TruSeq Custom Amplicon Dx FFPE QC Kit

Transkript

1 TruSeq Custom Amplicon Dx FFPE QC Kit TIL IN VITRO-DIAGNOSTISK BRUK Katalognr : 1 4 anvendelser, opptil 48 prøver Tiltenkt bruk Illumina TruSeq Custom Amplicon Dx FFPE QC Kit er et sett med reagenser som brukes til å bestemme forsterkningspotensialet for genomisk DNA (gdna) som er ekstrahert fra prøver som er formalinfiksert og nedsenket i parafin (FFPE). Prosedyreprinsipper Illumina TruSeq Custom Amplicon Dx FFPE QC Kit er beregnet på å evaluere kvaliteten på potensielle DNA-prøver fra FFPE-vev for å bestemme om de kan brukes sammen med TruSeq Custom Amplicon Kit Dx eller andre bibliotekklargjøringssett. Settet brukes som en kvantitativ PCR-analyse i sanntid (qpcr) som kan utføres ved hjelp av standard instrumentering. qpcr bestemmer forsterkningspotensial for DNA som er ekstrahert fra FFPE-prøver. FFPE gdna-innmatingskrav for bibliotekklargjøring er basert på deltakvantitivsyklusen (dcq) som oppnås fra settet. dcq er forskjellen mellom syklusen der både en prøve og en kontroll passerer en terskel. Reagensene som følger med i TruSeq Custom Amplicon Dx FFPE QC Kit forsterker spesifikt gjentatte regioner i hele genomet. Kvantiteten av biblioteker avhenger av kvantiteten av gdna som kan forsterkes som er ekstrahert fra FFPE-prøver. Jo høyere dcq for prøvene, dess lavere er kvantiteten av gdna som kan forsterkes, og dess høyere er mengden innmatings-dna som kreves for bibliotekklargjøring. Prosedyremessige begrensninger 1 Til in vitro-diagnostisk bruk. Produktkomponenter Illumina TruSeq Custom Amplicon Dx FFPE QC Kit består av følgende: TruSeq Custom Amplicon Dx FFPE QC Kit (katalognr ) Reagenser Reagenser som følger med Illumina TruSeq Custom Amplicon Dx FFPE QC Kit er konfigurert for å behandle 48 prøver. Settet støtter fire anvendelser med 12 prøver per anvendelse. Se følgende tabeller for en komplett liste over reagenser dette settet inneholder. November 2017 Dokumentnr v00 NOR 1

2 Illumina TruSeq Custom Amplicon Dx FFPE QC Kit Tabell 1 Boks 1 Preforsterkningsreagenser Komponent Kvantitet Fyllingsvolum Aktive ingredienser Oppbevaring qpcr-hovedblanding 2 rør 1 ml Bufret vandig løsning inneholdende salter, dntper, 25 C til 15 C DNA-polymerase, passiv referanse og grønt fluorescerende fargestoff (SYBR) QC-primere 4 rør 75 µl Bufret vandig løsning inneholdende oligonukleotider (primeren) for DNAprøvekvalifisering 25 C til 15 C Reagenser som er påkrevd, men som ikke følger med 1X TE-buffer (10 mm tris, 1 mm EDTA, ph 8,0) RNase/DNase-fritt vann Oppbevaring og håndtering 1 Romtemperatur defineres som 15 C til 30 C. 2 Følgende reagenser blir sendt i frossen tilstand og er stabile når de lagres ved 25 C til 15 C inntil den angitte utløpsdatoen. qpcr-hovedblanding QC-primere Reagensene er stabile i maksimalt seks fryse/tine-sykluser som utføres før den angitte utløpsdatoen. 3 Endringer i de leverte reagensenes fysiske utseende kan indikere nedbryting av materialene. Hvis det forekommer endringer i det fysiske utseendet (for eksempel åpenbare endringer i reagensfarge eller uklarhet sammen med mikrobiell kontaminasjon), skal ikke reagensene brukes. Utstyr og materiell Utstyr og materiell som er påkrevd, men som ikke følger med Utstyr og materialer til preforsterkning 1 Bordsentrifuge Én bordsentrifuge plassert enten i pre- eller postforsterkningslaboratorieområdet. Sentrifugen skal oppfylle følgende spesifikasjoner. Kan opprettholde 20 C Passer til en 96- eller 384-brønners plate Godtar 5 ml rør Oppnår hastigheter på 280 til 2400 g 2 Presisjonsdråpetellere Ett sett med presisjonsdråpetellere er påkrevd. Bruk av presisjonsdråpetellere sikrer nøyaktig reagens- og prøvetilførsel. Dråpetellere med enkel kanal og/eller flere kanaler kan brukes hvis de blir kalibrert regelmessig og er nøyaktige innen 5 % av oppgitt volum. 3 Forbruksmateriell Følgende forbruksmateriell er påkrevd. 1,5 ml eller 2 ml rør 8-rørs strimler og hetter 96- eller 384-brønners PCR-plater som er kompatible med qpcr-instrument, 0,2 ml polypropylen eller tilsvarende Oppløsningsbeholder, PVC, DNase, RNase-fri (kar) Forsegling som er kompatibel med qpcr-instrument Aerosolmotstandige dråpetellerspisser 4 Mikrosentrifuge 2 Dokumentnr v00 NOR November 2017

3 5 Vortekser 6 Kvalitetskontroll-DNA Dobbelstrenget humant DNA med høy molekylvekt som er tilgjengelig fra kommersielle forhandlere eller isolert fra menneskeblod. Utstyr og materialer til postforsterkning 1 qpcr-termosykler Ett kvantitativt PCR-instrument er påkrevd. Instrumentet må ha et oppvarmet lokk og ha evnen til å detektere SYBR-fargestoffet (FAM-kanal; eksitasjonsfilter på ~490 nm og utslippsfilter på ~520 nm). Prøvetaking, transport og oppbevaring Følgende betingelser bør oppfylles ved håndtering av tumorvev og DNA ekstrahert fra vevet. 1 Tumorvev bør være formalinfiksert og parafininnstøpt. 2 Ekstrahert gdna bør oppbevares mellom 2 C og 8 C i maks. 28 dager eller oppbevares i frossen tilstand mellom 15 C til 25 C i maks. 161 dager. 3 gdna-prøver i frosset tilstand er stabile i to fryse/tine-sykluser. DNA-ekstraksjon Illumina anbefaler kolonnebaserte DNA-ekstraksjonssett ved bruk av dobbel mengde proteinase K, proteinase K-inkubasjoner med omrøring over natten og endelige elusjoner i minst 30 µl volum. Kulebaserte ekstraksjonsmetoder og metoder som bare bruker lysering av ubehandlede celleekstrakter, anbefales ikke til bruk med disse reagensene. MERK Ingen negativ virkning på settets ytelse ble observert med FFPE-vev da spormengder av avparafineringsoppløsning, parafinvoks, xylen, etanol, proteinase K, vaskeoppløsninger, hemoglobin eller nekrotisk vev var til stede. Advarsler og forholdsregler FORSIKTIG Føderal lov begrenser denne enheten til salg av, eller på bestilling av, en lege eller annet fagpersonell, lovmessig lisensiert i staten vedkommende praktiserer, for å bruke eller pålegge bruk av enheten. ADVARSEL Dette reagenssettet inneholder potensielt farlige kjemikalier. Personskade kan forekomme ved innånding, svelging, hudkontakt og øyekontakt. Bruk verneutstyr, inkludert vernebriller, hansker og laboratoriefrakk som er egnet ved risiko for eksponering. Brukte reagenser skal behandles som kjemisk avfall og kastes i samsvar med gjeldende regionale, nasjonale og lokale lover og forskrifter. Hvis du ønsker ytterligere informasjon om helse, miljø og sikkerhet, kan du se SDS på support.illumina.com/sds.html. 1 Alle blodprøver skal håndteres som om de er kjent for å være smittefarlige med tanke på humant immunsviktvirus (HIV), humant hepatitt B-virus (HBV) og andre blodbårne patogener (generelle forholdsregler). 2 Hvis du unnlater å følge prosedyrene som beskrevet, kan det resultere i feil resultater eller betydelig reduksjon i prøvekvaliteten. 3 Bruk rutinemessige forholdsregler for laboratoriet. Ikke pipetter med munnen. Ikke spis, drikk eller røyk i tilordnede arbeidsområder. Bruk engangshansker og laboratoriefrakker når du håndterer prøver og settreagenser. Vask hendene grundig etter å ha håndtert prøvene og settreagensene. 4 Ikke bruk noen settkomponenter utover deres oppgitte utløpsdato på etiketten på settets eske. Ikke bytt om settkomponenter fra ulike settpartier. Vær oppmerksom på at settpartier er identifisert på etiketten på settets eske. 5 Oppbevar settkomponentene ved angitt temperatur i tilordnede preforsterknings- og postforsterkningsområder. 6 Unngå gjentatte fryse/tine-sykluser av reagensene. Du finner informasjon om antall anvendelser av settet under Prosedyremessige merknader på side 4. 7 For å hindre nedbrytning av prøver eller reagens må du påse at all natriumhypoklorittdamp er fullstendig oppløst før protokollen startes. November 2017 Dokumentnr v00 NOR 3

4 8 God laboratoriepraksis og god laboratoriehygiene er påkrevd for å hindre at PCR-produkter kontaminerer reagenser, instrumentering og genomiske DNA-prøver. PCR-kontaminasjon kan medføre unøyaktige og upålitelige resultater. 9 For å hindre kontaminasjon må du påse at preforsterknings- og postforsterkningsområdene har sitt eget utstyr (for eksempel dråpetellere, dråpetellerspisser, vortekser og sentrifuge). 10 Unngå krysskontaminasjon. Bruk nye dråpetellerspisser mellom prøvene og mellom dispensering av reagenser. Bland prøver med en dråpeteller og sentrifuger platen når dette angis. Ikke roter platene. Bruk av aerosolresistente spisser reduserer risikoen for amplikon-overføring og krysskontaminasjon fra prøve til prøve. 11 Kvantifiseringsmetoder avhenger av nøyaktige pipetteringsmetoder. Ikke bruk dråpetellere helt i utkanten av volumspesifikasjonene. Kontroller at dråpetellere er kalibrert. Akronymer Tabell 2 Akronymer for Illumina TruSeq Custom Amplicon Dx FFPE QC Kit Akronym NTC qpcr Definisjon No Template Control (Ingen malkontroll) Quantitative Polymerase Chain Reaction (Kvantitativ polymerasekjedereaksjon) Prosedyremessige merknader 1 Settet kan brukes opptil fire ganger hvis færre enn 96 prøver undersøkes. 2 Illumina krever at negativ kontroll (NTC eller ingen malkontroll) er inkludert i hver bruk. 3 Kvalifiser DNA-et ved hjelp av Illumina TruSeq Custom Amplicon Dx FFPE QC Kit som beskrevet i Bruksanvisning. Bibliotekproduksjon og sekvenseringsytelse avhenger av prøvekvalitet som målt av TruSeq Custom Amplicon Dx FFPE QC Kit. Bruksanvisning Klargjøring 1 La kvalitetskontroll-dna-et, QC-primerne, qpcr-hovedblandingen og gdna nå romtemperatur. 2 Roter QC-primerne kraftig, og sentrifuger rørene et øyeblikk for å samle væske. 3 Snu kontroll-dna-et, gdna-et og qpcr-hovedblandingen 10 ganger, og sentrifuger rørene et øyeblikk for å samle væske. 4 Plasser alle rør på is, og skjerm qpcr-hovedblandingen mot lys i omgivelsene. 5 Bestem plateoppsettet for qpcr-reaksjonen (bruk Figur 1 på side 5 som en veiledning). Prosedyre 1 Klargjør kvalitetskontroll-dna ved å velge ett av følgende alternativer: [Alternativ 1] Kommersielt tilgjengelig gdna Fortynn DNA-et basert på konsentrasjonen levert av forhandleren. Klargjør minst 50 µl kvalitetskontroll-dna ved en konsentrasjon på 0,25 ng/µl ved hjelp av 1X TE-buffer. [Alternativ 2] Ekstrahert gdna Bestem konsentrasjonen med et spektrofotometer og 1X TE-buffer som blank. Mål gdna-prøven i tre eksemplarer. % CV må være mindre enn eller lik 20 %. Gjenta prøveavlesninger hvis % CV er større enn 20 %. Klargjør minst 50 µl kvalitetskontroll-dna nyfortynnet til 0,25 ng/µl ved hjelp av 1X TE-buffer. 4 Dokumentnr v00 NOR November 2017

5 2 Bestem plateoppsettet for qpcr-reaksjonen (Figur 1). Test kontroll-dna, NTC og hvert prøve-gdna i tre eksemplarer. Beregn antall brønner ved å utføre følgende trinn: Totalt antall brønner = 3 [1 (kontroll-dna) + 1 (NTC) + ant. gdna-prøver] 3 I en strimmel med 8 PCR-rør kombinerer du 148,5 µl 1X TE-buffer og 1,5 µl prøve-gdna slik at du får en 100- gangers fortynning. 4 Ved hjelp av en P200-flerkanalsdråpeteller stilt inn på 100 µl pipetterer du opp og ned 10 ganger for å blande fortynningene. 5 Overfør 30 µl 0,25 ng/µl kontroll-dna-fortynning til en ubrukt brønn i strimmelen med 8 PCR-rør. Figur 1 Foreslått plateoppsett for qpcr 6 Tilsett 150 µl 1X TE-buffer i en annen ubrukt brønn, som brukes som NTC. 7 Sett hette på strimmelen med 8 rør, og sentrifuger et øyeblikk for å samle væsken. 8 Klargjør en tilstrekkelig kvantitet av qpcr-reaksjonsblanding for et 384-brønners eller 96-brønners plateformat basert på antall reaksjoner bestemt i trinn 2. Tabell 3 oppgir volumene av hver komponent for en enkel reaksjon. Ta med ekstra volum for pipetteringsfeil. Tabell 3 qpcr-reaksjonsblanding Reaksjonsblandingskomponent 384-brønners vol. (µl) 96-brønners vol. (µl) qpcr-hovedblanding 5 10 QC-primere 0,8 1,6 Vann 2,2 4,4 Vol. reaksjonsblanding per brønn 8 16 Prøve 2 4 Reaksjonsblanding totalt per brønn Bland reaksjonsblandingen forsiktig, men grundig. Sentrifuger et øyeblikk for å samle væsken. Plasser reaksjonsblandingen på is, og beskytt den mot lys frem til den skal brukes. 10 Dele reaksjonsblanding i like deler i et kar eller en strimmel med 8 rør, og dispenser den med flerkanalsdråpeteller. 11 Tilsett 8 µl (384-brønners format) eller 16 µl (96-brønners format) av qpcr-reaksjonsblandingen i hver prøvebrønn i qpcr-platen. November 2017 Dokumentnr v00 NOR 5

6 FORSIKTIG Sørg for å pipettere nøyaktig små variasjoner vil påvirke analysen. 12 Tilsett 2 µl (384-brønners format) eller 4 µl (96-brønners format) 0,25 ng/µl fortynning av DNA, gdnaprøvefortynningene eller 1X TE-buffer i hver brønn i platen (du finner forslag i Figur 1). FORSIKTIG Sørg for å pipettere nøyaktig små variasjoner vil påvirke analysen. 13 Ved hjelp av en P20-flerkanalsdråpeteller stilt inn på halvparten av det totale reaksjonsvolumet (5 µl for 384- brønners plate eller 10 µl for 96-brønners plate) pipetterer du sakte opp og ned tre ganger for å blande. 14 Forsegl platen med en optisk klar forsegling, og sørg for å unngå krysskontaminasjon og å unngå å tilsmusse forseglingens overflate. 15 Sentrifuger platen ved 1000 g ved 20 C i 1 minutt. 16 Kontroller at forseglingen og platen er frie for væske eller støv, plasser platen i riktig retning i qpcrinstrumentet, og lukk deretter lokket og kjør følgende termiske qpcr-profil (med et oppvarmet lokk): 50 C i 2 minutter 95 C i 10 minutter 40 sykluser på: 95 C i 30 sekunder 57 C i 30 sekunder 72 C i 30 sekunder 17 Bekreft at instrumentet tar bilder etter 72 C-trinnet i trinn Ta gjennomsnittet av Cq-verdien for triplikatreaksjoner av kontroll-dna-et, NTC og hver prøve. Behandle avvikende resultater som angitt i Kvalitetskontrollprosedyrer på side Trekk gjennomsnittlig Cq for kontroll-dna-et fra gjennomsnittlig Cq for hver prøve (prøvens gjennomsnittlige Cq minus kontroll-dna-ets gjennomsnittlige Cq) for å få dcq-verdiene for hver prøve. Registrer dcq-verdiene, eventuelle replikater som ble ekskludert og prøvefortynningsfaktorene. For prøver med dcq 1,5 skal prøven fortynnes 16 ganger. Gjenta dcq-måling til verdien er > 1,5. Til bibliotekklargjøring bruker du TSCA Kit Dx. Følg instruksjonene for prøvefortynning for den gjeldende gruppen: 1,5 < dcq 0,5, fortynn prøve åtte ganger 0,5 < dcq 0,5, fortynn prøve fire ganger 0,5 < dcq 1,5, fortynn prøve to ganger 1,5 < dcq 4, bruk ufortynnet prøve 4 > dcq, ikke bruk prøve SIKKERT STOPPEPUNKT dcq-verdiene er gyldige i 28 dager hvis DNA-prøvene oppbevares ved 2 C til 8 C, og de er gyldige i 161 dager hvis DNA-prøvene oppbevares ved 25 C til 15 C. Kvalitetskontrollprosedyrer Et kvalitetskontroll-dna og en negativ (ingen mal) kontroll er inkludert i hver kvalifiserende qpcr-kjøring. Kvalitetskontroll-DNA-malen brukes til å normalisere qpcr-dataene. Etter det siste trinnet analyserer qpcr-instrumentet de kvantifiserte prøvene. Hvis forsterkning av NTC forekommer innenfor 10 sykluser av kvalitetskontroll-dna-forsterkningen, er kontaminasjon av prøver sannsynlig, og testing på gjentas. Kontroller at kvalitetskontroll-dna-et gir forventede forsterkningskurver. Forsterk kvalitetskontroll-dna-et ved en Cq på omtrent sykluser. Ekskluder replikater fra en triplikatgruppe som er > 0,5 Cq forskjellige fra resten av gruppen. Ekskluder replikater som viser abnormale forsterkningskurver. Minst to av de tre replikatene må være inkludert i den endelige beregningen for en individuell prøve, ellers må kvalifikasjonsprosessen gjentas for disse prøvene. 6 Dokumentnr v00 NOR November 2017

7 Hvis replikater fjernes fra fire eller flere prøver per 10 kjørte prøver, gjentar du kvalifikasjonsprosessen for alle prøver. Ytelseskarakteristikker Tabell 4 viser Cq-verdiene fra gdna ved 0,25 ng/µl fra fem kommersielle forhandlere (B, C, P, R og T) eller som er ekstrahert fra en fullblodprøve. NIST-referansemateriale ved samme konsentrasjon vises for sammenligning. Cq-verdiene er fra tre uavhengige operatører og tre uavhengige qpcr-plattformer (A, B, S). Resultatene viser gjennomsnittlig ± standardavvik. Instrument B viser en konsekvent Cq-økning i forhold til instrument A og S prøver normalisert med kvalitetskontroll-dna-et hadde konsekvente dcq-verdier på tvers av instrumenter (data vises ikke). Tabell 4 Cq-verdier for kvalitetskontroll-dna hentet fra leverandører eller ekstrahert fra blod qpcrinstrument mann 2372 NIST Forhandler B Forhandler C Forhandler P Forhandler R Forhandler T Ekstrahert Instrument A 18,87 +/ 19,14 +/ 0,14 18,79 +/ 0,13 19,11 +/ 0,17 19,07 +/ 0,12 19,03 +/ 0,17 18,78 +/ 0,07 0,07 Instrument B 20,47 +/ 20,75 +/ 0,12 20,43 +/ 0,12 20,71 +/ 0,19 20,71 +/ 0,06 20,69 +/ 0,15 20,46 +/ 0,09 0,09 Instrument S 19,06 +/ 0,10 19,39 +/ 0,13 18,99 +/ 0,14 19,29 +/ 0,16 19,31 +/ 0,10 19,24 +/ 0,15 19,08 +/ 0,16 Patenter og varemerker Dette dokumentet og dets innhold er opphavsrettslig beskyttet for Illumina, Inc. og tilknyttede selskaper («Illumina»), og er ment utelukkende for kontraktbruk av kunden i forbindelse med bruk av produktet (produktene) beskrevet her, og for intet annet formål. Dette dokumentet og dets innhold skal ikke brukes eller distribueres til andre formål og/eller på annen måte kommuniseres, fremlegges eller reproduseres på noen måte uten forutgående, skriftlig samtykke fra Illumina. Illumina overfører ikke noen lisens under sitt patent, varemerke, opphavsrett eller sedvanerett eller lignende rettigheter til tredjeparter gjennom dette dokumentet. Instruksjonene i dette dokumentet skal følges strengt og tydelig av kvalifisert og tilfredsstillende utdannet personell for å sikre riktig og sikker bruk av produktet (produktene) som er beskrevet i dette dokumentet. Alt innhold i dette dokumentet skal leses fullt ut og være forstått før produktet (produktene) brukes. HVIS DET UNNLATES Å LESE FULLSTENDIG OG UTTRYKKELIG FØLGE ALLE INSTRUKSJONENE I DETTE DOKUMENTET, KAN DET FØRE TIL SKADE PÅ PRODUKTET (PRODUKTENE), SKADE PÅ PERSONER, INKLUDERT BRUKERE ELLER ANDRE, OG SKADE PÅ ANNEN EIENDOM), OG DETTE VIL UGYLDIGGJØRE EVENTUELL GARANTI SOM GJELDER FOR PRODUKTET (PRODUKTENE). ILLUMINA PÅTAR SEG IKKE ANSVAR SOM FØLGE AV FEIL BRUK AV PRODUKTET (PRODUKTENE) SOM ER BESKREVET I DETTE DOKUMENTET (INKLUDERT DELER AV DETTE ELLER PROGRAMVARE) Illumina, Inc. Med enerett. Illumina, TruSeq, den gresskaroransje fargen og streamingbase-designen er varemerker som tilhører Illumina, Inc. og/eller tilknyttede selskaper i USA og/eller andre land. Alle andre navn, logoer og andre varemerker tilhører deres respektive eiere. AMPure, Beckman og Beckman Coulter er varemerker eller registrerte varemerker for Beckman Coulter, Inc. Kontaktinformasjon Illumina 5200 Illumina Way San Diego, California, USA ILMN (4566) (utenfor Nord- Amerika) techsupport@illumina.com Illumina Cambridge Limited Chesterford Research Park, Little Chesterford Saffron Walden, CB10 1XL STORBRITANNIA Australsk sponsor: Illumina Australia 1 International Court Scoresby, Victoria, 3179 Australia November 2017 Dokumentnr v00 NOR 7

8 Produktmerking Ønsker du en fullstendig oversikt over symboler som kan finnes på produktemballasjen og -merkingen, kan du gå til support.illumina.com og lese under fanen Documentation and Literature (Dokumentasjon og litteratur) for settet. 8 Dokumentnr v00 NOR November 2017