cobas EGFR Mutation Test

Transkript

1 cobas EGFR Mutation Test FOR BRUK TIL IN VITRO-DIAGNOSTIKK. cobas DNA Sample Preparation Kit DNA SP 24 Tests P/N: cobas EGFR Mutation Test EGFR 24 Tests P/N: MERK: Kjøp av dette produktet gir kjøperen tillatelse til å bruke det for amplifikasjon og deteksjon av nukleinsyresekvenser ved polymerasekjedereaksjon (PCR) og relaterte prosesser for in vitro-diagnostikk på humane prøver. Kjøpet gir ingen generelle patent- eller andre lisensrettigheter bortsett fra bruksretten til dette produktet. TILTENKT BRUK cobas EGFR mutasjonstest er en sanntids PCR-test for kvalitativ deteksjon og identifikasjon av mutasjoner i ekson 18, 19, 20 og 21 i det epidermale vekstfaktorreseptorgenet (EGFR) i DNA utskilt fra formalinfiksert, parafininnstøpt (FFPET) humant tumorvev fra ikkesmåcellet lungekreft (NSCLC). Testen skal brukes til å identifisere pasienter med fremskreden NSCLC med tumorer som har mutasjoner i ekson 18, 19, 20 og 21 i EGFR-genet, og for å velge pasienter for behandling med småmolekylære tyrosinkinasehemmere (TKI) som er rettet mot EGFR. Prøvene behandles med cobas DNA prøveprepareringskit for manuell prøvepreparering og cobas z 480-analysatoren for automatisert amplifikasjon og deteksjon. SAMMENDRAG OG BESKRIVELSE AV TESTEN Aktivering av mutasjoner i genet som koder for EGFR, forekommer primært i NSCLC, og fører til konstant aktivering av kinaseaktiviteten til EGFR-proteinet, noe som bidrar til den onkogene prosessen. 1 Forekomsten av slike mutasjoner i ikke-utvalgte tilfeller av NSCLC er ca. 10 %. Slike mutasjoner forekommer imidlertid oftest, men ikke utelukkende, hos kvinnelige pasienter av asiatisk opprinnelse som ikke røyker, eller som røyker lite, og som har en histologi med adenokarsinom. 2 Kliniske data tyder på at pasienter med fremskredne NSCLC-tumorer med aktiverte mutasjoner i EGFR, som vanligvis forekommer som delesjoner i ekson 19 eller som L858R-punktmutasjoner i ekson 21, har en høy responsrate og forlenget progresjonsfri overlevelse (PFS) når de behandles med anti-egfr TKI, både i første- og andrelinjebehandling. 3-5 Andre mindre vanlige EGFRmutasjoner, som G719X-substitusjoner i ekson 18 og L861Q-punktmutasjoner i ekson 21, predikerer også respons på anti-egfrbehandling. 6-8 Median overlevelse blant pasienter med EGFR-mutant NSCLC som ble behandlet med anti-egfr TKI, er nå ca. 2 år. 9 Gjeldende kliniske retningslinjer anbefaler at man vurderer anti-egfr TKI-behandling som førstelinjebehandling ved fremskreden EGFR-mutant NSCLC. 10,11 De fleste pasienter med EGFR-mutant NSCLC vil etter hvert utvikle progressiv sykdom etter behandling med anti-egfr TKI. Hos omtrent halvparten av disse progredierende tilfellene kan utvikling av sekundære resistente mutasjoner i EGFR-genet, vanligvis T790M-mutasjonen i ekson 20, identifiseres. 12 Hos enkelte pasienter kan slike sekundære resistente mutasjoner detekteres i tumorene før anti-egfr TKI-behandling. Selv om disse TKI-naive tilfellene fortsatt har en høy responsrate på behandling, ser det ut til at disse pasientene har betydelig kortere progresjonsfri overlevelse enn pasienter med tumorer som mangler disse sekundære mutasjonene. 6,13 TESTPRINSIPPER cobas EGFR mutasjonstest er basert på to hovedprosesser: (1) manuell prøvepreparering for å hente genomisk DNA fra FFPET; og (2) PCR-amplifikasjon og deteksjon av mål-dna ved bruk av komplementære primerpar og oligonukleotidprober merket med fluorofor. Testen er utformet for å detektere G719X (G719A, G719C og G719S), i ekson 18, delesjoner og komplekse mutasjoner i ekson 19, S768I, T790M og innskudd i ekson 20 og L858R i ekson 21. Mutasjon detekteres ved hjelp av PCR-analyse med cobas z 480-analysatoren. En mutantkontroll og en negativ kontroll er inkludert i hver analyseserie for å bekrefte gyldigheten av analyseserien. Prøvepreparering FFPET-prøver behandles og genomisk DNA isoleres ved bruk av cobas DNA-prøveprepareringskit, en generisk, manuell prøvepreparering basert på nukleinsyrebinding til glassfibre. Et deparafinisert 5 μm-snitt av en FFPET-prøve lyseres ved inkubasjon ved forhøyet temperatur med en protease og kaotropisk lyserings-/bindingsbuffer som frigjør nukleinsyrer og beskytter det frigjorte genomiske DNA fra DNaser. Deretter tilsettes isopropanol til lyseringsblandingen, som så sentrifugeres gjennom en kolonne med et glassfiberfilter. Under sentrifugering bindes det genomiske DNA til overflaten på glassfiberfilteret. Ubundede substanser, slik som salter, proteiner og andre cellulære forurensninger, fjernes under sentrifugeringen. De adsorberte nukleinsyrene vaskes og elueres deretter med en vandig løsning. Mengden genomisk DNA bestemmes spektrofotometrisk og justeres til en fast konsentrasjon som skal tilsettes amplifikasjons-/deteksjonsblandingen. Mål-DNA blir deretter amplifisert og detektert i cobas z 480-analysatoren ved bruk av amplifikasjons- og deteksjonsreagensene som følger med cobas EGFR mutasjonstestkitet. Avsnittet med informasjon om dokumentrevisjon er plassert ved slutten av dette dokumentet NO 1 Doc Rev. 4.0

2 PCR-amplifikasjon Valg av mål cobas EGFR mutasjonstestkitet bruker primere som definerer spesifikke baseparsekvenser for hver av mutasjonene som testen er rettet mot. For G719X-mutasjoner i ekson 18 er baseparsekvenser i området fra 104 til 106 målet; for delesjonsmutasjoner i ekson 19 er baseparsekvenser i området fra 125 til 141 målet; for S768I-mutasjon i ekson 20 er en 133-baseparsekvens målet; for T790Mmutasjon i ekson 20 er en 118-baseparsekvens målet; for ekson 20-innskudd er baseparsekvenser i området fra 125 til 143 målet; for L858R-mutasjon i ekson 21 er en 138-baseparsekvens målet. Amplifikasjonen skjer kun i EGFR-genets region mellom primerne. Hele EGFR-genet amplifiseres ikke. Målamplifikasjon Et derivat av Thermus species Z05-AS1 DNA-polymerase brukes til målamplifikasjon. PCR-reaksjonsblandingen varmes først opp for å denaturere det genomiske DNA og eksponere primermålsekvensene. Når blandingen kjøles ned, hybridiseres oppstrøms- og nedstrømsprimere til mål-dna-sekvensene. I nærvær av divalent metallion og dntp i overskudd forlenger Z05 DNA-polymerase hver hybridiserte primer, og en ny DNA-tråd syntetiseres. Dette avslutter den første PCR-syklusen, og gir en dobbelttrådet DNA-kopi som inkluderer basepar-målregionene av EGFR-genet. Denne prosessen gjentas i et bestemt antall sykluser, der hver syklus effektivt dobler mengden amplicon-dna. Automatisk sanntidsdeteksjon av mutasjon cobas EGFR mutasjonstesten anvender sanntids PCR-teknologi. Hver målspesifikke oligonukleotidprobe i reaksjonen er merket med et rapporteringsfluorofor og et slukkerfluorofor, som absorberer (slukker) fluorescensutstrålingene fra rapporteringsfluoroforet i en intakt probe. Under hver amplifikasjonssyklus bindes prober som er komplementære til den enkelttrådete DNA-sekvensen i ampliconet, og blir deretter splittet av 5' til 3'-nukleaseaktiviteten til Z05-AS1 DNA-polymerasen. Så snart rapporteringsfluoroforet er separert fra slukkerfluoroforet av denne nukleaseaktiviteten, kan fluorescens med en karakteristisk bølgelengde måles når rapporteringsfluoroforet eksiteres av riktig lysspektrum. Fire ulike rapporteringsfluoroforer brukes til å merke mutasjonene som er målet for testen. Amplifikasjon av de seks EGFR-sekvensene detekteres uavhengig over tre reaksjoner ved å måle fluorescensen ved de fire karakteristiske bølgelengdene i dedikerte optiske kanaler. Selektiv amplifikasjon Selektiv amplifikasjon av målnukleinsyre fra prøven oppnås i cobas EGFR mutasjonstesten ved bruk av AmpErase -enzymet (uracil-n-glykosylase) og deoksyuridintrifosfat (dutp) 15. AmpErase-enzymet gjenkjenner og katalyserer destruksjon av DNA-tråder som inneholder deoksyuridin, men ikke DNA som inneholder tymidin. Deoksyuridin finnes ikke i naturlig forekommende DNA, men finnes alltid i amplicon på grunn av bruken av dutp i stedet for deoksytymidin-trifosfat som en av nukleotidtrifosfatene i Master Mixreagensene. Det er derfor kun amplicon som inneholder deoksyuridin. Deoksyuridin gjør kontaminerende amplicon mottakelig for destruksjon ved hjelp av AmpErase-enzymet forut for amplifikasjon av mål-dna. AmpErase-enzymet, som inngår i Master Mixreagensene, katalyserer nedbrytningen av DNA som inneholder deoksyuridin, ved å bryte deoksyuridingruppens deoksyribosekjede ved C1-posisjonen. Ved temperaturøkning i det første varmetrinnet ved alkalisk ph brytes amplicon-dna-kjeden der deoksyuridinet finnes, noe som igjen fører til at DNA ikke lenger er amplifiserbart. AmpErase-enzymet er inaktivt ved temperaturer over 55 C, dvs. gjennom alle termosykliske trinn, og derfor blir ikke målamplicon ødelagt. cobas EGFR mutasjonstest har vist seg å kunne deaktivere minst 10 3 kopier av deoksyuridinholdig EGFR-mutantamplicon per PCR NO 2 Doc Rev. 4.0

3 REAGENSER cobas DNA Sample Preparation Kit DNA SP 24 tester cobas DNA-prøveprepareringskit (P/N: ) DNA TLB 1 x 10 ml (DNA-vevslyseringsbuffer) Tris-HCl-buffer Kaliumklorid 0,04 % EDTA 0,1 % triton X-100 0,09 % natriumazid PK 1 x 100 mg (Proteinase K) Proteinase K (lyofilisert) Xn Proteinase K Helseskadelig DNA PBB (DNA parafinbindingsbuffer) Tris-HCl-buffer 49,6 % guanidinhydroklorid 0,05 % urea 17,3 % triton X-100 Xn 49,6 % (vekt per vekt) guanidin-hcl 1 x 10 ml Helseskadelig WB I (DNA vaskebuffer I) Tris-HCl-buffer 64 % guanidinhydroklorid Xn 64 % (vekt per vekt) guanidin-hcl 1 x 25 ml Helseskadelig WB II (DNA vaskebuffer II) Tris-HCl-buffer Natriumklorid DNA EB (DNA elueringsbuffer) Tris-HCl-buffer 0,09 % natriumazid FT (Filterrør med kork) CT (Oppsamlingsrør) 1 x 12,5 ml 1 x 6 ml 1 x 25 stk. 3 x 25 stk NO 3 Doc Rev. 4.0

4 cobas EGFR Mutation Test EGFR 24 tester (P/N: ) EGFR 2 x 0,48 ml (EGFR Master Mix 1) Tris-buffer Kaliumklorid Glyserol EDTA Tween 20 3,13 % dimetylsulfoksid 0,09 % natriumazid < 0,10 % dntps < 0,01 % Z05-AS1 DNA-polymerase (mikrobiell) < 0,01 % AmpErase (uracil-n-glykosylase) enzym (mikrobiell) < 0,01 % Aptamer < 0,01 % oppstrøms og nedstrøms EGFR-primere < 0,01 % fluoroformerkede EGFR-prober EGFR 2 x 0,48 ml (EGFR Master Mix 2) Tris-buffer Kaliumklorid Glyserol EDTA Tween 20 3,13 % dimetylsulfoksid 0,09 % natriumazid < 0,10 % dntps < 0,01 % Z05-AS1 DNA-polymerase (mikrobiell) < 0,01 % AmpErase (uracil-n-glykosylase) enzym (mikrobiell) < 0,01 % Aptamer < 0,01 % oppstrøms og nedstrøms EGFR-primere < 0,01 % fluoroformerkede EGFR-prober EGFR 2 x 0,48 ml (EGFR Master Mix 3) Tris-buffer Kaliumklorid Glyserol EDTA Tween 20 3,13 % dimetylsulfoksid 0,09 % natriumazid < 0,10 % dntps < 0,01 % Z05-AS1 DNA-polymerase (mikrobiell) < 0,01 % AmpErase (uracil-n-glykosylase) enzym (mikrobiell) < 0,01 % Aptamer < 0,01 % oppstrøms og nedstrøms EGFR-primere < 0,01 % fluoroformerkede EGFR-prober MGAC 6 x 0,2 ml (Magnesiumacetat) Magnesiumacetat 0,09 % natriumazid EGFR MC 6 x 0,1 ml (EGFR mutantkontroll) Tris-buffer EDTA Poly-rA RNA (syntetisk) 0,05 % natriumazid < 0,1 % plasmid-dna som inneholder EGFR-ekson 18-, 19-, 20- og 21-sekvenser (mikrobiell) < 0,1 % EGFR villtype-dna (cellekultur) DNA SD 2 x 3,5 ml (DNA-fortynningsløsning) Tris-HCl-buffer 0,09 % natriumazid NO 4 Doc Rev. 4.0

5 ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER A. FOR BRUK TIL IN VITRO-DIAGNOSTIKK. B. Denne testen skal kun brukes til FFPET NSCLC-prøver. C. Ikke pipetter med munnen. D. Ikke spis, drikk eller røyk i laboratoriets arbeidsområder. E. Unngå mikrobiell kontaminering og DNA-kontaminering av reagenser. F. Kasser ubrukte reagenser og avfall i henhold til nasjonalt, regionalt og lokalt regelverk. G. Bruk ikke kit etter utløpsdatoen. H. Reagenser fra ulike kit eller lot må ikke slås sammen. I. Hansker må brukes, og de må byttes mellom håndtering av prøver og reagenser for å unngå kontaminering. J. For å unngå at Working Master Mix kontamineres med DNA-prøver, skal amplifikasjon og deteksjon utføres i et annet område enn der det utføres DNA-isolering. Arbeidsområdet der det utføres amplifikasjon og deteksjon, skal være fullstendig rengjort før tillaging av Working Master Mix. For å sikre tilstrekkelig rengjøring skal alle overflater, inkludert stativ og pipetter, tørkes grundig med en 0,5 % natriumhypoklorittløsning og deretter med en 70 % etanolløsning. K. DNA PBB og WB I inneholder guanidinhydroklorid. Hvis væske som inneholder denne bufferen søles, må du rengjøre med passende laboratorierengjøringsmiddel og vann. Hvis det søles væske med potensielt infeksiøse agens, rengjør det affiserte området først med laboratorierengjøringsmiddel og vann, og deretter med 0,5 % natriumhypokloritt*. Hvis det søles på cobas z 480-analysatoren, følg instruksjonene i instrumentmanualen for cobas z 480-analysatoren. *MERK: Kommersielt tilgjengelig blekemiddel til husholdningsbruk inneholder normalt natriumhypokloritt med en konsentrasjon på 5,25 %. En fortynning i forholdet 1:10 med et slikt blekemiddel gir en 0,5 % natriumhypoklorittløsning. L. Prøver må håndteres som smittebærende, og sikre laboratorierutiner må følges. Disse er beskrevet i Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 16 og CLSI-dokumentet M29-A3. 17 M. DNA TLB og DNA PBB inneholder Triton X-100, som irriterer slimhinnene. Unngå kontakt med øyne, hud og slimhinner. N. DNA TLB, DNA EB, MGAC, EGFR, EGFR, EGFR, EGFR MC og DNA SD inneholder natriumazid. Natriumazid kan reagere med bly- og kobberrør og danne svært eksplosive metallazider. Hvis løsninger som inneholder natriumazid, helles ned i avløp i laboratoriet, må de skylles ned med store mengder vann for å unngå opphopning av azider. O. Xylen er et farlig kjemikalium og skal brukes i et kjemikaliekabinett. Kastes i beholderen for kjemisk avfall i samsvar med lokalt, nasjonalt og regionalt regelverk. P. Bruk vernebriller, laboratoriefrakk og engangshansker ved håndtering av reagenser. Unngå kontakt med hud, øyne og slimhinner. Skyll umiddelbart med mye vann hvis slik kontakt oppstår. Hvis kontaktstedet ikke blir behandlet, kan det oppstå brannskade. Fortynn med vann før du tørker opp eventuelt søl. Q. Alt forbruksmateriell er laget for bare å brukes én gang. Skal ikke gjenbrukes. R. Bruk ikke forbruksmateriell etter utløpsdato. S. Bruk ikke natriumhypoklorittløsning (klormiddel) til å rengjøre cobas z 480-analysatoren. Rengjør cobas z 480-analysatoren i samsvar med prosedyrene som er beskrevet i instrumentmanualen for cobas z 480-analysatoren. T. For ytterligere advarsler, forholdsregler og prosedyrer for å redusere risikoen for kontaminasjon av cobas z 480-analysatoren henvises det til instrumentmanualen for cobas z 480-analysatoren. U. Bruk av sterile engangspipetter og DNase-frie pipettespisser anbefales. OPPBEVARING OG HÅNDTERING A. Med unntak av PK-reagenset, skal ikke reagenser fryses. B. Oppbevar DNA TLB, DNA PBB, WB I, WB II, DNA EB, PK, FT og CT ved 15 C til 30 C. Når de er åpnet er DNA TLB, DNA PBB, WB I, WB II, DNA EB og PK stabile for bruk opptil 8 ganger over 90 dager eller til utløpsdato, avhengig av hva som kommer først. C. Etter at sterilt, nukleasefritt vann er tilsatt til PK, oppbevar ubrukt rekonstituert PK i alikvoter på 450 μl ved -20 C. Når det er rekonstituert, skal PK brukes innen 90 dager eller inntil utløpsdatoen, avhengig av hva som kommer først. D. Etter at absolutt etanol er tilsatt, skal WB I og WB II oppbevares ved 15 C til 30 C. Disse arbeidsløsningene er stabile i opptil 90 dager eller til utløpsdato, avhengig av hva som kommer først. E. Oppbevar MGAC, EGFR, EGFR, EGFR, EGFR MC og DNA SD ved 2 C til 8 C. Når disse reagensene er åpnet, er de stabile for bruk opptil 4 ganger over 90 dager eller til utløpsdato, avhengig av hva som kommer først. F. EGFR, EGFR, EGFR og Working MMX (tillages ved tilsetting av MGAC til EGFR eller EGFR eller EGFR ) skal beskyttes mot langvarig eksponering for lys NO 5 Doc Rev. 4.0

6 G. Working Master Mix skal oppbevares mørkt ved 2 C til 8 C. Preparerte prøver og kontroller må tilsettes innen 1 time fra tidspunktet Working Master Mix ble tillaget. H. Behandlede prøver (ekstrahert DNA) er stabile i inntil 24 timer ved 15 C til 30 C eller opptil 14 dager ved 2 C til 8 C eller opptil 60 dager ved -15 C til -25 C eller etter 3 fryse-tine-sykluser hvis de oppbevares ved -15 C til -25 C. Ekstrahert DNA skal amplifiseres innen anbefalte oppbevaringsperioder eller før utløpsdatoen for cobas DNA-prøveprepareringskitet som brukes til å ekstrahere DNA, avhengig av hva som kommer først. I. Amplifikasjon må startes innen 1 time fra det tidspunktet da de behandlede prøvene og kontrollene er tilsatt i Working Master Mix (tillages ved å tilsette MGAC til EGFR eller EGFR eller EGFR ). MATERIELL SOM MEDFØLGER A. cobas DNA Sample Preparation Kit DNA SP 24 tester cobas DNA-prøveprepareringskit (P/N: ) DNA TLB (DNA-vevslyseringsbuffer) PK (Proteinase K) DNA PBB (DNA parafinbindingsbuffer) WB I (DNA vaskebuffer I) WB II (DNA vaskebuffer II) DNA EB (DNA elueringsbuffer) FT (Filterrør med kork) CT (Oppsamlingsrør) B. cobas EGFR Mutation Test EGFR 24 tester (P/N: ) MGAC (magnesiumacetat) (lokk med gult merke) EGFR (EGFR Master Mix 1) (lokk med hvitt merke) EGFR (EGFR Master Mix 2) (lokk med gullfarget merke) EGFR (EGFR Master Mix 3) (lokk med blågrønt merke) EGFR MC (EGFR mutantkontroll) (lokk med rødt merke) DNA SD (DNA-fortynningsløsning) MATERIELL SOM KREVES, MEN SOM IKKE MEDFØLGER Xylen (Sigma, kat.nr eller Fisher Scientific, kat.nr. X5-4 eller tilsvarende) Absolutt etanol (Sigma, kat.nr. E7023 eller Fisher Scientific, kat.nr. BP eller tilsvarende) Isopropanol (Sigma, kat.nr eller Fisher Scientific, kat.nr. A451-1 eller tilsvarende) Sterilt vann, nukleasefritt (Applied Biosystems-vann med PCR-kvalitet, kat.nr.# AM9937 eller Thermo Scientific-vann med molekylærbiologikvalitet, kat.nr. SH eller tilsvarende) Sterile serologiske pipetter for engangsbruk: 5 og 25 ml Mikrobrønnplate (AD-plate) og forseglingsfilm (Roche P/N ) for cobas 4800-systemet Forseglingsfilmapplikator for cobas 4800 (Roche P/N ) NO 6 Doc Rev. 4.0

7 Justerbare pipetter* (kapasitet 10 μl, 20 μl, 200 μl og 1000 μl) med aerosolbarriere- eller "positive displacement" DNase-frie spisser Pipettefyller (Drummond P/N: eller tilsvarende) Bordmikrosentrifuge som kan yte 8000 x g og til x g (Eppendorf 5417C eller tilsvarende)** To (2) varmeblokker med kapasitet til å varme opp mikrosentrifugerør til 56 C og 90 C** 1,5 ml Safe-Lock-mikrosentrifugerør, sterile, RNase/DNase-frie, PCR-kvalitet (Eppendorf, kat.nr ) Nanodrop UV-Vis spektrofotometer (Thermo Scientific ND-1000 eller ND-2000)** Vortexmikser** Stativer for mikrosentrifugerør Engangshansker, pudderfrie Kalibrerte termometere for varmeblokk** Vannbad** som kan opprettholde 37 C Enegget knivblad eller lignende * Pipettene må vedlikeholdes i samsvar med produsentens instruksjoner og ha en nøyaktighet innenfor 3 % av angitt volum. Aerosolbarriere- eller "positive displacement" DNase-frie spisser må brukes der dette er angitt for å hindre krysskontaminering av prøver og amplicon. ** Alt utstyr må vedlikeholdes i samsvar med produsentens instruksjoner. Instrumentering og programvare cobas z 480-analysatoren cobas 4800 SR2-systemets kontrollenhet med OSXP-bilde cobas 4800 SR2-systemets programvareversjon 2.0 EGFR-analyseringspakke programvareversjon 1.0 Strekkodeleser USB-utg. Skriver HP P2055d PRØVETAKING, -TRANSPORT OG -OPPBEVARING MERK: Alle prøver må behandles som om de er potensielt smittebærende. A. Prøvetaking NSCLC FFPET-prøver er validert for bruk med cobas EGFR mutasjonstest. B. Prøvetransport NSCLC FFPET-prøver kan transporteres ved 15 C til 30 C. Transport av FFPET-prøver må skje i henhold til nasjonalt, regionalt og lokalt regelverk for transport av biologisk materiale. 14 C. Prøveoppbevaring NSCLC FFPET-prøver kan oppbevares ved 15 C til 30 C i inntil 12 måneder etter prøvetakingsdatoen. 5 μm-snitt montert på objektglass kan oppbevares ved 15 C til 30 C i opptil 60 dager. BRUKSANVISNING MERK: Kun NSCLC FFPET-snitt med en tykkelse på 5 μm med minst 10 % tumorinnhold per område skal brukes i cobas EGFR mutasjonstesten. Prøver med mindre enn 10 % tumorinnhold per område skal makrodissikeres etter deparafinisering. MERK: Se instrumentmanualen for cobas z 480-analysatoren for detaljert bruksanvisning for cobas z 480-analysatoren. MERK: Varmeblokker med kapasitet til å varme opp mikrosentrifugerør skal slås på og settes på 56 C og 90 C. Størrelse på analyseserier En enkelt analyseserie kan inkludere fra 1 til 30 prøver (pluss kontroller) per 96-brønns mikrobrønnplate. Hvis mer enn 24 prøver analyseres, må det brukes flere cobas EGFR mutasjonstestkit. cobas EGFR mutasjonstest inneholder tilstrekkelig med reagenser for 8 analyseserier av 3 prøver (pluss kontroller) for maksimalt 24 prøver per kit NO 7 Doc Rev. 4.0

8 Arbeidsflyt cobas EGFR mutasjonstesten består av manuell prøvepreparering ved bruk av cobas DNA prøveprepareringskit etterfulgt av amplifikasjon/deteksjon på cobas z 480-analysatoren ved bruk av cobas EGFR mutasjonstestkit. Tillaging av reagenser A. Rekonstituer proteinase K (PK) ved å tilsette 4,5 ml sterilt, nukleasefritt vann (PCR-kvalitet) til flasken ved å bruke en steril 5-ml serologisk engangspipette. Blandes ved å vende flasken opp-ned 5 til 10 ganger. Avpipetter 450 μl rekonstituert PK til 1,5 ml Safe-Lock-mikrosentrifugerør og oppbevar ved -20 C. Hvis proteinase K allerede er rekonstituert og fryst, tin opp et tilstrekkelig antall avpipetterte mengder til å behandle det antall prøver som skal kjøres før deparafinisering (70 μl med rekonstituert PK er nødvendig for hver prøve). B. Alle løsninger som er lagret ved C, skal være klare. Hvis det forekommer bunnfall i noen av reagensene, varm opp løsningen i et vannbad på 37 C til bunnfallet løses opp. Må ikke brukes før alt bunnfall er oppløst. C. Tillag aktiv DNA-vaskebuffer I (WB I) ved å tilsette 15 ml absolutt etanol til flasken med WB I. Blandes ved å vende flasken oppned 5 til 10 ganger. Skriv på flasken at etanol er tilsatt, og noter datoen. Oppbevar aktiv WB I ved 15 C til 30 C. D. Tillag aktiv DNA-vaskebuffer II (WB II) ved å tilsette 50 ml absolutt etanol til flasken med WB II. Blandes ved å vende flasken opp-ned 5 til 10 ganger. Skriv på flasken at etanol er tilsatt, og noter datoen. Oppbevar aktiv WB II ved 15 C til 30 C. Deparafinisering av FFPET-snitt montert på objektglass MERK: Xylen er et farlig kjemikalium. Alle trinn for deparafinisering skal utføres i et kjemikaliekabinett. Se "Advarsler og forholdsregler". A. Legg et objektglass med et montert FFPET-snitt på 5 μm i en beholder med tilstrekkelig xylen til å dekke vevet, og bløtlegg i 5 minutter. B. Overfør objektglasset til en beholder med tilstrekkelig absolutt etanol til å dekke vevet. Bløtlegg i 5 minutter. C. Fjern objektglasset fra etanolen og la snittet lufttørke helt (5 til 10 minutter). D. Utfør makrodisseksjon hvis prøven inneholder mindre enn 10 % tumorinnhold per område. E. Merk ett 1,5-ml Safe-Lock-mikrosentrifugerør for hver prøve med prøveidentifikasjon. F. Tilsett 180 μl DNA TLB til 1,5-ml Safe-Lock-mikrosentrifugerøret. G. Tilsett 70 μl rekonstituert PK til Safe-Lock-mikrosentrifugerøret som inneholder DNA TLB. H. Skrap vevet av objektglasset og inn i Safe-Lock-røret. Senk vevet ned i blandingen med DNA TLB/PK. I. Forsett med Trinn A i prosedyren for DNA-isolering. Deparafinisering av FFPET-snitt som ikke er montert på objektglass MERK: Xylen er et farlig kjemikalium. Alle trinn for deparafinisering skal utføres i et kjemikaliekabinett. Se "Advarsler og forholdsregler". MERK: Hvis prøven har mindre enn 10 % tumorinnhold per område, må snittet monteres på et objektglass for makrodisseksjon. Følg prosedyren som er beskrevet i "Deparafinisering av FFPET-snitt montert på objektglass". A. Plasser ett FFPET-snitt på 5 μm i et 1,5-ml Safe-Lock-mikrosentrifugerør merket med prøveidentifikasjon for hver prøve. B. Tilsett 500 μl xylen til Safe-Lock-mikrosentrifugerøret som inneholder FFPET-snittet. C. Bland godt ved å vortexe i 10 sekunder. D. La røret stå i 5 minutter ved 15 C til 30 C. E. Tilsett 500 μl absolutt etanol og bland ved å vortexe i 10 sekunder. F. La røret stå i 5 minutter ved 15 C til 30 C. G. Sentrifuger ved x g til x g i 2 minutter. Fjern supernatanten uten å røre pelleten. Kast supernatanten i beholderen for kjemisk avfall. H. Tilsett 1 ml absolutt etanol og vortex i 10 sekunder. I. Sentrifuger ved x g til x g i 2 minutter. Fjern supernatanten uten å røre pelleten. Kast supernatanten i beholderen for kjemisk avfall. MERK: Hvis pelleten flyter i den gjenværende supernatanten, sentrifuger på nytt i 1 minutt ved x g til x g. Fjern eventuell gjenværende supernatant. J. Tørk vevspelleten i 10 minutter ved 56 C i en varmeblokk med røret åpent. MERK: Kontroller at etanolen er helt fordampet og at pelleten er tørr før du går videre til neste trinn. MERK: Ved behov kan tørre pellets oppbevares i inntil 24 timer ved 2 C til 8 C NO 8 Doc Rev. 4.0

9 K. Resuspender vevspelleten i 180 μl DNA-vevslyseringsbuffer (DNA TLB). L. Tilsett 70 μl rekonstituert PK. M. Forsett med Trinn A i prosedyren for DNA-isolering. PRØVEPREPARERING Prosedyre for DNA-isolering MERK: Preparer en negativ kontroll samtidig med prøven(e). Tillag den negative kontrollen ved å kombinere 180 μl DNAvevslyseringsbuffer (DNA TLB) og 70 μl PK-løsning i et 1,5-ml Safe-Lock-mikrosentrifugerør merket NEG CT. Den negative kontrollen skal behandles ved å følge samme prosedyre som for prøvene. A. Vortex rørene med blandingen av prøve/dna TLB/PK og blandingen med negativ kontroll (NEG CT) i 30 sekunder. MERK: Vevet må være fullstendig nedsenket i blandingen av DNA TLB/PK. B. Plasser rørene i varmeblokken på 56 C og inkuber i 60 minutter. C. Vortex rørene i 10 sekunder. MERK: Vevet må være fullstendig nedsenket i blandingen av DNA TLB/PK. D. Plasser rørene i varmeblokken på 90 C og inkuber i 60 minutter. MERK: Under inkuberingen, klargjør nødvendig antall filterrør (FT) med hengslede lokk ved å plassere filterrørene i et oppsamlingsrør (CT) og merke hvert FT-lokk med riktig prøve- eller kontrollidentifikasjon. MERK: Hver prøve trenger 1 FT, 3 CT og 1 elueringsrør (1,5 ml mikrosentrifugerør). MERK: Under inkubering, merk nødvendig antall med elueringsrør (1,5 ml mikrosentrifugerør) med riktig prøve- eller kontrollidentifikasjon. E. La rørene kjøles til 15 C til 30 C. Etter kjøling, pulssentrifuger rørene for å samle opp væske fra lokkene. F. Tilsett 200 μl DNA PBB til hvert rør og bland ved å pipettere opp og ned 3 ganger. G. Inkuber rørene ved 15 C til 30 C i 10 minutter. H. Tilsett 100 μl isopropanol til hvert rør og bland lysatet ved å pipettere opp og ned 3 ganger. I. Overfør hvert lysat til den riktig merkede FT/CT-enheten. J. Sentrifuger FT/CT-enhetene ved 8000 x g i 1 minutt. K. Plasser hver FT i en ny CT. Kast væskeinnholdet i den gamle CTen i beholder for kjemisk avfall, og kast den brukte CTen i henhold til gjeldende forskrifter. L. Tilsett 500 μl aktivt WB I til hvert FT. MERK: Tillaging av aktivt WB I er beskrevet i avsnittet "Tillaging av reagenser". M. Sentrifuger FT/CT-enhetene ved 8000 x g i 1 minutt. N. Kast væskeinnholdet i hver CT i beholder for kjemisk avfall. Plasser FTen tilbake i samme CT. O. Tilsett 500 μl aktivt WB II til hvert FT. MERK: Tillaging av aktivt WB II er beskrevet i avsnittet "Tillaging av reagenser". P. Sentrifuger FT/CT-enhetene ved 8000 x g i 1 minutt. Q. Plasser hver FT i en ny CT. Kast væskeinnholdet i den gamle CTen i beholder for kjemisk avfall, og kast den brukte CTen i henhold til gjeldende forskrifter. R. Sentrifuger FT/CT-enhetene ved til x g i 1 minutt for å tørke filtermembranene. S. Plasser hver FT i et elueringsrør (1,5 ml mikrosentrifugerør) som er merket med prøve- eller kontrollidentifikasjon. Kast væskeinnholdet i den gamle CTen i beholder for kjemisk avfall, og kast den brukte CTen i henhold til gjeldende forskrifter. T. Tilsett 100 μl DNA EB i sentrum av hver FT-membran uten å berøre FT-membranen. U. Inkuber FT med elueringsrøret ved 15 C til 30 C i 5 minutter. V. Sentrifuger FT med elueringsrøret ved 8000 x g i 1 minutt for å samle eluat i elueringsrøret. Kast brukt FT i henhold til gjeldende forskrifter. W. Lukk lokket på elueringsrøret. Elueringsrøret inneholder nå DNA-stokkløsningen. Gå videre til Trinn A i avsnittet DNAkvantitering. MERK: Måling av DNA-konsentrasjonen skal utføres straks etter prosedyren for DNA-isolering, og før oppbevaring NO 9 Doc Rev. 4.0

10 DNA-kvantitering: A. Bland hver DNA-stokkløsning ved å vortexe i 5 sekunder. B. Kvantiter DNA ved å bruke et Nanodrop UV-Vis spektrofotometer (ND-1000 eller ND-2000) i samsvar med produsentens protokoll. Bruk DNA EB som blank for instrumentet. Gjennomsnittlig to etterfølgende avlesninger er påkrevd. De to målingene skal være innenfor ± 10 % av hverandre når de avleste DNA-konsentrasjonene er 20,0 ng/μl. For avleste DNA-konsentrasjoner < 20,0 ng/μl skal de to målingene være innenfor ± 2 ng/μl. Hvis de to målingene ikke er innenfor ± 10 % av hverandre når de avleste DNA-konsentrasjonene er 20,0 ng/μl eller innenfor ± 2 ng/μl når de avleste DNA-konsentrasjonene er < 20,0 ng/μl, må det tas ytterligere 2 avlesninger før kravene er oppfylt. Gjennomsnittet av disse to nye målingene skal da beregnes. MERK: DNA-stokkløsningen fra den behandlede negative kontrollen (NEG CT) trenger ikke måles. C. Konsentrasjonen til DNA-stokkløsningen fra prøvene må være 2 ng/μl for at cobas EGFR mutasjonstesten skal kunne utføres. Tre amplifikasjoner/deteksjoner kjøres per prøve, og det benyttes 25 μl av en 2 ng/μl-fortynning av DNA-stokkløsningen (50 ng DNA totalt) for hver amplifikasjon/deteksjon. MERK: Hver DNA-stokkløsning må ha en minimumskonsentrasjon på 2 ng/μl for at cobas EGFR mutasjonstesten skal kunne utføres. Hvis konsentrasjonen av en DNA-stokkløsning er < 2 ng/μl, skal prosedyrene for deparafinisering, DNA-isolering og DNA-kvantitering gjentas for den aktuelle prøven ved bruk av to FFPET-snitt på 5 μm. For monterte prøver, etter deparafinisering, kombiner vevet fra begge snittene i ett rør, nedsenk vevet i DNA TLB + PK, og utfør DNA-isolering og kvantitering som beskrevet ovenfor. For umonterte prøver, kombiner to snitt i ett rør, nedsenk vevet i DNA TLB + PK, og utfør DNA-isolering og kvantitering som beskrevet ovenfor. Hvis DNAstokkløsningen fortsatt er < 2 ng/μl, bestill et annet FFPET-prøvesnitt fra det henvisende sykehuset. MERK: Behandlede prøver (ekstrahert DNA) er stabile i inntil 24 timer ved 15 C til 30 C eller opptil 14 dager ved 2 C til 8 C eller opptil 60 dager ved -15 C til -25 C eller etter 3 fryse-tine-sykluser når de oppbevares ved -15 C til -25 C. Ekstrahert DNA skal amplifiseres innen anbefalte oppbevaringsperioder eller før utløpsdatoen for cobas DNA-prøveprepareringskitet som brukes til å ekstrahere DNA, avhengig av hva som kommer først. AMPLIFIKASJON OG DETEKSJON MERK: For å unngå at Working Master Mix kontamineres med DNA-prøver, skal amplifikasjon og deteksjon utføres i et annet område enn der det utføres DNA-isolering. Arbeidsområdet der det utføres amplifikasjon og deteksjon, skal være fullstendig rengjort før tillaging av Working Master Mix. For å sikre tilstrekkelig rengjøring skal alle overflater, inkludert stativ og pipetter, tørkes grundig med en 0,5 % natriumhypoklorittløsning og deretter med en 70 % etanolløsning. Kommersielt tilgjengelig blekemiddel til husholdningsbruk inneholder normalt natriumhypokloritt med en konsentrasjon på 5,25 %. En fortynning i forholdet 1:10 med et slikt blekemiddel gir en 0,5 % natriumhypoklorittløsning. Klargjøring av instrumentet: Se instrumentmanualen for cobas z 480-analysatoren for detaljerte instruksjoner om klargjøring av cobas z 480. Klargjøring av testrekkefølge: Se operatørmanualen for cobas 4800-systemet, programvareversjon 2.0, for cobas EGFR mutasjonstesten (operatørmanualen for (cobas EGFR) for detaljerte instruksjoner om trinnene i EGFR-arbeidsflyten. Fortynningsberegning av prøve-dna-stokkløsning: Fortynningsberegning av konsentrasjoner til DNA-stokkløsningen fra 2 ng/μl til 36 ng/μl MERK: DNA-stokkløsninger fra prøver skal fortynnes like før amplifikasjon og deteksjon. MERK: Tre (3) amplifikasjoner/deteksjoner kjøres per prøve, og det benyttes et totalvolum på 75 μl (25 μl hver av tre reaksjoner) av en 2 ng/μl-fortynning av DNA-stokkløsningen (totalt 150 ng DNA). A. For hver prøve, beregn volumet (μl) av DNA-stokkløsning som trengs: μl av DNA-stokkløsning = (90 μl x 2 ng/μl) konsentrasjon til DNA-stokkløsningen [ng/μl] B. For hver prøve, beregn volumet (μl) av DNA-fortynningsløsning (DNA SD) som trengs: μl av DNA SD = 90 μl μl av DNA-stokkløsning Eksempel: Konsentrasjon til DNA-stokkløsningen = 6,5 ng/μl A. μl av DNA-stokkløsning = (90 μl x 2 ng/μl) 6,5 ng/μl = 27,7 μl B. μl av DNA SD = (90 μl 27.7 μl) = 62.3 μl NO 10 Doc Rev. 4.0

11 Fortynningsberegning av konsentrasjoner til DNA-stokkløsningen > 36 ng/μl MERK: DNA-stokkløsninger fra prøver skal fortynnes like før amplifikasjon og deteksjon. MERK: Tre (3) amplifikasjoner/deteksjoner kjøres per prøve, og det benyttes et totalvolum på 75 μl (25 μl hver av tre reaksjoner) av en 2 ng/μl-fortynning av DNA-stokkløsningen (totalt 150 ng DNA). A. Ved konsentrasjoner til DNA-stokkløsningen > 36 ng/μl, bruk følgende formel for å beregne hvor mye DNA-fortynningsløsning (DNA SD) som trengs for å tillage minst 90 μl fortynnet DNA-stokkløsning. Dette er for å sikre at hver prøve bruker minst 5 μl med DNA-stokkløsning. B. For hver prøve, beregn volumet (μl) av DNA SD som trengs for å fortynne 5 μl av DNA-stokkløsningen til 2 ng/μl: Volum av DNA SD som trengs i μl = ((5 μl av DNA-stokkløsning x konsentrasjon til DNA-stokkløsningen i ng/μl) / 2 ng/μl) 5 μl Eksempel: Konsentrasjon til DNA-stokkløsningen = 100 ng/μl A. Volum av DNA SD som trengs i μl = ((5 μl x 100 ng/μl) / 2 ng/μl) 5 μl = 245 μl B. Bruk det beregnede volumet av DNA SD for å fortynne 5 μl med DNA-stokkløsning. Prøvefortynning A. Klargjør riktig antall med 1,5 ml Safe-Lock-mikrosentrifugerør for DNA-fortynninger ved å merke dem med riktig prøveidentifikasjon. B. Bruk en pipette med aerosolbarrierespiss og pipetter det beregnede volumet av DNA SD i hvert merkede prøverør. Pipetter 45 μl av DNA SD i et Safe-Lock-rør merket NEG CT. C. Vortex hver DNA-stokkløsning og den negative kontrollen i 5 til 10 sekunder. D. Bruk en pipette med aerosolbarrierespiss (ny spiss for hver pipettering) og pipetter forsiktig det beregnede volumet av hver DNA-stokkløsning i riktig rør med DNA SD. Pipetter 45 μl av negativ kontroll (ekstrahert eluat) i NEG CT-røret. E. Kork rørene og vortex hvert rør i 5 til 10 sekunder. F. Bytt hansker. Tillaging av Working Master Mix (, og ) MERK: EGFR, EGFR, EGFR og Working Master Mix er lysfølsomme og må beskyttes mot langvarig eksponering for lys. MERK: Grunnet viskositeten til EGFR MIX og Working Master Mix skal det pipetteres langsomt for å sikre at all blanding blir fullstendig dispensert fra spissen. MERK: EGFR, EGFR og EGFR kan være lyseblå/lillaaktige. Dette påvirker ikke reagensenes ytelse. Klargjør tre porsjoner med Working Master Mix, én som inneholder EGFR, én som inneholder EGFR, og én som inneholder EGFR, i separate 1,5 ml Safe-Lock-mikrosentrifugerør. A. Beregn volumet av EGFR eller EGFR eller EGFR som trengs for hver Working Master Mix, ved å bruke følgende formel: Volum av EGFR eller EGFR eller EGFR som trengs = (antall prøver + 2 kontroller +1) x 20 μl B. Beregn volumet av MGAC som trengs for hver Working Master Mix, ved å bruke følgende formel: Volum av MGAC som trengs = (antall prøver + 2 kontroller + +1) x 5 μl Bruk tabell 1 for å bestemme volumet av hvert reagens som trengs for tillaging av Working Master Mix, basert på antall prøver i analyseserien. Tabell 1 Volumer av reagenser som trengs for Working Master Mix 1, Working Master Mix 2 og Working Master Mix 3 Antall prøver* MMX 20 μl MGAC 5 μl Totalvolum for hver Working Master Mix (μl) * Volumer for antall prøver er basert på summen av antall prøver + 2 kontroller NO 11 Doc Rev. 4.0

12 C. Ta ut riktig antall flasker med EGFR, EGFR, EGFR og MGAC fra kjølelagringen på 2 C til 8 C. Vortex hvert reagens i 5 sekunder for å samle væsken i bunnen av røret før bruk. Merk et sterilt mikrosentrifugerør for Working Master Mix 1, Working Master Mix 2 og Working Master Mix 3. D. Tilsett det beregnede volumet av EGFR eller EGFR eller EGFR til deres respektive rør med Working Master Mix. E. Tilsett beregnet volum av MGAC til rørene med Working Master Mix. F. Vortex rørene i 3 til 5 sekunder for å sikre tilstrekkelig blanding. MERK: Prøver og kontroller skal tilsettes mikrobrønnplaten (AD-platen) innen 1 time etter tillaging av Working Master Mix. MERK: Bruk kun mikrobrønnplate (AD-plate) og forseglingsfilm for cobas 4800-systemet (Roche P/N ). Klargjøring av plate Figur 1 Oppsett av prøveplate Figur 1. Plateoppsett for cobas EGFR mutasjonstest Rad / kolonne A B C D E F G H MUT NEG S1 S2 S3 S4 S5 S6 MUT NEG S1 S2 S3 S4 S5 S6 MUT NEG S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14 S15 S16 S17 S18 S19 S20 S21 S22 S15 S16 S17 S18 S19 S20 S21 S22 S15 S16 S17 S18 S19 S20 S21 S22 S23 S24 S25 S26 S27 S28 S29 S30 S23 S24 S25 S26 S27 S28 S29 S30 S23 S24 S25 S26 S27 S28 S29 S30 Der: NEG = negativ kontroll, MUT = mutantkontroll, S# = prøve-id og MMX-# tilsvarer Master Mix-reagens 1, 2 eller 3. MERK: En gitt prøve må spres over tre etterfølgende kolonner i én rad for å generere et resultat. A. Pipetter 25 μl Working Master Mix til hver reaksjonsbrønn som trengs for analyseserien, i mikrobrønnplaten (AD-platen). Ikke la pipettespissen berøre platen utenfor brønnen. Tilsett Working Master Mix 1 (som inneholder EGFR ) til brønnene på mikrobrønnplaten (AD-platen) i kolonnene 1, 4, 7 og 10, etter behov. Tilsett Working Master Mix 2 (som inneholder EGFR ) til brønnene på mikrobrønnplaten (AD-platen) i kolonnene 2, 5, 8 og 11, etter behov. Tilsett Working Master Mix 3 (som inneholder EGFR ) til brønnene på mikrobrønnplaten (AD-platen) i kolonnene 3, 6, 9 og 12, etter behov. B. Pipetter 25 μl EGFR MC til brønnene A1, A2 og A3 på mikrobrønnplaten (AD-platen). Bland godt ved å pipettere opp og ned i brønnen minst to ganger. C. Bruk en ny pipettespiss og pipetter 25 μl NEG CT til brønnene B1, B2 og B3 i mikrobrønnplaten (AD-platen). Bland godt ved å pipettere opp og ned i brønnen minst to ganger. MERK: Hver analyseserie må inneholde positiv kontroll (EGFR MC) i brønn A1, A2 og A3, og negativ kontroll (NEG CT) i brønn B1, B2 og B3, ellers blir analyseserien gjort ugyldig av cobas z 480-analysatoren. MERK: Bytt hansker ved behov for å forebygge kontaminasjon fra prøve til prøve og kontaminasjon av utsiden av PCRreaksjonsrøret NO 12 Doc Rev. 4.0

13 D. Bruk nye pipettespisser for hver fortynnet prøve-dna og tilsett 25 μl av det første prøve-dna-et til brønn C1, C2 og C3 i mikrobrønnplaten (AD-platen). Bruk en ny pipettespiss for å tilsette prøve-dna i hver brønn, og bland hver brønn ved å pipettere opp og ned i brønnen minst to ganger. Gjenta denne prosedyren for det fortynnede DNA-et fra den andre prøven (brønn D1, D2 og D3). Følg malen i figur 1 til alle prøvenes DNA-fortynninger er fylt i mikrobrønnplaten (AD-platen). Sørg for at all væske er samlet i bunnen av brønnene. E. Dekk mikrobrønnplaten (AD-platen) med forseglingsfilmen (leveres med platene). Bruk forseglingsfilmapplikatoren for å forsegle filmen godt til mikrobrønnplaten (AD-platen). F. Kontroller at all væske er samlet i bunnen av hver brønn før du starter PCR. MERK: Amplifikasjon og deteksjon skal startes innen 1 time etter at den første prøve-dna-fortynningen ble tilsatt i Working Master Mix. Starte PCR Se operatørmanualen for cobas EGFR for detaljerte instruksjoner om trinnene i EGFR-arbeidsflyten. TOLKNING AV RESULTATER MERK: All analyseserie- og prøvevalidering utføres av cobas 4800-programvaren. MERK: En gyldig analyseserie kan omfatte både gyldige og ugyldige prøveresultater. Prøveresultater fra gyldige analyseserier tolkes som vist i tabell 2. Tabell 2 Tolkning av resultater med cobas EGFR mutasjonstest Testresultat Mutasjonsresultat Tolkning Mutation Detected Ekson 19-delesjon S768I L858R T790M G719X (G719A, G719C, G719S) Ekson 20-innskudd (Mer enn én mutasjon kan forekomme) Mutasjon detektert i spesifisert mål-egfr-region. Mutation Not N/A Mutasjon ikke detektert i spesifiserte mål-egfr-regioner Detected* Invalid N/A Prøveresultat er ugyldig. Gjenta testing av prøver med ugyldige resultater i samsvar med instruksjonene i avsnittet Gjentatt testing av prøver med ugyldige resultater under. Failed N/A Mislykket grunnet feil ved maskinvare eller programvare. Kontakt ditt lokale Roche-kontor for teknisk støtte. * Et "Mutation Not Detected"-resultat utelukker ikke tilstedeværelsen av en mutasjon i mål-egfr-regionene, fordi resultatene avhenger av prosentvise mutantsekvenser, tilstrekkelig god prøveintegritet, fravær av hemmere og tilstrekkelig med DNA til å kunne detekteres. Gjentatt testing av prøver med ugyldige resultater A. Gjenta fortynning av den ugyldige prøve-dna-stokkløsningen ved å starte med prosedyrene Fortynningsberegning av prøve- DNA-stokkløsning og Prøvefortynning i avsnittet AMPLIFIKASJON OG DETEKSJON. B. Etter å ha fortynnet DNA-stokkløsningen til 2 ng/μl, som beskrevet i Prøvefortynning, fortsett med Tillaging av Working Master Mix (, og ) og resten av prosedyren for amplifikasjon og deteksjon. MERK: Hvis prøven fortsatt er ugyldig etter gjentatt testing, eller hvis det ikke var nok DNA-stokkløsning til å preparere en annen fortynning i trinn A, Gjentatt testing av prøver med ugyldige resultater, gjenta hele testprosedyren for den aktuelle prøven. Start med deparafinisering og DNA-isolering ved bruk av et nytt FFPET-snitt på 5 μm NO 13 Doc Rev. 4.0

14 KVALITETSKONTROLL Ett sett med cobas EGFR-test mutantkontroll (EGFR MC) og negativ kontroll (NEG CT) for Working Master Mix 1, Working Master Mix 2 og Working Master Mix 3 er inkludert i hver analyseserie for opptil 30 prøver. En analyseserie er gyldig hvis brønnene med EGFR mutantkontroll (EGFR MC) (A1, A2 og A3) og brønnene med negativ kontroll (NEG CT) (B1, B2 og B3) er gyldige. Hvis EGFR mutantkontroll (EGFR MC) eller negativ kontroll (NEG CT) for Working Master Mix 1, Working Master Mix 2 eller Working Master Mix 3 er ugyldige, er hele analyseserien ugyldig og må gjentas. Klargjør en fersk fortynning av den tidligere isolerte prøve-dnastokkløsningen, for å sette opp en ny mikrobrønnplate (AD-plate) med kontroller for amplifikasjon og deteksjon. Positiv kontroll Resultatet for EGFR mutantkontroll (EGFR MC) må være "Valid" for Working Master Mix 1, Working Master Mix 2 og Working Master Mix 3. Hvis resultatene for EGFR MC konsekvent er ugyldige, kontakt ditt lokale Roche-kontor for teknisk assistanse. Negativ kontroll Resultatene for negativ kontroll (NEG CT) må være "Valid" for Working Master Mix 1, Working Master Mix 2 og Working Master Mix 3. Hvis resultatene for NEG CT konsekvent er ugyldige, kontakt ditt lokale Roche-kontor for teknisk assistanse. FORSIKTIGHETSREGLER Som for andre laboratorieprosedyrer er god laboratorieteknikk essensielt for å sikre optimal ytelse for denne analysen. På grunn av testens høye analytiske sensitivitet må det utvises aktsomhet for å sikre at reagenser og amplifikasjonsblandinger ikke kontamineres. TESTENS BEGRENSNINGER 1. Test kun de angitte prøvematerialene. cobas EGFR mutasjonstest er bare validert for bruk med NSCLC FFPET-prøver. 2. cobas EGFR mutasjonstest er bare validert ved bruk av cobas DNA-prøveprepareringskit (Roche P/N: ). 3. Deteksjon av en mutasjon er avhengig av antallet kopier som er til stede i prøven, og kan påvirkes av prøvens integritet, mengden isolert DNA og tilstedeværelse av interfererende substanser. 4. Pålitelige resultater er avhengig av adekvat prøvefiksering, transport, oppbevaring og håndtering. Følg prosedyrene i dette pakningsvedlegget og i operatørmanualen for cobas EGFR. 5. Effekten av andre mulige variabler, som f.eks. prøvefikseringsvariabler, er ikke evaluert. 6. Tilsetning av AmpErase-enzym i cobas EGFR mutasjonstest Master Mix muliggjør selektiv amplifikasjon av mål-dna. Kontaminering av reagensene kan imidlertid bare unngås gjennom gode laboratorierutiner og ved å følge prosedyrene som er spesifisert i dette pakningsvedlegget nøye. 7. Dette produktet må kun brukes av personell som er opplært i PCR-teknikk og bruken av cobas 4800-systemet. 8. Dette produktet er kun validert for bruk med cobas z 480-analysatoren. Ingen annen termocycler med optisk sanntidsdeteksjon kan brukes sammen med dette produktet. 9. På grunn av iboende forskjeller mellom teknologier anbefales det at brukerne utfører metodekorrelasjonsstudier i laboratoriet for å bestemme de teknologiske forskjellene før en ny teknologi tas i bruk. 10. Selv om det er sjelden, kan mutasjoner innenfor regionene av det genomiske DNA for EGFR-genet som cobas EGFR mutasjonstestens primere og/eller prober er rettet mot, resultere i manglende evne til å detektere forekomst av en mutasjon. 11. Tilstedeværelse av PCR-hemmere kan føre til falske negative eller ugyldige resultater. 12. Selv om det er sjelden, kan cobas EGFR mutasjonstest vise resultatet "Mutation Not Detected" for enkelte mutasjoner, og begrenset kryssreaktivitet (resultatet "Mutation Detected") for mutasjoner ytterst på målmutasjonene i ekson 18, 19, 20 og cobas EGFR mutasjonstest er validert for bruk med 50 ng DNA per reaksjonsbrønn. DNA-innmatingsmengder under 50 ng per reaksjonsbrønn anbefales ikke NO 14 Doc Rev. 4.0

15 VURDERING AV ANALYTISK YTELSE Analytisk sensitivitet Analytisk sensitivitet for cobas EGFR mutasjonstest ved bruk av plasmidblandinger Seks DNA-plasmidkonstruksjoner som inneholdt de vanligste observerte mutasjonene for hver mutasjonsklasse som detekteres med testen, ble blandet med villtype-cellelinje-dna til en endelig målsammensetning av 5 % mutantsekvenser basert på genomiske DNA-ekvivalenter. Serielle fortynninger av de 5 % mutantsekvensstammene ble tillaget, og 24 replikater av hver panelprøve ble testet ved bruk av 3 kitlot for cobas EGFR mutasjonstest. Den analytiske sensitiviteten ble bestemt med den laveste DNA-mengden som ga en EGFR "Mutation Detected"-rate på minst 95 % for målmutasjonen, og vises i tabell 3. Tabell 3 Sensitivitet for cobas EGFR mutasjonstest ved bruk av DNA fra plasmid- og cellelinjeblandinger EGFR-ekson EGFR-mutasjon Målnukleinsyresekvens Den laveste mengden DNA (ng) i 5 %- mutantpanelprøven per reaksjonsbrønn for å oppnå en 95 % "Mutation Detected"-rate (N = 72 replikater) 18 G719A 2156 G>C 3,13 19 Ekson 19-delesjon del15 0,78 20 S768I 2303 G>T 0,78 20 T790M 2369 C>T 3,13 20 Ekson 20-innskudd 2307_2308ins9 (GCCAGCGTG) 3,13 21 L858R 2573 T>G 0,78 Analytisk sensitivitet ved bruk av FFPET-prøveblandinger Tre DNA-ekstrakter fra FFPET-prøver for ekson 19-delesjon og L858R-mutasjoner ble blandet med EGFR-villtype-FFPETprøveekstrakt for å oppnå prøveblandinger med et målmutasjonsnivå på 10, 5,0, 2,5 og 1,25 %, som bestemt med en validert, massiv parallell pyrosekvenseringsmetode, 454-sekvensering (454 Life Sciences, Branford, CT, USA). Serielle fortynninger av hver proveblanding ble tillaget, og åtte (8) replikater av hver panelprøve ble analysert ved bruk av 3 kitlot for cobas EGFR mutasjonstest (n = 24 / panelprøve). Sensitiviteten for hver prøve ble bestemt med den laveste DNA-mengden som ga en EGFR "Mutation Detected"-rate på minst 95 % for målmutasjonen, som vist i tabell 4. Tabell 4 Sensitivitet for cobas EGFR mutasjonstest ved bruk av FFPET-prøveblandinger EGFRmutasjon Prøve EGFR-nukleinsyresekvens Ekson 19- delesjon L858R Prøve nr _2249del15 1,4 Prøve nr _2250del15 2,5 Prøve nr _2252del15 2,4 Prøve nr T>G 4,0 Prøve nr T>G 4,2 Prøve nr T>G 4,3 Prosentvis mutasjon i panelprøven for å oppnå en 95 % "Mutation Detected"-rate med 50 ng DNA-innmating per reaksjonsbrønn (N = 24 replikater) Denne studien viser at cobas EGFR mutasjonstest kan detektere mutasjoner i EGFR-ekson 19 og 21 med et mutasjonsnivå på minst 5 % ved bruk av standardinnmating på 50 ng per reaksjonsbrønn. Korrelasjon med referansemetode Det ble utført sammenligningstesting av 201 NSCLC FFPET-prøver ved å bruke 2 lot av cobas EGFR mutasjonstest og 2X bidireksjonal sekvensering (Sanger-sekvensering) for å bestemme positivt, negativt og samlet prosentvis samsvar mellom metodene. Avvikende resultater mellom cobas EGFR mutasjonstest og Sanger-sekvensering ble testet ved bruk av 454-sekvensering for å løse avvik. Prøver med ugyldige resultater for cobas EGFR mutasjonstest og/eller for Sanger-sekvensering ble utelatt fra analysering. Resultatene fra cobas EGFR-mutasjonstesten anses som ugyldige hvis noen av eller alle mutasjonstypene rapporteres som "invalid" (tabell 2). Resultatene av Sanger-sekvensering anses som ugyldige hvis noen av eller alle de fire eksonene for en prøve ikke ga gyldige resultater NO 15 Doc Rev. 4.0

16 Resultater fra cobas EGFR mutasjonstest og Sanger-sekvensering Av de 201 prøvene som ble evaluert i sammenligningstesten, var det 49 prøver som ikke kunne evalueres for overensstemmelse, fordi en av eller begge metodene hadde ugyldige resultater. 48 prøver var ugyldige for Sanger-sekvensering (23,8 %), 6 prøver var ugyldige for cobas EGFR mutasjonstestlot 1 (3,0 %), og 5 prøver var ugyldige for cobas EGFR mutasjonstestlot 2 (2,5 %). Fordelingen av ugyldige resultater for hver av metodene vises i tabell 5. Tabell 5 Fordeling av ugyldige resultater mellom metodene cobas EGFR mutasjonstest Ugyldige prøver etter metode Lot 1 Lot 2 Kun ugyldige for Sanger-sekvensering Kun ugyldige for cobas 1 1 Ugyldige for Sanger-sekvensering og cobas 5 4 Totalt Sammenligningen av de 152 gyldige resultatene for Sanger-sekvensering og cobas EGFR mutasjonstest vises i tabell 6. Tabell 6 Samsvarsanalyse for cobas EGFR mutasjonstest (per lot) vs. Sanger-sekvensering Sanger-sekvensering Sanger-sekvensering MD MND Totalt MD MND Totalt MD MD cobas cobas MND MND Lot 1 Lot 2 Totalt Totalt Positivt samsvar = 95,8 % (95 % KI = 88,3 til 99,1 %) Positivt samsvar = 95,8 % (95 % KI = 88,3 til 99,1 %) Negativt samsvar = 97,5 % (95 % KI = 91,3 til 99,7 %) Negativt samsvar = 97,5 % (95 % KI = 91,3 til 99,7 %) Samlet samsvar = 96,7 % (95 % KI = 92,5 til 98,9 %) Samlet samsvar = 96,7 % (95 % KI = 92,5 til 98,9 %) MD: Mutasjon detektert MND: Mutasjon ikke detektert Samsvaret mellom cobas EGFR mutasjonstest vs. Sanger-sekvensering var 96,7 % (totalt 5 avvikende resultater) for Lot 1 og 96,7 % (totalt 5 avvikende resultater) for Lot 2. Sammenligningstesten mellom cobas EGFR mutasjonstest og Sanger-sekvensering evaluerte seks mål for hver prøve. Totalt 912 mutasjonstyper ble funnet basert på resultatene av de 152 gyldige prøvene. Tabell 7 og 8 viser sammenligningen av cobas EGFR mutasjonstest og Sanger-sekvensering per mutasjonstype for henholdsvis Lot 1 og Lot 2. To gyldige prøver viste avvikende resultater mellom Lot 1 og Lot 2 for cobas EGFR mutasjonstest: én prøve hadde en innskuddsmutasjon i ekson 20 for Lot 1 og en MND-mutasjon for Lot 2, og den andre prøven hadde en delesjonsmutasjon i ekson 19 for Lot 2 og en MND-mutasjon for Lot 1. Tabell 7 Sammenligning av cobas EGFR mutasjonstest (Lot 1) og Sanger-sekvensering per mutasjonstype cobas Lot 1 Sanger-sekvensering Ekson Ekson G719X S768I T790M L858R MND Annen Total 19-del. 20-inns. G719X Ekson 19-del S768I Ekson 20-inns T790M L858R MND * 837 Total * Resultatet av Sanger-sekvensering for én prøve var G719D, en mutasjon som ikke var et mål for cobas EGFR mutasjonstest. For analysen ble denne prøven kategorisert som MND for begge metodene NO 16 Doc Rev. 4.0

17 cobas Lot 2 Tabell 8 Sammenligning av cobas EGFR mutasjonstest (Lot 2) og Sanger-sekvensering per mutasjonstype Sanger-sekvensering Ekson Ekson G719X S768I T790M L858R MND Annen Total 19-del. 20-inns. G719X Ekson 19-del S768I Ekson 20-inns T790M L858R MND * 837 Total * Resultatet av Sanger-sekvensering for én prøve var G719D, en mutasjon som ikke var et mål for cobas EGFR mutasjonstest. For analysen ble denne prøven kategorisert som MND for begge metodene. Avvikende analyse med 454-sekvensering Basert på sammenligning av resultatene med Sanger-sekvensering var 5 prøver gyldige og avvikende for hver lot av cobas EGFR mutasjonstest. Prøver som ga avvikende resultater mellom cobas EGFR mutasjonstesten og Sanger-sekvensering, ble analysert med 454-sekvensering og vises i tabell 9. En revidert samsvarsanalyse ble utført basert på resultatene av 454-sekvenseringen. I denne analysen ble prøver med resultater av 454-sekvensering som samsvarte med resultatene av cobas EGFR mutasjonstest, ansett som samsvarende. Prøver med resultater av 454-sekvensering som samsvarte med Sanger-sekvensering, ble ansett som avvikende. Tabell 9 Løsning av avvikende prøver med 454-sekvensering Prøve Sangersekvensering cobas Lot 1 cobas Lot 2 Løsning med 454-sekvensering Prøve 1 G719A MND MND MND Prøve 2* G719S MND MND G719S (1,1 % mutasjon) Prøve 3 Ekson 19-del. MND MND MND Prøve 4** MND MND Ekson 19-del. Ekson 19-del. (3,0 % mutasjon) Prøve 5 MND Ekson 20-inns. Ekson 20-inns. Ekson 20-inns. (13,7 % mutasjon) Prøve 6 MND Ekson 20-inns. MND MND * Prøve 2 ble bekreftet som G719S med 454-sekvensering med 1,1 % mutasjon. Dette er under deteksjonsgrensen for cobas EGFR mutasjonstest. **Prøve 4 ble bekreftet som ekson 19-delesjon med 454-sekvensering med 3,0 % mutasjon. Dette er på eller nær deteksjonsgrensen for cobas EGFR mutasjonstest NO 17 Doc Rev. 4.0

18 Etter at avvikende prøveresultater med cobas EGFR mutasjonstest vs. Sanger-sekvensering ble løst med 454-sekvensering, ble det samlede samsvaret over alle målmutasjonsklasser 98,7 % for Lot 1 og 99,3 % for Lot 2 av cobas EGFR mutasjonstest, som vist i tabell 10. Tabell 10 Samsvarsanalyse for cobas EGFR mutasjonstest (per lot) vs. Sanger-sekvensering med løsning av avvikende resultater med 454-sekvensering cobas Lot 1 Sanger-sekvensering, løst med 454-sekvensering Sanger-sekvensering, løst med 454-sekvensering MD MND Total MD MND Total MD MD cobas MND MND Lot 2 Total Total Positivt samsvar = 98,6 % (95 % KI = 92,4 til 100 %) Positivt samsvar = 98,6 % (95 % KI = 92,5 til 100 %) Negativt samsvar = 98,8 % (95 % KI = 93,3 til 100 %) Negativt samsvar = 100 % (95 % KI = 96,3 til 100 %) Samlet samsvar = 98,7 % (95 % KI = 95,3 til 99,8 %) Samlet samsvar = 99,3 % (95 % KI = 96,4 til 100 %) Tabell 11 og 12 viser sammenligningen av cobas EGFR mutasjonstest og Sanger-sekvensering med løsning av avvik med 454-sekvensering per mutasjonstype for henholdsvis Lot 1 og Lot 2. Tabell 11 Sammenligning av cobas EGFR mutasjonstest (Lot 1) og Sanger-sekvensering per mutasjonstype, med løsning av avvik med 454-sekvensering cobas Lot 1 Sanger-sekvensering, løst med 454-sekvensering Ekson Ekson G719X S768I T790M L858R MND Annen Total 19-del. 20-inns. G719X Ekson 19-del S768I Ekson 20-inns T790M L858R MND * 837 Total * Resultatet av Sanger-sekvensering for én prøve var G719D, en mutasjon som ikke var et mål for cobas EGFR mutasjonstest. For analysen ble denne prøven kategorisert som MND for begge metodene. cobas Lot 2 Tabell 12 Sammenligning av cobas EGFR mutasjonstest (Lot 2) og Sanger-sekvensering per mutasjonstype, med løsning av avvik med 454-sekvensering Sanger-sekvensering, løst med 454-sekvensering Ekson Ekson G719X S768I T790M L858R MND Annen Total 19-del. 20-inns. G719X Ekson 19-del S768I Ekson 20-inns T790M L858R MND * 837 Total * Resultatet av Sanger-sekvensering for én prøve var G719D, en mutasjon som ikke var et mål for cobas EGFR mutasjonstest. For analysen ble denne prøven kategorisert som MND for begge metodene NO 18 Doc Rev. 4.0

19 Inklusivitet med plasmider cobas EGFR mutasjonstest har vist seg å detektere følgende mutasjoner som vises i tabell 13. Tabell 13 Mutasjoner som ble detektert med cobas EGFR mutasjonstest Ekson 18 mutasjonstype G719X Mutasjon Aminosyreendring COSMIC-ID 2155 G>A G719S G>T G719C G>C G719A 6239 Ekson 19 mutasjonstype ekson 19-delesjon Mutasjon Aminosyreendring COSMIC-ID 2235_2249del15 E746_A750del _2250del15 E746_A750del _2257del18 L747_P753>S _2254del15 L747_T751del _2256del18 L747_S752del _2251>C L747_T751>P _2251del15 E746_T751>A _2255>T E746_S752>V _2248TTAAGAGAAG>C E747_A750>P _2253del15 L747_T751del _2247del9 L747_E749del _2252>AAT E746_T751>I _2253del18 E746_T751del _2254del18 E746_S752>A _2255del18 E746_S752>D _2248>GC L747_A750>P _2252>GCA L747_T751>Q _2258>CA L747_P753>Q _2251del12 L747_T751>S _2247del15 K745_E749del _2276del24 S752_I759del _2248>AATTC E746_A750>IP _2252>T E746_T751>V _2251>AATTC E746_T751>IP _2255>AAT E746_S752>I _2253>TTGCT E746_T751>VA _2257>TCT E746_P753>VS _2252del15 L747_T751del _2256>CAA L747_S752>Q NO 19 Doc Rev. 4.0

20 Ekson 20 mutasjonstyper T790M, S768I, ekson 20-innskudd Mutasjon Aminosyreendring COSMIC-ID 2303 G>T S768I C>T T790M _2320insCAC H773_V774insH _2311insGGT D770_N771insG _2308ins9GCCAGCGTG V769_D770insASV _2310AC>CCAGCGTGGAT V769_D770insASV _2312ins9GCGTGGACA D770_N771insSVD Ekson 21 mutasjonstype L858R Mutasjon Aminosyreendring COSMIC-ID 2573 T>G L858R _2574TG>GT L858R Kryssreaktivitet Lungerelaterte mikroorganismer Streptococcus pneumoniae og Haemophilus influenzae i 1 x 10 6 CFU (kolonidannende enheter) ble funnet ikke å kryssreagere med eller forstyrre cobas EGFR mutasjonstest da de ble tilsatt i prøver som inneholdt villtype- og mutant-egfr-sekvenser, under lyseringstrinnet. Interferens Triglycerider ( 37 mm, CLSI-anbefalt høy konsentrasjon 19 ) og hemoglobin ( 2 mg/ml, CLSI-anbefalt høy konsentrasjon 19 ) viste seg ikke å interferere med cobas EGFR mutasjonstest da den potensielt interfererende substansen ble tilsatt i lyseringstrinnet under prøveprepareringsprosedyren. Prøver med opptil 85 % nekrotisk vev viste seg ikke å interferere med cobas EGFR mutasjonstest. Robusthet Robustheten til cobas EGFR mutasjonstest ble bestemt ved å bruke én EGFR L858R-mutant FFPET-prøve med 22 % mutasjon. Prøven ble delt i 100 enkelte 5 μm-snitt for analysering. DNA ble ekstrahert fra hvert snitt ved bruk av cobas DNAprøveprepareringskit. Et enkelt replikat av ekstrahert DNA ble testet for hvert av de 100 snittene for prøven. 100 % av replikatene ble rapportert som "Mutation Detected" av cobas EGFR mutasjonstest for L858R-mutasjonen, noe som ga en falsk negativ-rate på 0 %. Repeterbarhet Repeterbarheten til cobas EGFR mutasjonstest ble vurdert ved å bruke seks FFPET-prøver, inkludert: 2 villtypeprøver, 4 mutantprøver med henholdsvis ekson 19-delesjonsmutasjon, S768I-, G719X- og ekson 20-innskuddsmutasjon. Disse prøvene ble testet i duplikat av to operatører, ved bruk av to ulike reagenslot og to cobas z 480-analysatorer over 4 dager. cobas EGFR mutasjonstest hadde en korrekt mutasjonstyperate på 98 % (188/192) NO 20 Doc Rev. 4.0

21 REFERANSER 1. Sharma SV, Bell DW, Settleman J, Haber DA. Epidermal growth factor receptor mutations in lung cancer. Nature Reviews Cancer. 2007;7: Paz-Ares L, Soulières D, Melezínek I, et al. Clinical outcomes in non-small-cell lung cancer patients with EGFR mutations: pooled analysis. J Cell Mol Med 2010;14: Mok TS, Wu Y-L, Thongprasert S, et al. Gefitinib or carboplatin paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma. New England Journal of Medicine Maemondo M, Inoue A, Kobayashi K, et al. Gefitinib or chemotherapy for non small-cell lung cancer with mutated EGFR. New England Journal of Medicine. 2010;362: Rosell R, Moran T, Queralt C, et al. Screening for epidermal growth factor receptor mutations in lung cancer. New England Journal of Medicine. 2009;361: Maheswaran S, Sequist LV, Nagrath N, et al. Detection of mutations in EGFR in circulating lung-cancer cells. New England Journal of Medicine. 2008;359: Lynch TJ, Bell DW, Sordella R, et al. Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non small-cell lung cancer to gefitinib. New England Journal of Medicine. 2004;350: Jackman DM, Miller VA, Cioffredi L-A, et al. Impact of epidermal growth factor receptor and KRAS mutations on clinical outcomes in previously untreated non small cell lung cancer patients: Results of an online tumor registry of clinical trials. Clinical Cancer Research. 2009;15: Pao W, Chmielecki J. Rational, biologically based treatment of EGFR-mutant non-small-cell lung cancer. Nat Rev Cancer. 2010;10: D'Addario G, Fruh M, Reck M, Baumann P, Klepetko W, Felip E. Metastatic non-small-cell lung cancer: ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 2010;21 Suppl 5:v Keedy VL, Temin S, Somerfield MR, et al. American Society of Clinical Oncology Provisional Clinical Opinion: Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) Mutation Testing for Patients With Advanced Non-Small-Cell Lung Cancer Considering First-Line EGFR Tyrosine Kinase Inhibitor Therapy. J Clin Oncol. 12. Balak MN, Gong Y, Riely GJ, et al. Novel D761Y and common secondary T790M mutations in epidermal growth factor receptormutant lung adenocarcinomas with acquired resistance to kinase inhibitors. Clin Cancer Res. 2006;12: Rosell R, Molina MA, Costa C, et al. Pretreatment EGFR T790M Mutation and BRCA1 mrna Expression in Erlotinib-Treated Advanced Non-Small-Cell Lung Cancer Patients with EGFR Mutations. Clin Cancer Res. 2011;17: International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 52nd Edition Longo, M.C., Berninger, M.S. and Hartley, J.L Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions. Gene. 93: Chosewood, L.C. and Wilson, D.E. Biosafety and Microbiological and Biomedical Laboratories. HHS Publication Fifth # edition.(cdc) Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Protection of Laboratory Workers from Occupationally Acquired Infections. Approved Guideline-Third Edition. CLSI Document M29-A3 Villanova, PA:CLSI, Catalogue of Somatic Mutations in Cancer (COSMIC), 2011, v.51, Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) EP7-A2, Interference Testing in Clinical Chemistry; Approved Guidelines Second Edition, Appendix D NO 21 Doc Rev. 4.0

22 Informasjon om dokumentrevisjon Doc Rev /2013 Økt størrelsen på farevarselsymbolene. I avsnittet REAGENSER ble fyllingsmengden revidert fra 0,40 ml til 0,48 ml for alle MMX-er. Oppdatert produsentens og den autoriserte representantens adresse. Rettet telefonnummeret til teknisk brukerstøtte fra til Kontakt din lokale Roche-representant om du har noen spørsmål. Doc Rev /2013 Oppdaterte instruksjoner om oppbevaring og håndtering av prøver. Kontakt din lokale Roche-representant hvis du har noen spørsmål. Roche Molecular Systems, Inc US Highway 202 South Branchburg, NJ USA Roche Diagnostics (Schweiz) AG Roche Diagnostics Industriestrasse 7 2, Avenue du Vercors 6343 Rotkreuz, Switzerland Meylan, France Distributed by Roche Diagnostics GmbH Distributore in Italia: Sandhofer Straße 116 Roche Diagnostics S.p.A Mannheim, Germany Viale G. B. Stucchi Monza, Milano, Italy Roche Diagnostics, SL Avda. Generalitat, Distribuidor em Portugal: E Sant Cugat del Vallès Roche Sistemas de Diagnósticos Lda. Barcelona, Spain Estrada Nacional, Amadora, Portugal Roche Diagnostics 201, boulevard Armand-Frappier Roche Diagnostica Brasil Ltda. H7V 4A2 Laval, Québec, Canada Av. Engenheiro Billings, 1729 (For Technical Assistance call: Jaguaré, Building 10 Pour toute assistance technique, São Paulo, SP Brazil appeler le: ) COBAS, COBAS Z og AMPERASE er varemerker for Roche. Teknologien for forebygging av smitte i AmpErase-enzymet dekkes av U.S. Patent 5,035,996, og tilsvarende utenlandske patenter eies av Invitrogen Corporation og er lisensiert til Roche Molecular Systems, Inc. EPPENDORF er et varemerke for Eppendorf AG. PIPET-AID er et varemerke for Drummond Scientific. NANODROP er et varemerke for Thermo Scientific. Copyright 2013 Roche Molecular Systems, Inc. Med enerett. 07/ Doc Rev NO 22 Doc Rev. 4.0

23 Følgende symboler brukes nå ved merking for Roche PCR-diagnostiske produkter. Tilleggsprogramvare Lotnummer SW Autorisert representant i EF Biologisk risiko Strekkodedataark Katalognummer Vennligst se brukerveiledningen Kun for evaluering av IVD-ytelse Tilstrekkelig til Nedre grense for akseptområdet Innhold i kitet Produsent Distribuert av Oppbevares på et mørkt sted For bruk til in vitro-diagnostikk Temperaturbegrensning Testdefinisjonsfil Utløpsdato TDF Øvre grense for akseptområdet Dette produktet innfrir kravene til Europaparlamentets Rådsdirektiv 98/79/ EF om in vitro-diagnostisk medisinsk utstyr. Teknisk support for kunder i USA NO 23 Doc Rev. 4.0