MiSeqDx -instrument. Katalognr. DX Tiltenkt bruk. Prosedyreprinsipper. Prosedyrebegrensninger TIL IN VITRO-DIAGNOSTISK BRUK

Transkript

1 MiSeqDx -instrument TIL IN VITRO-DIAGNOSTISK BRUK Katalognr. DX Tiltenkt bruk Illumina MiSeqDx er et sekvenseringsinstrument som måler fluoresente signaler fra merkede nukleotider ved bruk av instrumentspesifikke reagenser og flowceller (MiSeqDx universalsett 1.0), avbildingsmaskinvare og dataanalyseprogramvare. MiSeqDx-plattformen er beregnet for målrettet sekvensering av humant genom-dna fra perifere helblodsprøver. MiSeqDx-plattformen er ikke beregnet for hele genomet eller de novo-sekvensering. MiSeqDx er beregnet brukt med Illumina-levert IVD-analyser og reagenssett. Prosedyreprinsipper Illumina MiSeqDx er beregnet for målrettet resekvensering av humant genom-dna fra perifere helblodsprøver ved bruk av Illumina-anskaffede forbruksvarer. Det genomiske DNA-et behandles via klargjøringstrinnene for biblioteket, som spesifikt amplifiserer de tiltenkte genomiske områdene på hver prøve ved bruk av tilpassede oligonukleotider som er utformet av brukeren, mens det også tilføyer indekser og flowcelle-innfangingssekvenser til de amplifiserte produktene. Klargjør av biblioteket består av fire hovedtrinn: Hybridisering, ekstensjonsligering, PCRamplifisering og biblioteknormalisering. De resulterende normaliserte prøvebibliotekene er klar for sekvensering på Illumina MiSeqDx-instrumentet ved bruk av SBS (sekvensering ved syntese)-kjemi. SBS-kjemi bruker en reversibel terminatormetode for å detektere enkle nukleotidebaser idet de blir inkorporert i voksende DNA-strenger. Programvaren for sanntidsanalyse (RTA) utfører bildeanalyser og basepåvisning, i tillegg til tildeling av kvalitetsskår på hver base for hver sekvenseringssyklus. Når den primære analysen er utført, behandler MiSeq Reporter-programvaren på MiSeqDx-instrumentet basepåvisne med sekundæranalyse, som inkluderer demultipleksing, FASTQ-filgenering, sammenstilling, variantpåvisning og generering av VCF (filer) som inneholder informasjon om varianter som ble funnet ved spesifikke posisjoner i et referansegenom. Prosedyrebegrensninger 1 Til in vitro-diagnostisk bruk. 2 Dette produktet er begrenset til å levere: Sekvenseringsutgang >1 Gb Avleser > millioner Avlesingslengde (i parvis endekjøring) 2 x 10 bp Baser høyere enn Q0 >7 % (mer enn 7 % av basene har en kvalitetsskår på Phred-skalaen som er høyere enn 0, noe som indikerer en basepåvisningsnøyaktighet på mer enn 99,9 %) Varianter i homopolymerkjøringer som overstiger åtte baser, filtreres ut i VCF-filene (R8-filter). Systemet har blitt validert for detektering av SNV og opptil baseslettinger. Evaluering av 1-bases innsettinger har blitt begrenset til ulike innsettinger på separate kromosomer. Systemet har problemer med å detektere 1-bases innsettinger eller slettinger i homopolymerspor (for eksempel polya). 6 MiSeqDx-systemet er utformet for levering av kvalitative resultater (det vil si genotyperesultater). 7 Som ved all hybridiseringsbasert arbeidsflyt kan underliggende polymorfismer eller mutasjoner, innsettinger eller slettinger i oligonukleotidbindende områder påvirke allelene som sonderes, og derfor også påvisne som utføres. 8 Anbefalt minimal dekning per amplikon som kreves for nøyaktig variantpåvisning (Q(max_gt poly_site) >= 100), er 7x. Februar 201 Delenr Rev. B NOR 1

2 Produktkomponenter Illumina MiSeqDx består av følgende: MiSeqDx-instrumentet (Katalognr. DX ) Følgende programvarekomponenter er påkrevd for MiSeqDx-bruk og dataanalyse: Programvareapplikasjon Funksjon Beskrivelse MOS MiSeqDxdriftsprogramvare Kontrollerer instrumentbetjening MOS-programvaren styrer betjen av instrumentet under sekvensering og genererer bilder til bruk med programvaren Real-Time Analysis (RTA). RTA programvare for sanntidsanalyse Utfører primære analyser RTA-programvaren konverterer bildene generert av MOS for hver plate per syklus av sekvenseringskjør til basepåvisningsfiler som er innganger for MiSeq Reporter-programvaren. RTA-programvaren inneholder ikke brukergrensesnitt. MiSeq Reporter Utfører sekundæranalyse Oppbevaring og håndtering MiSeq Reporter-programvaren behandler base med sekundær analyse, som inkluderer demultipleksing, FASTQ filgenerering, innretting, variantpåvisning og generering av VCF-filer som inneholder informasjon om varianter som finnes ved spesifikke posisjoner i et referansegenom. Element Temperatur Fuktighet Spesifikasjon Transport og oppbevaring: -10 C til 0 C (1 F til 10 F) Driftsforhold: 19 C til 2 C (66 F til 77 F) Transport og oppbevaring: Ikke-kondenserende luftfuktighet Driftsforhold: 0 7 % relativ luftfuktighet (ikke-kondenserende) Utstyr og materialer som er påkrevd, men som ikke følger med Forbruksmateriell til sekvensering MiSeqDx universalsett 1.0 (Katalognr. DX ) Forbruksmateriell skaffet av brukeren Påse at følgende forbruksmaterialer, skaffet av brukeren, er tilgjengelig før en kjøring starter. Forbruksmateriale Spritkluter, 70 % isopropyl eller Etanol, 70 % Laboratorieklut, lavt lo Linsepapir, x 6 tom. Tween 20 Pinsett, firkantspiss plast (ekstrautstyr) Vann, DNase-fri, RNase-fri Formål Rengjøring av flowcelleholder Rengjøring av flowcellehyllen Rengjøring av flowcellen Vaske instrumentet Fjerne flowcelle fra flowcellens transportbeholder Vaske instrumentet 2 Delenr Rev. B NOR Februar 201

3 Retningslinjer for DNase- og RNase-fritt vann Bruk alltid DNase- og RNase-fritt vann for å utføre instrumentprosedyrer. Bruk aldri springvann eller avionisert vann. Alle følgende eksempler er godkjent: 18 Megaohm (MΩ) vann Milli-Q-vann Super-Q-vann Molekylært vann av biologiklasse Advarsler og forholdsregler FORSIKTIG Ifølge amerikansk lovgivning kan denne enheten kun selges av, eller på bestilling av, en lege aller annen allmennpraktiserende lege, lovmessig lisensiert i staten vedkommende praktiserer, for å bruke eller pålegge bruk av enheten. 1 Noen komponenter i Illuminas reagenser til bruk med MiSeqDx-instrumentet inneholder formamid, et alifatisk amid som er et mulig reproduktivt toksin. (Se de respektive produktvedleggene for mer informasjon.) Personskade kan forekomme ved inhalasjon, svelging, hudkontakt og øyekontakt. Kasser beholdere og eventuelt ubrukt i samsvar med gjeldende lokale offentlige sikkerhetsstandarder. For mer informasjon, kontakt Illumina tekniske støtte. 2 Noen av komponentene i Illuminas reagenssett inneholder 2-mercaptoetanol, et reduseringsmiddel. (Se de respektive produktvedleggene for mer informasjon.) Personskade kan forekomme ved inhalasjon, svelging, hudkontakt og øyekontakt. Brukes i et godt ventilert område og eventuelle beholdere og ubrukt skal kasseres i samsvar med gjeldende lokale, statlige sikkerhetsstandarder. For mer informasjon, kontakt Illuminas tekniske støtte. Håndter alle prøver som om de er potensielt infeksiøse stoffer. Hvis du unnlater å følge prosedyrene som beskrevet, kan det resultere i feil resultater eller betydelig reduksjon i prøvekvaliteten. Bruk rutinemessige forholdsregler for laboratoriet. Ikke pipetter med munnen. Ikke spis, drikk eller røyk i tilordnede arbeidsområder. Bruk engangshansker og laboratoriefrakker når du håndterer prøver og settreagenser. Vask hendene grundig etter å ha håndtert prøvene og settreagensene. 6 God laboratoriepraksis og god laboratoriehygiene er påkrevd for å hindre at PCR-produkter fra kontaminerende reagens, instrumentering og genomiske DNA-prøver. PCR-kontaminering kan medføre unøyaktige og upålitelige resultater. 7 For å hindre kontaminering på du påse at preamplifiserings- og postamplifiserings-områdene har sitt eget utstyr (som pipetter, pipettespisser, vortekser og sentrifuge). 8 Indeksprøvesammensetn må samsvare nøyaktig med prøvearket. Misforhold mellom prøvearket og plateoppsettet vil resultere i tap av positiv prøveidentifikasjon og uriktig resultatrapportering. 9 Under biblioteknormaliseringstrinnene i de respektive reagensproduktvedleggene, er det ekstremt kritisk å resuspendere bibliotek-kulen. Dette er avgjørende for å oppnå clustertetthet på MiSeqDx flowcellen. 10 Følg de spesifiserte inkubasjonstidene i biblioteknormaliseringstrinnene som beskrevet i de respektive reagenspakkevedleggene. Feil inkubasjon kan påvirke bibliotekrepresentasjonen og clustertettheten. 11 Installasjon av brukerlevert antivirusprogramvare anbefales sterkt for å beskyttede datamaskinen mot virus. Se brukerhåndboken for instruksjoner om installasjon. 12 Ikke betjen MiSeqDx med noen av dekslene fjernet. Betjening av instrumentet med noen av dekslene fjernet utgjør mulig eksponering til nettspenning eller likespenning. 1 Ikke berør flowcellehyllen i flowcellekammeret. Varmeenheten i dette kammeret fungerer mellom 22 C og 9 C og kan forårsake brannsår. 1 Instrumentet veier omtrent 7 kg og kan forårsake alvorlig skade hvis det faller ned eller behandles på feil måte. Februar 201 Delenr Rev. B NOR

4 Prosedyremessige merknader Gjennomløpet per MiSeqDx-kjøring kan være mellom 8 og 8 prøver. Indekseringsprimerne som brukes under PCRamplifiser, må velges på grunnlag av ønsket endelig prøvegjennomløp for å sikre diversitet i indekssekvensen. MERK For å få maksimal gjennomløpseffektivitet må biblioteksklargjøring utføres for opptil 96 prøver, og deretter må prøvene deles inn i to sekvenseringskjøringer med maksimum 8 prøver hver. MiSeqDx bruker en grønn LED-lampe for å sekvensere G/T-baser og en rød LED-lampe til sekvensering av A/C-baser. For hver syklus må minst én av to nukleotider i hver fargekanal avleses for å sikre riktig registrering. Det er viktig å opprettholde fargebalansen for hver base av indeksavles som sekvenseres, ellers kan det oppstå registreringsfeil under sekvensering av indeksavles. Hvis det sekvenseres færre enn 8 prøver i en sekvenseringskjøring, velges de aktuelle indeksene, basert på sine sekvenser for å opprettholde fargebalansen i de grønne og røde kanalene. Som minimum må kjøringer med 8 til 8 prøver inkludere indekseringsprimerkombinasjonene som identifiseres i pakningsvedlegget for MiSeqDx universalsett 1.0. For å behandle mindre kjøringer på riktig måte må det være minst åtte prøver til stede. Hvis seks unike prøver (ekskludert de positive og negative kontrollene) ikke er tilgjengelige, er det akseptabelt å fylle kjør med prøvereplikater eller enhver form for human DNA-prøve. Se pakningsvedlegget for MiSeqDx universalsett 1.0 for det minimale settet med fargebalanserte indekser til bruk ved sekvenseringskjøringer med åtte prøver. Bruksanvisning Følgende bruksanvisning for MiSeqDx-instrumentet krever reagenser skaffet i MiSeqDx universalsett 1.0. Klargjøre prøveark for MiSeqDx 1 Fra velkomstskjermen på Illumina Worklist Manager velges Create Worklist (Opprett arbeidsliste). 2 Velg MiSeqDx Universal i feltet Test Type (Testtype). I feltet Worklist Name (Arbeidslistenavn), oppgi et navn på prøvearket. Hvis den alfanumeriske strekkode-id-en på reagenskassetten brukes som prøvearknavn, vil MiSeqdriftsprogramvare (MOS) finne prøvearket automatisk. Hvis det blir brukt et annet navn på prøvearket, kan knappen Browse (Bla gjennom) MiSeqdriftsprogramvare (MOS) brukes til å finne det aktuelle prøvearket. [Valgfritt] Gi en beskrivelse for å identifisere kjør. Sørg for at datoen overensstemmer med startdatoen på kjør. 6 Velg Next (Neste). Oppgi prøveinformasjon 1 Fra fanen Table (Tabell) eller Plate, oppgi følgende informasjon for hver prøvebrønn: a Prøve-ID Oppgi en unik prøve-id. b Indeks 1 og Indeks 2 Spesifiser indeksadapteren som skal brukes for hver indeksavlesing. c Manifest Angi navnet på manifestfilen som inneholder informasjon om prøvene i denne spesielle brønnen. 2 [Valgfritt] Hvis du vil registrere mer detaljert informasjon om prøvene, kan du oppgi et prøvenavn og beskrivelse. [Valgfritt] Du kan identifisere kontroller på platen ved å velge Negative eller Positive fra nedtrekkmenyen Control (Kontroll). Gå til fanen for plategrafikk og bruk alternativet Copy to Clipboard (Kopier til utklippstavle) eller Print (Skriv ut) for å fange et bilde av prøveplaten. Velg Finish (Avslutt). Delenr Rev. B NOR Februar 201

5 Klargjøre prøve Følgende trinn må utføres i samsvar med bruksanvisn i pakningsvedlegget for MiSeqDx Universal Kit 1.0: Hybridisering av sammenslåtte oligonukleotider Fjerning av ubundne oligonukleotider Ekstensjonsligasjon av bundne oligonukleotider PCR-amplifisering PCR-rengjøring Biblioteknormalisering Biblioteksammenslåing Klargjøre reagenskassetten 1 Tin Reagenskassett for MiSeqDx i vannbad som har tilstrekkelig avionisert vann med romtemperatur til at bunndelen av reagenskassetten når opp til vannlinjen som er trykket på reagenskassetten. Ikke la vannet komme høyere enn maksimum vannlinje. 2 La reagenskassetten tine i vannbadet med romtemperatur i omtrent 1 time eller til den er fullstendig opptint. Ta kassetten opp av vannbadet og bank den forsiktig på benken for å fjerne vann fra bunndelen av kassetten. Tørk av bunndelen av kassetten. Påse at det ikke har kommet vann på den øvre delen av reagenskassetten. Kontrollere reagenskassetten 1 Snu reagenskassetten ti ganger for å blande de tinte reagensene og kontroller deretter at alle posisjonene er tint. MERK Det er kritisk av reagensene i kassetten er grundig tint og blandet for å sikre tilfredsstillende sekvensering. 2 Kontroller reagensene i posisjon 1, 2 og for å påse at de er fullt blandet og fri for bunnfall. Bank kassetten forsiktig mot benken for å redusere luftbobler i reagensene. MERK MiSeqDx-sugerørene går til bunnen på hvert reservoar for å aspirere reagensene, så det er viktig at reservoarene er fri for luftbobler. Sett reagenskassetten på is eller sett den til side ved 2 C til 8 C (opp til 6 timer) til det klart til å sette opp kjør. For å få de beste resultatene, fortsett direkte til innlasting av prøven og oppsetting av kjør. Klargjøre prøver for sekvensering 1 Bring Bibliotekfortynningsbuffer til romtemperatur. Vortekser Bibliotekfortynningsbuffer og påse at alt bunnfallet er fullstendig oppløst. 2 Hvis SGP-platen ble oppbevart frossen, skal SGP-platen tines i romtemperatur. Sentrifuger SGP-platen ved 1000 g i 20 C i 1 minutt. Sett ut et nytt Eppendorf-rør (heretter kalt PAL-rør.) Bestem hvilke prøver som skal grupperes for sekvensering. Maksimum 8 prøver kan grupperes for sekvensering. 6 Hvis SGP-platen var oppbevart frossen, blandes hvert bibliotek som skal sekvenseres ved å pipettere opp og ned - ganger. 7 Overfør µl av hvert bibliotek som skal sekvenseres fra SGP-plate, kolonne etter kolonne, til en strimmel med åtte PCR-rør. Forsegle SGP med en klebeplateforsegling og sett den til side. MERK Etter bruk oppbevares den forseglede SGP-platen ved -2 C til -1 C. Den forseglede SGP-platen er stabil i opp til dager. 8 Kombiner og overfør inneholdene i strimmelen med åtte PCR-rør til PAL-røret. Bland PAL-røret grundig. 9 Sett ut et nytt Eppendorf-rør (heretter kaltdal-rør.) Februar 201 Delenr Rev. B NOR

6 10 Tilsett 8 µl Bibliotekfortynningsbuffer i DAL-røret. 11 Tilsett 6 µl av 20 pm PhiX internkontroll i DAL-røret. Pipetter opp og ned - ganger for å skylle spissen og sikre at overfør er fullstendig. 12 Overfør 9 µl av PAL- til DAL-røret som inneholder Bibliotekfortynningsbuffer. Pipetter opp og ned - ganger for å skylle spissen og sikre at overfør er fullstendig. 1 Bland DAL ved å vorteksere røret med topphastighet. 1 Sentrifuger DAL-røret ved 1000 g i 20 C i 1 minutt. 1 Inkuber DAL-røret på en varmeblokk ved 96 C i 2 minutter. 16 Etter inkubasjonen inverteres DAL-røret 1-2 ganger for å blande, og settes deretter umiddelbart i isvann. 17 La DAL-røret stå i isvann i minutter. Laste inn prøvebiblioteker på kassetten 1 Bruk en separat, ren og tom 1 ml pipettespiss til å gjennomhulle folieforsegl over reservoaret på reagenskassetten merket Load Samples (Last inn prøver). 2 Pipetter 600 µl av DAL -prøvebibliotekene til beholderen merket Load Samples (Last inn prøver). Vær forsiktig slik at du unngår å berøre folieforsegl mens prøven dispenseres. Sjekk for luftbobler i reservoaret etter at prøven er lastet inn. Hvis luftbobler er tilstede, banker du kassetten forsiktig mot benken for å frigjøre boblene. Fortsett direkte til kjøringsoppsett-trinnene ved bruk av MiSeq-driftsprogramvare (MOS)-grensesnittet. Kjøringsoppsett 1 Logg inn på MiSeq-driftsprogramvare (MOS). 2 Velg Sequence (Sekvens). En serie med kjøringsoppsettsskjermer åpnes i denne rekkefølgen: Select Run Type (Velg kjøringstype), Load Flow Cell (Sett inn flowcelle), Load Reagents (Last inn reagenser), Review (Gjennomgang) og Pre-Run Check (Før kjøring-kontroll). Velg Diagnostic Run (Diagnostisk kjøring). Når skjermen Load Flow Cell (Sett inn flowcelle) vises, skal flowcellen rengjøres og lastes inn. Lukk flowcellelåsen og døren til flowcellekammeret. Både låsen og kammerdøren skal være lukket før kjør begynner. Når flowcellen er satt inn, vil programvaren lese av og registrere RFID-en. En bekreftelse om at RFID var avlest vises nederst i høyre hjørne på skjermen. 6 Når skjermen Load Reagents (Last inn reagenser) vises, tømmes avfallsflasken, flasken MiSeqDx SBS-løsning (PR2) settes inn og deretter lastes reagenskassetten. Når flasken med MiSeqDx SBS-løsn (PR2) og reagenskassetten er lastet inn, vil programvaren lese av og registrere RFID-en. En bekreftelse om at RFID var avlest vises nederst i høyre hjørne på skjermen. 7 Velg det aktuelle prøvearket. Som standard vil programvaren se etter en prøvearkfil med et navn som samsvarer med strekkodetallet på reagenskassetten som er lastet inn på instrumentet. 8 Bekreft kjøringsinnstille og resultatene fra før kjøring-kontrollen. 9 Start kjør. Sekvenseringsskjermen åpnes når kjør begynner. Denne skjermen gir en visuell fremstilling av kjørs fremgang, inkludert intensiteter og kvalitetskårer (Q-skårer). Resultater Den integrerte primæranalyseprogramvaren ([sanntidsanalyse RTA]) utfører bildeanalyse og basepåvisning, i tillegg til at den tildeler en kvalitetsskår for hver base for hver sekvenseringssyklus. Når primæranalysen er ferdig, starter MiSeq Reporter programvaren på MiSeqDx-instrumentet sekundæranalysen som beskrevet nedenfor. 6 Delenr Rev. B NOR Februar 201

7 Demultipleksing Demultipleksing er det første trinnet i analysen hvis prøvearket har oppført flere prøver og kjør har indeksavlesinger. Demultipleksing skiller data fra samlede prøver, basert på korte indekssekvenser som merker prøver fra ulike biblioteker. Hver indeksavlest sekvens sammenlignes med indekssekvensene som er spesifisert i prøvearket. Ingen kvalitetsverdier vurderes på dette trinnet. FASTQ-filgenerering Etter demultipleksing MiSeq Reporter genereres mellomliggende filer i FASTQ-formatet, som er en tekstform som brukes til å representere sekvensene. FASTQ-filer inneholder avlese for hver prøve og kvalitetsskårene, uten avlesinger fra eventuelle clustere som ikke passerer filteret. Kvalitetsskåren Q beregnes som -10 log 10 P, der P er sannsynligheten for at basepåvisn er feil. Sammenstilling Innretting sammenligner sekvenser mot referansen for å identifisere et forhold mellom sekvenser og tildeler en skår, basert på likhetsområder. Innrettede avlesinger skrives til filer i BAM-format. For MiSeqDx universalsett 1.0 bruker MiSeq Reporter en "bundet" Smith-Waterman-algoritme som utfører lokale sekvenssammenstillinger for å fastslå lignende områder mellom to sekvenser. Variantpåvisning For MiSeqDx universalsett 1.0 bruker MiSeq Reporter Starling-variantpåvisning, som påviser SNP-er og små indeler i tillegg til å oppsummere dybde og sannsynligheter for hver posisjon i genomet. Starling produserer html-formaterte rapporter for SNP-er og indeler og tabulatoravgrensede tekstfiler som inneholder varianter i variantpåvisningsformatet (VCF). For informasjon om hvordan resultatene kan beregnes fra VCF-filer se Brukerveiledning for MiSeq Reporter (delenr ). Ytelseskarakteristikker Nøyaktighet Tre separate studier ble utført for å vurdere nøyaktigheten ved MiSeqDx-plattformen. Studie 1 Denne studien brukte en representativ analyse, utarbeidet for å utforske en rekke gener som dekker 2. baser over 19 ulike kromosomer og inneholder potensielt klinisk relevante eksoner. De 1 unike prøvene som brukes i denne studien kommer fra to foreldre og 11 barn som har blitt sekvensiert ofte av flere laboratorier og sekvenseringsmetoder. Det foreligger seks prøver fra kvinner og sju fra menn. Nøyaktigheten ble fastslått for enkle nukleotidevarianter (SNV) ved å sammeligne studiedata med en godt karakterisert referansedatabase. Referansedatabase-sekvensen ble avledet av kombinasjonen av flere sekvenseringsmetoder, offentlig tilgjengelige data og arvelighetsinformasjon. Følgende tabell for evaluering av nøyaktigheten i systemet var sammensatt fra data fra den første kjør i studien. Ingen repetisjonstesting ble utført for denne studien. Resultatene fra denne studien er beskrevet nedenfor. Februar 201 Delenr Rev. B NOR 7

8 Tabell 1 Studie 1 Presisjonsdata på amplikonnivå for MiSeqDx plattform Amplikon Kromosom Analysert fragmentstørrelse 1 Amplikongenomisk unike prøver analyserte prøver 2 per prøve som kan utføres per prøve Poly C (), 6 % GC Poly T () Poly T () Poly A (6) Poly T (), Poly C () Poly T () Poly A (1) Poly A () Poly A (), Poly T () Delenr Rev. B NOR Februar 201

9 Amplikon Kromosom Analysert fragmentstørrelse 1 Amplikongenomisk unike prøver analyserte prøver 2 per prøve som kan utføres per prøve Poly T () Poly T (), SNV Poly A () Poly A (6), Poly T (), Homologt område på et annet kromosom Homologt område på et annet kromosom Poly T () Poly C (7), 66 % GC 26 1 Poly C (), 69 % GC SNV Delenr Rev. B NOR Februar 201

10 Amplikon Kromosom Analysert fragmentstørrelse 1 Amplikongenomisk unike prøver analyserte prøver 2 per prøve som kan utføres per prøve Poly A () SNV Poly T () Poly A () Poly T (6) Poly A () Poly T (), SNV 0 1 Poly T (), SNV SNV Delenr Rev. B NOR Februar 201

11 Amplikon Kromosom Analysert fragmentstørrelse 1 Amplikongenomisk unike prøver analyserte prøver 2 per prøve som kan utføres per prøve Poly T () Poly A (7) Poly A (6) Poly A () Poly A () CT() SNV Delenr Rev. B NOR Februar 201

12 Amplikon Kromosom Analysert fragmentstørrelse 1 Amplikongenomisk unike prøver analyserte prøver 2 per prøve som kan utføres per prøve Poly T (6) % GC Poly A (6) Poly T (8) % GC Poly A () 9 % GC Poly C (), 6 % GC % GC SNV Poly A () Poly T () Delenr Rev. B NOR Februar 201

13 Amplikon Kromosom Analysert fragmentstørrelse 1 Amplikongenomisk unike prøver analyserte prøver 2 per prøve som kan utføres per prøve % GC % GC Poly G (6), 61 % GC Poly T () Poly A (6) % GC % GC Poly T () Homologt område på et annet kromosom Homologt område på et annet kromosom Poly A (1) (av 10) Delenr Rev. B NOR Februar 201

14 Amplikon Kromosom Analysert fragmentstørrelse 1 Amplikongenomisk unike prøver analyserte prøver 2 per prøve som kan utføres per prøve Homologt område på et annet kromosom; SNV Poly A () Poly C () % GC Poly A () 7 % GC % GC Poly C (), 67 % GC % GC % GC % GC % GC SNV Delenr Rev. B NOR Februar 201

15 Amplikon Kromosom Analysert fragmentstørrelse 1 Amplikongenomisk unike prøver analyserte prøver 2 per prøve som kan utføres per prøve % GC Poly T () % GC Poly T (); Homologt område på et annet kromosom CA() Poly A (6); Homologt område på et annet kromosom Poly C (); SNV % GC Delenr Rev. B NOR Februar 201

16 Amplikon Kromosom Analysert fragmentstørrelse 1 Amplikongenomisk unike prøver analyserte prøver 2 per prøve som kan utføres per prøve Poly T (10) Poly T () Poly A () Poly T () Poly A (6) Poly T (6) Poly T () Poly T (8); 19 % GC Poly A (); Poly T () Poly A () % GC SNV Poly T (8); SNV Poly A () Delenr Rev. B NOR Februar 201

17 Amplikon Kromosom Analysert fragmentstørrelse 1 Amplikongenomisk unike prøver analyserte prøver 2 per prøve som kan utføres per prøve Poly A () % GC Poly C () SNV Poly T (6) Poly T (); 26 % GC Poly A () Delenr Rev. B NOR Februar 201

18 Amplikon Kromosom Analysert fragmentstørrelse 1 Amplikongenomisk unike prøver analyserte prøver 2 per prøve som kan utføres per prøve % GC Poly C () % GC Poly C (6); 60 % GC SNV % GC Poly C (); 6 % GC Poly G (6); 67 % GC SNV % GC Poly C () % GC Delenr Rev. B NOR Februar 201

19 Amplikon Kromosom Analysert fragmentstørrelse 1 Amplikongenomisk unike prøver analyserte prøver 2 per prøve som kan utføres per prøve % GC Poly A (6) % GC Poly G (6); 66 % GC % GC % GC % GC Homologt område på et annet kromosom Delenr Rev. B NOR Februar 201

20 Amplikon Kromosom Analysert fragmentstørrelse 1 Amplikongenomisk unike prøver analyserte prøver 2 per prøve som kan utføres per prøve Poly C (); 72 % GC Homologt område på et annet kromosom % GC % GC Poly T () Poly A (7) Poly A (); Poly C () % GC SNV % GC Analysert fragment betyr størrelsen på det sekvenserte genomiske området i baser, ikke inkludert målspesifikke primere. 2 oppførte prøver er 1, fordi to av de 1 unike prøvene som var analysert, var kjørt i to uavhengige replikater. /prøver som kunne gjøres, er et baser som hadde tilstrekkelig kvalitet til å bli påvist av systemet. et er et baser i et amplikon som resulterer i en påvisning i kjør. et per prøve er et påviste baser i amplikonet som hadde resultater som samsvarte med referansesekvensen for det humane genomet, versjon 19 og den godt karakteriserte sammensatte referansen. 6 et u var det totale et u påvisning for SNV eller indel i dette amplikonet. Ytterligere detaljer om feil er beskrevet i fotnoten nedenfor. 7 tilsvarer riktig påvisningsfrekvens for alle baser i amplikonet, der riktig påvisning for SNV eller indel er basert på brønnens karakteriserte sammensatte referanseinformasjon, og den påvisn for baser i det som gjenstår av amplikonsekvensen, er basert på sammenligning med humant gemon-referansesekvens versjon 19. Denne kolonnen kan ha mer enn ett forventet resultat for et gitt amplikon hvis noen prøver forventes å inneholde en indel, og enkelte ikke forventes å ha det, f.eks. amplikon 9. for prøvene med feil resultat er presentert i tabellen. 20 Delenr Rev. B NOR Februar 201

21 8 Amplikon 9 har en homopolymerkjøring på 1 A-er i henhold til humant genom-referansesekvensen versjon 19. Den godt karakteriserte sammensatte referanseinformasjonen for 7 av 1 prøver har imidlertid 1 A-er i denne homopolymerkjør. I disse 7 prøvene representerer sletting av dette ene baseparet en falsk negativ i MiSeqDxsekvenseringsnøyaktighetsstudien. 9 Amplikon 6 har en én baseinnsetting som er rapportert i 9 prøver i godt karakterisert referansedatabase og er riktig detektert i alle analyserte prøver. 10 Amplikon 9 har en homopolymerkjøring på 1 A-er i henhold til humant genom-referansesekvensen versjon 19. Den godt karakteriserte sammensatte referansesekvensen for 1 av 1 prøver har imidlertid 1 A-er i denne homopolymerkjør. I disse 1 prøvene er denne ene parinnsett en falsk negativ i MiSeqDx-sekvenseringsnøyaktighetsstudie. 21 Delenr Rev. B NOR Februar 201

22 Følgende tabell inneholder data fra studie 1, vist med positivt og negativt prosentsamsvar, der variantresultatene er sammenlignet med den godt karakteriserte sammensatte referanseinformasjonen for PPA-beregninger. Siden den sammensatte referanseinformasjonen kun gir resultater for de enkle nukleotidevariantene og innsettinger/slettinger, er ikke-variante baseresultater sammenlignet med referansesekvensen for humant genom, versjon 19, for NPA-beregninger. Alle ikke-variantbaser hadde 100 % samsvar med referansesekvensen. Alle SNV-er hadde 100 % samsvar med referansesekvensen. Varianter som manglet, var enten 1 baseinnsettinger eller 1 baseslettinger i homopolymerområder. Tabell 2 Prøve Samsvar mellom MiSeqDx-plattformens basepåviste resultater og referansedata for 1 godt karakteriserte prøver. amplikoner amplikondekning 1 Varianter forventet per prøve 2 Varianter riktig påvist Varianter gått tapt Ikkevariantbaser påvist riktig PPA (%) NPA (%) NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA amplikondekning er et basert i amplikoner sekvensert med konfidens. 2 Varianter forventet per prøve inkluderer både SNV-er og indeler. Du finner de tapte variantene i den første tabellen for studie 1 og fotnotene Positivt prosentsamsvar (PPA) = 100xTP/(TP+FN), der de sanne positivene (TP) er et positive variant på genomiske koordinater, der varianter er tilstede i henhold til referensesekvensen og påvist mutant-allele overensstemmer med referansesekvensen (kolonnen kalt "Varianter påvist riktig"), og de falske negative (FN) er et negative variant på genomiske koordinater, der varianter er tilstede i henhold til referansesekvensen (kolonnen kalt "Varianter gått tapt"). Negativt prosentsamsvar (NPA) = 100xTN/(FP+TN) der de falske positivene (FP) er et positive variant på genomiske koordinater, der varianter er fraværende i henhold til referansesekvensen, eller hvis påvist mutant-allele ikke stemmer overens med referansesekvensen (ikke i tabellen, falske positive variant ble gjort i denne studien) og sanne negative (TN) er et negative variant på genomiske koordinater, der varianter er fraværende i henhold til referansestandarden (kolonnen kalt "ikke-variantbaser påvist riktig"). Studie 2 Sekvenseringsresultatet for amplikonpanelet ovenfor ble sammenlignet med en genotype med høy konfidens, etablert for NA12878 av National Institutes of Standards and Technology (NIST) (v ). Av de 19 amplikonene var 18 amplikoner innen høyt konfidente referanse i NIST-sekvensen og ble sammenlignet. Ikke-variante base ble sammenlignet med referansesekvensen for humant genom, versjon 19. Februar 201 Delenr Rev. B NOR 22

23 Tabell Prøve Sammenligning av MiSeqDx-plattformens sekvenseringsresultater for NA12878-prøve med NIST-database amplikoner amplikondekning 2 Varianter forventet Varianter riktig påvist Varianter gått tapt Ikkevariantbaser påvist riktig PPA (%) NPA (%) NA Zook, JM et al. Integrating sequencing datasets to form highly confident SNP and indel genotype calls for a whole human genome. arxiv: [q-bio.gn]. 2 amplikondekning er et basert i amplikoner sekvensert med konfidens. Positivt prosentsamsvar (PPA) = 100xTP/(TP+FN). Negativt prosentsamsvar (NPA) = 100xTN/(FP+TN). Den manglende varianten er den ene baseparslett i amplikon 9 i homopolymerkjør av 1 A-er som ikke er påvist av MiSeqDx som er tilstede i NIST-sekvensen. Vær oppmerksom på at NIST-sekvensen ikke inkluderer den ene baseparinnsett i den andre homopolymeren av A-er som var tilstede i den andre referansedatabasen brukt ovenfor i studie 1. Studie En ekstra nøyaktighetsstudie ble utført for å vurdere ytelsen til små innsettinger og slettinger innen en representativ analyse, Illumina MiSeqDx Cystic Fibrosis 19-Variant Assay, som inkluderte en delmengde med CFTR klinisk signifikante genetiske variasjoner, analysert med MiSeq Reporter-programvaren som bruker MiSeqDx plattformmålrettet DNA-sekvenseringsflyt. De forespurte innsette og slette ble detektert der de var forventet med høy konfidens. Disse prøvene ble karakterisert av toveis Sanger-sekvensering som en referansemetode til oppretting av den forventede sekvensen. Tabell Oppsummering av indeldeteksjon med MiSeqDx-plattform Amplikon Innsettstørrelse Amplikon genomisk / prøver som ikke kunne utføres påviste baser/prøve /prøve u baseinnsetting baseslettinger baseslettinger basesletting basesletting basesletting Dataene fra disse nøyaktighetsstudiene støtter påstanden om at MiSeqDx-plattformen kan sekvensere nøyaktig: GC- 19 % (alle baser i 1 av 1 sekvenserte amplikoner med 19 % GC- riktig påvist) GC- 72 % (alle baser i 1 av 1 sekvenserte amplikoner med 72 % GC- riktig påvist) PolyA-lengder 7 (PolyA-gjentakelse av 7 nukleotider ble riktig påvist i 270 av 270 sekvenserte amplikoner som inneholdt PolyA =7) PolyT-lengder 8 (PolyT-gjentakelse av 8 nukleotider ble riktig påvist i 270 av 270 sekvenserte amplikoner som inneholdt PolyT =8) PolyG-lengder 6 (PolyG-gjentakelse av 6 nukleotider ble riktig påvist i 0 av 0 sekvenserte amplikoner som inneholdt PolyG =6) 2 Delenr Rev. B NOR Februar 201

24 PolyC-lengder 7 (PolyC-gjentakelse av 7 nukleotider ble riktig påvist i 1 av 1 sekvenserte amplikoner som inneholdt PolyC =7) Dinukleotidegjentakelseslengder x (alle baser i 1 av1 sekvenserte amplikoner med x dinukleotidegjentakelse ble riktig påvist) Trinukleotidegjentakelseslengder x (alle baser i 810 av 810 sekvenserte amplikoner med x trinukleotidegjentakelser ble riktig påvist) 1 baseinnsettinger og eller færre baseslettinger 2 av 1-baseinnsettinger som ble testet ble riktig påvist. Riktige ble gjort for to 1- baseinnsettinger i ikke-homopolymerregioner i 82 amplikoner. Én 1-baseinnsetting ble ikke påvist i en homopolymerkjøring på 1 A-er på kromosom 2 i 1 amplikoner. av 1-baseslettinger ble riktig påvist. Alle ble gjort i ikke-homopolymerregioner i amplikoner. Én 1-basesletting ble ikke påvist i en homopolymerkjøring på 1 A-er på kromosom 9 i 6 amplikoner. 2-basesletting ble riktig påvist i én prøve. -baseslettinger ble riktig påvist i 21 prøver. Reproduserbarhet Reproduserbarheten i MiSeqDx-plattformen ble bestemt ved bruk av to representative analyser. Studie 1 En representativ analyse ble utarbeidet for å utforske en rekke gener som dekker 2 baser over 19 ulike kromosomer og inneholder potensielt klinisk relevante eksoner. Studien undersøkte 1 prøver over ni kjøringer som brukte tre ulike MiSeqDx-instrumenter og tre ulike operatører (Tabell ). Et enkelt parti med reagenser for klargjøring av biblioteket og to partier med sekvenseringsforbruksmateriell ble brukt. De 1 prøvene var fra to foreldre og 11 barn som hadde blitt sekvensiert ofte av flere laboratorier og sekvenseringsmetoder. To prøver ble kjørt i duplikat, slik at hver kjøring genererte resultater fra 1 prøver. For evaluering av reproduserbarheten fra parti til parti ble 9 prøver og to ikke-templat-kontroller testet på tvers av tre partier. Hvert parti ble delt i to 8-prøvers kjøringer for å teste alle reagenser og mulige indeksprimerkombinasjoner. Alle sekvenseringskjøre ble fullført av en enkel operatør og på et enkelt MiSeqDx-instrument for å fjerne eventuell potensiell varians fra operatøren eller instrumentet (Tabell 6). Nøyaktige ble fastslått for enkle nukleotidevarianter (SNV) ved å sammenligne studiedata med en godt karakterisert referansedatabase. Det var mislykkede kjøringer eller nye kjøringer i reproduserbarhetsstudien. Følgende tabeller viser resultatene fra studiene som evaluerte reproduserbarheten i systemet. Februar 201 Delenr Rev. B NOR 2

25 Tabell Studie 1 Resultater fra instrument til instrument-reproduserbarhet for MiSeqDx-plattformen (amplikonnivå) MiSeqDx 1 MiSeqDx 2 MiSeqDx Amplikon Kr. Analysert fragmentstørrelse 1 Amplikon -genomisk et prøver i kjøring Poly C (); 6 % GC , , Poly T () Poly T () Poly A (6) Poly T (); Poly C () Poly T () Poly A (1) , , Poly A () Poly A (); Poly T () Delenr Rev. B NOR Februar 201

26 MiSeqDx 1 MiSeqDx 2 MiSeqDx Amplikon Kr. Analysert fragmentstørrelse 1 Amplikon -genomisk et prøver i kjøring Poly T () Poly T (); SNV Poly A () Poly A (6); Poly T (); Homologt område på et annet kromosom Homologt område på et annet kromosom Poly T () Poly C (7); 66 % GC 26 1 Poly C (); 69 % GC Delenr Rev. B NOR Februar 201

27 MiSeqDx 1 MiSeqDx 2 MiSeqDx Amplikon Kr. Analysert fragmentstørrelse 1 Amplikon -genomisk et prøver i kjøring SNV Poly A (); SNV Poly T () Poly A () Poly T (6) Poly A (); Poly T (); SNV 0 1 Poly T (); SNV SNV Delenr Rev. B NOR Februar 201

28 MiSeqDx 1 MiSeqDx 2 MiSeqDx Amplikon Kr. Analysert fragmentstørrelse 1 Amplikon -genomisk et prøver i kjøring Poly T () Poly A (7) Poly A (6) Poly A () Delenr Rev. B NOR Februar 201

29 MiSeqDx 1 MiSeqDx 2 MiSeqDx Amplikon Kr. Analysert fragmentstørrelse 1 Amplikon -genomisk et prøver i kjøring Poly A () CT() SNV Poly T (6) % GC Poly A (6); Poly T (8) % GC Poly A (); 9 % GC Delenr Rev. B NOR Februar 201

30 MiSeqDx 1 MiSeqDx 2 MiSeqDx Amplikon Kr. Analysert fragmentstørrelse 1 Amplikon -genomisk et prøver i kjøring Poly C (); 6 % GC % GC SNV Poly A (); Poly T () % GC % GC Poly G (6); 61 % GC Poly T () Poly A (6) % GC % GC Delenr Rev. B NOR Februar 201

31 MiSeqDx 1 MiSeqDx 2 MiSeqDx Amplikon Kr. Analysert fragmentstørrelse 1 Amplikon -genomisk et prøver i kjøring Poly T () Homologt område på et annet kromosom Homologt område på et annet kromosom Poly A (1) Homologt område på et annet kromosom; SNV Poly A (); Poly C () Delenr Rev. B NOR Februar 201

32 MiSeqDx 1 MiSeqDx 2 MiSeqDx Amplikon Kr. Analysert fragmentstørrelse 1 Amplikon -genomisk et prøver i kjøring % GC Poly A (); 7 % GC % GC Poly C (); 67 % GC % GC % GC % GC % GC SNV % GC Poly T () % GC Delenr Rev. B NOR Februar 201

33 MiSeqDx 1 MiSeqDx 2 MiSeqDx Amplikon Kr. Analysert fragmentstørrelse 1 Amplikon -genomisk et prøver i kjøring Poly T (); Homologt område på et annet kromosom CA() Poly A (6); Homologt område på et annet kromosom Poly C (); SNV % GC Poly T (10) Poly T () Poly A () Delenr Rev. B NOR Februar 201

34 MiSeqDx 1 MiSeqDx 2 MiSeqDx Amplikon Kr. Analysert fragmentstørrelse 1 Amplikon -genomisk et prøver i kjøring Poly T () Poly A (6) Poly T (6) Poly T () Poly T (8); 19 % GC Poly A (); Poly T () Poly A () SNV; 26 % GC Poly T (8); SNV Poly A () Delenr Rev. B NOR Februar 201

35 MiSeqDx 1 MiSeqDx 2 MiSeqDx Amplikon Kr. Analysert fragmentstørrelse 1 Amplikon -genomisk et prøver i kjøring Poly A () % GC Poly C () SNV Poly T (6) Poly T (); 26 % GC Poly A () % GC Delenr Rev. B NOR Februar 201

36 MiSeqDx 1 MiSeqDx 2 MiSeqDx Amplikon Kr. Analysert fragmentstørrelse 1 Amplikon -genomisk et prøver i kjøring Poly C () % GC Poly C (6); 60 % GC SNV % GC Poly C (); 6 % GC Poly G (6); 67 % GC SNV % GC Poly C () Delenr Rev. B NOR Februar 201

37 MiSeqDx 1 MiSeqDx 2 MiSeqDx Amplikon Kr. Analysert fragmentstørrelse 1 Amplikon -genomisk et prøver i kjøring % GC % GC Poly A (6) % GC Poly G (6); 66 % GC % GC % GC % GC Homologt område på et annet kromosom Delenr Rev. B NOR Februar 201