MiSeqDx Cystisk fibrose 139-variantanalyse

Transkript

1 TIL IN VITRO-DIAGNOSTISK BRUK Dato: Illumina Settparti nr.: Beskrivelse: ILLUMINA PROPRIETÆR English Source: Rev. B August 2016 Side 1 av 19

2 Forbruksmateriell Vare CF 139-Variant Assay-Oligo Pool Hybridiseringsbuffer Stringent vaskebuffer Universalvaskebuffer Filterplate Ekstensjons-ligeringsblanding PCR hovedblanding PCR polymerase Varenummer 0,05 N NaOH Dato utarbeidet: 10 N NaOH Templatfritt vann Elueringsbuffer PCR rengjøringskuler 80 % etanol Dato utarbeidet: 100 % etanol Templatfritt vann Biblioteknormaliserings-fortynning Bibliotekkuler Vaskeløsning for biblioteknormalisering Bibliotekoppbevaringsbuffer 0,1 N NaOH Dato utarbeidet: 10 N NaOH Templatfritt vann Bibliotekfortynningsbuffer 10 nm PhiX internkontroll TE-buffer MiSeqDx-reagenskassett - CF 139-variantanalyse MiSeqDx-strømningcelle MiSeqDx SBS-løsning (PR2) - CF 139- variantanalyse Side 2 av 19

3 Indeksprimere Indeksprimer A (A501) Indeksprimer B (A502) Indeksprimer C (A503) Indeksprimer D (A504) Indeksprimer E (A505) Indeksprimer F (A506) Indeksprimer G (A507) Indeksprimer H (A508) Indeksprimer 1 (A701) Indeksprimer 2 (A702) Indeksprimer 3 (A703) Indeksprimer 4 (A704) Indeksprimer 5 (A705) Indeksprimer 6 (A706) Indeksprimer 7 (A707) Indeksprimer 8 (A708) Indeksprimer 9 (A709) Indeksprimer 10 (A710) Indeksprimer 11 (A711) Indeksprimer 12 (A712) Side 3 av 19

4 Hybridisering av oligonukleotid-pool I dette trinnet blir oligonukleotid-poolen for cystisk fibrose med oppstrøms- og nedstrøms oligonukleotider som er spesifikke for cystisk fibrose transmembran konduktivitetsregulatorgenet (CFTR) hybridisert til genomiske DNA-prøver. Beregnet tid } Total varighet: 1 time, 35 minutter } I praksis: 15 minutter Tilberedelse [_] 5 Bring CF 139-Variant Assay-Oligo Pool, hybridiseringsbufferen, genomiske DNA-prøver og positiv kontrollprøve til romtemperatur. Vortekser CF 139-Variant Assay-Oligo Pool og hybridiseringsbuffer kraftig for å sikre at alt bunnfallet er fullstendig oppløst og gjør en kort sentrifugering av rørene for å samle væske. Still inn en 96-brønners varmeblokk på 95 C. Forvarm en inkubator til 37 C. Sett opp prøveplaten i henhold til plategrafikkutskriften fra Illumina Worklist Manager. Prøvearknavn: Prosedyre [_] 5 [_] 6 Sett opp en ny 96-brønners PCR-plate (heretter kalt HYB-plate). Plate-ID: Tilsett 5 µl av prøven eller kontrollen til 50 ng/µl (250 ng totalt) til de aktuelle brønnene i HYB-platen. Følg det genererte plateoppsettet for riktig brønnvalg. Tilsett 5 µl av CF 139-Variant Assay-Oligo Pool i alle brønnene som inneholder genomisk DNA. Tilsett 40 µl av hybridiseringsbuffer i hver prøve i HYB-platen. Pipetter forsiktig opp og ned 3 5 ganger for å blande. Forsegle HYB-platen og sentrifuger 1000 g ved 20 C i 1 minutt. Legg HYB-platen på den forhåndsoppvarmede blokken ved 95 C, og inkuber i 1 minutt. Side 4 av 19

5 [_] 7 Reduser varmeblokken til 40 C, og fortsett å inkubere til varmeblokken når 40 C (omtrent 80 minutter). Gradvis avkjøling er avgjørende for riktig hybridisering. PCR-termosyklere med aktiv avkjøling (for eksempel Peltier, termoelektrisk avkjølt) anbefales derfor ikke for denne prosessen. Starttid: Stopptid: SIKKERT STOPPEPUNKT Når varmeblokken har nådd 40 C, er HYB-platen stabil på 40 C i 2 timer. Kommentarer Side 5 av 19

6 Fjerning av ubundne oligonukleotider Denne prosessen fjerner ubundne oligonukleotider fra genomisk DNA med et filter som kan velge størrelse. To vasketrinn med stringent vaskebuffer sikrer fullstendig fjerning av ubundne oligonukleotider. Et tredje vasketrinn med universalvaskebuffer fjerner resterende stringent vaskebuffer og gjør prøvene klar til ekstensjonsligeringstrinnet. Beregnet tid } Total varighet: 20 minutter } I praksis: 20 minutter Tilberedelse Prosedyre Bring ekstensjons-ligeringsblanding, stringent vaskebuffer og universalvaskebuffer til romtemperatur og gjør en kort vorteksering. Sett sammen filterplateenheten (heretter kalt FPU) i denne rekkefølgen (fra topp til bunn): lokk, filterplate, adaptermuffe og MIDI-plate. Filterplate-ID: Forvask filterplatemembranen slik: [_] a Tilsett 45 µl stringent vaskebuffer i hver brønn. [_] b Dekk til filterplaten med lokket og sentrifuger ved 2400 g i 20 C i 5 minutter. Fjern HYB-platen fra varmeblokken og sentrifuger ved 1000 g i 20 C i 1 minutt. Overfør hele volumet (omtrent 55 µl) for hver prøve til de tilsvarende brønnene på filterplaten. Dekk til filterplaten med lokket og sentrifuger deretter ved 2400 g i 20 C i 5 minutter. Vask filterplaten slik: [_] a Tilsett 45 µl stringent vaskebuffer i hver prøvebrønn. [_] b Dekk til filterplaten med lokket og sentrifuger ved 2400 g i 20 C i 5 minutter. [_] 5 [_] 6 [_] 7 [_] 8 Gjenta vaskingen som beskrevet i tidligere trinn. MERK Hvis vaskebufferen ikke dreneres helt, sentrifuger på nytt ved 2400 g i 20 C til all væsken har gått gjennom (ytterligere 5 10 minutter). Kasser alt som flyter gjennom (som inneholder formamid) og setter deretter sammen FPU. Tilsett 45 µl universalvaskebuffer i hver prøvebrønn. Dekk til filterplaten med lokket og sentrifuger ved 2400 g i 20 C i 10 minutter. MERK Påse at all væske er drenert etter sentrifugering Gjenta sentrifugeringen hvis dette er nødvendig. Side 6 av 19

7 Kommentarer Side 7 av 19

8 Ekstensjonsligasjon av bundne oligonukleotider Denne prosessen forbinder de hybridiserte oppstrøms- og nedstrøms-oligonukleotidene. En DNApolymerase strekker seg fra oppstrøms-oligonukleotiden gjennom målregionen, fulgt av ligering til 5 -enden på nedstrøms-oligonukleotiden med en DNA-ligase. Dette resulterer i dannelsen av produkter som inneholder de målrettede regionene av interesse, flankert av sekvensene som er påkrevd for amplifikasjon. Beregnet tid } Total varighet: 50 minutter } I praksis: 5 minutter Prosedyre Tilsett 45 µl av ekstensjons-ligeringsblanding i hver prøvebrønn på filterplaten. Forsegle filterplaten med klebende aluminiumfolie og dekk deretter til med lokket. Inkuber FPU-anordningen i den forhåndsoppvarmede inkubatoren på 37 C i 45 minutter. Starttid: Stopptid: Kommentarer Side 8 av 19

9 PCR-amplifisering I dette trinnet blir ekstensjonsligeringsproduktene amplifisert med primere som legger til indekssekvenser for prøvemultipleksing, i tillegg til vanlige adaptere som er påkrevd for klyngegenerering. Beregnet tid } Total varighet: ca. 90 minutter } I praksis: 30 minutter Tilberedelse Tilbered ny 0,05 N NaOH. Bestem hvilke indeksprimere som skal brukes i henhold til plategrafikkutskriften fra Illumina Worklist Manager. Bring PCR hovedblanding og de aktuelle indeksprimerne opp til romtemperatur. Vortekser hvert tint rør for å blande og gjør deretter en rask sentrifugering av rørene. Sett opp en ny 96-brønners PCR-plate (heretter kalt AMP-plate). [_] 5 Tilsett indeksprimere i AMP-platen slik: [_] a Tilsett 4 µl av de valgte indeksprimerne [A (A501) H (A508)] i den aktuelle brønnen i en kolonne på AMP-platen. [_] b Kasser de opprinnelige hvite hettene og sett på nye hvite hetter. [_] c Tilsett 4 µl av de valgte indeksprimerne [1 (A701) 12 (A712)] i den aktuelle brønnen på AMP-platen. Spissene skal byttes etter hver rad for å unngå indeks-krysskontaminering. [_] d Kasser de opprinnelige oransje hettene og sett på nye oransje hetter. [_] 6 Tilbered PCR hovedblanding/pcr polymerase PCR-arbeidsoppløsning slik: [_] a For 96 prøver tilsettes 56 µl PCR polymerase til 2,8 ml PCR hovedblanding. [_] b Snu den tilberedte PCR-arbeidsoppløsningen 20 ganger for å blande. PCR-arbeidsoppløsningen er stabil i romtemperatur i 10 minutter. Prosedyre [_] 5 Ta FPU ut av inkubatoren og fjern deretter aluminiumfolieforseglingen. Dekk til filterplaten med lokket og sentrifuger ved 2400 g i 20 C i 2 minutter. Tilsett 25 µl av 0,05 N NaOH i hver prøvebrønn på filterplaten. Pipetter NaOH opp og ned 5 6 ganger. Dekk til og inkuber filterplaten ved romtemperatur i 5 minutter. Mens filterplaten inkuberes, overføres 22 µl PCR-arbeidsoppløsning i hver brønn på AMPplaten som inneholder indeksprimere. Side 9 av 19

10 [_] 6 Overfør prøver som er eluert fra filteret til AMP-platen slik: [_] a Pipetter prøvene i første kolonne på filterplaten opp og ned 5 6 ganger. [_] b Overfør 20 µl fra filterplaten til tilsvarende kolonne på AMP-platen. [_] c Pipetter forsiktig opp og ned 5 6 ganger for å grundig kombinere DNA med PCRarbeidsoppløsningen. [_] d Overfør gjenværende kolonner fra filterplaten til AMP-platen på samme måte. Spissene skal byttes etter hver kolonne for å unngå indeks- og prøvekrysskontaminering. [_] 7 [_] 8 [_] 9 0 Forsegle AMP-platen og fest den med en gummivalse. Sentrifuger ved 1000 g i 20 C i 1 minutt. Overfør AMP-platen til postamplifiseringsområdet. Utfør PCR med følgende program på en termosykler: 95 C i 3 minutter 25 sykluser på: 95 C i 30 sekunder 62 C i 30 sekunder 72 C i 60 sekunder 72 C i 5 minutter Holdes på 10 C Starttid: Stopptid: SIKKERT STOPPEPUNKT Hvis du ikke fortsetter umiddelbart til PCR-rengjøring, kan AMP-platen bli på termosykleren over natten eller oppbevares ved 2 C til 8 C i opp til 48 timer. Kommentarer Side 10 av 19

11 PCR-rengjøring Denne prosessen bruker PCR rengjøringskuler for å rengjøre PCR-produktene fra andre reaksjonskomponenter. Beregnet tid } Total varighet: 50 minutter } I praksis: 20 minutter Tilberedelse Prosedyre [_] 5 [_] 6 [_] 7 [_] 8 [_] 9 Bring PCR rengjøringskuler til romtemperatur. Tilbered ny 80 % etanol fra absolutt etanol. Sentrifuger AMP-platen ved 1000 g i 20 C i 1 minutt. Sett opp en ny MIDI-plate (heretter kalt CLP-plate). Plate-ID: Snu PCR rengjøringskuler 10 ganger. Vortekser kraftig og snu deretter ytterligere 10 ganger. Kontroller visuelt oppløsningen for å sikre at kulene er resuspendert. Tilsett 45 µl av PCR rengjøringskuler i hver brønn i CLP-platen. Overfør hele PCR-produktet fra AMP-platen til CLP-platen. Forsegle CLP-platen og rist den på en mikroplaterister ved 1800 opm i 2 minutter. Inkuberes i romtemperatur uten risting i 10 minutter. Sett platen på et magnetstativ i minst 2 minutter eller til supernatanten er klar. Mens CLP-platen står på magnetstativet, fjernes supernatanten forsiktig og kasseres. 0 Mens CLP-platen står på magnetstativet, vaskes kulene slik: [_] a Tilsett 200 µl nytilberedt 80 % etanol i hver prøvebrønn. [_] b Inkuber platen på et magnetstativ i minst 30 sekunder eller til supernatanten er klar. [_] c Fjern supernatanten forsiktig og kasser den Gjenta vaskingen som beskrevet i tidligere trinn. Bruk et P20 flerkanalspipettesett på 20 µl til å fjerne overskytende etanol. Ta CLP-platen ut av magnetstativet og la kulene lufttørke i 10 minutter. Starttid: Stopptid: 4 5 Tilsett 30 µl elueringsbuffer til hver prøve og gjør en kort vorteksering. Forsegle CLP-platen og rist den på en mikroplaterister ved 1800 opm i 2 minutter. Etter ristingen må du kontrollere at prøvene ble resuspendert. Hvis ikke, skal dette trinnet gjentas. Side 11 av 19

12 Inkuberes i romtemperatur i 2 minutter. Sett CLP-platen på et magnetstativ i minst 2 minutter eller til supernatanten er klar. Sett opp en ny MIDI-plate (heretter kalt LNP-plate). Plate-ID: Overfør 20 µl av supernatanten fra CLP-platen til LNP-platen. [Valgfritt] Overfør gjenværende 10 µl av supernatanten fra CLP-platen til en ny plate og merk platen med et kjøringsnavn og dato. Oppbevar denne platen ved -25 C til -15 C til sekvenseringskjøringen og dataanalysen er ferdig. De rengjorte PCR-produktene kan brukes til feilsøking hvis det oppstår prøvefeil. SIKKERT STOPPEPUNKT Hvis den stopper på dette punktet, forsegles LNP-platen og sentrifugeres med 1000 g ved 20 C i ett minutt. Platen er stabil i opp til 3 timer ved 2 C til 8 C. Kommentarer Side 12 av 19

13 Biblioteknormalisering Denne prosessen normaliserer mengden i hvert bibliotek for å sikre lik bibliotekrepresentasjon i den sammenslåtte prøven. Beregnet tid } Total varighet: 1 time, 20 minutter } I praksis: 30 minutter Tilberedelse Prosedyre [_] a [_] b [_] c [_] d Tilbered ny 0,1 N NaOH. Bring biblioteknormaliserings-fortynning, bibliotekkuler og vaskeløsning for biblioteknormalisering til romtemperatur. Vortekser biblioteknormaliserings-fortynning kraftig og påse at alt bunnfallet er fullstendig oppløst. Vortekser bibliotekkuler kraftig i 1 minutt med vekselvis vending til kulene er resuspendert og ingen pellet finnes på bunnen av røret når røret er vendt opp ned. Bland biblioteknormaliserings-fortynning og bibliotekkuler i et nytt 15 ml konisk rør slik: MERK Ved behandling av < 24 prøver, bruk et nytt 1,5 ml rør. For 96 prøver tilsettes 4,4 ml av biblioteknormaliserings-fortynning. Pipetter bibliotekkuler opp og ned 10 ganger for å resuspendere. MERK Det er ekstremt kritisk at bibliotekkulepelleter på bunnen av røret blir resuspendert. Bruk av en P1000 sikrer at kulene er homogent resuspendert og at det ikke finnes kulemasse på bunnen av røret. Dette er avgjørende for å oppnå clustertetthet på flowcellen. For 96 prøver pipetteres 800 µl av bibliotekkuler til røret inneholder biblioteknormaliserings-fortynning. Bland ved å snu røret ganger. Tilsett 45 µl av den kombinerte biblioteknormaliserings-fortynning/bibliotekkuler arbeidsløsningen i hver brønn på LNP-platen som inneholder biblioteker. Forsegle LNP-platen og rist den på en mikroplaterister ved 1800 opm i 30 minutter. Starttid: Stopptid: [_] 5 Sett platen på et magnetstativ i minst 2 minutter eller til supernatanten er klar. Mens LNP-platen står på magnetstativet, fjernes supernatanten forsiktig og kasseres. Side 13 av 19

14 [_] 6 Ta LNP-platen ut av magnetstativet og vask kulene med vaskeløsning for biblioteknormalisering slik: [_] a Tilsett 45 µl vaskeløsning for biblioteknormalisering i hver prøvebrønn. [_] b Forsegle LNP-platen og rist den på en mikroplaterister ved 1800 opm i 5 minutter. [_] c Sett platen på et magnetstativ i minst 2 minutter eller til supernatanten er klar. [_] d Fjern supernatanten forsiktig og kasser den. [_] 7 [_] 8 [_] Gjenta vaskeløsning for biblioteknormalisering-prosedyren som beskrevet i tidligere trinn. Bruk et P20 flerkanalspipettesett på 20 µl til å fjerne overskytende vaskeløsning for biblioteknormalisering. Ta LNP-platen ut av magnetstativet og tilsett 30 µl med 0,1 N NaOH i hver brønn. Forsegle LNP-platen og rist den på en mikroplaterister ved 1800 opm i 5 minutter. I løpet av elueringen på 5 minutter, sett opp en ny 96-brønners PCR-plate (heretter kalt SGPplaten). Plate-ID: Tilsett 30 µl bibliotekoppbevaringsbuffer i hver brønn som skal brukes i SGP-platen. Etter elueringen på 5 minutter, påse at alle prøvene på LNP-platen er fullstendig resuspendert. Hvis prøvene ikke er fullstendig resuspendert, pipetteres disse prøvene forsiktig opp og ned, eller bank platen forsiktig mot benken for å resuspendere kulene og rist deretter i ytterligere 5 minutter. Sett LNP-platen på et magnetstativ i minst 2 minutter. Overfør supernatanten fra LNP-platen tilsgp-platen. Pipetter forsiktig opp og ned 5 ganger for å blande. Forsegle SGP-platen og sentrifuger deretter ved 1000 g ved 20 C i 1 minutt. Kommentarer SIKKERT STOPPEPUNKT Hvis du ikke fortsetter umiddelbart til bibliotekpooling og påfølgende sekvensering på MiSeqDx, oppbevares den forseglede SGP-platen i -25 C til -15 C i opptil 3 dager. Side 14 av 19

15 Bibliotek-pooling Som forberedelse til klyngegenerering og sekvensering blir like volum av normalisert bibliotek kombinert, fortynnet i hybridiseringsbuffer og varmedenaturert før sekvensering på MiSeqDx. PhiX brukes som intern kontroll for sekvensering. Beregnet tid } Total varighet: 10 minutter } I praksis: 10 minutter Klargjøring for bibliotek-pooling Still inn en varmeblokk som rommer 1,5 ml sentrifugerør på 96 C. Tilbered et isbad i en isbøtte. Avkjøl bibliotekfortynningsbuffer i isbadvannet. Begynn å tine MiSeqDxs reagenskassett. Tilberede en ny fortynning av NaOH FORSIKTIG Det er avgjørende å bruke ny, fortynnet NaOH for å fullstendig denaturere prøver for clustergenerering på MiSeqDx. Kombiner følgende volumer i et mikrosentrifugerør: DNase, RNase-fritt vann (900 µl) Stamløsning 1,0 N NaOH (100 µl) Snu røret flere ganger for å blande. Denaturere og fortynne PhiX internkontroll [_] 5 Kombiner følgende volumer for å fortynne PhiX internkontroll-biblioteket til 2 nm: 10 nm PhiX internkontroll-bibliotek (2 µl) 1X TE Buffer (8 µl) Kombiner følgende volum for å oppnå et 1 nm PhiX internkontroll-bibliotek: 2 nm PhiX internkontroll-bibliotek (10 µl) 0.1 N NaOH (10 µl) Vortekser kort for å blande 1 nm PhiX internkontroll-bibliotekoppløsningen. Sentrifuger templatløsningen ved 280 g i 20 C i 1 minutt. Inkuber i 4,5 minutter i romtemperatur for å denaturere PhiX internkontroll-biblioteket i enkle tråder. Side 15 av 19

16 [_] 6 Tilsett følgende volum med forhåndsavkjølt bibliotekfortynningsbuffer i røret som inneholder denaturert PhiX internkontroll-bibliotek for å oppnå et 20 pm PhiX internkontroll-bibliotek. Denaturert PhiX internkontroll-bibliotek (20 µl) Forhåndsnedkjølt bibliotekfortynningsbuffer (980 µl) Klargjøre reagenskassetten Tin MiSeqDx-reagenskassett - CF 139-variantanalyse i vannbad som har tilstrekkelig avionisert vann med romtemperatur til at bunndelen av reagenskassetten når opp til vannlinjen som er trykket på reagenskassetten. Ikke la vannet komme høyere enn maksimum vannlinje. La reagenskassetten tine i vannbadet med romtemperatur i omtrent 1 time eller til den er opptint. Starttid: Stopptid: Ta kassetten opp av vannbadet og bank den forsiktig på benken for å fjerne vann fra bunndelen av kassetten. Tørk av bunndelen av kassetten. Påse at det ikke har kommet vann på øvre delen av reagenskassetten. Kontrollere reagenskassetten Snu reagenskassetten ti ganger for å blande de tinte reagensene og kontroller deretter at alle posisjonene er tint. MERK Det er kritisk av reagensene i kassetten er grundig tint og blandet for å sikre tilfredsstillende sekvensering. Kontroller reagensene i posisjon 1, 2 og 4 for å påse at de er fullt blandet og fri for bunnfall. Bank kassetten forsiktig mot benken for å redusere luftbobler i reagensene. MERK MiSeqDx-sugerørene går til bunnen på hvert reservoar for å aspirere reagensene, så det er viktig at reservoarene er fri for luftbobler. Sett reagenskassetten på is eller sett den til side ved 2 C til 8 C (opp til 6 timer) til det klart til å sette opp kjøringen. For å få de beste resultatene, fortsett direkte til innlasting av prøven og oppsetting av kjøringen. Klargjøre prøver for sekvensering Bring bibliotekfortynningsbuffer til romtemperatur. Vortekser bibliotekfortynningsbuffer og påse at alt bunnfallet er fullstendig oppløst. Hvis SGP-platen ble oppbevart frossen, skal SGP-platen tines i romtemperatur. Sentrifuger SGP-platen ved 1000 g i 20 C i 1 minutt. Sett ut et nytt Eppendorf-rør (heretter kalt PAL-rør.) Rør-ID: Side 16 av 19

17 [_] 5 [_] 6 [_] 7 [_] 8 [_] Bestem hvilke prøver som skal grupperes for sekvensering. Maksimum 48 prøver kan grupperes for sekvensering. Hvis SGP-platen var oppbevart frossen, blandes hvert bibliotek som skal sekvenseres ved å pipettere opp og ned 3-5 ganger. Overfør 5 µl av hvert bibliotek som skal sekvenseres fra SGP-plate, kolonne etter kolonne, til en strimmel med åtte PCR-rør. Forsegle SGP med en klebeplateforsegling og sett den til side. MERK Etter bruk oppbevares den forseglede SGP-platen ved -25 C til -15 C. Den forseglede SGPplaten er stabil i opp til 3 dager. Kombiner og overfør inneholdene i strimmelen med åtte PCR-rør til PAL-røret. Bland PALrøret grundig. Sett ut et nytt Eppendorf-rør (heretter kaltdal-rør.) Rør-ID: Tilsett 585 µl bibliotekfortynningsbuffer i DAL-røret. Tilsett 6 µl av 20 pm PhiX internkontroll i DAL-røret. Pipetter opp og ned 3-5 ganger for å skylle spissen og sikre at overføringen er fullstendig. Overfør 9 µl av PAL- til DAL-røret som inneholder bibliotekfortynningsbuffer. Pipetter opp og ned 3-5 ganger for å skylle spissen og sikre at overføringen er fullstendig. Bland DAL ved å vorteksere røret med topphastighet. Sentrifuger DAL-røret ved 1000 g i 20 C i 1 minutt. Inkuber DAL-røret på en varmeblokk ved 96 C i 2 minutter. Etter inkubasjonen inverteres DAL-røret 1-2 ganger for å blande, og settes deretter umiddelbart i isvann. La DAL-røret stå i isvann i 5 minutter. Kommentarer Side 17 av 19

18 Biblioteksekvensering Flowcellen skal vaskes, tørkes og lastes inn i MiSeqDx, prøvene skal lastes inn i reagenskassetten, reagenskassetten lastes inn i MiSeqDx og sekvenseringskjøringen startes. MiSeqDx utfører clustergenerering, sekvensering ved syntese og dataanalyse. Beregnet tid } Total sekvenseringsvarighet: ~27 timer } I praksis: ~5 minutter Prosedyre [_] 5 [_] 6 [_] 7 [_] 8 [_] Det finnes flere detaljer om trinnene beskrevet her i Referanseveiledning for MiSeqDx-instrumentet (delenummer ). Bruk en separat, ren og tom 1 ml pipettespiss til å gjennomhulle folieforseglingen over reservoaret på MiSeqDx-reagenskassett - CF 139-variantanalyse merket Load Samples (Last inn prøver). Pipetter 600 µl av DAL-prøvebibliotekene til beholderen merket Load Samples (Last inn prøver). Vær forsiktig slik at du unngår å berøre folieforseglingen mens prøven dispenseres. Sjekk for luftbobler i reservoaret etter at prøven er lastet inn. Hvis luftbobler er tilstede, banker du kassetten forsiktig mot benken for å frigjøre boblene. Logg inn på MiSeq-driftsprogramvare. MiSeqDx-serienummer: Dato for siste forebyggende vedlikehold: Velg Sequence (Sekvens). En serie med kjøringsoppsettskjermbilder åpnes. Rengjør flowcellen. Last inn flowcellen Tøm avfallsflasken og last inn MiSeqDx SBS-løsning (PR2) - CF 139-variantanalyse-flasken. Last inn reagenskassetten. Bekreft kjøringsinnstillingene og resultatene fra før kjøring-kontrollen. Start kjøringen. Kjørings-ID: Utfør en etter kjøring-vask Kommentarer Side 18 av 19

19 Illumina 5200 Illumina Way San Diego, California, U.S.A ILMN (4566) (utenfor Nord-Amerika) Emergo Europe Molenstraat BH The Hague Nederland