cobas PIK3CA Mutation Test PIK3CA

Transkript

1 cobas PIK3CA Mutation Test cobas DNA Sample Preparation Kit DNA SP 24 Tests P/N: cobas PIK3CA Mutation Test PIK3CA 24 Tests P/N: TESTPRINSIPPER cobas PIK3CA mutasjonstest er en sanntids PCR-test som kun skal brukes til forskning (RUO-test), for kvalitativ deteksjon og identifikasjon av mutasjoner i ekson 1, 4, 7, 9 og 20 i fosfoinositid-3-kinase, katalytisk, alfa-gen (PIK3CA) i DNA utskilt fra formalinfiksert, parafininnstøpt humant vev (FFPET). Prøvene behandles med cobas DNA prøveprepareringskit for manuell prøvepreparering og cobas z 480-analysatoren for automatisert amplifikasjon og deteksjon. cobas PIK3CA mutasjonstest er basert på to hovedprosesser: (1) manuell prøvepreparering for å isolere genomisk DNA fra FFPET; og (2) PCR-amplifikasjon og deteksjon av mål-dna ved bruk av komplementære primerpar og oligonukleotidprober merket med fluorofor. Testen er utformet for å detektere R88Q i ekson 1, N345K i ekson 4, C420R i ekson 7, E542K, E545X (E545A, E545D*, E545G og E545K), Q546X (Q546E, Q546K, Q546L og Q546R) i ekson 9 og M1043I, H1047X (H1047L, H1047R og H1047Y) og G1049R i ekson 20 når den prosentvise mutasjonen er 5 % eller høyere. Mutasjon detekteres ved hjelp av PCR-analyse med cobas z 480-analysatoren. En mutantkontroll og en negativ kontroll er inkludert i hver analyseserie for å bekrefte gyldigheten av analyseserien. Prøvepreparering FFPET-prøver behandles og genomisk DNA isoleres ved bruk av cobas DNA-prøveprepareringskit, en generisk, manuell prøvepreparering basert på nukleinsyrebinding til glassfibre. Et deparafinisert 5 μm-snitt av en FFPET-prøve lyseres ved inkubasjon ved forhøyet temperatur med en protease og kaotropisk lyserings-/bindingsbuffer som frigjør nukleinsyrer og beskytter det frigjorte genomiske DNA fra DNaser. Deretter tilsettes isopropanol til lyseringsblandingen, som så sentrifugeres gjennom en kolonne med et glassfiberfilter. Under sentrifugering bindes det genomiske DNA til overflaten på glassfiberfilteret. Ubundne substanser, slik som salter, proteiner og andre cellulære forurensninger, fjernes under sentrifugeringen. De adsorberte nukleinsyrene vaskes og elueres deretter med en vandig løsning. Mengden genomisk DNA bestemmes spektrofotometrisk og justeres til en fast konsentrasjon som skal tilsettes amplifikasjons-/deteksjonsblandingen. Mål-DNA blir deretter amplifisert og detektert i cobas z 480-analysatoren ved bruk av amplifikasjons- og deteksjonsreagensene som følger med cobas PIK3CA mutasjonstestkitet. PCR-amplifikasjon Valg av mål cobas PIK3CA mutasjonstestkit bruker en pool av primere som definerer spesifikke baseparsekvenser som er fra 85 til 155 basepar lange i PIK3CA-eksonene 1, 4, 7, 9 og 20. Et ekstra primerpar er rettet mot en konservert 167-basepars region i ekson 3 i PIK3CA-genet for å sikre full prosesskontroll av prøveadekvans, ekstraksjon og amplifikasjon. Amplifikasjonen skjer kun i PIK3CA-genets region mellom primerne. Hele PIK3CA-genet amplifiseres ikke. Målamplifikasjon Et derivat av Thermus species Z05-AS1 DNA-polymerase brukes til målamplifikasjon. PCR-reaksjonsblandingen varmes først opp for å denaturere det genomiske DNA og eksponere primermålsekvensene. Når blandingen kjøles ned, hybridiseres oppstrøms- og nedstrømsprimere til mål-dna-sekvensene. I nærvær av divalent metallion og dntp i overskudd forlenger Z05-AS1 DNA-polymerase hver hybridiserte primer, og en ny DNA-tråd syntetiseres. Dette avslutter den første PCR-syklusen, og gir en dobbelttrådet DNA-kopi som inkluderer basepar-målregionene av PIK3CA-genet. Denne prosessen gjentas i et bestemt antall sykluser, der hver syklus effektivt dobler mengden amplicon-dna. * For E545D-aminosyresubstitusjonen blir kun nukleotidsubstitusjonen c.1635g>t-mutasjon detektert av testen. For M1043I-aminosyresubstitusjonen blir kun nukleotidsubstitusjonen c.3129g>t-mutasjon detektert av testen. Avsnittet med informasjon om dokumentrevisjon er plassert ved slutten av dette dokumentet NO 1 Doc Rev. 1.0

2 Automatisk sanntidsdeteksjon av mutasjon cobas PIK3CA mutasjonstest anvender sanntids PCR-teknologi. Hver målspesifikke oligonukleotidprobe i reaksjonen er merket med et rapporteringsfluorofor og et slukkerfluorofor, som absorberer (slukker) fluorescensutstrålingene fra rapporteringsfluoroforet i en intakt probe. Under hver amplifikasjonssyklus bindes prober som er komplementære til den enkelttrådete DNA-sekvensen i ampliconet, og blir deretter splittet av 5' til 3'-nukleaseaktiviteten til Z05-AS1 DNA-polymerasen. Så snart rapporteringsfluoroforet er separert fra slukkerfluoroforet av denne nukleaseaktiviteten, kan fluorescens med en karakteristisk bølgelengde måles når rapporteringsfluoroforet eksiteres av riktig lysspektrum. Fire ulike rapporteringsfluoroforer brukes til å detektere mutasjonene som er målet for testen. Amplifikasjon av PIK3CA-sekvensene, som er målet for testen, detekteres uavhengig over tre reaksjoner ved å måle fluorescensen ved de fire karakteristiske bølgelengdene i dedikerte optiske kanaler. Selektiv amplifikasjon Selektiv amplifikasjon av målnukleinsyre fra prøven oppnås i cobas PIK3CA mutasjonstesten ved bruk av AmpErase-enzymet (uracil- N-glykosylase) og deoksyuridintrifosfat (dutp) 1. AmpErase-enzymet gjenkjenner og katalyserer destruksjon av DNA-tråder som inneholder deoksyuridin, men ikke DNA som inneholder tymidin. Deoksyuridin finnes ikke i naturlig forekommende DNA, men finnes alltid i amplicon på grunn av bruken av dutp i tillegg til deoksytymidin-trifosfat som en av nukleotidtrifosfatene i Master Mixreagensene. Det er derfor kun amplicon som inneholder deoksyuridin. Deoksyuridin gjør kontaminerende amplicon mottakelig for destruksjon ved hjelp av AmpErase-enzymet forut for amplifikasjon av mål-dna. AmpErase-enzymet, som inngår i Master Mixreagensene, katalyserer nedbrytningen av DNA som inneholder deoksyuridin, ved å bryte deoksyuridingruppens deoksyribosekjede ved C1-posisjonen. Ved temperaturøkning i det første varmetrinnet ved alkalisk ph brytes amplicon-dna-kjeden der deoksyuridinet finnes, noe som igjen fører til at DNA ikke lenger er amplifiserbart. AmpErase-enzymet er inaktivt ved temperaturer over 55 C, dvs. gjennom alle termosykliske trinn, og derfor blir ikke målamplicon ødelagt. REAGENSER (materiell som medfølger) cobas DNA Sample Preparation Kit cobas DNA-prøveprepareringskit (P/N: ) DNA TLB (DNA-vevslyseringsbuffer) PK (Proteinase K) Proteinase K (lyofilisert) Xn Proteinase K DNA SP 24 tester 1 x 10 ml 1 x 100 mg Helseskadelig DNA PBB (DNA-parafinbindingsbuffer) Xn 49,6 % (vekt per vekt) guanidin-hcl 1 x 10 ml Helseskadelig WB I (DNA vaskebuffer I) Xn 64 % (vekt per vekt) guanidin-hcl 1 x 25 ml Helseskadelig NO 2 Doc Rev. 1.0

3 WB II (DNA-vaskebuffer II) DNA EB (DNA-elueringsbuffer) FT (Filterrør med kork) CT (Oppsamlingsrør) cobas PIK3CA Mutation Test (P/N: ) PIK3CA (PIK3CA Master Mix 1, lokk med hvitt merke) PIK3CA (PIK3CA Master Mix 2, lokk med gullfarget merke) PIK3CA (PIK3CA Master Mix 3, lokk med blågrønt merke) MGAC (Magnesiumacetat, lokk med gult merke) PIK3CA MC (PIK3CA mutantkontroll, lokk med rødt merke) DNA SD (DNA-prøvefortynningsløsning) PIK3CA 1 x 12,5 ml 1 x 6 ml 1 x 25 stk. 3 x 25 stk. 24 tester 2 x 0,48 ml 2 x 0,48 ml 2 x 0,48 ml 6 x 0,2 ml 6 x 0,1 ml 2 x 3,5 ml ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER A. Kun for bruk til forskning. Skal ikke brukes til diagnostiske prosedyrer. B. Denne testen skal brukes til FFPET-prøver. C. Ikke pipetter med munnen. D. Det må ikke spises, drikkes eller røykes i laboratoriets arbeidsområder. E. Unngå mikrobiell kontaminering og DNA-kontaminering av reagenser. F. Kast ubrukte reagenser og avfall i henhold til nasjonalt, regionalt og lokalt regelverk. G. Bruk ikke kit etter utløpsdatoen, og bruk ikke kit som ikke har vært riktig oppbevart. H. Reagenser fra ulike kit eller lot må ikke slås sammen. I. Hansker må brukes, og de må byttes mellom håndtering av prøver og reagenser for å unngå kontaminering. J. For å unngå at Working Master Mix (Working MMX, dvs. etter tilsetning av MGAC i MMX) kontamineres med DNA-prøver, skal amplifikasjon og deteksjon utføres i et annet område enn der det utføres DNA-isolering. Arbeidsområdet der det utføres amplifikasjon og deteksjon, skal være fullstendig rengjort før tillaging av Working Master Mix. For å sikre tilstrekkelig rengjøring skal alle overflater, inkludert stativ og pipetter, tørkes grundig med en 0,5 % natriumhypoklorittløsning og deretter med en 70 % etanolløsning NO 3 Doc Rev. 1.0

4 K. DNA PBB og WB I inneholder guanidinhydroklorid. Hvis væske som inneholder denne bufferen søles, må du rengjøre med passende laboratorierengjøringsmiddel og vann. Hvis det søles væske med potensielt infeksiøse agens, rengjør det affiserte området først med laboratorierengjøringsmiddel og vann, og deretter med 0,5 % natriumhypokloritt*. Hvis det søles på cobas z 480-analysatoren, følg instruksjonene i instrumentmanualen for cobas z 480-analysatoren. *MERK: Kommersielt tilgjengelig blekemiddel til husholdningsbruk inneholder normalt natriumhypokloritt med en konsentrasjon på 5,25 %. En fortynning i forholdet 1:10 med et slikt blekemiddel gir en 0,5 % natriumhypoklorittløsning. L. Prøver må håndteres som smittebærende, og sikre laboratorierutiner må følges. Disse er beskrevet i Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 2 og CLSI-dokumentet M29-A3 3. M. DNA TLB og DNA PBB inneholder Triton X-100, som irriterer slimhinnene. Unngå kontakt med øyne, hud og slimhinner. N. DNA TLB, DNA EB, MGAC, PIK3CA, PIK3CA, PIK3CA, PIK3CA MC og DNA SD inneholder natriumazid. Natriumazid kan reagere med bly- og kobberrør og danne svært eksplosive metallazider. Hvis løsninger som inneholder natriumazid, helles ned i avløp i laboratoriet, må de skylles ned med store mengder kaldt vann for å unngå opphopning av azider. O. Xylen er et farlig kjemikalium og skal brukes i et kjemikaliekabinett. Kastes i beholderen for kjemisk avfall i samsvar med lokalt, nasjonalt og regionalt regelverk. P. Bruk vernebriller, laboratoriefrakk og engangshansker ved håndtering av reagenser. Unngå kontakt med hud, øyne og slimhinner. Skyll umiddelbart med store mengder vann hvis slik kontakt oppstår. Hvis kontaktstedet ikke blir behandlet, kan det oppstå brannskade. Fortynn med vann før du tørker opp eventuelt søl. Q. Alt forbruksmateriell er laget for bare å brukes én gang. Skal ikke gjenbrukes. R. Bruk ikke forbruksmateriell etter utløpsdato. S. Bruk ikke natriumhypoklorittløsning (klormiddel) til å rengjøre cobas z 480-analysatoren. Rengjør cobas z 480-analysatoren i samsvar med prosedyrene som er beskrevet i instrumentmanualen for cobas z 480-analysatoren. T. Prøver og/eller reagenser skal ikke overføres fra én mikrobrønnplate til en annen, for å unngå risiko for kontaminasjon. U. For ytterligere advarsler, forholdsregler og prosedyrer for å redusere risikoen for kontaminasjon av cobas z 480-analysatoren henvises det til instrumentmanualen for cobas z 480-analysatoren. V. Bruk av sterile engangspipetter og DNase-frie pipettespisser anbefales. OPPBEVARING OG HÅNDTERING A. Med unntak av det rekonstituerte PK-reagenset, skal ikke reagenser fryses. B. Oppbevar DNA TLB, DNA PBB, WB I, WB II, DNA EB, PK, FT og CT ved 15 til 30 C. Når de er åpnet, er DNA TLB, DNA PBB, WB I, WB II, DNA EB og PK stabile for bruk opptil 8 ganger over 90 dager eller til utløpsdato, avhengig av hva som kommer først. C. Etter at sterilt, nukleasefritt vann er tilsatt til PK, oppbevar ubrukt rekonstituert PK i alikvoter på 450 μl ved -20 C. Når det er rekonstituert, skal PK brukes innen 90 dager eller før utløpsdatoen, avhengig av hva som kommer først. D. Etter at absolutt etanol er tilsatt, skal WB I og WB II oppbevares ved 15 til 30 C. Disse arbeidsløsningene er stabile i opptil 90 dager eller til utløpsdato, avhengig av hva som kommer først. E. Oppbevar MGAC, PIK3CA, PIK3CA, PIK3CA, PIK3CA MC og DNA SD ved 2 til 8 C. Når disse reagensene er åpnet, er de stabile for bruk opptil 4 ganger over 90 dager eller til utløpsdato, avhengig av hva som kommer først. F. PIK3CA, PIK3CA, PIK3CA og Working MMX (tillages ved tilsetting av MGAC til PIK3CA eller PIK3CA eller PIK3CA ) skal beskyttes mot langvarig eksponering for lys NO 4 Doc Rev. 1.0

5 G. Oppbevar Working MMX mørkt og ved romtemperatur. Preparerte prøver og kontroller må tilsettes innen 1 time fra tidspunktet Working Master Mix ble tillaget. H. Behandlede prøver (ekstrahert DNA) er stabile i inntil 24 timer ved 15 til 30 C, i opptil 14 dager ved 2 til 8 C, i opptil 60 dager ved -15 til -25 C og etter 3 fryse-tine-sykluser ved oppbevaring ved -15 til -25 C. Ekstrahert DNA skal amplifiseres innen anbefalte oppbevaringsperioder eller før utløpsdatoen for cobas DNA-prøveprepareringskitet som brukes til å ekstrahere DNA, avhengig av hva som kommer først. I. Amplifikasjon må startes innen 1 time fra det tidspunktet da de behandlede prøvene og kontrollene er tilsatt i Working Master Mix (tillages ved å tilsette MGAC til PIK3CA eller PIK3CA eller PIK3CA ). MATERIELL SOM KREVES, MEN SOM IKKE MEDFØLGER Xylen (Sigma-Aldrich, kat.nr eller Thermo Fisher Scientific, kat.nr. X5-4 eller tilsvarende) Absolutt etanol (Sigma-Aldrich, kat.nr. E7023 eller Thermo Fisher Scientific, kat.nr. BP eller tilsvarende) Isopropanol (Sigma-Aldrich, kat.nr eller Thermo Fisher Scientific, kat.nr. A451-1 eller tilsvarende) Sterilt vann, nukleasefritt vann med PCR-kvalitet (Life Technologies, kat.nr. AM9937 eller Thermo Fisher Scientific, kat.nr. SH eller tilsvarende) Sterile serologiske pipetter for engangsbruk: 5 og 25 ml Mikrobrønnplate (AD-plate) og forseglingsfilm (Roche P/N ) for cobas 4800-systemet Forseglingsfilmapplikator for cobas 4800 (Roche P/N ) Justerbare pipetter* (kapasitet 10 μl, 20 μl, 200 μl og 1000 μl) med aerosolbarriere- eller "positive displacement" DNase-frie spisser Pipettefyller (Drummond P/N: eller tilsvarende) Bordmikrosentrifuge som kan yte 8000 x g og til x g (Eppendorf 5417C eller tilsvarende)** To (2) varmeblokker med kapasitet til å varme opp mikrosentrifugerør til 56 C og 90 C** 1,5 ml Safe-Lock-mikrosentrifugerør, sterile, RNase/DNase-frie, PCR-kvalitet (Eppendorf, kat.nr ) Nanodrop UV-Vis spektrofotometer (Thermo Fisher Scientific ND-1000 eller ND-2000)** Vortexmikser** Stativer for mikrosentrifugerør Engangshansker, pudderfrie Kalibrerte termometere for varmeblokk** Vannbad** som kan opprettholde 37 C Enegget knivblad eller lignende * Pipettene må vedlikeholdes i samsvar med produsentens instruksjoner og ha en nøyaktighet innenfor 3 % av angitt volum. Aerosolbarrierespisser eller "positive displacement" DNase-frie spisser må brukes der dette er angitt, for å hindre krysskontaminering av prøver og amplicon. ** Alt utstyr må vedlikeholdes i samsvar med produsentens instruksjoner NO 5 Doc Rev. 1.0

6 Instrumentering og programvare cobas z 480-analysatoren cobas 4800 SR2-systemets kontrollenhet med OSXP-bilde cobas 4800 SR2-systemets programvareversjon 2.0 eller høyere PIK3CA-analyseringspakke, programvareversjon 1.0 eller høyere Strekkodeleser USB-utg. Skriver PRØVETAKING, -TRANSPORT OG -OPPBEVARING MERK: Alle prøver må behandles som om de er potensielt smittebærende. A. Prøvetaking FFPET-prøver kan brukes med cobas PIK3CA mutasjonstest. B. Prøvetransport FFPET-prøver kan transporteres ved 15 til 30 C. Transport av FFPET-prøver må skje i henhold til nasjonalt, regionalt og lokalt regelverk for transport av biologisk materiale. 4 C. Prøveoppbevaring FFPET-prøver kan oppbevares ved 15 til 30 C i inntil 12 måneder etter prøvetakingsdatoen. 5 μm-snitt kan oppbevares ved 15 til 30 C i opptil 60 dager. BRUKSANVISNING MERK: Kun FFPET-snitt med en tykkelse på 5 μm med minst 10 % tumorinnhold per område skal brukes i cobas PIK3CA mutasjonstesten. Prøver med mindre enn 10 % tumorinnhold per område skal makrodissikeres etter deparafinisering. MERK: Se instrumentmanualen for cobas z 480-analysatoren for detaljert bruksanvisning for cobas z 480-analysatoren. MERK: Varmeblokker med kapasitet til å varme opp mikrosentrifugerør skal slås på og settes på 56 C og 90 C. Størrelse på analyseserier En enkelt analyseserie kan inkludere fra 1 til 30 prøver (pluss kontroller) per 96-brønns mikrobrønnplate. Hvis mer enn 24 prøver analyseres, må det brukes flere cobas PIK3CA mutasjonstestkit for samme lot. cobas PIK3CA mutasjonstest inneholder tilstrekkelig med reagenser for 8 analyseserier av 3 prøver (pluss kontroller) for maksimalt 24 prøver per kit. Arbeidsflyt cobas PIK3CA mutasjonstesten består av manuell prøvepreparering ved bruk av cobas DNA prøveprepareringskit etterfulgt av amplifikasjon/deteksjon på cobas z 480-analysatoren ved bruk av cobas PIK3CA mutasjonstestkit NO 6 Doc Rev. 1.0

7 Tillaging av reagenser A. Rekonstituer proteinase K (PK) ved å tilsette 4,5 ml sterilt, nukleasefritt vann (PCR-kvalitet) til flasken ved å bruke en steril 5-ml serologisk engangspipette. Blandes ved å vende flasken opp-ned 5 til 10 ganger. Avpipetter 450 μl rekonstituert PK til 1,5 ml Safe-Lock-mikrosentrifugerør og oppbevar ved -20 C. Hvis proteinase K allerede er rekonstituert og fryst, tin opp et tilstrekkelig antall alikvoter til å behandle det antall prøver som skal kjøres før deparafinisering (70 μl med rekonstituert PK er nødvendig for hver prøve). B. Alle løsninger som er lagret ved C, skal være klare. Hvis det forekommer bunnfall i noen av reagensene, varm opp løsningen i et vannbad på 37 C til bunnfallet løses opp. Må ikke brukes før alt bunnfall er oppløst. C. Tillag aktiv DNA-vaskebuffer I (WB I) ved å tilsette 15 ml absolutt etanol til flasken med WB I. Blandes ved å vende flasken opp-ned 5 til 10 ganger. Skriv på flasken at etanol er tilsatt, og noter datoen. Oppbevar aktiv WB I ved 15 C til 30 C. D. Tillag aktiv DNA-vaskebuffer II (WB II) ved å tilsette 50 ml absolutt etanol til flasken med WB II. Blandes ved å vende flasken opp-ned 5 til 10 ganger. Skriv på flasken at etanol er tilsatt, og noter datoen. Oppbevar aktiv WB II ved 15 C til 30 C. Deparafinisering av FFPET-snitt montert på objektglass MERK: Xylen er et farlig kjemikalium. Alle trinn for deparafinisering skal utføres i et kjemikaliekabinett. Se "Advarsler og forholdsregler". A. Legg et objektglass med et montert FFPET-snitt på 5 μm i en beholder med tilstrekkelig xylen til å dekke vevet, og bløtlegg i 5 minutter. B. Overfør objektglasset til en beholder med tilstrekkelig absolutt etanol til å dekke vevet. Bløtlegg i 5 minutter. C. Fjern objektglasset fra etanolen og la snittet lufttørke helt (5 til 10 minutter). D. Utfør makrodisseksjon hvis prøven inneholder mindre enn 10 % tumorinnhold per område. E. Merk ett 1,5-ml Safe-Lock-mikrosentrifugerør for hver prøve med prøveidentifikasjon. F. Tilsett 180 μl DNA TLB til 1,5-ml Safe-Lock-mikrosentrifugerøret. G. Tilsett 70 μl rekonstituert PK til Safe-Lock-mikrosentrifugerøret som inneholder DNA TLB. H. Skrap vevet av objektglasset og inn i Safe-Lock-røret. Senk vevet ned i blandingen med DNA TLB/PK. I. Forsett med Trinn A i prosedyren for DNA-isolering. Deparafinisering av FFPET-snitt som ikke er montert på objektglass MERK: Xylen er et farlig kjemikalium. Alle trinn for deparafinisering skal utføres i et kjemikaliekabinett. Se "Advarsler og forholdsregler". MERK: Hvis prøven har mindre enn 10 % tumorinnhold per område, må snittet monteres på et objektglass for makrodisseksjon. Følg prosedyren som er beskrevet i "Deparafinisering av FFPET-snitt montert på objektglass". A. Plasser ett FFPET-snitt på 5 μm i et 1,5-ml Safe-Lock-mikrosentrifugerør merket med prøveidentifikasjonen for hver prøve. B. Tilsett 500 μl xylen til Safe-Lock-mikrosentrifugerøret som inneholder FFPET-snittet. C. Bland godt ved å vortexe i 10 sekunder. D. La røret stå i 5 minutter ved 15 C til 30 C. E. Tilsett 500 μl absolutt etanol og bland ved å vortexe i 10 sekunder. F. La røret stå i 5 minutter ved 15 C til 30 C. G. Sentrifuger ved x g til x g i 2 minutter. Fjern supernatanten uten å røre pelleten. Kast supernatanten i beholderen for kjemisk avfall NO 7 Doc Rev. 1.0

8 H. Tilsett 1 ml absolutt etanol og vortex i 10 sekunder. I. Sentrifuger ved x g til x g i 2 minutter. Fjern supernatanten uten å røre pelleten. Kast supernatanten i beholderen for kjemisk avfall. MERK: Hvis pelleten flyter i den gjenværende supernatanten, sentrifuger på nytt i 1 minutt ved x g til x g. Fjern eventuell gjenværende supernatant. J. Tørk vevspelleten i 10 minutter ved 56 C i en varmeblokk med røret åpent. MERK: Kontroller at etanolen er helt fordampet og at pelleten er tørr før du går videre til neste trinn. MERK: Ved behov kan tørre pellets oppbevares i inntil 24 timer ved 2 C til 8 C. K. Resuspender vevspelleten i 180 μl DNA-vevslyseringsbuffer (DNA TLB). L. Tilsett 70 μl rekonstituert PK. M. Forsett med Trinn A i prosedyren for DNA-isolering. PRØVEPREPARERING Prosedyre for DNA-isolering MERK: Tillag en negativ kontroll samtidig med prøven(e). Tillag den negative kontrollen ved å kombinere 180 μl DNAvevslyseringsbuffer (DNA TLB) og 70 μl PK-løsning i et 1,5-ml Safe-Lock-mikrosentrifugerør merket NEG CT. Den negative kontrollen skal behandles ved å følge samme prosedyre som for prøvene. A. Vortex rørene med blandingen av prøve/dna TLB/PK og blandingen med negativ kontroll (NEG CT) i 30 sekunder. MERK: Vevet må være fullstendig nedsenket i blandingen av DNA TLB/PK. B. Plasser rørene i varmeblokken på 56 C og inkuber i 60 minutter. C. Vortex rørene i 10 sekunder. MERK: Vevet må være fullstendig nedsenket i blandingen av DNA TLB/PK. D. Plasser rørene i varmeblokken på 90 C og inkuber i 60 minutter. MERK: Under inkuberingen, klargjør nødvendig antall filterrør (FT) med hengslede lokk ved å plassere filterrørene i et oppsamlingsrør (CT) og merke hvert FT-lokk med riktig prøve- eller kontrollidentifikasjon. MERK: Hver prøve trenger 1 FT, 3 CT og 1 elueringsrør (1,5 ml mikrosentrifugerør). MERK: Under inkubering, merk nødvendig antall med elueringsrør (1,5 ml mikrosentrifugerør) med riktig prøve- eller kontrollidentifikasjon. E. La rørene kjøles til 15 C 30 C. Etter kjøling, pulssentrifuger rørene for å samle opp væske fra lokkene. F. Tilsett 200 μl DNA PBB til hvert rør og bland ved å pipettere opp og ned 3 ganger. G. Inkuber rørene ved 15 C 30 C i 10 minutter. H. Tilsett 100 μl isopropanol til hvert rør og bland lysatet ved å pipettere opp og ned 3 ganger. I. Overfør hvert lysat til den riktig merkede FT/CT-enheten. J. Sentrifuger FT/CT-enhetene ved 8000 x g i 1 minutt NO 8 Doc Rev. 1.0

9 K. Plasser hver FT i en ny CT. Kast væskeinnholdet i den gamle CTen i beholder for kjemisk avfall, og kast den brukte CTen i henhold til gjeldende forskrifter. L. Tilsett 500 μl aktit WB I til hver FT. MERK: Tillaging av aktiv WB I er beskrevet i avsnittet "Tillaging av reagenser". M. Sentrifuger FT/CT-enhetene ved 8000 x g i 1 minutt. N. Kast væskeinnholdet i hver CT i beholderen for kjemisk avfall. Plasser FTen tilbake i samme CT. O. Tilsett 500 μl aktiv WB II til hver FT. MERK: Tillaging av aktiv WB II er beskrevet i avsnittet "Tillaging av reagenser". P. Sentrifuger FT/CT-enhetene ved 8000 x g i 1 minutt. Q. Plasser hver FT i en ny CT. Kast væskeinnholdet i den gamle CTen i beholder for kjemisk avfall, og kast den brukte CTen i henhold til gjeldende forskrifter. R. Sentrifuger FT/CT-enhetene ved til x g i 1 minutt for å tørke filtermembranene. S. Plasser hver FT i et elueringsrør (1,5 ml mikrosentrifugerør) som er merket med prøve- eller kontrollidentifikasjon. Kast væskeinnholdet i den gamle CTen i beholder for kjemisk avfall, og kast den brukte CTen i henhold til gjeldende forskrifter. T. Tilsett 100 μl DNA EB i sentrum av hver FT-membran uten å berøre FT-membranen. U. Inkuber FT med elueringsrøret ved 15 C til 30 C i 5 minutter. V. Sentrifuger FT med elueringsrøret ved 8000 x g i 1 minutt for å samle eluat i elueringsrøret. Kast brukt FT i henhold til gjeldende forskrifter. W. Lukk lokket på elueringsrøret. Elueringsrøret inneholder nå DNA-stokkløsningen. Gå videre til Trinn A i avsnittet DNA-kvantitering. MERK: Måling av DNA-konsentrasjonen skal utføres straks etter prosedyren for DNA-isolering, og før oppbevaring. DNA-kvantitering: A. Bland hver DNA-stokkløsning ved å vortexe i 5 sekunder. B. Kvantiter DNA ved å bruke et Nanodrop UV-Vis spektrofotometer (ND-1000 eller ND-2000) i samsvar med produsentens protokoll. Bruk DNA EB som blank for instrumentet. Gjennomsnittlig to etterfølgende avlesninger er påkrevd. De to målingene skal være innenfor ± 10 % av hverandre når de avleste DNA-konsentrasjonene er 20,0 ng/μl. For avleste DNAkonsentrasjoner < 20,0 ng/μl skal de to målingene være innenfor ± 2 ng/μl. Hvis de to målingene ikke er innenfor ± 10 % av hverandre når de avleste DNA-konsentrasjonene er 20,0 ng/μl eller innenfor ± 2 ng/μl når de avleste DNA-konsentrasjonene er < 20,0 ng/μl, må det tas ytterligere 2 avlesninger før kravene er oppfylt. Gjennomsnittet av disse to nye målingene skal da beregnes. MERK: DNA-stokkløsningen fra den behandlede negative kontrollen (NEG CT) trenger ikke måles. C. Konsentrasjonen til DNA-stokkløsningen fra prøvene må være 2 ng/μl for at cobas PIK3CA mutasjonstesten skal kunne utføres. Tre amplifikasjoner/deteksjoner kjøres per prøve, og det benyttes 25 μl av en 2 ng/μl-fortynning av DNA-stokkløsningen (50 ng DNA totalt) for hver amplifikasjon/deteksjon NO 9 Doc Rev. 1.0

10 MERK: Hver DNA-stokkløsning må ha en minimumskonsentrasjon på 2 ng/μl for at cobas PIK3CA mutasjonstesten skal kunne utføres. Hvis konsentrasjonen av en DNA-stokkløsning er < 2 ng/μl, skal prosedyrene for deparafinisering, DNA-isolering og DNA-kvantitering gjentas for den aktuelle prøven ved bruk av to FFPET-snitt på 5 μm. For monterte prøver, etter deparafinisering, kombiner vevet fra begge snittene i ett rør, nedsenk vevet i DNA TLB + PK, og utfør DNA-isolering og kvantitering som beskrevet ovenfor. For umonterte prøver, kombiner to snitt i ett rør, nedsenk vevet i DNA TLB + PK, og utfør DNA-isolering og kvantitering som beskrevet ovenfor. Behandle en annen FFPET-prøveblokk hvis DNA-stokkløsningen fortsatt er < 2 ng/μl. MERK: Behandlede prøver (ekstrahert DNA) er stabile i opptil 14 dager ved 2 til 8 C eller opptil 60 dager ved -15 til -25 C. Ekstrahert DNA skal amplifiseres innen anbefalte oppbevaringsperioder eller før utløpsdatoen for cobas DNA-prøveprepareringskitet som brukes til å ekstrahere DNA, avhengig av hva som kommer først. AMPLIFIKASJON OG DETEKSJON MERK: For å unngå at Working Master Mix kontamineres med DNA-prøver, skal amplifikasjon og deteksjon utføres i et annet område enn der det utføres DNA-isolering. Arbeidsområdet der det utføres amplifikasjon og deteksjon, skal være fullstendig rengjort før tillaging av Working Master Mix. For å sikre tilstrekkelig rengjøring skal alle overflater, inkludert stativ og pipetter, tørkes grundig med en 0,5 % natriumhypoklorittløsning og deretter med en 70 % etanolløsning. Kommersielt tilgjengelig blekemiddel til husholdningsbruk inneholder normalt natriumhypokloritt med en konsentrasjon på 5,25 %. En fortynning i forholdet 1:10 med et slikt blekemiddel gir en 0,5 % natriumhypoklorittløsning. Klargjøring av instrumentet: Se instrumentmanualen for cobas z 480-analysatoren for detaljerte instruksjoner om klargjøring av cobas z 480. Klargjøring av testrekkefølge: Se operatørmanualen for cobas 4800-systemet, programvareversjon 2.0 for cobas PIK3CA mutasjonstesten for detaljerte instruksjoner om trinnene i PIK3CA-arbeidsflyten. Fortynningsberegning av prøve-dna-stokkløsning: Fortynningsberegning av konsentrasjoner til DNA-stokkløsningen fra 2 ng/μl til 36 ng/μl MERK: DNA-stokkløsninger fra prøver skal fortynnes like før amplifikasjon og deteksjon. MERK: Tre (3) amplifikasjoner/deteksjoner kjøres per prøve, og det benyttes et totalvolum på 75 μl (25 μl hver av tre reaksjoner) av en 2 ng/μl-fortynning av DNA-stokkløsningen (totalt 150 ng DNA). A. For hver prøve, beregn volumet (μl) av DNA-stokkløsning som trengs: μl av DNA-stokkløsning = (90 μl x 2 ng/μl) konsentrasjon til DNA-stokkløsningen [ng/μl] B. For hver prøve, beregn volumet (μl) av DNA-fortynningsløsning (DNA SD) som trengs: Eksempel: μl av DNA SD = 90 μl - μl av DNA-stokkløsning Konsentrasjon til DNA-stokkløsningen = 6,5 ng/μl A. μl av DNA-stokkløsning = (90 μl x 2 ng/μl) 6,5 ng/μl = 27,7 μl B. μl av DNA SD = (90 μl - 27,7 μl) = 62,3 μl NO 10 Doc Rev. 1.0

11 Fortynningsberegning av konsentrasjoner til DNA-stokkløsningen > 36 ng/μl MERK: DNA-stokkløsninger fra prøver skal fortynnes like før amplifikasjon og deteksjon. MERK: Tre (3) amplifikasjoner/deteksjoner kjøres per prøve, og det benyttes et totalvolum på 75 μl (25 μl hver av tre reaksjoner) av en 2 ng/μl-fortynning av DNA-stokkløsningen (totalt 150 ng DNA). A. Ved konsentrasjoner til DNA-stokkløsningen > 36 ng/μl, bruk følgende formel for å beregne hvor mye DNA-fortynningsløsning (DNA SD) som trengs for å tillage minst 90 μl fortynnet DNA-stokkløsning. Dette er for å sikre at hver prøve bruker minst 5 μl med DNA-stokkløsning. B. For hver prøve, beregn volumet (μl) av DNA SD som trengs for å fortynne 5 μl med DNA-stokkløsningen til 2 ng/μl: Eksempel: Volum av DNA SD som trengs i μl = ((5 μl av DNA-stokkløsning x konsentrasjon til DNA-stokkløsningen i ng/μl) / 2 ng/μl) - 5 μl Konsentrasjon til DNA-stokkløsningen = 100 ng/μl A. Volum av DNA SD som trengs i μl = ((5 μl x 100 ng/μl) / 2 ng/μl) - 5 μl = 245 μl B. Bruk det beregnede volumet av DNA SD for å fortynne 5 μl med DNA-stokkløsning. Prøvefortynning A. Klargjør riktig antall med 1,5 ml Safe-Lock-mikrosentrifugerør for DNA-fortynninger ved å merke dem med riktig prøveidentifikasjon. B. Bruk en pipette med aerosolbarrierespiss og pipetter det beregnede volumet av DNA SD i hvert merkede prøverør. Pipetter 45 μl av DNA SD i et Safe-Lock-rør merket NEG CT. C. Vortex hver DNA-stokkløsning og den negative kontrollen i 5 til 10 sekunder. D. Bruk en pipette med aerosolbarrierespiss (ny spiss for hver pipettering) og pipetter forsiktig det beregnede volumet av hver DNAstokkløsning i riktig rør med DNA SD. Pipetter 45 μl av negativ kontroll (ekstrahert eluat) i NEG CT-røret. E. Kork rørene og vortex hvert rør i 5 til 10 sekunder. F. Bytt hansker. Tillaging av Working Master Mix (, og ) MERK: PIK3CA, PIK3CA, PIK3CA og Working MMX er lysfølsomme og må beskyttes mot langvarig eksponering for lys. MERK: Grunnet viskositeten til PIK3CA MIX og Working Master Mix skal det pipetteres langsomt for å sikre at all blanding blir fullstendig dispensert fra spissen. MERK: PIK3CA, PIK3CA og PIK3CA kan være lyseblå/lillaaktige. Dette påvirker ikke reagensenes ytelse. Klargjør tre porsjoner med Working MMX, én som inneholder PIK3CA, én som inneholder PIK3CA, og én som inneholder PIK3CA, i separate 1,5 ml Safe-Lock-mikrosentrifugerør. A. Beregn volumet av PIK3CA eller PIK3CA eller PIK3CA som trengs for hver Working MMX, ved å bruke følgende formel: Volum av PIK3CA eller PIK3CA eller PIK3CA som trengs = (antall prøver + 2 kontroller +1) x 20 μl B. Beregn volumet av MGAC som trengs for hver Working Master Mix, ved å bruke følgende formel: Volum av MGAC som trengs = (antall prøver + 2 kontroller +1) x 7 μl NO 11 Doc Rev. 1.0

12 Bruk tabell 1 for å bestemme volumer av hvert reagens som trengs for tillaging av Working Master Mix, basert på antall prøver i analyseserien. Tabell 1 Volumer av reagenser som trengs for Working, Working og Working Antall prøver* MMX 20 μl MGAC 7 μl Totalvolum for hver Working Master Mix (μl) * Volumer for antall prøver er basert på summen av antall prøver + 2 kontroller + 1 C. Ta ut riktig antall flasker med PIK3CA, PIK3CA, PIK3CA og MGAC fra kjølelagringen på 2 til 8 C. Vortex hvert reagens i 5 sekunder for å samle væsken i bunnen av røret før bruk. Merk et sterilt mikrosentrifugerør for Working Master Mix 1, Working Master Mix 2 og Working Master Mix 3. D. Tilsett det beregnede volumet av PIK3CA eller PIK3CA eller PIK3CA til deres respektive rør med Working MMX. E. Tilsett beregnet volum av MGAC til rørene med Working Master Mix. F. Vortex rørene i 3 til 5 sekunder for å sikre tilstrekkelig blanding. MERK: Prøver, kontroller og kalibrator skal tilsettes mikrobrønnplaten (AD-platen) innen 1 time etter tillaging av Working Master Mix. MERK: Bruk kun mikrobrønnplate (AD-plate) og forseglingsfilm for cobas 4800-systemet (Roche P/N ). Klargjøring av plate Figur 1 Plateoppsett for cobas PIK3CA mutasjonstest Rad / kolonne A B C D E F G H MC NEG S1 S2 S3 S4 S5 S6 MC NEG S1 S2 S3 S4 S5 S6 MC NEG S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14 S15 S16 S17 S18 S19 S20 S21 S22 S15 S16 S17 S18 S19 S20 S21 S22 S15 S16 S17 S18 S19 S20 S21 S22 S23 S24 S25 S26 S27 S28 S29 S30 S23 S24 S25 S26 S27 S28 S29 S30 Der: NEG = negativ kontroll, MC = PIK3CA mutantkontroll, S# = prøve-id og MMX-# tilsvarer Master Mix-reagens 1, 2 eller 3. S23 S24 S25 S26 S27 S28 S29 S NO 12 Doc Rev. 1.0

13 MERK: En gitt prøve må spres over tre etterfølgende kolonner i én rad for å generere et resultat. A. Pipetter 25 μl Working Master Mix til hver reaksjonsbrønn som trengs for analyseserien, i mikrobrønnplaten (AD-platen). Ikke la pipettespissen berøre platen utenfor brønnen. Tilsett Working Master Mix 1 til brønnene på mikrobrønnplaten (AD-platen) i kolonnene 1, 4, 7 og 10, etter behov. Tilsett Working Master Mix 2 til brønnene på mikrobrønnplaten (AD-platen) i kolonnene 2, 5, 8 og 11, etter behov. Tilsett Working Master Mix 3 til brønnene på mikrobrønnplaten (AD-platen) i kolonnene 3, 6, 9 og 12, etter behov. B. Pipetter 25 μl PIK3CA MC til brønnene A1, A2 og A3 på mikrobrønnplaten (AD-platen). Bland godt ved å pipettere opp og ned i brønnen minst to ganger. C. Bruk en ny pipettespiss og pipetter 25 μl NEG CT til brønn B1, B2 og B3 i mikrobrønnplaten (AD-platen). Bland godt ved å pipettere opp og ned i brønnen minst to ganger. MERK: Hver analyseserie må inneholde positiv kontroll (PIK3CA MC) i brønn A1, A2 og A3, og negativ kontroll (NEG CT) i brønn B1, B2 og B3, ellers blir analyseserien gjort ugyldig av programvaren for PIK3CAanalyseringspakken. MERK: Bytt hansker ved behov for å forebygge kontaminasjon fra prøve til prøve og kontaminasjon av utsiden av PCRreaksjonsrøret. D. Bruk nye pipettespisser for hver fortynnet prøve-dna og tilsett 25 μl av det første prøve-dnaet til brønn C1, C2 og C3 i mikrobrønnplaten (AD-platen). Bland godt ved å pipettere opp og ned i brønnen minst to ganger. Gjenta denne prosedyren for det fortynnede DNA-et fra den andre prøven (brønn D1, D2 og D3). Følg malen i figur 1 til alle prøvenes DNA-fortynninger er fylt i mikrobrønnplaten (AD-platen). E. Dekk mikrobrønnplaten (AD-platen) med forseglingsfilmen (leveres med platene). Bruk applikatoren for å forsegle filmen godt til mikrobrønnplaten (AD-platen). F. Kontroller at all væske er samlet i bunnen av hver brønn før du starter PCR. MERK: Amplifikasjon og deteksjon skal startes innen 1 time etter at den første prøve-dna-fortynningen ble tilsatt i Working Master Mix. Starte PCR Se operatørmanualen for cobas PIK3CA for detaljerte instruksjoner om trinnene i PIK3CA-arbeidsflyten NO 13 Doc Rev. 1.0

14 TOLKNING AV RESULTATER MERK: All analyseserie- og prøvevalidering utføres av cobas 4800-programvaren. MERK: En gyldig analyseserie kan omfatte både gyldige og ugyldige prøveresultater. Prøveresultater fra gyldige analyseserier tolkes som vist i tabell 2. Tabell 2 Tolkning av resultater fra cobas PIK3CA mutasjonstest Testresultat Mutasjonsresultat Tolkning Mutation Detected R88Q N345K C420R E542K E545X (E545A, E545D, E545G eller E545K) Q546X (Q546E, Q546K, Q546L eller Q546R) M1043I H1047X (H1047L, H1047R eller H1047Y) G1049R (Mer enn én mutasjon kan forekomme) Mutasjon detektert i spesifisert mål-pik3ca-region. Mutation Not Detected* N/A Mutasjon ikke detektert i spesifiserte mål-pik3ca-regioner. Invalid N/A Prøveresultat er ugyldig. Gjenta testing av prøver med ugyldige resultater i samsvar med instruksjonene i avsnittet Gjentatt testing av prøver med ugyldige resultater. For en liste over resultatflagg, inkludert flaggbeskrivelser, henvises det til operatørmanualen for cobas 4800-systemet for cobas PIK3CA mutasjonstest (Kun for bruk til forskning). Failed N/A Mislykket grunnet feil ved maskinvare eller programvare. Kontakt ditt lokale Roche-kontor for teknisk støtte. * Et "Mutation Not Detected"-resultat utelukker ikke tilstedeværelse av en mutasjon i mål-pik3ca-regionene, fordi resultatene avhenger av prosentvise mutantsekvenser, tilstrekkelig god prøveintegritet, fravær av hemmere og tilstrekkelig med DNA til å kunne detekteres. For E545D-aminosyresubstitusjonen blir kun nukleotidsubstitusjonen c.1635g>t-mutasjon detektert av testen. For M1043I-aminosyresubstitusjonen blir kun nukleotidsubstitusjonen c.3129g>t-mutasjon detektert av testen NO 14 Doc Rev. 1.0

15 Gjentatt testing av prøver med ugyldige resultater A. Gjenta fortynning av den ugyldige prøve-dna-stokkløsningen ved å starte med prosedyrene Fortynningsberegning av prøve- DNA-stokkløsning og Prøvefortynning i avsnittet AMPLIFIKASJON OG DETEKSJON. B. Etter å ha fortynnet DNA-stokkløsningen til 2 ng/μl, som beskrevet i Prøvefortynning, fortsett med Tillaging av Working Master Mix (, og ) og resten av prosedyren for amplifikasjon og deteksjon. MERK: Hvis prøven fortsatt er ugyldig etter gjentatt testing, eller hvis det ikke var nok DNA-stokkløsning til å klargjøre en annen fortynning i trinn A, "Gjentatt testing av prøver med ugyldige resultater", gjenta hele testprosedyren for den aktuelle prøven. Start med deparafinisering og DNA-isolering ved bruk av et nytt FFPET-snitt på 5 μm. KVALITETSKONTROLL Ett sett med PIK3CA mutantkontroll (PIK3CA MC) og negativ kontroll (NEG CT) for Working Master Mix 1, Working Master Mix 2 og Working Master Mix 3 er inkludert i hver analyseserie for opptil 30 prøver. En analyseserie er gyldig hvis brønnene med PIK3CA MC (A1, A2 og A3) og brønnene med NEG CT (B1, B2 og B3) er gyldige. Hvis PIK3CA MC eller NEG CT for Working, Working eller Working er ugyldige, er hele analyseserien ugyldig og må gjentas. Klargjør en fersk fortynning av den tidligere isolerte prøve-dna-stokkløsningen, for å sette opp en ny mikrobrønnplate (AD-plate) med kontroller for amplifikasjon og deteksjon. Positiv kontroll Resultatet for PIK3CA MC må være "Valid" for Working, Working og Working. Hvis resultatene for PIK3CA MC konsekvent er ugyldige, kontakt ditt lokale Roche-kontor for teknisk assistanse. Negativ kontroll Resultatet for NEG CT må være "Valid" for Working, Working og Working. Hvis resultatene for NEG CT konsekvent er ugyldige, kontakt ditt lokale Roche-kontor for teknisk assistanse. FORSIKTIGHETSREGLER Som for andre laboratorieprosedyrer er god laboratorieteknikk essensielt for å sikre optimal ytelse for denne analysen. På grunn av testens høye analytiske sensitivitet, må det utvises aktsomhet for å sikre at reagenser og amplifikasjonsblandinger ikke kontamineres. TESTENS BEGRENSNINGER 1. cobas PIK3CA mutasjonstest er verifisert med FFPET-prøver med brystkreft. 2. cobas PIK3CA mutasjonstest er verifisert ved bruk av cobas DNA-prøveprepareringskit (Roche P/N: ). 3. Deteksjon av en mutasjon er avhengig av antallet kopier som er til stede i prøven, og kan påvirkes av prøvens integritet, mengden isolert DNA og tilstedeværelse av interfererende substanser. 4. Pålitelige resultater er avhengig av adekvat prøvefiksering, transport, oppbevaring og håndtering. Følg prosedyrene i dette pakningsvedlegget og i operatørmanualen for cobas 4800-systemet, programvareversjon 2.0 for cobas PIK3CA mutasjonstest. 5. Effekten av andre mulige variabler, som f.eks. prøvefikseringsvariabler, er ikke evaluert. 6. Tilsetning av AmpErase-enzym i cobas PIK3CA mutasjonstest Master Mix muliggjør selektiv amplifikasjon av mål-dna. Kontaminering av reagensene kan imidlertid bare unngås gjennom gode laboratorierutiner og ved å følge prosedyrene som er spesifisert i dette pakningsvedlegget nøye. 7. Dette produktet må kun brukes av personell som er opplært i PCR-teknikk og bruken av cobas 4800-systemet NO 15 Doc Rev. 1.0

16 8. Kun cobas z 480-analysatoren er verifisert for bruk med dette produktet. Ingen annen termocycler med optisk sanntidsdeteksjon kan brukes sammen med dette produktet. 9. På grunn av iboende forskjeller mellom teknologier anbefales det at brukerne utfører metodekorrelasjonsstudier i laboratoriet for å bestemme de teknologiske forskjellene før en ny teknologi tas i bruk. 10. Selv om det er sjelden, kan mutasjoner innenfor regionene av det genomiske DNA for PIK3CA-genet som cobas PIK3CA mutasjonstestens primere og/eller prober er rettet mot, resultere i manglende evne til å detektere forekomst av en mutasjon. 11. Tilstedeværelsen av PCR-hemmere kan føre til falske negative eller ugyldige resultater. 12. Selv om det er sjelden, kan cobas PIK3CA mutasjonstest vise begrenset kryssreaktivitet (resultatet "Mutation Detected") for mutasjoner ytterst på målmutasjoner i ekson 9 og cobas PIK3CA mutasjonstest er verifisert for bruk med 50 ng DNA per reaksjonsbrønn. DNA-innmatingsmengder under 50 ng per reaksjonsbrønn anbefales ikke. 14. Selv om det er sjelden, kan prøver som inneholder nærliggende doble mutasjoner på samme kromosom, forstyrre deteksjon av en av de to mutasjonene. ANALYTISK YTELSE Følgende data viser den analytiske ytelsen for cobas PIK3CA mutasjonstest. Dataene er ikke ment som bevis på påstander om testens kliniske ytelse. cobas PIK3CA mutasjonstest skal kun brukes til forskning og skal ikke brukes til diagnostiske prosedyrer. Analytisk sensitivitet ved bruk av FFPET-prøveblandinger DNA isolert fra fire brystkreft-ffpet-prøver med PIK3CA-mutasjoner (tre prøver med mutasjoner i ekson 9 og én prøve med mutasjon i ekson 20) ble blandet med DNA isolert fra PIK3CA villtype-ffpet-brystkreftprøver for å oppnå prøve-dna-blandinger med et målmutasjonsnivå på 5,0 %, som bestemt med en massiv parallell pyrosekvenseringsmetode, 454-sekvensering (454 Life Sciences, et Roche-selskap, Branford, CT, USA). Fortynningsrekker av hver prøve-dna-blanding ble tillaget, og totalt tjue (20) replikater av hver panelprøve ble analysert ved bruk av 2 kitlot for cobas PIK3CA mutasjonstest (n=20/panelprøve). Den analytiske sensitiviteten for hver prøve ble bestemt med den laveste DNA-mengden som ga en PIK3CA "Mutation Detected"-rate på minst 95 % for målmutasjonen, som vist i tabell 3. Tabell 3 Analytisk sensitivitet for cobas PIK3CA mutasjonstest ved bruk av FFPET-prøve-DNA-blandinger PIK3CA-ekson PIK3CA-mutasjon PIK3CA nukleinsyresekvens Prosentvis mutasjon* Mengden DNA (ng/25 μl) for å oppnå en 95 % "Mutation Detected"-rate (N=20) E542K 1624 G>A 5,5 % 1,5 ng 9 E545K 1633 G>A 4,7 % 5,0 ng Q546K 1636 C>A 4,4 % 15,0 ng 20 H1047R 3140 A>G 4,8 % 1,5 ng * Prosentvis mutasjon bestemt ved 454-sekvensering. cobas PIK3CA mutasjonstesten detekterte mutasjoner i PIK3CA-ekson 9 og 20 med et anslagsvis mutasjonsnivå på 5 % ved bruk av standard DNA-innmating i området fra 1,5 ng til 15,0 ng per reaksjonsbrønn. Dette indikerer at testen vil detektere de testede PIK3CAmutasjonene når ~70 til 97 % av DNA er forringet eller ikke-amplifiserbart grunnet fikseringsprosessen NO 16 Doc Rev. 1.0

17 Inklusivitet med plasmider For hver av de 17 PIK3CA-mutasjonene som er målet for cobas PIK3CA mutasjonstest, ble en DNA-plasmidkonstruksjon blandet med villtype-cellelinje-dna til en endelig målsammensetning av 5 % mutantsekvenser basert på genomiske DNA-ekvivalenter. Et samlet antall på minst 20 replikater for hver plasmidblanding ble testet med en DNA-innmating på 50 ng ved bruk av 2 kitlot for cobas PIK3CA mutasjonstest. De observerte "Mutation Detected"-ratene for hver 5 % plasmidblanding vises i tabell 4. PIK3CA-ekson Tabell 4 Mutasjoner detektert av cobas PIK3CA mutasjonstest ved bruk av 5 % mutant-dna-plasmidblandinger PIK3CA-mutasjon PIK3CA nukleinsyresekvens Cosmic ID 1 R88Q 263 G>A % 4 N345K 1035 T>A % 7 C420R 1258 T>C % 9 20 E542K 1624 G>A % E545A 1634 A>C % E545D 1635 G>T % E545G 1634 A>G % E545K 1633 G>A % Q546E 1636 C>G % Q546K 1636 C>A % Q546L 1637 A>T % Q546R 1637 A>G % M1043I 3129 G>T % H1047L 3140 A>T % H1047R 3140 A>G % H1047Y 3139 C>T % G1049R 3145 G>C % "Mutation Detected"-rate med et mål på 5 % mutant DNA og 50 ng DNA-innmating (N 20) Korrelasjon med 2X bidireksjonal Sanger-sekvensering og 454-sekvensering Det ble utført sammenligningstesting av 110 brystkreft-ffpet-prøver ved bruk av hver av 2 lot av cobas PIK3CA mutasjonstest og 2X bidireksjonal sekvensering (Sanger-sekvensering) for å bestemme positivt, negativt og samlet prosentvis samsvar mellom metodene. Avvikende resultater mellom cobas PIK3CA mutasjonstest og Sanger-sekvensering ble testet ved bruk av 454-sekvensering for å avdekke uoverensstemmelser. Sammenligningen av de 110 gyldige resultatene for Sanger og cobas PIK3CA mutasjonstest vises i tabell 5. Legg merke til at lot 1 og lot 2 av cobas PIK3CA mutasjonstest gav samme testresultat for hver av de 110 brystkreft-ffpet-prøvene NO 17 Doc Rev. 1.0

18 Tabell 5 cobas PIK3CA mutasjonstest sammenlignet med 2X bidireksjonal sekvensering cobas PIK3CA mutasjonstest Sanger-sekvensering MD MND Totalt MD 50* 4 54 MND Totalt Positivt samsvar = 100 % (95 % KI = 92,9 til 100 %) Negativt samsvar = 93,3 % (95 % KI = 84,1 til 97,4 %) Samlet samsvar = 96,4 % (95 % KI = 91,0 til 98,6 %) MD: Mutasjon detektert MND: Mutasjon ikke detektert * Én prøve viste resultatet MD med både Sanger-sekvensering og cobas PIK3CA mutasjonstest, men Sanger-sekvensering detekterte ikke en andre mutasjon (se tabell 7). Sammenligningstesten mellom cobas PIK3CA mutasjonstest og Sanger-sekvensering evaluerte ni mål for hver prøve. Totalt 990 mutasjonstyper ble funnet basert på resultatene av de 110 gyldige prøvene. Tabell 6 viser sammenligningen av cobas PIK3CA mutasjonstest og Sanger-sekvensering per mutasjonstype. Tabell 6 Sammenligning av cobas PIK3CA mutasjonstest og Sanger-sekvensering per mutasjonstype Sanger-sekvensering R88Q N345K C420R E542K E545X Q546X M1043I H1047X G1049R MND Totalt R88Q N345K cobas PIK3CA mutasjonstest C420R E542K E545X Q546X M1043I H1047X G1049R MND Totalt NO 18 Doc Rev. 1.0

19 Avviksanalyse med 454-sekvensering Det var fem avvikende prøveresultater ved sammenligning av Sanger-sekvensering og cobas PIK3CA mutasjonstest. Prøver som ga avvikende resultater mellom cobas PIK3CA mutasjonstesten og Sanger-sekvensering, ble analysert med 454-sekvensering og vises i tabell 7. En revidert samsvarsanalyse ble utført basert på resultatene av 454-sekvenseringen. I denne analysen ble prøver med resultater av 454-sekvensering som samsvarte med resultatene av cobas PIK3CA mutasjonstest, ansett som samsvarende. Prøve Sangersekvensering Tabell 7 Løsning av avvikende prøver med 454-sekvensering cobas PIK3CA mutasjonstest, lot 1 cobas PIK3CA mutasjonstest, lot 2 Løsning med 454-sekvensering Prøve 1* MND H1047X H1047X H1047R (3,7 % mutasjon) Prøve 2* MND E542K E542K E542K (4,3 % mutasjon) Prøve 3* MND H1047X H1047X H1047R (2,6 % mutasjon) Prøve 4** C420R C420R;H1047X C420R;H1047X Prøve 5*** MND E542K E542K C420R (18,4 % mutasjon) H1047R (1,3 % mutasjon) E542K (9,2 % mutasjon) H1047R (1,8 % mutasjon) * Med 454-sekvensering ble prøve 1, 2 og 3 bekreftet som PIK3CA-mutanter med < 5,0 % mutasjon. ** Med 454-sekvensering ble prøve 4 bekreftet som PIK3CA-dobbeltmutant (1,3 % H1047R-mutasjon og 18,4 % C420R-mutasjon). ***Med 454-sekvensering ble prøve 5 bekreftet som E542K-mutant med 9,2 % mutasjon. I tillegg identifiserte 454-sekvensering en annen lavnivå H1047R-mutant (1,8 %), som ikke ble detektert med verken Sanger-sekvensering eller cobas PIK3CA mutasjonstest. Etter at avvikende prøveresultater med cobas PIK3CA mutasjonstest vs. Sanger-sekvensering ble løst med 454-sekvensering, var samlet samsvar for cobas PIK3CA mutasjonstest og sekvensering 100 % over alle målmutasjonsklasser, som vist i tabell 8. Tabell 8 Samsvarsanalyse for cobas PIK3CA mutasjonstest vs. Sanger-sekvensering med løsning av avvikende resultater med 454-sekvensering Sanger-sekvensering, løst med 454-sekvensering cobas PIK3CA mutasjonstest MD MND Totalt MD MND Totalt MD-samsvar = 100 % (95 % KI = 93,4 til 100 %) MND-samsvar = 100 % (95 % KI = 93,6 til 100 %) Samlet samsvar = 100% (95 % KI = 96,6 til 100 %) NO 19 Doc Rev. 1.0

20 Tabell 9 viser sammenligningen av cobas PIK3CA mutasjonstest og Sanger-sekvensering med løsning av avvik med 454-sekvensering per mutasjonstype. Tabell 9 Sammenligning av cobas PIK3CA mutasjonstest og Sanger-sekvensering per mutasjonstype, med løsning av avvikende resultater med 454-sekvensering Sanger-sekvensering, løst med 454-sekvensering R88Q N345K C420R E542K E545X Q546X M1043I H1047X G1049R MND Totalt R88Q N345K cobas PIK3CA mutasjonstest C420R E542K E545X Q546X M1043I H1047X G1049R MND Totalt Repeterbarhet Repeterbarheten til cobas PIK3CA mutasjonstest ble vurdert ved å bruke seks FFPET-prøver, inkludert: 2 villtypeprøver, 4 mutantprøver med henholdsvis én E542K-, E545K-, Q546K- eller H1047R-mutasjon. Disse prøvene ble testet i duplikat av to operatører, ved bruk av to ulike reagenslot og to cobas z 480-analysatorer over 8 dager. cobas PIK3CA mutasjonstest hadde en korrekt mutasjonstyperate på 99,5 % (191/192) NO 20 Doc Rev. 1.0