Maxwell CSC RNA FFPE Kit

Transkript

1 TEKNISK HÅNDBOK Maxwell CSC RNA FFPE Kit Bruksanvisning for produktet AS1360 Forsiktig: Håndter kassetter med forsiktighet, forseglingskantene kan være skarpe. BRUKANVISNING FOR PRODUKTET AS Woods Hollow Rd. Madison, WI USA MDSS GmbH Schiffgraben Hannover, Germany Revidert 10/18 TM404

2 Maxwell CSC RNA FFPE Kit Alle teknisk litteratur er tilgjengelig på: Gå til nettstedet for å kontrollere at du bruker den mest oppdaterte versjonen av denne tekniske håndboken. Send e-post til Promega Technical Services dersom du har spørsmål vedrørende bruk av dette systemet: 1. Beskrivelse Produktkomponenter, oppbevaringsbetingelser og symbolforklaring Tiltenkt bruk av produktet Bruksbegrensninger for produktet Før du starter A. Klargjøre FFPE-prøver B. Klargjøring av Maxwell CSC-kassett Instrumentkjøring Etter rensing Feilsøking Vedlegg A. Skape et ribonukleasefritt miljø B. Referanse Oppsummering av endringer Maxwell CSC RNA FFPE Kit er bare tilgjengelig i visse land. Dette produktet overholder de vesentlige kravene i EU-direktiv 98/79/EF vedrørende in vitro-diagnostiske medisinske enheter. 1. Beskrivelse Maxwell CSC RNA FFPE Kit brukes sammen med Maxwell CSC-instrumentet for å oppnå en enkel metode for effektiv og automatisert rensing av genomisk RNA fra humane FFPE-vevsprøver (formalinfikserte, parafininnstøpte) fra bryst, lunge eller tykktarm. Maxwell CSC-instrumentet leveres med forhåndsprogrammerte rensemetoder. Det er utformet for bruk med de forhåndsdispenserte reagenskassettene samt ytterligere reagenser som følger med i settet, noe som maksimerer enkelthet og brukervennlighet. Instrumentet kan behandle opptil 16 prøver på under 60 minutter, og det rensede RNA-et kan brukes direkte i en rekke amplifikasjonsbaserte nedstrøms bruksområder, for eksempel RT-PCR. Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI USA Grønn linje i USA: Faks: TM404 Revidert 10/18

3 1. Beskrivelse (fortsettelse) Maxwell CSC RNA FFPE Kit renser nukleinsyre ved hjelp av paramagnetiske partikler, som gir en mobil solid fase for å optimalisere prøveinnhenting, vask og rensing av RNA. Maxwell CSC-instrumentet er et instrument til håndtering av magnetiske partikler. Dette systemet muliggjør effektiv binding av RNA til de paramagnetiske partiklene i første brønn av en forhåndsfylt kassett, beveger prøven gjennom brønnene i kassetten og blander den under behandlingen. Denne tilnærmingen til magnetisk registrering unngår vanlige problemer knyttet til systemer for håndtering av væsker, som tette tupper eller delvise reagensoverføringer, som resulterer i suboptimal rensebehandling, som oppstår i andre ofte brukte automatiserte systemer. 2. Produktkomponenter, oppbevaringsbetingelser og symbolforklaring PRODUKT STØRRELSE KAT.NR. Maxwell CSC RNA FFPE Kit 48 preps AS1360 For in vitro-diagnostisk bruk. Kun til profesjonell bruk. Tilstrekkelig til 48 automatiserte isoleringer fra FFPE-prøver. Maxwell CSC-kassetter er kun beregnet på engangsbruk. 15 C 30 C 6010TB 48 Inneholder: 25ml Mineral Oil 20ml Lysis Buffer 2 1ml Proteinase K 100µl Blue Dye 2 1ml MnCl 2, 0.09M 1ml DNase Buffer 3 vials DNase I (lyophilized) 48 Maxwell FFPE Cartridges 50 CSC/RSC Plungers 50 Elution Tubes (0.5ml) 25ml Nuclease-Free Water Oppbevaringsbetingelser: Maxwell CSC RNA FFPE Kit oppbevares ved omgivelsestemperatur (15 30 C). Oppbevar rehydrert DNase I ved -10 til -30 C. Ikke frys og tin opp igjen mer enn 10 ganger. Sikkerhetsinformasjon: Reagenskassettene inneholder etanol og isopropanol. Disse stoffene anses som brannfarlige, skadelige og irriterende. Maxwell CSC-kassettene er utformet for bruk med potensielt smittefarlig materiale. Bruk riktig personlig verneutstyr (f.eks. hansker og beskyttelsesbriller) ved håndtering av smittefarlig materiale. Følg institusjonens retningslinjer for håndtering og kassering av alt smittefarlig materiale brukt med dette systemet. 2 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI USA Grønn linje i USA: Faks: TM404 Revidert 10/18

4 Forsiktig: Håndter kassetter med forsiktighet, forseglingskantene kan være skarpe. Tilleggsinformasjon: Maxwell CSC RNA FFPE Kit-komponentene er kvalifisert og kvalitetssikringstestet for å fungere sammen. Det anbefales ikke å blande settkomponenter mellom forskjellige settloter. Bruk bare komponentene som følger med i settet. Symbolforklaring Symbol Forklaring Symbol Forklaring Medisinsk utstyr for in vitro-diagnostikk Autorisert representant 15 C 30 C Oppbevares ved C Woods Hollow Rd. Madison, WI USA Produsent Viktig Irriterende Kreftfremkallende Innholdet rekker til n tester Conformité Européenne Advarsel. Biologisk fare. Advarsel. Klemfare. Bestillingsnummer Lotnummer Skal ikke gjenbrukes Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI USA Grønn linje i USA: Faks: TM404 Revidert 10/18

5 3. Tiltenkt bruk av produktet Maxwell CSC RNA FFPE Kit er beregnet på bruk sammen med Maxwell CSC-instrumentet og Maxwell CSC FFPE RNA-rensemetoden, som en in vitro-diagnostisk (IVD) medisinsk enhet for å utføre automatisert isolering av genomisk RNA fra humane FFPE-vevsprøver (formalinfikserte, parafininnstøpte) fra bryst, lunge og kolon. Det rensede RNA-et er egnet for bruk i amplifikasjonsbaserte in vitro-diagnostiske analyser. Maxwell CSC RNA FFPE Kit skal brukes ved en temperatur på C. Bruk utenfor dette temperaturområdet kan medføre suboptimale resultater. FFPE-prøver klargjort med 10 % nøytralbufret formalin kan brukes med Maxwell CSC RNA FFPE Kit. Maxwell CSC RNA FFPE Kit skal ikke brukes som en del av en spesifikk diagnostisk test. Maxwell CSC RNA FFPE Kit er bare beregnet på profesjonell bruk. Diagnostiske resultater som oppnås med RNA-et som renses med dette systemet, må tolkes i sammenheng med andre kliniske funn eller laboratoriedata. 4. Bruksbegrensninger for produktet Maxwell CSC RNA FFPE Kit er kun beregnet på bruk med FFPE-vevsprøver innsamlet fra humant bryst, lunge eller kolon. Det er ikke beregnet på bruk med ikke-ffpe-vevsprøver, for eksempel ferske eller frosne vevsprøver, eller FFPE-vevsprøver innsamlet fra andre vev enn humant bryst, lunge og kolon. Maxwell CSC RNA FFPE Kit er ikke beregnet på bruk med andre typer prøver, inkludert ikke-humane prøver, eller til rensing av DNA. Maxwell CSC RNA FFPE Kit er ikke beregnet på bruk med vevsprøver som har blitt klargjort med andre fiksativer enn 10 % nøytralbufret formalin. Ytelsen til Maxwell CSC RNA FFPE Kit ble evaluert ved å isolere RNA fra FFPE-vevsprøver i størrelsesområdet 0,1 2,0 mm 3. Produktet skal ikke brukes med prøver utenfor dette området. Brukeren er ansvarlig for å kontrollere hvilke ytelseskarakteristikker som kreves til nedstrøms diagnostiske formål. Egnede kontroller skal inkluderes i alle nedstrøms diagnostiske applikasjoner med RNA renset med Maxwell CSC RNA FFPE Kit. 4 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI USA Grønn linje i USA: Faks: TM404 Revidert 10/18

6 5. Før du starter Materialer som må anskaffes av bruker mikrosentrifuge pipettorer og pipettespisser for forbehandling og overføring av prøver til forhåndsfylte reagenskassetter 1,5 2,0 ml rør for inkubasjon av prøver (f.eks. mikrorør, 1,5 ml kat.nr. V1231) varmeblokker stilt til 56 C og 80 C (Merk: Varmeblokken må settes til den nødvendige temperaturen. Faktisk varmblokktemperatur må måles til temperaturen innenfor kalibreringsspesifikasjonene for termometeret som brukes for målingen.) FFPE-prøver med et totalt vevsvolum på 0,1 2,0 mm 3. Seksjonens tykkelse må ikke overskride 5 µm (Merk: Prøver må oppbevares ved romtemperatur [15 30 C].) barberhøveblader (Merk: Vær forsiktig under bruk av barberblader til å skrape prøve fra objektglasset.) Rekonstituer et lyofilisert hetteglass med DNase I med 275 µl nukleasefritt vann etter behov. Vend hetteglasset for å skylle DNase I av undersiden av hetten og virvle forsiktig rundt for å blande. Ikke bland i virvelblander. 5.A. Klargjøre FFPE-prøver Forbehandle seksjonsprøver 1. Plasser seksjonsmaterialet i et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Ved bruk av vevsseksjoner på objektglass skraper du seksjonsmaterialet av objektglasset ved hjelp av et rent barberblad. 2. Tilsett 300 µl mineralolje i prøverørene. Bland i virvelblander i 10 sekunder. 3. Varm opp prøvene ved 80 C i 2 minutter. Plasser prøvene i romtemperatur mens masterblandingen klargjøres. 4. Klargjør en masterblanding av lyseringsbuffer, proteinase K-løsning og blåfarge som vist nedenfor. Reagens Mengde/reaksjoner Reaksjoner (antallet som skal kjøres + +1) Totalt Lyseringsbuffer 224 µl n µl (n+1) Proteinase K 25 µl n+1 25 µl (n+1) Blåfarge 1 µl n+1 1 µl (n+1) 5. Tilsett 250 µl masterblanding i hvert prøverør og bland i virvelblander i 5 sekunder. 6. Sentrifuger prøverørene ved g i 20 sekunder for å skille lagene. Hvis en pellet er til stede i det vandige laget (lavere, blått lag), blander du forsiktig for å fordele pelleten. La begge fasene være i røret. 7. Overfør prøverørene til en 56 C varmeblokk og inkuber i 15 minutter. 8. Overfør prøverørene til en 80 C varmeblokk og inkuber i 1 time. 9. Fjern prøverørene fra varmeblokken og la prøvene kjøle seg ned til romtemperatur i 15 minutter. Mens prøvene avkjøles, klargjør du DNase-blandingen som beskrevet i trinn 10. Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI USA Grønn linje i USA: Faks: TM404 Revidert 10/18

7 5.A. Klargjøre FFPE-prøver (fortsettelse) 10. Klargjør en blanding av MnCl 2, DNase-buffer og DNase I i rekkefølgen som vises nedenfor: Reagens 1 Mengde/reaksjoner Reaksjoner (antallet som skal kjøres +1) Totalt MnCl 2, 0,09 M 26 µl n+1 26 µl (n+1) DNase-buffer 2 14 µl n+1 14 µl (n+1) DNase I 3 10 µl n+1 10 µl (n+1) 1 Hvis DNase-blandingens reagenser tilsettes i prøverørene individuelt, må du sørge for å tilsette dem i rekkefølgen som vises ovenfor. Tilsett hver reagens ved grundig pipettering før du tilsetter neste reagens. 2 Oppbevar DNase-buffer ved C. Det kan presipitere hvis det oppbevares ved lavere temperaturer. Hvis bufferen inneholder bunnfall, oppløser du bunnfallet igjen ved å varme opp til 56 C i 2 minutter, etterfulgt av kort tid i virvelblander for å blande. 3 Oppbevar gjenværende rekonstituert DNase I ved -30 til -10 C. 11. Tilsett 50 µl av DNase-blandingen i hvert prøverør. Bland ved å pipettere 10 ganger. 12. Inkuber prøverørene i 15 minutter ved romtemperatur (15 30 C). 13. Sentrifuger prøverørene ved full hastighet i en mikrosentrifuge i 5 minutter. 14. Overfør umiddelbart den blå, vandige fasen til brønn nr. 1 i en Maxwell CSC-kassett. Se avsnitt 5.B for instruksjoner om klargjøring av kassett. 5.B. Klargjøring av Maxwell CSC-kassett 1. Bytt hansker før du håndterer Maxwell CSC-kassetter, CSC/RSC-stempler og elueringsrør. Kassetter settes opp på Maxwell CSC-dekkbrettet utenfor instrumentet, og dekkbrettet som inneholder kassettene og prøvene, overføres til instrumentet for rensing. Plasser kassettene som skal brukes, i Maxwell CSCdekkbrettet (figur 2). Plasser hver kassett i dekkbrettet med brønn nr. 1 (den største brønnen i kassetten) lengst borte fra elueringsrørene. Trykk ned kassetten slik at den sitter helt på plass. Kontroller at begge kassettendene er helt festet dekkbrettet. Dra forsiktig vekk forseglingen slik at hele forseglingen fjernes fra toppen av kassetten. Kontroller at all forseglingsteip og eventuelt gjenværende klebende materiale er fjernet fra kassetten. Forsiktig: Håndter kassetter med forsiktighet. Forseglingskantene kan være skarpe. 2. Plasser ett stempel i brønn nr. 8 i hver kassett. Merk: Bruk bare stemplene som følger med i Maxwell CSC RNA FFPE Kit. Stempler for Maxwell 16 LEV og SEV Kit er ikke kompatible med Maxwell CSC-instrumentet. 6 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI USA Grønn linje i USA: Faks: TM404 Revidert 10/18

8 3. Plasser et tomt elueringsrør i elueringsrørposisjonen for hver kassett i Maxwell CSC-dekkbrettet. Merk: Bruk bare elueringsrørene som følger med i Maxwell CSC RNA FFPE Kit. Andre elueringsrør vil kanskje ikke være kompatible med Maxwell CSC-instrumentet og kan påvirke RNA-renseytelsen. 4. Tilsett 50 µl nukleasefritt vann i bunnen av hvert elueringsrør. Elueringsrørene må forbli åpne under RNArensingen. Merk: Bruk bare det nukleasefrie vannet som følger med i Maxwell CSC RNA FFPE Kit. Bruk av andre elueringsbuffere kan påvirke RNA-renseytelsen eller nedstrøms bruk. Merknader for klargjøring av Maxwell FFPE-kassetten 1. Dersom du behandler færre enn 16 prøver, skal kassettene midtstilles på dekkbrettet. 2. Fjern prøve- eller reagenssøl på alle deler av Maxwell CSC-dekkbrettet som angitt i Maxwell CSC Instrument Manual. Ikke bruk blekemiddel pa noen av instrumentdelene Bindeløsning 2. Magnetiske partikler 3. Vaskemiddel 4. Vaskemiddel 5. Vaskemiddel 6. Vaskemiddel 7. Tomt 8. Tomt 11339TC Brønninnhold som brukeren tilsetter 1. Forbehandle prøver 8. CSC/RSC-stempel Figur 1. Maxwell CSC-kassett. Denne figuren viser innholdet i en kassett. De forbehandlede FFPE-prøvene tilsettes i brønn nr. 1, og et stempel settes i brønn nr TB Figur 2. Oppsett og konfigurering av Maxwell CSC-dekkbrettet. Nukleasefritt vann tilsettes i elueringsrørene som angitt. Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI USA Grønn linje i USA: Faks: TM404 Revidert 10/18

9 6. Instrumentkjøring Maxwell CSC RNA FFPE-metoden kan lastes ned fra Promega-nettstedet: tools/maxwellcscmethod. Se Maxwell CSC Methods Installation Technical Manual #TM401 for mer detaljert informasjon. Hvis du mistenker at instrumentet kan være kontaminert med RNase, rengjør du instrumentet før du kjører det, med et rengjøringsmiddel, for eksempel Steris LpH. Følg instruksjonene i delen Rengjøring og vedlikehold i Maxwell CSC Instrument Operating Manual. 1. Slå på Maxwell CSC-instrumentet og nettbrettet. Instrumentets brukergrensesnitt starter automatisk, og instrumentet fortsetter med en selvtest og setter alle bevegelige deler i utgangsposisjon. 2. Velg Start på startskjermbildet. 3. Skann eller skriv inn metodestrekkoden på Maxwell CSC RNA FFPE Kit-etiketten for automatisk å velge metoden som skal kjøres (figur 3). Merk: Maxwell CSC FFPE RNA Kit-metodestrekkoden er påkrevd for rensing av RNA på Maxwell CSC-instrumentet. Settetiketten inneholder to strekkoder. Metodestrekkoden er angitt på figur 3. Hvis strekkoden ikke kan skannes, kontakter du Promega Technical Services TA Figur 3. Settetiketten som indikerer metodestrekkoden som skal skannes. I den røde boksen vises metodestrekkoden på settetiketten som skal skannes for å starte en rensekjøring. 4. Velg kassettposisjoner som skal kjøres (se Maxwell CSC Instrument Operating Manual), og skann eller legg manuelt inn den påkrevde prøvesporingsinformasjonen. Velg bort eventuelle ubrukte posisjoner. Velg Fortsett når all prøveinformasjonen har blitt angitt. 5. På nettbrettet kontrollerer du at prøvene ble tilsatt i brønn nr. 1 i kassettene (som anvist i del 5.A), at kassettene er lastet på instrumentet, at elueringsrørene som inneholder 50 μl nukleasefritt vann, er til stede og åpne, og at stemplene er til stede i brønn nr Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI USA Grønn linje i USA: Faks: TM404 Revidert 10/18

10 6. Overfør Maxwell CSC-dekkbrettet som inneholder de klargjorte kassettene, til Maxwell CSCinstrumentdekket. Kontroller at dekkbrettet er plassert i Maxwell CSC-instrumentet med elueringsrørene nærmest døren. Dekkbrettet får bare plass i instrumentet dersom det vender i denne retningen. Dersom dekkbrettet ikke passer på plattformen, kontrollerer du at det er satt inn riktig vei. Kontroller at dekkbrettet sitter plant på instrumentdekket. Merk: Hold Maxwell CSC-dekkbrettet etter sidene for å unngå å forflytte kassettene fra stativet. Advarsel: Klemfare. 7. Bekreft at all angitt forbehandling har blitt utført, og trykk på Start for å lukke instrumentdøren og starte behandlingen. 8. Maxwell CSC-instrument starter rensingen umiddelbart. Skjermen viser trinnene som utføres og omtrentlig tid som er igjen i kjøringen. Merk: Dersom kjøringen avbrytes før fullføring, vil instrumentet vaske partiklene av stemplene og slippe stemplene i brønn nr. 8 i kassetten. Prøvene vil da gå tapt. Ikke forsøk å rense på nytt prøver fra en avbrutt instrumentkjøring. 9. Når den automatiske rensekjøringen er fullført, viser nettbrettskjermen en melding om at metoden er avsluttet, Kjøring avsluttet. Kjøring avsluttet 10. Følg instruksjonene på skjermen etter at metoden har blitt fullført, for å åpne døren. Kontroller at stemplene befinner seg i brønn nr. 8 i kassetten etter fullført kjøring. Fjern dekkbrettet fra instrumentet og fjern eluerte prøver fra dekkbrettet. Hvis alle stempler ikke har blitt fjernet fra stempelstangen: Følg meldingene på skjermen for å utføre rengjøringsmetoden for en avbrutt kjøring, eller velg rengjøringsmetoden fra innstillingsskjermbildet for en fullført kjøring for å fjerne de gjenværende stemplene. 11. Sett på hetter og fjern elueringsrørene som inneholder RNA, umiddelbart etter kjøringen for å forhindre fordampning av eluatene. Fjern Maxwell CSC-dekkbrettet fra instrumentet. Merk: Hvis du vil fjerne stativet fra instrumentplattformen, holder du stativet etter sidene. Sørg for at prøvene er fjernet fra instrumentet før kjøring av instrumentets UV-steriliseringsprotokoll, for å unngå skader på den rensede nukleinsyren. RNA-prøver kan oppbevares over natten ved -30 til -10 C, eller ved lavere enn -60 C for langvarig oppbevaring. 12. Fjern kassettene og stemplene fra Maxwell CSC-dekkbrettet og håndter dem som farlig avfall i henhold til institusjonens prosedyrer. Kassettene, stemplene og elueringsrørene er bare til engangsbruk. Maxwell CSC-kassetter, CSC/RSC-stempler og elueringsrør må ikke brukes på nytt. 7. Etter rensing Fastslå om utbyttet og renheten til det rensede RNA-et oppfyller de angitte kravene for den diagnostiske nedstrøms analysen før bruk i denne analysen. Settytelsen ble evaluert basert på rensing av amplifiserbart RNA. Andre former for kvantifisering som omfatter absorbans eller binding fluorescerende farge, vil kanskje ikke samsvare med amplifiseringen (1). Absorbansavlesninger for FFPE-prøver kan overvurdere utbyttet. Vi anbefaler bruk av mer spesifikke metoder for å bestemme utbytte (1). Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI USA Grønn linje i USA: Faks: TM404 Revidert 10/18

11 8. Feilsøking For spørsmål som ikke besvares her, bes du kontakte ditt lokale Promega-kontor eller den lokale forhandleren. Kontaktinformasjon er tilgjengelig på: E-post: Symptomer Lavere enn forventet konsentrasjon RNA i eluat (En typisk FFPE-seksjon skal gi amplifiserbart RNA avhengig av vevsstørrelse, cellularitet, formalinfikseringstilstand og håndtering.) Årsaker og kommentarer Settytelsen ble evaluert ved å isolere RNA fra FFPEvevsprøver i størrelse fra 0,1 mm 3 til 2,0 mm 3. Det er ikke utformet for prøver utenfor dette området. Bruk seksjonsmateriale som faller innenfor dette området. Settet ble utformet for bruk med FFPE-vevsprøver innsamlet fra humant bryst, lunge eller kolon. Det er ikke beregnet på bruk med ikke-ffpe-vevsprøver, for eksempel ferske eller frosne vevsprøver, eller FFPEvevsprøver innsamlet fra andre vev enn humant bryst, lunge og kolon. Inkubasjonstider og -temperaturer ble testet kun for humant bryst, lunge og kolon. Bruk kun humant bryst, lunge eller kolon. Settet ble ikke utformet for bruk med vevsprøver som har blitt klargjort med andre fiksativer enn 10 % nøytralbufret formalin. Kontroller at et alternativt bindemiddel ikke ble brukt. RNaser kan ha blitt introdusert under prøvebehandling eller kvantifisering. Se kapittel 9 for informasjon om å skape et ribonukleasefritt miljø. Det ble brukt vev fra et farget objektglass eller seksjon. Det foreligger ingen utsagn vedrørende fargede objektglass eller seksjonsmateriale. Gjenta rensingen med et ikke-farget objektglass eller seksjonsmateriale. Settytelsen ble evaluert basert på rensing av amplifiserbart RNA. Andre former for kvantifisering som omfatter absorbans eller binding fluorescerende farge, vil kanskje ikke samsvare med amplifiseringen. Bruk en amplifikasjonskvantifiseringsmetode for å vurdere utbyttet. 10 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI USA Grønn linje i USA: Faks: TM404 Revidert 10/18

12 8. Feilsøking (fortsettelse) Symptomer Lavere kvalitet enn forventet. (Eluatet inneholder svært fragmentert RNA eller hemmere av nedstrøms analyser.) DNA til stede i eluater. (Eluatene er kontaminert med DNA, noe som kan interferere med nedstrøms analyser.) Årsaker og kommentarer Formalinfiksering og påfølgende krysskoblingsreversering vil fragmentere RNA. Hvis RNA-et fragmenteres før ekstraksjon/rensing, vil fragmentert RNA bli renset med dette settet. Gjenta med en tilstøtende seksjon for å vurdere om det er et problem med den valgte seksjonen eller prosessen. Noen amplifiseringsanalyser er spesielt følsomme for tilstedeværelse av hemmere. Nedstrøms analysekontroller bør kunne identifisere tilstedeværelsen av en amplifikasjonshemmer i eluatet. Det er brukerens ansvar å kontrollere kompatibiliteten til dette produktet med alle nedstrøms analyser. DNase-blandingen som tilsettes i prøven, gir et overskudd av DNase-aktivitet når den brukes med FFPE-vevsprøver som varierer i størrelse i området 0,1 mm 3 til 2,0 mm 3. Den er ikke utformet for prøver utenfor dette området, og vil kanskje ikke være optimal. Bruk seksjonsmateriale som faller innenfor dette området. Utilstrekkelig blanding av DNase-blandingen i prøven under forbehandling kan resultere i ufullstendig nedbrytning av DNA. Sørg for å blande DNaseblandingen grundig inn i prøven. Hvis DNase-blandingens komponenter tilsettes i prøven separat, må du tilsette dem i rekkefølgen som er angitt i delen 5.A, trinn 10. I tillegg må du sørge for å blande hver komponent grundig når den tilsettes. Tilsetting av komponenter i en annen rekkefølge, eller ufullstendig blanding kan inaktivere DNase. Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI USA Grønn linje i USA: Faks: TM404 Revidert 10/18

13 9. Vedlegg 9.A. Skape et ribonukleasefritt miljø Ribonukleaser er svært vanskelige å inaktivere. Sørg for å unngå å introdusere RNase-aktivitet i RNA-prøvene under og etter isolasjon. Dette er spesielt viktig hvis utgangsmaterialet bare er tilgjengelig i et begrenset antall. Følgende merknader kan bidra til å forhindre utilsiktet RNase-kontaminering av prøvene. 1. To av de vanligste kildene til RNase-kontaminering er brukerens hender og bakterier eller mugg som kan finnes på luftbårne støvpartikler. For å hindre smitte fra disse kildene må du bruke aseptisk teknikk ved håndtering av reagensene som leveres med dette systemet. Bruk alltid hansker. Bytt hansker når det kan ha oppstått kontakt med ribonukleaser. 2. Når det er mulig, bruker du sterile engangsplastenheter for håndtering av RNA. Disse materialene er generelt RNase-frie og krever ikke forbehandling for å deaktivere RNase. 3. Behandle ikke-sterile glass- og plastenheter før bruk for å sikre at de er RNase-frie. Sett glassenheter i ovn ved en temperatur på 200 C over natten, og rengjør plastenheter med 0,1 N NaOH, 1 mm EDTA, etterfulgt av RNase-fritt vann. Kommersielt tilgjengelige produkter for fjerning av RNase kan også brukes, i henhold til produsentens instruksjoner. 4. Behandle løsninger som ikke følger med systemet, ved å tilsette dietyl-pyrokarbonat (DEPC) til 0,1 % i en avtrekkshette. Inkuber over natten med omrøring ved romtemperatur i hetten. Autoklaver i 30 minutter for å fjerne eventuelle spor av DEPC. Forsiktig: DEPC er et mistenkt karsinogen og må bare brukes i en kjemisk avtrekkshette. DEPC reagerer raskt med aminer og kan ikke brukes til å behandle Tris-buffere. Merk: For alle nedstrøms bruksområder er det viktig at du fortsetter å beskytte RNA-prøvene fra RNaser. 9.B. Referanse 1. Bonin, S. et al. (2010) Multicentre validation study of nucleic acids extraction from FFPE tissues. Virchows Arch. 457, Oppsummering av endringer Følgende endringer ble foretatt i 10/18-revisjonen av dette dokumentet: 1. Oppdatert med tilføying av kravene i EU IVD-direktivet (98/79/EF). 12 Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI USA Grønn linje i USA: Faks: TM404 Revidert 10/18

14 Promega Corporation. Med enerett. Maxwell er et registrert varemerke tilhørende Promega Corporation. Produkter kan være omfattet av anmeldte eller utstedte patentbeskyttelser, eller kan ha visse begrensninger. Det henvises til vårt nettsted for ytterligere informasjon. Alle priser og spesifikasjoner oppgis med forbehold om endringer. Produktutsagn oppgis med forhold om endringer. Kontakt Promega Technical Services eller se Promegas online-katalog for oppdatert informasjon vedrørende Promega-produkter. Promega Corporation 2800 Woods Hollow Road Madison, WI USA Grønn linje i USA: Faks: TM404 Revidert 10/18