DNA-polymerase (mikrobiell) < 0,1 % AmpErase (uracil-n-glykosylase)-enzym (mikrobiell) 0,09 % natriumazid 2 x 1,0 ml 2 x 1,0 ml 4 x 1,0 ml 2 x 24 tester 2 x 1,4 ml 7

8 CTM Mn 2+ (COBAS TaqMan manganløsning) < 1,2 % manganacetat Isedikk 0,09 % natriumazid 2 x 24 tester 2 x 1,0 ml ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER A. FOR BRUK TIL IN VITRO-DIAGNOSTIKK. B. Denne testen er ikke tiltenkt å brukes som en screeningtest for forekomst av HCV i blod og blodprodukter eller som en diagnostisk test for å bekrefte forekomst av HCV-infeksjon. C. Kalibreringskoeffisientenes tillagte verdier er lotspesifikke og spesifikke for COBAS TaqMan HCV-test, v2.0 til bruk sammen med High Pure System. Verdienes gyldighet kan ikke uten videre overføres ved bruk av alternative metoder for preparering av prøvemateriale. D. Testen er validert for prøvematerialene humant EDTA-plasma og humant serum. E. Ikke pipetter med munnen. F. Ikke spis, drikk eller røyk i laboratoriets arbeidsområder. Bruk beskyttende engangshansker, laboratoriefrakk og vernebriller når du håndterer prøver og reagenser. Vask hendene nøye etter håndtering av prøver og reagenser. G. Unngå mikrobiell kontaminering og ribonukleasekontaminering av reagensene når du pipetterer ut porsjoner fra reagensflasker. H. Bruk av sterile engangspipetter og RNase-frie pipettespisser anbefales. I. Reagenser fra ulike lot eller ulike flasker fra samme lot må ikke blandes sammen. J. Reagenser fra ulike kit må ikke blandes. K. Kast ubrukte reagenser, avfall og prøver i henhold til nasjonalt, regionalt og lokalt regelverk. L. Kit som er utgått på dato må ikke brukes. M. Dataark om materialsikkerhet (MSDS) kan sendes på forespørsel fra ditt lokale Roche-kontor. N. Prøver og kontroller må håndteres som smittebærende, og sikre laboratorierutiner må følges. Disse er beskrevet i Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 20 og CLSI-dokumentet M29-A3 21. Rengjør og desinfiser alle arbeidsoverflater nøye med en fersk løsning av 0,5 % natriumhypokloritt i deionisert eller destillert vann. Merk: Kommersielt tilgjengelig blekemiddel til husholdningsbruk inneholder normalt natriumhypokloritt med en konsentrasjon på 5,25 %. En fortynning i forholdet 1:10 med et slikt blekemiddel gir en 0,5 % natriumhypoklorittløsning. O. ADVARSEL: CTM ( ) C, HCV L(+)C, v2.0 og HCV H(+)C, v2.0 inneholder humant plasma utskilt fra humant blod. Kildematerialet er testet og har vist seg å være ikke-reaktivt for hepatitt B overflateantigen (HBsAg), antistoffer mot HIV-1/2 og HCV og HIV p24 antigen. Testing av negativt humant plasma med PCR-metoder viste ikke detekterbart HIV-1-RNA, HCV-RNA eller HBV-DNA. Ingen kjente testmetoder kan fullstendig garantere at produkter fra humant blod ikke vil kunne overføre infeksiøse agens. Derfor må alt humant materiale betraktes som potensielt infeksiøst. CTM ( ) C; HCV L(+)C, v2.0 og HCV H(+)C, v2.0 bør håndteres som smittebærende, og sikre laboratorierutiner må følges, som beskrevet i Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 20 og CLSI-dokumentet M29-A3 21. Rengjør og desinfiser alle arbeidsoverflater nøye med en nylaget løsning av 0,5 % natriumhypokloritt i deionisert eller destillert vann. P. HCV MMX og CTM Mn 2+ inneholder natriumazid. Natriumazid kan reagere med bly- og kobberrør og danne svært eksplosive metallazider. Hvis løsninger som inneholder natriumazid helles i avløp i laboratoriet, må de skylles ned med store mengder vann for å unngå azidoppbygging. Q. Bruk vernebriller, laboratoriefrakk og engangshansker ved håndtering av reagenser. Unngå kontakt med hud, øyner eller slimhinner. Skyll umiddelbart med mye vann hvis en slik kontakt oppstår. Hvis kontaktstedet ikke blir behandlet, kan det oppstå brannskade. Fortynn med vann før du tørker opp eventuelt søl fra disse reagensene. 8

9 OPPBEVARING OG HÅNDTERING Prøveprepareringsreagenser A. Oppbevar High Pure Systems Viral Nucleic Acid-reagenser ved ºC etter leveranse. B. Oppbevar elueringsbuffer (ELB) og lyserings-/bindingsbuffer (LYS) ved C. Når de åpnes, skal ELB og LYS oppbevares ved C. Åpnet ELB og LYS må brukes innen 28 dager eller før holdbarhetsdatoen utløper, avhengig av hva som kommer først. C. Etter at elueringsbuffer (ELB) er tilsatt for å rekonstituere carrier-rna og proteinase K, må ubrukt rekonstituert carrier-rna (CAR) og ubrukt rekonstituert proteinase K (PK) oppbevares ved -15 til -25 ºC. Etter rekonstituering må carrier-rna og proteinase K brukes innen 28 dager eller før utløpsdato, avhengig av hva som kommer først. D. Etter at etanol er tilsatt i buffer for fjerning av hemmere og etanol og vann er tilsatt i vaskebufferen, skal buffer for fjerning av hemmere (IRB) og vaskebuffer (WASH) oppbevares ved ºC. Disse arbeidsløsningene er stabile i 28 dager eller til utløpsdato, avhengig av hva som kommer først. E. Arbeidsløsning av lyserings-/bindingsbufferen [lyserings-/bindingsbuffer tilsatt carrier-rna, proteinase K og HCV QS] må brukes umiddelbart etter tillaging. Eventuelt overskudd må kastes. Amplifikasjons- og deteksjonsreagenser A. Ikke frys reagenser eller kontroller. B. HCV MMX; CTM ( ) C; HCV L(+)C, v2.0; HCV H(+)C, v2.0; HCV QS og CTM Mn 2+ skal oppbevares ved 2 8 ºC. Når disse reagensene er uåpnet, er de stabile til utløpsdato. Når de åpnes for avpipettering av en reagensporsjon til en analyseserie på 12 prøver, må resterende HCV MMX; HCV L(+)C, v2.0; HCV H(+)C, v2.0; HCV QS og CTM Mn 2+ oppbevares ved 2 8 ºC. Så snart de er åpnet, er HCV MMX; HCV L(+)C, v2.0; HCV H(+)C, v2.0; HCV QS og CTM Mn 2+ stabile ved 2 8 C i 28 dager eller til utløpsdato, avhengig av hva som kommer først. Etter åpning må alle ubrukte deler av CTM ( ) C kastes. C. Working Master Mix (tillages ved tilsetting av CTM Mn 2+ til HCV MMX) må lagres på et mørkt sted ved 2 8 ºC. Preparerte prøver og kontroller må tilsettes innen 1 time fra tidspunktet Working Master Mix ble klargjort. D. Preparerte prøver og kontroller er stabile i opptil 3 timer ved C, opptil 24 timer ved 2 8 C eller fryst ved -20 C i opptil 1 uke. E. Amplifikasjon må startes innen 2 timer fra det tidspunktet de preparerte prøvene og kontrollene er tilsatt i Working Master Mix. MATERIELL SOM MEDFØLGER Prøveprepareringsreagenser A. High Pure System Viral Nucleic Acid Kit High Pure System Viral Nucleic Acid-kit (P/N: ) LYS (Lyserings-/bindingsbuffer) CAR (Carrier-RNA) PK (Proteinase K) IRB (Buffer for fjerning av hemmere) WASH (Vaskebuffer) ELB (Elueringsbuffer) RS (Stativ for High Pure System Viral Nucleic Acid-kit) WR (Avfallsstativ for High Pure System Viral Nucleic Acid-kit) 9

10 Amplifikasjons- og deteksjonsreagenser B. COBAS TaqMan HCV Test, v2.0 HCV HPS V2 (P/N: ) HCV QS (COBAS TaqMan HCV-kvantiteringsstandard) HCV H(+)C, v2.0 [HCV høy (+) kontroll, v2.0] HCV L(+)C, v2.0 [HCV lav (+) kontroll, v2.0] CTM ( ) C [COBAS TaqMan negativ kontroll (humant plasma)] HCV MMX (COBAS TaqMan HCV Master Mix) CTM Mn 2+ (COBAS TaqMan manganløsning) MATERIELL SOM KREVES, MEN SOM IKKE MEDFØLGER Instrumentering og programvare COBAS TaqMan 48-analysator AMPLILINK software Datastasjon for AMPLILINK-programvaren Instrumentmanualen for COBAS TaqMan 48-analysatoren for bruk sammen med AMPLILINK Software,Version Series eller instrumentmanualen for COBAS TaqMan 48-analysatoren for bruk sammen med applikasjonsmanualen for AMPLILINK Software, Version 3.2 Series. Applikasjonsmanualen for AMPLILINK Software Version 3.1 Series for bruk sammen med COBAS AmpliPrep-instrumentet, COBAS TaqMan -analysatoren og applikasjonsmanualen for COBAS TaqMan 48-analysatoren eller AMPLILINK Software Version 3.2 Series for bruk sammen med COBAS AmpliPrep-instrumentet, COBAS TaqMan -analysatoren, COBAS TaqMan 48-analysatoren og COBAS AMPLICOR -analysatoren. K-rør åpner/lukker Engangsartikler K-rør, eske med 12 x 96 Sentrifugekrav Sigma 4 15 C bordsentrifuge eller tilsvarende mikrotiterplatesentrifuge som yter en sentrifugalkraft på 4600 x g Sigma-sentrifuge med utsvingende rotor P/N: (inkluderer 2 sentrifugeinnsatser, P/N: og 2 plateholdere P/N: 17978) eller tilsvarende. MATERIELL SOM KREVES, MEN SOM IKKE MEDFØLGER Isopropanol (> 99 %) som oppfyller ACS-spesifikasjonene eller bedre Etanol ( %) som oppfyller ACS-spesifikasjonene eller bedre Deionisert vann Justerbare pipetter*: (kapasitet 250 µl og 1000 µl) med aerosolbarriere eller positive displacement RNase-frie spisser Pipette: Drummond (P/N: ) eller tilsvarende Vannbad ved 50 C (± 2 C) Varmeblokk ved 70 C (± 2 C) Sterile serologiske pipetter for engangsbruk: 5, 10 og 25 ml Sterile koniske rør av polypropylen; 15 ml og 50 ml: Corning (P/N: og P/N: ) eller tilsvarende 10

11 Sterile 2,0 ml mikrosentrifugerør: Sarstedt (P/N: ) eller tilsvarende Vortexmikser Rørstativ Engangshansker, uten pudder Kalibrerte termometre for vannbad og varmeblokk * Pipettene må ha 3 % nøyaktighet for angitt volum. Aerosolbarriere eller positive displacement RNase-frie spisser må brukes der dette er angitt for å hindre krysskontaminering mellom prøver og amplicon. PRØVETAKING, TRANSPORT OG OPPBEVARING Merk: Alle prøver må behandles som om de er potensielt smittebærende. A. Prøvetaking COBAS TaqMan HCV-test, v2.0 skal kun brukes for serum- eller plasmaprøver. Blodprøver må tas i BD SST serumseparatorrør eller sterile rør med EDTA som antikoagulant. Oppbevar fullblod ved 2 25 C i maks. 6 timer. Følg rørprodusentens anvisninger for separering av serum eller plasma fra fullblod innen 6 timer etter prøvetaking. Overfør serum eller plasma til et sterilt polypropylenrør. Figur 4 og 5 viser data fra disse prøvetakingsstudiene. Studiene ble utført med bruk av COBAS AMPLICOR HCV MONITOR-test, versjon 2.0 (v2.0). Figur 4 HCV-stabilitet i fullblod; SST-rør (serum) Gjennomsnittlig HCV-RNA-resultat Log 10 HCV-RNA (IU/ml) Prøvenummer < 1 time 2 8 C 6 timer 2 8 C 24 timer 2 8 C 48 timer 2 8 C 72 timer 2 8 C < 1 time C 6 timer C 24 timer C 48 timer C 72 timer C Figur 5 HCV-stabilitet i fullblod; EDTA-rør (EDTA-plasma) Gjennomsnittlig HCV-RNA-resultat Log 10 HCV-RNA (IU/ml) < 1 time 2 8 C 6 timer 2 8 C 24 timer 2 8 C 48 timer 2 8 C 72 timer 2 8 C < 1 time C 6 timer C 24 timer C 48 timer C 72 timer C Prøvenummer 11

12 B. Transport av prøver Transport av fullblod, serum eller plasma må skje i henhold til nasjonalt, regionalt og lokalt regelverk for transport av biologisk materiale 22. Fullblod må transporteres ved 2 25 C og behandles innen 6 timer etter prøvetaking. Plasma eller serum kan transporteres ved 2 8 C eller nedfrosset ved -20 C til -80 C. C. Oppbevaring av prøver Serum- eller plasmaprøver kan oppbevares ved 2 8 C i opptil 3 dager eller i frossen tilstand ved -70 C eller kaldere. Det er anbefalt at prøvene oppbevares i like porsjoner à µl i sterile 2,0 ml polypropylenrør med skrukork (for eksempel Sarstedt P/N: ). Figur 6 og 7 viser data fra disse prøvelagringsstudiene. Studiene ble utført med bruk av COBAS AMPLICOR HCV MONITOR-test, v2.0. Figur 6 HCV-stabilitet i serum < 1 time 2 8 C 72 timer 2 8 C 120 timer 2 8 C 168 timer 2 8 C 240 timer 2 8 C < 1 time C 72 timer C 120 timer C 168 timer C 240 timer C Gjennomsnittlig HCV-RNA-resultat Log 10 HCV-RNA (IU/ml) Prøvenummer Figur 7 HCV-stabilitet i EDTA-plasma Gjennomsnittlig HCV-RNA-resultat Log 10 HCV-RNA (IU/ml) Prøvenummer < 1 time 2 8 C 72 timer 2 8 C 120 timer 2 8 C 168 timer 2 8 C 240 timer 2 8 C < 1 time C 72 timer C 120 timer C 168 timer C 240 timer C Serum- og plasmaprøver kan fryses ned og tines opptil tre ganger uten tap av HCV-RNA. Tabell 1 viser data fra fryse-tine-studier som ble utført med COBAS AMPLICOR HCV MONITOR-test, v

13 BRUKSANVISNING Merk: Merk: Merk: Merk: Tabell 1 Log 10 differanser i HCV-konsentrasjoner vs. syklus 0 for serum og EDTA-plasma, fryst og tint i 5 sykluser Matriks Stabilitet Fryse-tine-syklus Prøvenr. Syklus 0 Syklus 1 Syklus 2 Syklus 3 Syklus 4 Syklus 5 1 0,00-0,052 0,238 0,179-0,670-0, ,00 0,293 0,228-0,206-0,338 0,175 Serum 3 0,00-0,270-0,023-0,430 0,008-0, ,00 0,071-0,516-0,295-0,564-0, ,00 0,342-0,031-0,344-0,436-0,277 Gjennomsnitt serum 0,00 0,077-0,021-0,239-0,400-0, ,00-0,006 0,043-0,143-0,159-0, ,00-0,329-0,375-0,234-0,642-0,265 EDTAplasma 13 0,00-0,056-0,248-0,371-0,395-0, ,00 0,186-0,066-0,034-0,241-0, ,00-0,120-0,111-0,055 0,250-0,217 Gjennomsnitt EDTA-plasma 0,00-0,065-0,151-0,167-0,237-0,170 For mer detaljert informasjon, utskrift av resultater, kommentarer og feilmeldinger, se (1) instrumentmanualen for COBAS TaqMan 48-analysatoren for bruk sammen med AMPLILINK Software, Version Series og applikasjonsmanualen for AMPLILINK Software, Version 3.1 Series for bruk sammen med COBAS AmpliPrep-instrumentet, COBAS TaqMan -analysatoren og COBAS TaqMan 48-analysatoren eller (2) instrumentmanualen for COBAS TaqMan 48-analysatoren for bruk sammen med applikasjonsmanualen for AMPLILINK Software, Version 3.2 Series og applikasjonsmanualen for AMPLILINK Software Version 3.2 Series for bruk sammen med COBAS AmpliPrep-instrumentet, COBAS TaqMan -analysatoren, COBAS TaqMan 48-analysatoren og COBAS AMPLICOR -analysatoren. Alle amplifikasjons- og deteksjonsreagenser må ha romtemperatur før bruk. Ta dem ut fra kjølelagringen på 2 8 C, minst 30 minutter før bruk. Serum- og plasmaprøver må stå minutter i romtemperatur før bruk. Bruk pipetter med aerosolbarriere eller positive displacement -spiss der dette er angitt. Vær svært forsiktig og varsom for å unngå kontaminering. Størrelse på analyseserier: Hvert kit inneholder reagenser som er tilstrekkelig for fire analyseserier à 12 tester. Disse kan utføres separat eller simultant. Ett replikat hver av CTM ( ) C, HCV L(+)C, v2.0 og HCV H(+)C, v2.0 må inngå i hver analyseserie bestående av opptil 24 prøver og kontroller (se avsnittet om kvalitetskontroll). Amplifikasjons- og deteksjonsreagenser foreligger i forpakninger à 24 tester som kan brukes to ganger. For å få en mest mulig effektiv bruk av reagenser bør prøver og kontroller kjøres i analyseserier bestående av et antall som er multipler av 12. Prøve- og kontrollpreparering Merk: Ved bruk av frosne serum- eller plasmaprøver må prøvene stå i romtemperatur til de er helt tinte og deretter vortexes i 5 10 sekunder før bruk. Merk: La reagensene oppnå romtemperatur før du fortsetter. Forvarm varmeblokk(er) til 70 C (± 2 C) og vannbad til 50 C (± 2 C) før du starter opprensningsreaksjonene. 13

14 A. Tillaging av reagenser Merk: Gjør klar arbeidsløsningen av lysering-/bindingsbufferen først etter at alle prøvene og kontrollene er romtemperert i minutter. 1. Gjør klar buffer for fjerning av hemmere ved å pipettere 20 ml % etanol og tilsette i buffer for fjerning av hemmere (IRB). Blandes ved å vende opp-ned 5 10 ganger. Dette gir rekonstituert buffer for fjerning av hemmere tilstrekkelig for 48 tester. 2. Gjør klar vaskebufferen ved å pipettere 50 ml % etanol og 30 ml deionisert vann og tilsett i vaskebufferen (WASH). Blandes ved å vende opp-ned 5 10 ganger. Dette gir rekonstituert vaskebuffer tilstrekkelig for 48 tester. 3. Forvarm elueringsbufferen (ELB) ved 70 C (± 2 C) i et 2,0 ml mikrosentrifugerør med skrukork. Flere rør kan brukes. Elueringsvolumet per prøve er 75 µl. Forvarm volumet angitt i tabellen under, i forhold til antall tester. Antall replikater Reagens Elueringsbuffer (ml) 2,0 4,0 4. Pipetter det volumet isopropanol som angis i tabellen nedenfor, i forhold til antall tester, i et rent og sterilt rør. Antall replikater Reagens Isopropanol (ml) 5,0 10,0 5. Tilsett 0,5 ml elueringsbuffer (ELB) i carrier-rna (CAR). Sett på korken, vend flasken og vortex til alt carrier-rna er rekonstituert. Denne mengden rekonstituert carrier-rna er tilstrekkelig til 24 tester. Ubrukt rekonstituert carrier-rna kan oppbevares ved -15 til -25 C i opptil 28 dager eller til utløpsdato, avhengig av hva som kommer først. 6. Tilsett 5,0 ml elueringsbuffer (ELB) i proteinase K (PK). Sett på korken, vend flasken og vortex til all proteinase K er rekonstituert. Denne mengden proteinase K er tilstrekkelig til 24 tester. Ubrukt proteinase K kan oppbevares ved -15 til -25 C i opptil 28 dager eller til utløpsdato, avhengig av hva som kommer først. 7. Gjør klar arbeidsløsningen av lyserings-/bindingsbufferen (LYS) på følgende måte ved å pipettere volumet som er angitt i følgende tabell i forhold til antall prøver og kontroller som skal behandles. Antall replikater Reagenser Lyserings-/bindingsbuffer (ml) 7,0 14,0 Carrier-RNA (µl) HCV QS (µl) Proteinase K (ml) 1,4 2,8 Merk: Volumet HCV QS er spesifikt for COBAS TaqMan HCV-test, v2.0. Merk: Hvis frosset rekonstituert carrier-rna eller proteinase K skal brukes, må de tines ved romtemperatur og vendes opp-ned flere ganger før bruk. Tilsett angitt volum av lyserings-/bindingsbuffer til et rent og sterilt 50 ml rør. Tilsett angitt volum av rekonstituert carrier-rna (CAR) til røret som inneholder lyserings-/ bindingsbufferen. Vortex HCV QS i 3 5 sekunder og tilsett angitt volum av HCV QS i røret som inneholder lyserings-/bindingsbufferen og rekonstituert carrier-rna. Sett korken på røret og bland ved å vende røret opp-ned ganger. IKKE vortex røret da oppstår det skum i løsningen. 14

15 Tilsett angitt volum av rekonstituert proteinase K til røret som inneholder lyserings-/ bindingsbufferen. Sett korken på røret og bland ved å vende røret opp-ned ganger. IKKE vortex røret da oppstår det skum i løsningen. Pipetter ut arbeidsløsningen av lyserings-/ bindingsbufferen umiddelbart etter at proteinase K er tilsatt og blandet med lyserings-/ bindingsbufferen. Ubrukt lyserings-/bindingsbuffer (LYS) kan oppbevares ved 15 til 25 C i opptil 28 dager eller til utløpsdato, avhengig av hva som kommer først. Ubrukt arbeidsløsning av lyserings-/bindingsbufferen må kastes. B. Prøve- og kontrollpreparering Merk: Justerbare pipetter og pipettespisser med aerosolbarriere anbefales for denne prosedyren. Merk: En multistep-pipette og sterile kombispisser av passende størrelse kan benyttes for trinn 19 og 22. Det bør imidlertid utvises stor forsiktighet for å unngå reagenssøl og krysskontaminering. 1. Pipetter 625 µl av lyserings-/bindingsbuffer-arbeidsløsning i hver brønn i lyseringsstativet (I, gjennomsiktig). Trykk ned lokkene så brønnene tildekkes. 2. Åpne en brønn om gangen, pipetter 500 µl med prøve eller kontroll i riktig brønn. Etter tilsetning av hver enkelt prøve eller kontroll, trykker du på det tilhørende lokket til det klikkes på plass og brønnen stenges. 3. Etter at alle prøvene og kontrollene er tilsatt, blandes innholdet ved å vortexe det fylte lyseringsstativet i cirka 10 sekunder. Kontroller visuelt at alle brønner er vortexet og godt blandet. 4. Inkuber lyseringsstativet i et vannbad forvarmet til 50 C (± 2 C) i 10 minutter. Plasser lyseringsstativet i et vannbad som er fylt med en vanndybde på cirka 5 7 cm. Tørk lyseringsstativet etter at det er tatt opp fra vannbadet. 5. Sentrifuger lyseringsstativet i mikrotiterplatesentrifugen ved 4600 x g i sekunder. Det kan hende at sentrifugen ikke oppnår innstilt hastighet. 6. Åpne én brønn om gangen og pipetter 250 µl isopropanol i hver brønn. Etter hver tilsetning trykker du på lokket til det klikkes på plass og brønnen stenges. Merk: Volumet av isopropanol er spesifikt for COBAS TaqMan HCV-test, v Bland prøvene ved å vende stativet opp-ned tre ganger og deretter vortexe stativet i cirka 10 sekunder. Kontroller visuelt at alle brønner er vortexet og godt blandet. 8. Sentrifuger lyseringsstativet i mikrotiterplatesentrifugen ved 4600 x g i sekunder. Det kan hende at sentrifugen ikke oppnår innstilt hastighet. 9. Åpne en brønn om gangen, og overfør 750 µl prøve- eller kontrollblanding til de korresponderende brønnene på filterrørstativet (II, gul) med påmontert avfallsstativ (hvit). Etter at hver prøve- eller kontrollblanding er tilsatt, trykker du på lokket til det klikkes på plass og brønnen stenges. 10. Etter at alle prøvene eller kontrollene er tilsatt, sentrifugeres filterrørstativet i mikrotiterplatesentrifugen ved 4600 x g i 2 minutter. 11. Åpne en brønn om gangen, og overfør resterende prøve- eller kontrollblanding til de korresponderende brønnene i filterrørstativet. Når samtlige prøve- eller kontrollblandinger er tilsatt, trykkes lokket godt på. Kast lyseringsstativet på forskriftsmessig måte. 12. Sentrifuger filterrørstativet i mikrotiterplatesentrifugen ved 4600 x g i 2 minutter. 13. Løsne filterrørstativet fra avfallsstativet ved å trykke ned begge sneppertlåsene på oversiden av filterrørstativet. Kast avfallsstativet. Erstatt dette med et nytt avfallsstativ, og fest filterrørstativet på avfallsstativet. 14. Åpne alle lokkene på filterrørstativet med griperedskapet, og pipetter 400 µl av buffer for fjerning av hemmere (IRB) langs siden av hver brønn. Ikke berør sidene på brønnen. Etter at buffer for fjerning av hemmere er tilsatt alle brønnene, må lokkene lukkes godt. 15. Sentrifuger filterrørstativet i mikrotiterplatesentrifugen ved 4600 x g i 2 minutter. 15

16 16. Åpne alle lokkene med griperedskapet, og pipetter 700 µl vaskebuffer (WASH) langs siden på hver brønn. Ikke berør sidene på brønnen. Etter at vaskebuffer er tilsatt alle brønnene, må lokkene stenges godt. 17. Sentrifuger filterrørstativet i mikrotiterplatesentrifugen ved 4600 x g i 2 minutter. 18. Løsne filterrørstativet fra avfallsstativet ved å trykke ned begge sneppertlåsene på oversiden av filterrørstativet. Kast avfallsstativet. Erstatt dette med et nytt avfallsstativ, og fest filterrørstativet på avfallsstativet. 19. Åpne alle lokkene med griperedskapet, og pipetter 700 µl vaskebuffer langs siden på hver brønn. Ikke berør sidene på brønnen. Etter at vaskebuffer er tilsatt alle brønnene, må lokkene stenges godt. 20. Sentrifuger filterrørstativet i mikrotiterplatesentrifugen ved 4600 x g i 3 minutter. 21. Løsne filterrørstativet fra avfallsstativet ved å trykke ned begge sneppertlåsene på oversiden av filterrørstativet. Plasser filterrørstativet på elueringsstativet (IIIA, blå), og klikk på plass filterrørstativet på elueringsstativet. Kast avfallsstativet på forskriftsmessig måte. 22. Åpne alle lokkene med griperedskapet, og pipetter 75 µl av den forhåndsoppvarmede elueringsbufferen (ELB) midt på hvert filter uten å berøre filteret. Merk: Ikke tilsett elueringsbuffer ved å avsette den langs brønnens side. Etter at elueringsbuffer er tilsatt alle brønnene, må lokkene stenges godt. Inkuber elueringsstativet ved romtemperatur i minst 3 minutter etter at elueringsbuffer er tilsatt den siste brønnen. 23. Sentrifuger filterrørstativet i mikrotiterplatesentrifugen ved 4600 x g i 3 minutter. 24. Løsne filterørstativet fra elueringsstativet ved å trykke ned begge sneppertlåsene på oversiden av filterrørstativet. Kast filterrørstativet på forskriftsmessig vis. 25. Plasser stativdekselet (IIIB, blå) på elueringsstativet (IIIA, blå). Trykk sneppertlåsene godt ned på elueringsstativet. Steng alle lokk. 26. De preparerte prøvene og kontrollene brukes direkte for PCR. Bruk 50 µl av de preparerte prøvene og kontrollene for amplifikasjon. Tilsett de preparerte prøvene og kontrollene til Working Master Mix innen 3 timer fra fullført preparering av prøver og kontroller. Hvis man ikke kan amplifisere de preparerte prøvene og kontrollene innen 3 timer etter preparering, kan de oppbevares ved 2 8 C i opptil 24 timer i tildekket elueringsstativ, eller frosne ved -20 C i opptil 1 uke i sterile 2,0 ml polypropylenrrør med skrukork (for eksempel Sarstedt P/N: ). Etter at de preparerte prøvene og kontrollene er tilsatt Working Master Mix, må de amplifiseres innen 2 timer. Revers transkripsjon, amplifikasjon og deteksjon Merk: K-rørstativ og holderen for K-rørstativ må tørkes av med en lofri klut fuktet med 70 % isopropanolløsning. C. Tillaging av reagenser Merk: COBAS TaqMan HCV Master Mix (HCV MMX)-, "Working Master Mix"- (Working MMX) samt preparerte prøver og kontroller er lyssensitive. Beskytt disse reagensene fra lys. Merk: COBAS TaqMan HCV Master Mix (HCV MMX) og COBAS TaqMan manganløsning (CTM Mn 2+ ) må stå i romtemperatur i minst 30 minutter før Working Master Mix gjøres klar. Merk: Gjør klar Working MMX etter at preparering av prøver og kontroller er fullført. Merk: Working MMX må brukes innen 1 time etter tillaging. Merk: Når preparerte prøver og kontroller er tilsatt Working MMX, må amplifikasjonen startes innen 2 timer. 1. La en flaske HCV MMX og en flaske CTM Mn 2+ stå i romtemperatur i minst 30 minutter. 2. Plasser et K-rørstativ i holderen for K-rørstativ. 3. Plasser nye K-rør i K-rørstativet uten å berøre sidene på K-rørene. Merk: Hvis det er færre enn 24 rør som skal analyseres, må posisjonene 1, 2, 5, 20, 23 og 24 benyttes for å balansere K-rørstativet i termoblokken. 16

17 4. Ta av lokkene ved hjelp av verktøyet for K-rør åpning/lukking. Plasser lokkene i oppbevaringsbeholderen for lokk til K-rør. 5. Klargjør Working MMX på følgende måte: For 24 tester tilsettes 170 µl CTM Mn 2+ til en flaske HCV MMX. Sett korken på flasken og bland ved å vende opp-ned 10 ganger. Ikke vortex Working MMX. Working MMX må beskyttes mot lys og brukes innen 1 time. For 12 tester, ta ut 669 µl HCV MMX og plasser i et 2 ml rør. Tilsett 81 µl CTM Mn 2+ til 2 ml røret som inneholder HCV MMX. Sett lokk på røret og bland godt ved å vende opp-ned 10 ganger. Working MMX må beskyttes mot lys og brukes innen 1 time. Oppbevar resten av det ubrukte HCV MMX og CTM Mn 2+ i originalflaskene ved 2 8 C. Etter åpning er HCV MMX og CTM Mn 2+ holdbare i 28 dager ved 2 8 C eller til utløpsdato, avhengig av hva som kommer først. Merk: Volumet av CTM Mn 2+ er spesifikt for COBAS TaqMan HCV-test, v Pipetter 50 µl Working MMX til hvert K-rør. Merk: Hvis preparerte prøver og kontroller har vært oppbevart i frossen tilstand før amplifikasjonen, må de tines i romtemperatur og blandes godt før du fortsetter med trinn Tilsett 50 µl av hver preparerte prøve og kontroll til det aktuelle K-røret som inneholder Working MMX, ved hjelp av en mikropipette med aerosolbarriere eller positive displacement -spiss. Bland hver prøve eller kontroll med mikropipetten ved å trekke prøve-/reagensblandingen tre ganger opp og ned uten å generere bobler. 8. Gjenta trinn 7 for hver preparerte prøve og kontroll til alle er overført til K-rørene. Bruk en ny spiss for hver prøve og kontroll. Inspiser visuelt at det ikke finnes bobler. Fjern dem ved behov. Steng lokkene på K-rørene ved hjelp av åpne-/lukkeverktøyet for K-rør. Verifiser visuelt at korrekt volum er tilsatt i alle K-rør. 9. Amplifikasjonen må startes innen 2 timer fra det tidspunktet da de preparerte prøvene og kontrollene ble tilsatt K-rørene med Working MMX. D. Oppstart av COBAS TaqMan 48-analysatoren 1. Slå på arbeidsstasjonens datamaskin, og logg deg på Windows XP med aktuelt bruker-id og passord. 2. Slå på COBAS TaqMan 48-analysatoren. Kontroller at instrumentet initialiseres og er klart til bruk. Hvis K-carriers fra tidligere analyseserier fortsatt befinner seg i noen av termoblokkene, må de fjernes ved hjelp av løfteverktøyet for K-carrier. 3. Åpne programvaren AMPLILINK på datamaskinen. Logg deg på med aktuell bruker-id og aktuelt passord. 4. Klikk på Orders-ikonet for å opprette testbestillinger for K-rørstativet for prøvene som skal analyseres. Velg fliken Sample, og klikk deretter på knappen New. Legg inn bestillingsnummeret for hver prøve ved hjelp av tastaturet eller strekkodeleseren. Velg testdefinisjonen for COBAS TaqMan HCV-test, v2.0. Gjenta denne prosedyren for hver prøve. Klikk på knappen Save (lagre). Merk: Hvis det er færre enn 24 rør som skal analyseres, må posisjonene 1, 2, 5, 20, 23 og 24 benyttes for å balansere K-rørstativet i termoblokken. 5. Angi informasjon for kvalitetskontroller ved å velge fliken Quality Control i vinduet Orders. Klikk på New-knappen og legg inn informasjon fra kontrollverdikortet for COBAS TaqMan HCV-test, v2.0 som følger med kitet, ved hjelp av tastaturet eller strekkodeleseren. Angi lotnummer, utløpsdato, akseptgrenser for lav (+) og høy (+) kontroll for COBAS TaqMan HCV-test, v2.0 i tillegg til lotspesifikke kalibreringskoeffisienter i de angitte feltene. Klikk på "OK". 6. Legg inn oppsettets K-rørstativnummer ved å klikke på fliken K-Carrier i vinduet Orders. Klikk på New i vinduet K-Carrier. Angi K-rørstativnummeret fra strekkoden på K-rørstativet i feltet til høyre for "K-Carrier ID" ved hjelp av tastaturet eller strekkodeleseren. Merk at resultatene fra et tidligere oppsett med samme K-rørstativ-ID må godkjennes først. Velg testdefinisjon for COBAS TaqMan HCV-test, v.2.0 fra testpanelet nederst i vinduet. 17

18 7. Velg den første raden i kolonnen Type (T) i Worklist. Marker dette feltet for å åpne rullegardinsmenyen. Velg deretter ønsket kontrolltype. Dobbeltklikk i feltet Sample ID på samme rad. Vinduet LookUp Control vises med alle tilgjengelige kontroller. Når kontrollen er valgt, vises de tilhørende kalibrerings- og kontrollverdiene i informasjonspanelet nede til høyre. Gjenta denne prosedyren for alle kontroller det er behov for. 8. For å legge til prøver i Worklist, dobbeltklikker du på den første posisjonen (raden) for innlegging av prøver. Da vises vinduet Lookup Sample som inneholder tildelte prøvebestillinger. Bruk Shift + Pil-taster for å markere mer enn ett bestillingsnummer. Kontroller at alle bestillinger er tildelt testdefinisjonen for COBAS TaqMan HCV-test, v Klikk på Save for å lagre bestillingen for K-rørstativet. E. Revers transkripsjon, amplifikasjon og deteksjon 1. Velg ikonet Systems på fliken System. Klikk på Open for å åpne termoblokken. Når dekselet på termoblokken har åpnet seg helt og "Ready to Load" vises i vinduet Systems, løfter du opp og holder lokket til termoblokken åpent. Ved hjelp av løfteverktøyet for K-rørstativ kan du overføre K-rørstativet som inneholder de lukkede K-rørene med Working Master Mix, prøver og kontroller til termoblokken. Lukk lokket på termoblokken. 2. Bekreft at testdefinisjonsfilen HCVHP2 er lastet inn for dette oppsettet. Klikk på Start i vinduet Systems under TC-ikonet for å lukke dekselet på termoblokken og starte analysen. 3. Revers transkripsjon, amplifikasjon og deteksjon utføres automatisk av COBAS TaqMan 48-analysator. RESULTATER Kalkulering av resultater COBAS TaqMan 48-analysator bestemmer automatisk HCV-RNA-titer for prøven eller kontrollen. HCV-RNA-titer uttrykkes i internasjonale enheter (IU)/ml i samsvar med WHOs Second International Standard for HCV-RNA-NAT-analyser (NIBSC-kode 96/798) 19. COBAS TaqMan 48-analysator: Bestemmer syklusens terskelverdi (Ct) for HCV-RNA og HCV-kvantiteringsstandard-RNA. Bestemmer HCV-RNA-titer basert på Ct-verdiene for HCV-RNA og HCV-kvantiteringsstandard-RNA og de lotspesifikke kalibreringskoeffisientene. Kontrollerer at det beregnede IU/ml titer for HCV L(+)C, v2.0 og HCV H(+)C, v2.0 faller innenfor de tillagte akseptgrensene. Validering av analyseserien For å sikre at analyseserien er gyldig, sjekk i AMPLILINK-resultatvinduet eller på utskriften om det finnes flagg og kommentarer. Analyseserien er gyldig hvis det ikke vises noen flagg for COBAS TaqMan HCV-kontrollene. Analyseserien er ikke gyldig hvis noen av de følgende flaggene vises for COBAS TaqMan HCV-kontroller: Negativ kontroll: HCV lav positiv kontroll: Flagg Resultat Tolkning _N_NC_INVALID Invalid Et ugyldig resultat eller et "gyldig" resultat som ikke var negativt for mål-hcv Flagg Resultat Tolkning _L_LPCINVALID < 2.50E+01 IU/mL Kontroll under akseptområdet Target Not Detected Et numerisk titer, X.XXE+XX IU/mL 18 Kontroll under akseptområdet Kontroll utenfor akseptområdet > 3.91E+08 IU/mL Kontroll over akseptområdet Invalid Et ugyldig resultat