LightCycler MRSA Advanced Test For Use With The LightCycler 2.0 Instrument

Transkript

1 LightCycler MRSA Advanced Test For Use With The LightCycler 2.0 Instrument FOR BRUK TIL IN VITRO-DIAGNOSTIKK. LightCycler MRSA Advanced Test LC MRSA 96 Tests P/N: LightCycler Advanced Lysis Kit LYS ADV 96 Tests P/N: TILTENKT BRUK LightCycler MRSA Advanced-testen er en kvalitativ in vitro-diagnostisk test for direkte deteksjon av nasal kolonisering av meticillinresistent Staphylococcus aureus (MRSA) for å bidra til forebygging og kontroll av MRSA-infeksjoner i helsevesenet. Testen utføres på LightCycler 2.0-instrumentet med nasale penselprøver fra pasienter der det er mistanke om kolonisering. Til preparering av prøver brukes penselekstraksjon og mekanisk lysering. Heretter følger polymerasekjedereaksjon (PCR) for å amplifisere MRSA DNA. Amplifisert DNA detekteres av fluorescensdannende målspesifikke hybridiseringsprober. LightCycler MRSA Advanced-testen skal ikke brukes til å diagnostisere, styre eller overvåke behandling av MRSA-infeksjoner. Medfølgende kulturer er nødvendige for å gjenfinne organismer for epidemiologisk typebestemmelse eller for ytterligere følsomhetstesting. SAMMENDRAG OG BESKRIVELSE AV TESTEN Staphylococcus aureus er et opportunistisk patogen som bæres som en kommensal organisme på huden og i neseveien hos ca. 30 % av normalbefolkningen og kan potensielt forårsake et bredt spektrum av sykdommer, i cirka 34 % av tilfellene med fatalt utfall i løpet av 30 dager etter infeksjon 1,2. Staphylococcus aureus kan raskt tilpasse seg selektivt press fra behandlinger med antibiotika, noe som har ført til spredning av meticillinresistente stammer av Staphylococcus aureus (MRSA). meca-genet er lokalisert på et stort, mobilt genetisk element som kalles SCCmec (stafylokokkenes kassettkromosom mec), og er ansvarlig for resistens mot meticillin og andre β-laktamantibiotika. meca-genet koder for et endret penicillinbindende protein, PBP2a eller PBP2, som har svært lav affinitet for alle β-laktamantibiotika og muliggjør normal syntese av det peptidoglykane laget selv om disse antibiotikatypene er til stede 3. Flere MRSA-stammer har oppstått og spredt seg over hele verden, og SCCmec har blitt overført til ulike linjer av meticillinsensitive Staphylococcus aureus 4. Hittil er sju SCCmec-typer (I VII) funnet, og flere varianter av disse SCCmec-typene er beskrevet 4. Sykehusassosierte infeksjoner (healthcare associated infections, HAI) forårsaket av MRSA har i det siste blitt et alvorlig problem for helseinstitusjoner verden over på grunn av høy grad av infeksjon og mortalitet og høye behandlingskostnader 5 8. I tillegg har samfunnservervet MRSA (CA-MRSA) spredt seg i de siste årene 9 og blitt en del av infeksjonsinnføringsveien til sykehus 10,11, noe som understreker behovet for omfattende infeksjonskontrollprogrammer. I 2008 ble det utarbeidet et sammendrag av alle offentliggjorte retningslinjer fra flere statlige, profesjonelle og offentlige helseorganisasjoner for å hjelpe institusjoner med å prioritere og implementere sine tiltak for å unngå spredning av MRSA. 12 Alle programmer for å forhindre spredning av MRSA må omfatte en rekke nøkkelstrategier, inkludert aktiv kontrollscreening, håndhygiene, pasientisolering og andre tiltak for å hindre spredning. PCR-deteksjon av MRSA i sanntid reduserer deteksjonstiden i betydelig grad (mindre enn 2 timer på laboratoriet) sammenlignet med standard kulturtester og gjør derfor kontroll- og administrasjonsstrategier mer effektive. Avsnittet for informasjon om dokumentrevisjon er plassert ved slutten av dette dokumentet NO 1 Doc Rev. 5.0

2 TESTPRINSIPPER Deteksjon av MRSA med LightCycler MRSA Advanced-testen bygger på 3 hovedprosesser: Preparering av prøve ved mekanisk lysering av den bakterielle celleveggen PCR-amplifisering av mål-dna og deteksjon ved bruk av spesifikke hybridiseringsprober Automatisk resultatgenerering etter smeltekurveanalyse Prøvepreparering Den mekaniske lyseringen av nasale penselprøver utføres av LightCycler Advanced-lyseringskit og MagNA Lyser-instrumentet. Penselhodene skjæres av, legges i lyseringsrør og varmes opp slik at alle bakterier deaktiveres. Etterpå blir lyseringsrørene overført til MagNA Lyser-instrumentet der den mekaniske lyseringen av bakteriecelleveggen finner sted og gir ubehandlede lysatpreparater. Etter en kort sentrifugering der glasskuler og prøvepenselfibrer fjernes, blir de behandlede prøvene overført til kapillærrør og utsatt for PCR-analyse ved bruk av LightCycler MRSA Advanced-testen og LightCycler 2.0-instrumentet. PCR-amplifikasjon Valg av mål Primerne og probene i LightCycler Advanced-testen detekterer en merkebeskyttet sekvens som indikerer at SCCmec-kassetten er integrert i Staphylococcus aureus-kromosomet, noe som tyder på tilstedeværelse av MRSA-DNA. Amplifikasjon De preparerte prøvene og amplifikasjonsblandingen som inneholder hot-start Taq-polymerase, plasseres i LightCycler -kapillærrørene (20 µl), hvor PCR-amplifikasjon vil finne sted. Hver LightCycler MRSA Advanced-testreaksjon inneholder en intern kontroll, som er konstruert for å kontrollere prøveinhibisjon og overvåke reagensintegritet. AmpErase (uracil-n-glykosylase)-enzymet som er inkludert i LightCycler MRSA Advanced-testen, gjenkjenner og katalyserer destruksjon av DNA-tråder som inneholder deoksyuridin, men ikke DNA som inneholder deoksytymidin. Siden amplicon som er produsert med LightCycler MRSA Advanced-testen, inneholder deoksyuridin, blir potensielle ampliconkontaminanter eliminert i løpet av et langt oppvarmingstrinn som utføres før PCR-amplifikasjonen starter. En målsekvens i et plasmid blir samtidig amplifisert i den positive kontrollen. Den positive kontrollen skal monitorere reagensfunksjonen og inkluderes i hver analyseserie. Hver analyseserie inkluderer også en negativ kontroll for å påvise reagens- eller miljøkontaminering av MRSA-DNA. Spesifikk deteksjon av PCR-produkter ved bruk av hybridiseringsprober MRSA og interne kontrollampliconer detekteres ved fluorescens ved bruk av et spesifikt hybridiseringsprobepar. Probene fester seg til en spesifikk intern sekvens i det amplifiserte fragmentet og posisjoneres nær hverandre. Ved eksitasjon sender disse bundne probene ut et fluorescenssignal av en spesifikk bølgelengde ved bruk av en prosess som kalles FRET (overføring av resonansfluorescensenergi). Lyset som sendes ut, måles av LightCycler 2.0-instrumentet. MRSA eller interne kontrollspesifikke ampliconer detekteres parallelt i to forskjellige deteksjonskanaler og kan derfor differensieres. Etter at PCR-prosessen er fullført i sanntid, blir en smeltekurveanalyse utført automatisk av LightCycler 2.0-instrumentet. Enkelttrådede DNA-ampliconer med bundne hybridiseringsprober utsettes for økte temperaturer. Når PCR-produktene når en spesifikk temperatur, vil en av de to bundne hybridiseringsprobene smelte vekk og føre til tap av fluorescenssignal. Reduksjonen av fluorescenssignalet finner sted ved en spesifikk temperatur og fører til smeltetopper som brukes til å identifisere og skjelne MRSAog IC-spesifikke ampliconer. Automatisk resultatgenerering etter smeltekurveanalyse Etter at smeltetoppene er identifisert visuelt ved bruk av T M -stolpene i LightCycler -programvaren, blir testresultatene overført til et dedikert tolkningsverktøy (mikroanalyseprogramvaren), og det opprettes en rapport med IVD-resultatene NO 2 Doc Rev. 5.0

3 REAGENSER LightCycler Advanced Lysis Kit LightCycler Advanced-lyseringskit (P/N: ) LYS (Lyseringsreagens) Tris-buffer EDTA < 15 % silisiumperler 0,09 % natriumazid LYS ADV 96 tester 96 x 0,6 ml LightCycler MRSA Advanced Test (P/N: ) MRSA RXNMX (MRSA reagensblanding) Tris-buffer < 0,1 % magnesiumklorid Kaliumklorid < 0,001 % datp, dctp, dgtp, dutp 0,19 % oktylglukosid 0,03 % bovint serumalbumin (fra pattedyr) < 0,1 % FastStart Taq DNA Polymerase (mikrobielt) < 0,1 % AmpErase (uracil-n-glykosylase) enzym (mikrobiell) 0,09 % natriumazid MRSA DETMX (MRSA-deteksjonsblanding) 0,05 % Brij 35-løsning Tris-buffer < 0,01 % EDTA < 0,01 % MRSA-primere < 0,01 % fluoroformerkede oligonukleotidprober spesifikke for MRSA og internkontrollen for MRSA 0,09 % natriumazid 0,001 % poly ra RNA (syntetisk) < 0,001 % ikke-infeksiøst plasmid-dna (mikrobielt) som inneholder bindingssekvenser for MRSA-primer og en unik probebindingssekvens MRSA (+) C (MRSA positiv kontroll) Tris-buffer < 0,01 % EDTA 0,002 % poly ra RNA (syntetisk) 0,09 % natriumazid < 0,001 % ikke-infeksiøst plasmid-dna (mikrobielt) som inneholder MRSA-sekvenser LC MRSA 96 tester 3 x 0,352 ml 3 x 0,176 ml 1 x 0,176 ml NO 3 Doc Rev. 5.0

4 ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER A. FOR BRUK TIL IN VITRO-DIAGNOSTIKK. Dette produktet må kun brukes av personell som er opplært i PCR-teknikk. B. Denne testen skal kun brukes til nasale penselprøver. C. Ikke pipetter med munnen. D. Ikke spis, drikk eller røyk i laboratoriets arbeidsområder. Bruk beskyttende engangshansker, laboratoriefrakk og vernebriller når du håndterer prøver og reagenser. Vask hendene nøye etter håndtering av prøver og reagenser. E. Unngå mikrobiell kontaminering av reagenser når avpipetterte mengder fjernes fra reagensflasker. Bruk av sterile engangspipettespisser anbefales. F. Reagenser fra ulike lot eller ulike flasker innen samme lot må ikke blandes. G. Reagenser fra ulike kitlot må ikke blandes. H. Kast ubrukte reagenser, avfall og prøver i henhold til nasjonalt, regionalt og lokalt regelverk. I. Kit som er utgått på dato, må ikke brukes. J. Dataark om materialsikkerhet (MSDS) kan på forespørsel sendes fra ditt lokale Roche-kontor. K. Prøver og kontroller må håndteres som infeksiøse, og sikre laboratorierutiner må følges. Disse er beskrevet i Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 13 og i CLSI-dokument M29-A3 14. Rengjør og desinfiser alle arbeidsoverflater nøye med en nylaget løsning av 0,5 % natriumhypokloritt i deionisert eller destillert vann. Merk: Kommersielt tilgjengelig blekemiddel til husholdningsbruk inneholder normalt natriumhypokloritt med en konsentrasjon på 5,25 %. En fortynning i forholdet 1:10 med et slikt blekemiddel gir en 0,5 % natriumhypoklorittløsning. L. LYS, MRSA RXNMX, MRSA DETMX og MRSA (+) C inneholder natriumazid. Natriumazid kan reagere med bly- og kobberrør og danne svært eksplosive metallazider. Hvis løsninger som inneholder natriumazid, helles ned i avløp i laboratoriet, må de skylles ned med store mengder vann for å unngå azidoppbygging. M. Bruk vernebriller, laboratoriefrakk og engangshansker ved håndtering av reagenser. Unngå kontakt med hud, øyne eller slimhinner. Skyll umiddelbart med mye vann hvis slik kontakt oppstår. Hvis kontaktstedet ikke blir behandlet, kan det oppstå brannskade. Fortynn med vann før du tørker opp eventuelt søl fra reagensene. N. Kontaminasjon fra positive kontroller og positive prøver kan unngås ved å bruke gode laboratorierutiner og ved å følge anvisningene i dette pakningsvedlegget nøye. OPPBEVARING OG HÅNDTERING A. Oppbevar LightCycler Advanced-lyseringskit (LYS) stående ved 15 til 25 C ved mottak. B. Oppbevar LightCycler MRSA Advanced-testkitet (MRSA RXNMX, MRSA DETMX og MRSA (+) C) ved 15 til 25 C ved mottak. Når disse reagensene er uåpnet, er de stabile til angitt utløpsdato. Når de er åpnet, skal det resterende MRSA RXNMX og MRSA DETMX oppbevares ved 15 til 25 C i inntil 30 dager. MRSA RXNMX og MRSA DETMX kan gjennomgå opptil 5 fryse-tine-sykluser. C. Når de er åpnet, skal det resterende MRSA (+) C oppbevares ved 15 til 25 C eller ved 2 til 8 C i inntil 30 dager. MRSA (+) C kan gjennomgå opptil 22 fryse-tine-sykluser. D. Ikke utsett MRSA DETMX for lys. E. Working Master Mix (tillages ved tilsetting av MRSA RXNMX og MRSA DETMX) må tillages ferskt og brukes innen 24 timer etter tillaging. Hvis Working Master Mix ikke brukes umiddelbart etter tillaging, må Working Master Mix oppbevares beskyttet mot lys ved 2 til 8 C i inntil 24 timer NO 4 Doc Rev. 5.0

5 F. Behandlede prøver og negative kontroller som er framstilt fra Liquid Stuart-pensler og Amiesgelpensler (med eller uten kull), er stabile i opptil 1 dag ved 15 til 25 C eller i opptil 5 dager ved 2 til 8 C eller i opptil 12 måneder ved -15 til -25 C. G. Amplifikasjon må startes omgående etter at de preparerte prøvene og kontrollene er tilsatt Working Master Mix. Hvis dette ikke er mulig, skal de fylte kapillærrørene oppbevares beskyttet mot lys i maksimalt 3 timer ved 2 til 8 C. MATERIELL SOM MEDFØLGER A. LightCycler Advanced Lysis Kit LightCycler Advanced-lyseringskit (P/N: ) LYS ADV LYS (lyseringsreagens) B. LightCycler MRSA Advanced Test (P/N: ) LC MRSA MRSA RXNMX (MRSA-reagensblanding) MRSA DETMX (MRSA-deteksjonsblanding) MRSA (+) C (MRSA positiv kontroll) MATERIELL SOM KREVES, MEN SOM IKKE MEDFØLGER Instrumentering og programvare LightCycler 2.0-instrumentet (P/N: ) LightCycler -programvare 4.1 (P/N: ) eller høyere LightCycler MRSA Advanced-programvaresett v1.2 CE (P/N: ) eller høyere LC-karusellsentrifuge 2.0 [P/N: (230 V) eller P/N: (110 V)] Merk: Hvis du allerede har kjøpt en LC-karusellsentrifuge [P/N: (230 V) eller P/N: (115 V)], trengs det også et LightCycler -karusell 2.0 rotorsett [P/N: ]. Eller standard bordmikrosentrifuge som inneholder en rotor for 2,0 ml rør og LCsentrifugeadaptere (P/N: ] MagNA Lyser-instrument [P/N: (230 V) eller (110 V)] Valgfri strekkodeleser [P/N: ] Reagenser og engangsprodukter LightCycler Multicolor Compensation-sett (P/N: ) LightCycler -kapillærrør, 20 µl (P/N: ) NO 5 Doc Rev. 5.0

6 ANNET MATERIELL SOM KREVES, MEN SOM IKKE MEDFØLGER BD CultureSwab Liquid Stuart (BD P/N: eller ), eller Copan Venturi Transystem Liquid Stuart (Copan Italia International P/N: 141C eller 139C); eller BD CultureSwab pluss Amies-gel uten kull (BD P/N: eller ), eller Copan Venturi Transystem pluss Amies-gel uten kull (Copan Italia International P/N: 108C eller 134C); eller BD CultureSwab pluss Amies-gel med kull (BD P/N: eller ), eller Copan Venturi Transystem pluss Amies-gel med kull (Copan Italia International P/N: 114C eller 136C) Engangshansker, uten pudder Gasbind Etanol (70 %) Justerbare pipetter*: (kapasitet 10 µl, 100 µl og 1000 µl) med sterile, DNase-frie mikropipettespisser med filterbarriere eller positiv displassering Varmeblokk ved 95 C (± 2 C): VWR (P/N: ) eller tilsvarende med 2,0 ml slangeblokk: VWR (P/N: ) Mikrosentrifuge som kan yte en sentrifugalkraft på x g med rotor som passer til 2,0 ml rør med skrukork: (P/N: Eppendorf modell 5417C) eller tilsvarende Sterile 1,5 ml silikonbelagte mikrosentrifugerør av polypropylen: (P/N Eppendorf ordrenummer ) eller liknende Vortexmikser: Fisher (P/N: ) eller tilsvarende Valgfritt mikrorørredskap: VWR (P/N: ) eller Rainin (P/N: PJ-4A) eller tilsvarende * Pipettene må ha en nøyaktighet innenfor 3 % av angitt volum. Aerosolbarriere- eller "positive displacement" DNase-frie spisser må brukes der dette er angitt for å hindre krysskontaminering av prøver og amplicon. TAKING, TRANSPORT OG OPPBEVARING AV PRØVER Merk: Alle prøver og kontroller må behandles som om de er potensielt infeksiøse. A. Taking av prøver 1. Fukt prøvepenselen med to dråper (ca. 50 µl) sterilt fysiologisk saltvann eller bruk tørr pensel. 2. Sett prøvepenselen forsiktig 1,3 cm inn i neseboret (begge penselhodene på samme tid hvis det dreier seg om en prøvepensel med to hoder) og roter den mot slimhinnen fem ganger mens det øves lett trykk på utsiden av nesen (for å sikre at penselhodene kommer i kontakt med innsiden av nesen). 3. Sett den samme prøvepenselen inn i det andre neseboret og gjenta prosedyren. 4. Legg prøvepenselen tilbake i beholderen og merk den NO 6 Doc Rev. 5.0

7 B. Transport og oppbevaring av prøver Transport av prøver må skje i henhold til nasjonalt, regionalt, statlig og lokalt regelverk for transport av biologisk materiale 15. Prøver kan transporteres ved 15 til 25 C. Prøver kan lagres før behandling (inkludert nødvendig transporttid) som definert nedenfor. Prøver som er tatt med Liquid Stuart-pensel, er stabile ved 15 til 25 C i opptil 5 dager, ved 2 til 8 C i opptil 5 dager, ved -15 til -25 C i opptil 1 måned. Prøver som er tatt med Amies-gelpensel med eller uten kull, er stabile ved 15 til 22 C i opptil 4 dager (ved 25 C var treffraten 95 % på dag 6). BRUKSANVISNING Klargjøring av instrumentet A. Installering av mikroanalyseprogramvaren (MAS) For installeringsoppdateringer, sjekk om ytterligere informasjon følger med produktet. 1. Logg deg på som administrator på LightCycler -datastasjonen. 2. Sett CDen med LightCycler MRSA Advanced-programvaresett v1.2 CE (eller høyere) inn i CDstasjonen på LightCycler -datastasjonen. Start installasjonen av MAS ved å dobbeltklikke på setup.exe-filen på CDen. 3. Førstegangsinstallasjon: a. Hvis Microsoft Data Access Components 2.8 ikke allerede er installert, blir du bedt om å installere det i begynnelsen av MAS-oppsettet. Microsoft Data Access Components 2.8 må være installert, ellers vil ikke MAS fungere ordentlig. b. Hvis Microsoft.NET Framework 2.0 (x86) ikke allerede er installert, blir du bedt om å installere det i begynnelsen av MAS-oppsettet. Microsoft.NET Framework 2.0 (x86) må være installert, ellers vil ikke MAS fungere ordentlig. c. Hvis Microsoft Windows Installer 3.1 ikke allerede er installert, blir du bedt om å installere det i begynnelsen av MAS-oppsettet. Microsoft Windows Installer 3.1 må være installert, ellers vil ikke MAS fungere ordentlig. d. Hvis Microsoft Visual Studio 2008 Report Viewer ikke er installert, blir du bedt om å installere det i begynnelsen av MAS-oppsettet. Microsoft Visual Studio 2008 Report Viewer må være installert, ellers vil ikke MAS fungere ordentlig. e. Hvis Microsoft SQL Server 2005 Express SP2 (x86) ikke allerede er installert, blir du bedt om å installere det i begynnelsen av MAS-oppsettet. Microsoft SQL Server 2005 Express SP2 (x86) må være installert, ellers vil ikke MAS fungere ordentlig. 4. Hvis du blir bedt om å starte maskinen på nytt, skal du bekrefte det ved å klikke på <Yes>. Merk: Ikke fjern CD-en for LightCycler MRSA Advanced-programvaresett i løpet av restartprosessen. 5. Etter ny oppstart, følg instruksjonene til installasjonsveiviseren. Trykk på <Next> for å starte installering av MAS. 6. Velg <Just Me> hvis bare én bruker skal jobbe på LightCycler -datastasjonen. Velg <Everyone> hvis mer en én bruker skal jobbe på LightCycler -datastasjonen NO 7 Doc Rev. 5.0

8 7. Bekreft at MAS-installeringen var vellykket ved å klikke på <Close> i vinduet <Installation Complete>. 8. Datamapper for *.ixo- og *.pdf-filer blir laget automatisk (<C:\Export to MAS>, <C:\Export to MAS\ColorCompensations> og <C:\Export to MAS\Macros>). B. Installasjon og eksport av LightCycler MRSA Advanced Macros 1. Installer *.lckit-makroene LightCycler MRSA Advanced MCC Macro v1.0 (MRSA MCC_ A_1.0.Ickit) eller høyere og LightCycler MRSA Advanced Macro v1.0 (MRSA_ _1.0.Ickit) eller høyere fra CDen med LightCycler MRSA Advanced-programvaresett v1.2 CE (eller høyere). 2. Se operatørmanual A for LightCycler 2.0-instrumentet, kapitlet Utføre en Roche-makro. 3. Eksporter begge makroene til <C:\Export to MAS\Macros>. Når du blir bedt om å lagre filen, velg *.ixo som filtype, og endre ikke det originale makronavnet. C. Verifisere installasjon av mikroanalyseprogramvaren (MAS) 1. Kopier følgende kontrollfiler fra CDen med LightCycler MRSA Advanced-programvaresett v1.2 CE (eller høyere) inn i <C:\Export to MAS>-mappen (ikke lagre filene i undermapper). a. MRSA Advanced kontrollfil v1.2 CE.ixo eller høyere b. MRSA Advanced kontrollfil v1.2 CE.pdf eller høyere 2. Kopier følgende fargekompensasjonsfiler fra CDen med LightCycler MRSA Advanced-programvaresett v1.2 CE (eller høyere) inn i <C:\Export to MAS\ColorCompensations>-mappen. a. MRSA_CCE_ ixo b. MRSA_CCO_ ixo 3. Hvis MAS ikke er åpen, dobbeltklikk på MAS-ikonet på skrivebordet og trykk på <Load>. 4. Velg MRSA Advanced Proof File v1.2 CE.ixo (eller høyere) i <C:\Export to MAS>-mappen. 5. Skriv inn lotnr., utløpsdato og labinfo i de riktige feltene i vinduet MRSA Configuration Settings. Advanced-lyseringskit Lot No 11A00000 Expiration Date MRSA Advanced-testen Lot No 23A00000 Expiration Date Personinformasjon Lab Info Roche-lab 6. Velg rapporttypen <MRSA Combined> og fortsett med <OK>. Filen vil bli analysert automatisk, og dataene vil vises. 7. Skriv ut rapporten. 8. Naviger til <C:\Export to MAS>-mappen og skriv ut MRSA Advanced kontrollfilen v1.2 CE.pdf (eller høyere). 9. Pass på at den utskrevne MAS-rapporten og den utskrevne PDF-rapporten inneholder de samme resultatene. Hvis ikke, kontakt ditt lokale Roche-kontor for teknisk støtte NO 8 Doc Rev. 5.0

9 D. Fjerning av mikroanalyseprogramvaren (MAS) 1. Logg på som administrator på LightCycler -datastasjonen. 2. Klikk på <Start> i oppgavefeltet for LightCycler -datastasjonen. 3. Velg <Start> / <Control Panel> / <Add/Remove Programs> i nederste venstre hjørne av Windows-skrivebordet. 4. En liste over alle installerte programmer vil vises. Klikk på <MAS>. 5. Velg <Remove>, og bekreft dette ved å klikke på <Yes>. Merk: CDen med MRSA Advanced-programvaresett har en avinstallerings- og reparasjonsfunksjon. Avinstalleringsfunksjonen kan brukes i stedet for den beskrevne prosessen. Reparasjonsfunksjonen kan brukes til å gjenopprette skadede eller manglende filer for mikroanalyseprogramvaren. E. Flerfargekompensasjonseksperiment ved bruk av LightCycler Multicolor Compensationsett som skal brukes med LightCycler 2.0-instrumentet Bruk de følgende trinnene for å opprette en ny eller for å erstatte en utgått fargekompensasjonsfil. 1. Tin rør 1, 2, 3 og 5. Vortex forsiktig og sentrifuger en kort stund. 2. Klargjør en 3-delers fortynning av rør 2 ved å blande sammen: a. 10 µl av blandingen i rør 2 b. 20 µl buffer fra et rør med LYS uten å overføre glasskulene 3. Pipetter 10 µl av hver komponent inn i et LightCycler -kapillærrør (20 µl). a. Kapillærrør nr.1: rør 1 b. Kapillærrør nr. 2: fortynningstrinn E2 c. Kapillærrør nr.3: rør 3 d. Kapillærrør nr.4: rør 5 Merk: Kast fortynningen av rør 2 etter at analyseserien er fullført. 4. Pipetter 10 µl buffer fra et rør med LYS (uten å overføre glassperlene) inn i hvert kapillærrør slik at du oppnår et totalt volum på 20 µl. 5. Forsegle hvert kapillærrør med en kork ved bruk av Capping-verktøyet. 6. Sentrifuger kapillærrørene ved bruk av LC-karusellsentrifuge 2.0 eller en standard sentrifuge og sentrifugeadaptere. Rørene skal være i følgende posisjon i karusellen: a. Karusellplassering 1: CCB (rør 1) b. Karusellplassering 2: CC530 (rør 2) c. Karusellplassering 3: CC610 (rør 3) d. Karusellplassering 4: CC670 (rør 5) Merk: Ikke reduser det volumet som ble brukt for hvert kapillærrør. 7. Overfør LightCycler -prøvekarusell til LightCycler 2.0-instrumentet. Hvis det ble brukt en vanlig sentrifuge, skal kapillærrørene overføres til LightCycler -prøvekarusell i den rekkefølgen som er beskrevet i trinn E6. Merk: Ikke endre rekkefølgen for reagensene i karusellen NO 9 Doc Rev. 5.0

10 8. Start og lagre fargekompensasjonseksperimentet (CCE). a. For bruk av LightCycler MRSA Advanced MCC Macro, se operatørmanual A for LightCycler 2.0-instrumentet, kapittelet "Utføre en Roche-makro". Merk: Ikke bruk feltet <assay lot number>. Hvis du ønsker å legge til analysens lotnummer til forsøket, må du taste inn opplysningene i det tilsvarende feltet i prøveredigereren. b. Lagre analyseserien ved hjelp av følgende obligatoriske navnekonvensjon for fargekompensasjonseksperimentet: MRSA_CCE_ÅÅMMDD-xx, hvor Å=år, M=måned, D=dag og xx=analyseserienummer. c. Når analyseserien er ferdig, vil en LightCycler -rapport automatisk lages og kan skrives ut. 9. Validering av analyseserien Rapporten vil ikke indikere hvorvidt fargekompensasjonseksperimentet var vellykket. Hvorvidt fargekompensasjonseksperimentet er vellykket kan bare avgjøres ved bruk av fargekompensasjonsobjektet som genereres fra CCE til den første MRSAAdvanced-analyseserien. a. Hvis LightCycler -programvarens (LCS) rapport for fargekompensasjonseksperimentet (CCE) inneholder flagget <User Developed or Modified Test Method>, er CCE ugyldig. Gjenta fargekompensasjonseksperimentet (fra trinn E1). b. Hvis LCS-rapporten fra fargekompensasjonseksperimentet (CCE) ikke inneholder et flagg, fortsett til neste trinn. 10. Opprette et fargekompensasjonsobjekt (CCO). a. Aktiver analysemodulen for fargekompensasjon, og trykk på knappen <save CC object>. b. Lag et kort og unikt navn ved hjelp av den obligatoriske navnekonvensjon for fargekompensasjonseksperimentet: MRSA_CCE_ÅÅMMDD-xx, hvor Å=år, M=måned, D=dag og xx=analyseserienummer. c. Dette objektet brukes for videre analyse med LightCycler MRSA Advanced-testen. 11. Eksporter både CCE og CCO-filene til <C:\Export to MAS\ColorCompensations>. Når du blir bedt om å lagre filen, velg *.ixo som filtype, og endre ikke de originale filnavnene. Prøve- og kontrollpreparering A. Prøvepreparering 1. Merk et LYS-rør med adekvat merking for hver pasientprøve. Merk: Ikke merk rørene på toppen av korken. 2. Fjern prøvepenselen fra transportbeholderen. 3. Plasser en enkelt penselhode i et LYS-rør. Merk: Hvis det brukes en pensel med et enkelt hode, kan en direkte kultur gjøres ved å stryke penselen mot platen før den plasseres i LYS-røret. 4. Hold penselen i pinnen nær kanten på røret, løft penselen noen få millimeter fra bunnen og bøy pinnen mot kanten på røret for å brekke den. Merk: Bruk gasbind for å minimere risikoen for kontaminering når prøvepenselen brekkes. Bruk et nytt gasbind for hver pensel. 5. Sett LYS-korken tett på NO 10 Doc Rev. 5.0

11 B. Preparering av negativ kontroll Merk: Den negative kontrollen skal prepareres samtidig med prøvene som skal testes. 1. Merk et LYS-rør for negativ kontroll. Merk: Ikke merk rørene på toppen av korken. 2. Plasser en steril prøvepensel i transportbeholderen. Se avsnittet "Annet materiell som kreves, men som ikke medfølger" for en liste over anbefalte prøvepensler. 3. Inkuber i romtemperatur i minst 1 minutt. 4. Fjern prøvepenselen fra transportbeholderen. 5. Plasser en enkelt penselhode i et LYS-rør. 6. Hold penselen i pinnen nær kanten på røret, løft penselen noen få millimeter fra bunnen og bøy pinnen mot kanten på røret for å brekke den. Merk: Bruk et nytt gasbind for å minimere risikoen for kontaminering når prøvepenselen brekkes. 7. Sett LYS-korken tett på. C. Preparering av prøver og kontroller 1. Varm opp prøver og negative kontroller ved 95 ± 2 C i 2 minutter i en varmeblokk. 2. Lyser prøver og negative kontroller i MagNA Lyser-instrumentet i 70 sekunder ved en hastighet på 5000 rpm. Se operatørmanualen for MagNA Lyser-instrumentet for detaljer om bruken. 3. Sentrifuger prøven og den negative kontrollen ved x g ved romtemperatur i 1 minutt. Merk: Preparerte prøver og negative kontroller som er framstilt fra Liquid Stuart-pensler og Amies-gelpensler (med eller uten kull), er stabile i opptil 1 dag ved 15 til 25 C eller i opptil 5 dager ved 2 til 8 C eller i opptil 12 måneder ved -15 til -25 C. Klargjøring av reagenser 1. Tin MRSA RXNMX og MRSA DETMX og MRSA (+) C ved romtemperatur. Pass på at reagensene er fullstendig opptint før bruk. 2. Vortex MRSA RXNMX og MRSA DETMX og MRSA (+) C i 3 5 sekunder og sentrifuger raskt for å samle opp materiale i bunnen av røret. 3. Klargjør Working Master Mix for det antallet prøver og kontroller som skal testes, i et sterilt silikonisert mikrosentrifugeringsrør av polypropylen. (Bruk tabell 1 som veiledning.) Hver analyseserie må inneholde minst én prøve, én PC og én NC. Merk: De anbefalte volumene omfatter 2 reaksjoner for den negative kontrollen og den positive kontrollen og et ekstra volum for å kompensere for dødvolum og for å lette pipettering ut av mastermiksrøret og inn i LC-kapillarrørene. Merk: Bruk mikrorørverktøyet (VWR P/N eller Rainin P/N PJ-4A) eller liknende for å lette åpningen av MRSA RXNMX og MRSA DETMX om nødvendig NO 11 Doc Rev. 5.0

12 Tabell 1 Klargjøring av Working Master Mix Antall prøver Volum av MRSA RXNMX (µl) Volum av MRSA DETMX (µl) Totalt volum (µl)* *Omfatter volum for NC, MRSA (+) C og dødvolum. 4. Vortex Working Master Mix i 3-5 sekunder og sentrifuger raskt for å samle opp materiale på bunnen av røret. Working Master Mix må tillages ferskt daglig. Kast ubrukt Working Master Mix innen 24 timer etter tillaging NO 12 Doc Rev. 5.0

13 Klargjøring av preparerte prøver og kontroller 1. Plasser det ønskede antall LightCycler -kapillærrør i LC-karusellen eller i sentrifugeadapterne. Et kapillærrør (1) for PC-en (posisjon 1), 1 kapillærrør for den preparerte NC (posisjon 2) og 1 kapillærrør for hver av de preparerte prøvene (posisjon 3 og høyere) trengs. Merk: Hold LightCycler -kapillærrørene i det øvre plastreservoaret av kapillærrøret. 2. Pipetter 15 µl Working Master Mix til hvert kapillærrørreservoar. 3. Pipetter 5 µl med klar supernatant fra hver preparerte prøve i kapillærrør nr. 3 og høyere. Bytt pipettespissen etter hver prøve. 4. Pipetter 5 µl av den preparerte negative kontrollen i kapillærrør nr. 2. Merk: Preparerte prøver og negative kontroller som er framstilt fra Liquid Stuart-pensler og Amies-gelpensler (med eller uten kull), er stabile i opptil 1 dag ved 15 til 25 C eller i opptil 5 dager ved 2 til 8 C eller i opptil 12 måneder ved -15 til -25 C. Hvis det brukes frosne preparerte prøver, skal de tines ved romtemperatur, vortexes i 10 sekunder og så sentrifugeres ved x g ved romtemperatur i 1 minutt. 5. Pipetter 5 µl av den opptinte MRSA (+) C i kapillærrør nr Forsegle hvert kapillærrør med en kork ved bruk av Capping-verktøyet. 7. Sentrifuger kapillærrørene i LC-karusellsentrifuge 2.0 eller ved bruk av en standardsentrifuge og sentrifugeadaptere. 8. Overfør LightCycler -prøvekarusell til LightCycler 2.0-instrumentet. Merk: Hvis det ble brukt en vanlig sentrifuge, skal kapillærrørene overføres til LightCycler - prøvekarusell i den rekkefølgen som er beskrevet i trinn 1. Merk: Amplifikasjon må startes omgående etter at de preparerte prøvene og kontrollene er tilsatt Working Master Mix. Hvis dette ikke er mulig kan de fylte kapillærrørene lagres i opptil 3 timer, beskyttet mot lys, ved 2 til 8 C. Innlasting og betjening av LightCycler 2.0-instrumentet 1. Logg deg på til LightCycler -programvaren. 2. Start LightCycler MRSA Advanced Macro (se operatørmanual A for LightCycler 2.0-instrumentet, kapittelet "Utføre en Roche-makro", for flere detaljer). Merk: Ikke bruk feltet <assay lot number>. MAS vil be om reagensinformasjon før prosessen med analyse av resultatene starter (assay lot-nummeret kan også legges inn i riktig felt i prøveredigereren i LightCycler -programvaren). 3. Navngi analyseserien ved å bruke en unik identifikasjon. 4. Reduser standard innlastingsliste til det antallet prøver som skal testes. Hvis for mange prøveposisjoner er blitt slettet ved et uhell, skal prosedyren startes fra trinn Skann strekkodeetikettene for prøvene, skriv inn prøvenavnene manuelt i prøvenavnfeltet, eller behold standardinnstillingene. Feltet <Run Note> kan brukes til å legge inn data om det er påkrevd. Merk: Ikke endre standardnavnet for positive og negative kontroller. 6. Følg instruksjonen på skjermen og start analyseserien med LightCycler MRSA Advanced-testen NO 13 Doc Rev. 5.0

14 RESULTATER Identifikasjon av topper og automatisk resultatanalyse: Merk: Ikke start en dataanalyse mens en LightCycler -analyseserie pågår. Manual T M Calling krever manuell betjening i to T M Calling-moduler som velges automatisk. Absolute Quantification-modulene brukes ikke for analysen av denne testen. I smeltetopp-vinduet vises alle kurver for de valgte grafene. T M -stolpene for hver analysemodul er forhåndsdefinert i LightCycler MRSA Advanced Macro. Det er mulig å velge eller velge bort T M -stolper uten å opprette et flagg. Baseline for hver analysemodul er predefinert i LightCycler MRSA Advanced Macro i henhold til den følgende tabellen og må ikke velges bort eller endres. Hvis baseline blir endret utilsiktet, skriv inn de korrekte verdier fra tabell 2. Tabell 2 Baseline-verdier CH 610 CH 670 Baseline-verdi 0,085 0,100 Topper defineres som maksima over baseline. Skuldre er ikke topper. Eksempler på typisk positiv kontroll (graf 1, kanal 610) og intern kontroll (graf 2, kanal 670) topper og topper med skulder (graf 3): Graf 1 Graf NO 14 Doc Rev. 5.0

15 Graf 3 Justering av T M -stolper: 1. Etter at analyseserien er avsluttet, viser eksperimentveiviseren meldingen <Analyses have been created>. 2. Flytt meldingsvinduet ned til bunnen av skjermen for å se T M og baseline-verdiene (ikke trykk på <Finish>). 3. Klikk på T M Calling 610-analysemodulen. En oversikt over alle posisjonene vises. 4. Reduser størrelsene på grafvinduet ved å skyve venstre håndtak i dette vinduet til høyre. Kolonnene "Baseline", "TM1" og "Height1" skal nå være synlige. Merk: Hvis mer enn én posisjon er valgt, vil innstillingene for det første valgte kapillærrøret vises. Merk: Stolpeforskyvninger har innvirkning på alle valgte kapillærrør. 5. Klikk på posisjonen for den positive kontrollen (#PC#) for å velge den. 6. Hvis TM-stolpen ikke er posisjonert ved toppmaksima (over baseline), skal den flyttes til toppmaksima med fokus på de spesifiserte TM-områdene (se tabell 3). 7. Hvis det ikke er noen topper over baseline, skal T M -stolpen forbli i standardposisjon. Pass på ingen stolper er plassert på stigningen for noen gjeldende topper (dvs. utenfor det spesifiserte T M -området). 8. Pass på at ingen verdier vises i kolonnene "TM1" og "Height1" for denne prøven (alle verdier). Hvis det ikke vises noen verdier (tomt område), omplasser T M -stolpen til toppmaksima. Det skal nå vises verdier i kolonnene "TM1" og "Height1". Tabell 3 Spesifiserte T M -områder MRSA (CH 610) Intern kontroll (CH 670) Lav T M ( C) Høy T M ( C) 57,00 62,00 57,00 62,00 Merk: For prøver uten topper (f.eks. i negativ kontroll) vil autoskalering justeres etter den høyeste bakgrunnsverdien. Predefinert baseline er kanskje ikke synlig i dette tilfellet. Hvis du ønsker at baseline skal være synlig, velg denne kapillærrørposisjonen sammen med den positive kontrollen. Merk: Avmerkede topper utenfor det spesifiserte T M -området vil bli rapportert i MAS-rapporten. 9. Fortsett med toppdeteksjon som beskrevet i trinn 5 til 8 ovenfor for alle gjenværende posisjoner (kontroller og prøver) NO 15 Doc Rev. 5.0

16 10. Klikk på T M Calling 670-analysemodul. 11. Fortsett med toppdeteksjon som beskrevet i trinn 4 til 8 ovenfor for alle posisjoner (kontroller og prøver). Avslutt TM calling: 1. Flytt eksperimentveiviseren til midten av skjermen og trykk på <Finish>. 2. En LightCycler -rapport blir opprettet automatisk og kan skrives ut. 3. Eksperimentet lagres automatisk. Merk: Hvis det gjøres endringer ved prøvenavnfelt i LightCycler -programvaren etter lagring må operatøren oppdatere databasen ved å velge og klikke på ikonene "Abs Quant 610" og "Abs Quant 670" og lagre filen på nytt. 4. Eksporter *.ixo-filen ved å klikke på <File> \ <Export> til mappen <C:\Export to MAS>. Automatisk resultat-calling ved bruk av mikroanalyseprogramvare (MAS): 1. Dobbeltklikk på MAS-ikonet på datamaskinens skrivebord og trykk på <Start>. 2. Velg det MRSA Advanced-eksperimentet som skal analyseres, fra mappen <C:\Export to MAS> og last inn *.ixo-filen. 3. Skann eller legg inn informasjon manuelt om lotnummer og utløpsdato som kommer sammen med Advanced-lyseringskit og LightCycler MRSA Advanced-testen. 4. Legg inn personlig informasjon (f.eks. operatørnavn) om ønsket. Merk: Den siste informasjonen som ble lagt inn i MAS, vil bli brukt heretter. 5. Velg et egnet rapportformat (tabellarisk, gruppert eller kombinert). 6. *.ixo-filen til MRSA Advanced-eksperimentet vil analyseres automatisk, og dataene vises i en rapport i det valgte rapportformatet. 7. Skriv ut MAS-rapporten og/eller eksporter den som *.pdf. Merk: MAS-rapporten viser IVD-resultater, derfor erstatter den informasjonen som gis på den generiske rapporten til LightCycler (LCS-rapport) NO 16 Doc Rev. 5.0

17 TOLKNING AV RESULTATER 1. Resultatene blir beregnet av LightCycler -programvaren ut fra målte fluorescenssignaler og innebygde beregningsalgoritmer og presentert med mikroanalyseprogramvaren (MAS). 2. Validering av analyseserien, kontroller og prøver blir automatisk utført av MAS. Merk: Flagg og kommentarer kan genereres for RUN STATUS, CONTROLS STATUS og SAMPLE STATUS. Operatøren må sjekke MAS-rapportutskriftene for flagg eller kommentarer i alle boksene. Merk: Et negativt resultat med LightCycler MRSA Advanced-testen utelukker ikke nasal kolonisering med MRSA. 3. Resultater fra gyldige analyseserier tolkes på følgende måte: CH 610- resultat (MRSA) POSITIV CH 670- resultat (IC) POSITIV eller NEGATIV MRSAresultat Kommentar DETECTED NEGATIV NEGATIV IC not detected NEGATIV POSITIV NOT DETECTED Tolkning Prøven er positiv for MRSA- DNA. Antatt nasal kolonisering av MRSA. Ugyldig resultat. Gjenta PCR-prosedyren med tinte preparerte prøver eller nye prøver. Hvis fortsatt ugyldig, rapporter ugyldig resultat. Ta kontakt med det lokale Roche-kontoret. MRSA-DNA ikke detektert. Nasal kolonisering av MRSA usannsynlig. Tilleggskommentarer angående positiv kontroll, negativ kontroll og prøveresultat kan rapporteres av MAS: Kommentar Peak(s) outside Target T M range Peak(s) outside IC T M range Tolkning Amplicon detektert utenfor spesifisert MRSA T M -område Amplicon detektert utenfor spesifisert IC T M -område Hvis MAS rapporterer kommentaren "Peak(s) outside Target T M range" for en prøve med et resultat som er enten "Not Detected / Valid" eller "Invalid / Invalid" (kolonnene "MRSA Result" og "Status" i MASrapporten), skal prøven antas å være positiv for MRSA-DNA. Ta en annen prøve (eller bruk resterende penselprøve fra en pensel med to hoder) og test på nytt med en alternativ prosedyre, som kultur, for å bestemme pasientens nasale koloniseringsstatus. Prøver som har resultatet "Detected / Valid" (i kolonnene "MRSA Result" og "Status" i MAS-rapporten), og som MAS viser kommentaren "Peak(s) outside Target T M range" for, skal tolkes som positive for MRSA-DNA (antatt nasal kolonisering med MRSA). Selv om disse kommentarene vises på linjen "Controls Status" i MAS-rapporten, endres ikke "Controls Status"-tolkningen eller "Run Status"-tolkningen som genereres av MAS og vises på MAS-rapporten NO 17 Doc Rev. 5.0

18 4. De følgende flaggene kan vises av MAS: Flagg Kommentarer Tolkning Status Korrigerende tiltak Gjenta LightCycler -analyseserien. Sjekk at makroen i Invalid File could not Run macro Feil makro er brukt LightCycler -programvaren be loaded version eller MRSA Advancedprogramvaresett er riktig. User Developed or Modified Test Method Lysis Kit expired MRSA Test expired CCO expired on YYMMDD 1 CCO NAME MULTIPLE CCO USED NO CCO USED Kritiske parametre i CCE og/eller CCO og/eller MRSA Advanced *.ixo-filer er forskjellige fra referanse-*.ixofilene i MRSA Advanced Macros. Mulige årsaker er beskrevet i operatørmanualen for LightCycler 2.0- instrumentet (f.eks. modifisering av standardinnstillinger for makroen). LightCycler Advancedlyseringskit utløpt LightCycler MRSA Advanced-test utløpt Fargekompensasjon sobjektfilen er eldre enn seks måneder. Fargekompensasjon sobjekt har uriktig navn Det er brukt forskjellige fargekompensasjonsfiler i analysemodulene. En eller flere fargekompensasjonsfiler mangler i analysemodulene. Run Run Run Run Run Run Run Hvis det vises flere flagg, se det korrigerende tiltaket som er oppgitt for det respektive flagget. Hvis det ikke vises flere flagg, skal eksperimentet gjentas. Hvis et flagg stadig blir vist, ring din lokale Roche servicetjeneste. Gjenta LightCycler -analyseserien med reagenser som ikke er utgått på dato. Gjenta LightCycler -analyseserien med reagenser som ikke er utgått på dato. Klargjør en ny fargekompensasjonsanalyseserie og opprett et nytt fargekompensasjonsobjekt. Gjenta LightCycler - analyseserien som ble utført med den utløpte CCO-en. Klargjør en ny fargekompensasjonsanalyseserie og opprett et nytt fargekompensasjonsobjekt i samsvar med navnekonvensjonene i dette dokumentet. Gjenta LightCycler - analyseserien som ble utført med den feilnavnede CCO-en. Åpne *.ixo-filen for MRSAeksperimentet i LightCycler - programvaren og velg riktig fargekompensasjonsobjekt. Lagre eksperimentet og eksporter på nytt. Åpne *.ixo-filen for MRSAexperimentet i LightCycler - programvaren og velg riktig fargekompensasjonsfil. Lagre eksperimentet og eksporter på nytt NO 18 Doc Rev. 5.0

19 Flagg Kommentarer Tolkning Status Korrigerende tiltak Det er brukt feil versjon av Åpne LightCycler -programvaren og sjekk at det er riktig LCS LightCycler Run - VERSION programvaren for versjonsnummer. prosedyren. BASELINE NC PC NC NAME PC NAME NC: Target peak(s) detected NC: IC not detected PC: PC not detected 1 MAS gir en advarsel 30 dager før reagensen utløper. Baseline-verdiene kan ha blitt endret utilsiktet. Amplicon detektert i MRSA TMområdet til den negative kontrollen Ingen IC detektert i negativ kontroll Ingen MRSA-målsekvens påvist i den positive kontrollen Standardnavnet for den negative kontrollen er endret. Standardnavnet for den positive kontrollen er endret. Run Controls Controls Controls Controls Åpne *.ixo-filen for MRSAeksperimentet i LightCycler - programvaren, og sjekk baseline-verdier i henhold til tabell 2. Lagre eksperimentet og eksporter på nytt. Se avsnittet "Kvalitetskontroll" Se avsnittet "Kvalitetskontroll" Åpne *.ixo-filen for MRSAeksperimentet i LightCycler - programvaren og legg inn #NC#. Lagre eksperimentet og eksporter på nytt. Åpne *.ixo-filen for MRSAeksperimentet i LightCycler - programvaren og legg inn #PC#. Lagre eksperimentet og eksporter på nytt NO 19 Doc Rev. 5.0

20 5. De følgende beskjedene kan vises av MAS: Beskjed Tolkning Status Korrigerende tiltak Eksporter makrofilen fra Makrofil <...> mangler i Macro file < > Interpretation LightCycler -programvaren til <C:\Export to MAS\ was not found aborted mappen <C:\Export to MAS\ Macros> Macros> igjen. CCExperiment file < > was not found CCObject < > file was not found Error in Color Compensation Experiment/Object / MRSA Experiment / or MD5 Hash code Modified test method in <.> CCE-fil <...> mangler i <C:\Eksporter til MAS\ ColorCompensations> CCO-fil <...> mangler i <C:\Eksporter til MAS\ ColorCompensations> Feil i integritetskontrollen for ixo-fil Påvist modifisert parameter Interpretation aborted Interpretation aborted Interpretation aborted Run Eksporter CCE-filen fra LightCycler -programvaren til mappen <C:\Export to MAS\ ColorCompensations> igjen. Eksporter CCO-fil fra LightCycler -programvaren til mappen <C:\Export to MAS\ ColorCompensations> igjen. Eksporter eksperimentfil og CC og makrofiler fra LightCycler - programvaren på nytt. Hvis denne beskjeden stadig blir vist, ring din lokale Roche servicetjeneste. Se "User Developed or Modified Test Method" NO 20 Doc Rev. 5.0

21 KVALITETSKONTROLL 1. Hver LightCycler MRSA Advanced-reaksjon inneholder en intern kontroll (IC). Den interne kontrollen er utformet for å kontrollere prøveinhibisjon og kontrollere reagensintegritet. a. Internkontroll (IC) Internkontrollen må være detektert positiv i alle MRSA-negative prøver, også i den negative kontrollen (NC). Hvis internkontrollen er negativ i en negativ prøve, er prøven ugyldig, og PCR-prosedyren må gjentas med en nylig opptint preparert prøve. Hvis internkontrollen er negativ i NC, er hele analyseserien ugyldig og må gjentas fra fryste, preparerte prøver eller nye prøver. Hvis den gjentatte analyseserien for fryste, preparerte prøver fremdeles er ugyldig, rapporter ugyldig resultat og kontakt ditt lokale Roche-kontor. Internkontrollresultatet ignoreres i MRSA-positive prøver og i en gyldig positiv kontroll (PC), siden MRSAamplifikasjon kan konkurrere med denne kontrollen. 2. Minst 1 positiv kontroll (PC) og 1 negativ kontroll (NC) må behandles i hver analyseserie. Den positive kontrollen skal monitorere reagensfunksjon. NC brukes til å påvise kontaminering av reagens eller miljø ved hjelp av MRSA-DNA. Amplifikasjonsreagenser inneholder et enzym for å hindre kontaminering med MRSA-ampliconer. LightCycler -programvaren angir posisjonen i instrumentet for begge kontrollene automatisk. a. Negativ kontroll (NC) Den negative kontrollen må være negativ, mens dens internkontroll må være positiv. Hvis NC ikke imøtekommer disse kriteriene, er hele analyseserien ugyldig og må gjentas fra fryste, preparerte prøver eller nye prøver. Hvis den gjentatte analyseserien fremdeles er ugyldig, kontakt ditt lokale Roche-kontor. b. Positiv kontroll (PC) PC må være positiv (med IC enten positiv eller negativ). Hvis PC ikke imøtekommer dette kriteriet, er hele analyseserien ugyldig og må gjentas fra fryste, preparerte prøver eller nye prøver. Hvis den gjentatte analyseserien fremdeles er ugyldig, kontakt ditt lokale Roche-kontor. Flagg og kommentarer kan genereres av mikroanalyseprogramvaren (MAS). Operatøren må kontrollere analyseutskriften(e) for flagg og kommentarer for å verifisere at analyseserien er gyldig. Kontroll Negativ kontroll Positiv kontroll CH 610- resultat (MRSA) CH 670- resultat (IC) Tolkning NEGATIV POSITIV Analyseserie gyldig, ingen tiltak POSITIV POSITIV eller NEGATIV Analyseserie ugyldig, analyser nye prøver NEGATIV POSITIV NEGATIV NEGATIV POSITIV eller NEGATIV POSITIV eller NEGATIV Analyseserie ugyldig, gjenta serien fra fryste, preparerte prøver (eller nye prøver). Hvis den gjentatte analyseserien for fryste, preparerte prøver fremdeles er ugyldig, kontakt ditt lokale Roche-kontor. Analyseserie gyldig, ingen tiltak Analyseserie ugyldig, gjenta serien fra fryste, preparerte prøver (eller nye prøver). Hvis den gjentatte analyseserien for fryste, preparerte prøver fremdeles er ugyldig, kontakt ditt lokale Roche-kontor NO 21 Doc Rev. 5.0

22 Merk: Hvis den negative kontrollen (NC) eller MRSA (+) C for LightCycler MRSA Advancedtesten vedvarende er ugyldig, kan LightCycler -flerfargekompensasjonsfilen være ukorrekt. Gjenta fargekompensasjonseksperimentet, eller kontakt ditt lokale Roche-kontor for teknisk støtte. Ekstern positiv kontroll (EPC) MicroBioLogics KWIK-STIK MRSA Positiv kontroll (P/N: 0158ROCHE) kan brukes til opplæring, kompetansetesting og ekstern kvalitetskontroll av LightCycler MRSA Advanced-testen. En MRSA-stamme som er representativ for RE2-typene, brukes for denne eksterne positive kontrollen. MRSA-stammer som representerer RE3 og RE7-typer, hvis de er tilgjengelige, kan brukes som ytterligere eksterne positive kontroller for å kontrollere analyseprimere og prober som ikke er direkte kontrollert i analysen. Eksterne kontroller kan brukes i samsvar med lokale, nasjonale og regionale akkrediteringsorganisasjoner, om det er relevant. Følg trinnene i KWIK-STIK pakningsvedlegget for klargjøring av penselprøver, men ikke plasser prøvepenselen på kulturmediet. Etter at prøvepenselen er mettet med det hydrerte materialet, følg pakningsvedlegget for LightCycler MRSA Advanced-testen for preparering av prøver og testing av penselprøven. EPC må være positiv (med IC enten positiv eller negativ). Hvis EPC ikke oppfyller dette kriteriet, er hele MagNA Lyser-analyseserien ugyldig og må gjentas fra nye prøver. Hvis den gjentatte analyseserien fremdeles er ugyldig, kontakt ditt lokale Roche-kontor. Merk: Hittil er sju SCCmec-typer (I VII) funnet, og flere varianter av disse SCCmec-typene er beskrevet 4. LightCycler MRSA Advanced-testen er basert på et merkebeskyttet deteksjonssystem som kan påvise MRSA-stammer med forskjellige molekylære sekvenser i det området som omgir RE-krysset (krysset for høyre ekstremitet) for SCCmec-kassetten med orfx-genet. De RE-typene som er vist å påvises av LightCycler MRSA-testen, omfatter RE2, RE3 og RE7. I tillegg har sekvensanalyse av type RE1 vist 100 % homogenitet for primere og prober som brukes i LightCycler 2.0 MRSA Advanced-testen. FORSIKTIGHETSREGLER 1. Som for andre laboratorieprosedyrer er god laboratorieteknikk essensielt for å sikre optimal ytelse for denne analysen. TESTENS BEGRENSNINGER 1. Dette produktet skal kun brukes sammen med LightCycler 2.0-instrumentet. 2. Denne testen er kun validert for bruk med humane nasalprøver. 3. Pålitelige resultater er avhengig av adekvat prøvetaking (antall organismer i prøven), transport, oppbevaring og håndtering. 4. Dette produktet skal kun brukes av opplært personell. 5. Et positivt resultat med LightCycler MRSA Advanced-testen indikerer ikke tilstedeværelse av levedyktig MRSA. Den er imidlertid presumptiv for tilstedeværelse av MRSA. Derfor indikerer ikke et positivt resultat nødvendigvis svikt i intervensjon eller utradering, siden ikke-levedyktig DNA fortsatt kan finnes. Imidlertid kan et negativt resultat etter et tidligere positivt resultat kanskje indikere vellykket utradering. 6. På grunn av de naturlige forskjellene mellom teknologier anbefales det at brukerne utfører metodekorrelasjonsstudier i laboratoriet for å bestemme de teknologiske forskjellene før en ny teknologi tas i bruk. 7. Tilstedeværelse av AmpErase-enzymet i LightCycler MRSA Advanced-reagensblandingen reduserer risikoen for kontaminasjon fra amplicon. Kontaminering fra MRSA (+) C og kliniske prøver kan kun unngås ved å bruke gode laboratorierutiner og følge anvisningene i dette pakningsvedlegget nøye. 8. Påvisning av MRSA ved lav konsentrasjon (f.eks 1000 CFU/pensel) ved tilstedeværelse av meticillinfølsom Staphylococcus aureus (MSSA) ved en konsentrasjon over 10E4 CFU/pensel er ikke etablert og forblir derfor ukjent NO 22 Doc Rev. 5.0

23 9. Selv om det forekommer sjelden, kan mutasjoner eller polymorfisme innenfor regionen av bakterielt genom som er dekket av LightCycler MRSA Advanced-testens primere og/eller probe, føre til manglende evne til å påvise bakterien. Sjeldne former av MSSA-stammen som bærer en genetisk variant av SCCmec-kassetten, kan gi positive resultater med LightCycler MRSA Advanced-testen. 10. Som med alle PCR-baserte in vitro-diagnostiske tester, vil svært lave nivåer av målet under LOD i analysen bli påvist, men resultatene er kanskje ikke reproduserbare (se avsnittet "Reproduserbarhet" for ytterligere opplysninger). 11. Krysskontaminering kan forekomme ved MRSA-konsentrasjoner over (>) 10E5 CFU/pensel. Interfererende substanser Substanser som kan interferere med deteksjon av MRSA med LightCycler MRSA Advanced-testen og potensielt produsere ugyldige resultater, inkluderer blod og overskytende mengder nesesekresjon/slim. Blod ble rapporter på nesepenselprøven for 20/1620 (1,2 %) av prøvene. Ingen av dem hadde ugyldige resultater på grunn av IC-svikt. De følgende eksogene substanser (se tabell 4), som er komponenter i midler mot kongestion og substanser som brukes til å lette tørrhet og/eller irritasjon i nesen, har vist seg å ikke interferere med deteksjon av MRSA ved bruk av LightCycler MRSA Advanced-testen. Tabell 4 Eksogene substanser som er testet for interferens med LightCycler MRSA Advanced-testen Handelsnavn Aktivt stoff InfectoPyoderm Mupirocin 20 mg/g (antibiotikum) Turixin Mupirocin-kalsium 21,5 mg/g (antibiotikum) Bepanthen nesesalve Dexpanthenol 50 mg/g (provitamin B5) Accumed 12-timers nesespray Oxymetazolin hydroklorid 0,05 % (dekongestant) Otriven Xylometazolin 0,1 % (dekongestant) Forventede verdier I klinisk utprøving av LightCycler MRSA Advanced-testen ble 1402 nesepenselprøver samlet inn fra 1402 personer ved 5 steder over hele USA. Studiepopulasjonen ble delt i grupper av sykehuspasienter i vanlige avdelinger (1007, 71,8 %), sykehuspasienter på intensivavdeling (67, 4,8 %), sykehjem/ hjemmesykepleiepasienter (255, 18,2 %) og medisinsk personale (73, 5,2 %). Det totale antall positive MRSA-prøver ved direkte kromogen kultur var 187 (13,3 %). Tabell 5 oppsummerer antall og prosentandel positive og negative tilfeller ved direkte kromogen kultur etter studiepopulasjonsgrupper. Tabell 5 Forventede verdier for MRSA i forskjellige populasjoner Gruppe Positiv N (%) Negativ N (%) Total N (%) Sykehus, ikke intensivavdeling 74 (7,3 %) 933 (92,7 %) 1007 (71,8 %) Sykehus, intensivavdeling 3 (4,5 %) 64 (95,5 %) 67 (4,8 %) Sykehjem/hjemmesykepleie 109 (42,7 %) 146 (57,3 %) 255 (18,2 %) Medisinsk personale 1 (1,4 %) 72 (98,6 %) 73 (5,2 %) Totalt 187 (13,3 %) 1215 (86,7 %) NO 23 Doc Rev. 5.0

24 YTELSESKARAKTERISTIKA KLINISK YTELSE Ytelsesegenskapene for LightCycler MRSA Advanced-testen ble vurdert i en multisenters, prospektiv undersøkelse ved 5 institusjoner, ved å sammenligne LightCycler MRSA Advanced-testen med en annen FDA-godkjent nukleinsyreamplifiseringstest (NAAT), direkte kromogen kultur, og buljongkultur (den mest sensitive dyrkningsmetoden). Studien omfattet individer og medisinsk personale som har risiko for kolonisering i nesen. Hver person ble innrullert i studien kun en gang. Personer som hadde fått systemisk eller lokale nasale antibiotika som brukes til å behandle nasal kolonisering med MRSA, fra den dagen prøven ble tatt og opptil en uke før inkludering i studien, alder under 2 år, og/eller som hadde kontraindikasjon for nesepenselprøvetaking, ble ekskludert fra studien. En dobbelthodet nesepensel ble innsamlet fra hver person. Et penselhode ble strøket direkte ut på en kvadrant av kromogen agarplate med cefoxitin, og deretter behandlet i henhold til pakningsvedlegget for testing med LightCycler MRSA Advanced-testen. De gjenværende kvadrantene av den kromogene agaren ble strøket med en steril slynge. Det andre penselhode ble strøket direkte ut på en separat kromogen plate med cefoxitin, og deretter klargjort for testing med den andre FDA-godkjente NAATtesten (i henhold til pakningsvedlegget). Deretter ble det andre penselhode overført til Trypticase soyabuljong og inkubert i 48 timer ved C, og deretter subkultivert på en kromogen plate med cefoxitin (buljongkultur). Kromogene kulturplater ble inkubert ved C i timer. Presumptive MRSA-kolonier fra alle kulturplater ble bekreftet med koagulasetesting og gramfarging dersom de ble funnet etter timers inkubering. Hvert deltakersted utførte alle testene. Ytelsen til LightCycler MRSA Advanced-testen ble beregnet i forhold til den andre FDA-godkjente NAAT, direkte kromogen kultur og buljongkulturresultater. Prøver hvor det vokste MRSA på direkte kromogen kultur enten fra penselhode A og/eller penselhode B, ble ansett for å være MRSA-positive med mindre annet er oppgitt. Totalt 1620 nesepenselprøver ble samlet inn fra personer på 5 steder over hele USA og testet med LightCycler MRSA Advanced-testen. Av de 1620 prøvene som ble testet, var 1402 prøver kvalifisert til å inkluderes i statistiske analyser. 1 Det totale antallet positive MRSA-prøver ved direkte kromogen kultur var 187 (13,3 %). Totalt var 2 (1,7 %) av 117 LightCycler -analyseseriene som ble utført under denne undersøkelsen, ugyldige på grunn av avvik fra studieprotokollen. Ti (10) (0,6 %) av 1620 nesepenselprøver testet med LightCycler MRSA Advanced-testen hadde ugyldige resultater på grunn av internkontrollsvikt (IC-svikt) etter initial testing, og 7/1620 (0,4 %) av prøvene var fortsatt ugyldige på grunn av internkontrollsvikt etter ny testing. Resultatene som ble funnet ved neseprøver fra godkjente deltakere testet for MRSA ved hjelp av LightCycler MRSA Advanced-testen sammenlignet med direkte kromogen kultur, den 2. FDA-godkjente NAAT og buljongkultur vises i tabellene 6, 7 og 8. Inkludert i tabell 6 er 1402 evaluerbare prøver som hadde gyldige resultater med LightCycler MRSA Advanced-testen og direkte kromogen dyrkning. Inkludert i tabell 7 er 1385 prøver med gyldige resultater for LightCycler MRSA Advanced-testen og den andre FDA-godkjente NAAT-testen, som i tillegg hadde overensstemmende direkte kromogene kulturresultater fra penselhode A og B. Inkludert i tabell 8 er 1395 evaluerbare prøver med gyldige resultater for LightCycler MRSA Advanced-testen og buljongkultur prøver var ikke evaluerbare for statistisk analyse. 36 personer oppfylte ikke innrulleringskriteriene, 153 prøver ble ikke testet etter studiens protokoll, 22 prøver var ugyldige på grunn av ekstern kontrollsvikt, og 7 prøver var ugyldige på grunn av internkontrollsvikt. Ved ny testing var disse 7 prøvene fortsatt ugyldige på grunn av internkontrollsvikt NO 24 Doc Rev. 5.0

25 Tabell 6 Sammenligning av LightCycler MRSA Advanced-testen med direkte kromogen kultur Direkte kromogen kultur LightCycler MRSA Advanced-testen Positiv Negativ Totalt Positiv Negativ Totalt Positiv prosentvis overensstemmelse (95 % eksakt CI a ) 95,2 % (91,1 %, 97,8 %) Negativ prosentvis overensstemmelse (95 % eksakt CI a ) 96,4 % (95,2 %, 97,4 %) Merk: Inkludert i denne sammendragstabellen er 1402 evaluerbare prøver som hadde gyldige resultater med LightCycler MRSA Advanced-testen og direkte kromogen dyrkning. a CI = konfidensintervall Av de 178 prøvene med positive resultater for LightCycler MRSA Advanced-testen og direkte kromogen kultur, var den andre FDA-godkjente NAAT positiv for 175 prøver og negativ for 3 prøver. Av de 44 prøvene med positive resultater for LightCycler MRSA Advanced-testen og direkte kromogen kultur, var den andre FDA-godkjente NAAT positiv for 25 prøver og negativ for 19 prøver. Av de 9 prøvene som viste negative resultater for LightCycler MRSA Advanced-testen og positive resultater for direkte kromogen kultur, var den andre FDA-godkjente NAAT positiv for 4 prøver og negativ for 5 prøver. Av de 1171 prøvene med negative resultater for LightCycler MRSA Advanced-testen og direkte kromogen kultur, var den andre FDA-godkjente NAAT positiv for 76 prøver, negativ for 1091 prøver og manglende/ ugyldig for 4 prøver. Tabell 7 Sammenligning av LightCycler MRSA Advanced-testen med den andre FDA-godkjente NAAT Den andre FDA-godkjente NAAT LightCycler MRSA Advanced-testen Positiv Negativ Totalt Positiv Negativ Totalt Positiv prosentvis overensstemmelse (95 % eksakt CI a ) 71,7 % (65,9 %, 77,0 %) Negativ prosentvis overensstemmelse (95 % eksakt CI a ) 98,2 % (97,2 %, 98,9 %) Merk: Inkludert i dette sammendraget er 1385 prøver med gyldige resultater for LightCycler MRSA Advanced-testen og den andre FDA-godkjente NAAT-testen som i tillegg hadde samsvarende resultater for direkte kromogen kultur fra penselhode A og B. a CI = konfidensintervall Av de 195 prøvene med positive resultater for LightCycler MRSA Advanced-testen og den andre FDAgodkjente NAAT, var direkte kromogen kultur positiv for 171 prøver og negativ for 24 prøver (MRSA ble bekreftet i 20 av disse 24 prøvene ved diskrepansanalyse). Av de 20 prøvene med positive resultater for LightCycler MRSA Advanced-testen og negative resultater for den andre FDA-godkjente NAAT, var direkte kromogen kultur positiv for 1 prøve og negativ for 19 prøver (MRSA ble bekreftet i 10 av disse 19 prøvene ved diskrepansanalyse) NO 25 Doc Rev. 5.0

26 Av de 77 prøvene med negative resultater for LightCycler MRSA Advanced-testen og positive resultater for den andre FDA-godkjente NAAT, var direkte kromogen kultur positiv for 1 prøve og negativ for 76 prøver (MRSA ble bekreftet i 13 av disse 76 prøvene ved diskrepansanalyse). Av de 1093 prøvene med negative resultater for LightCycler MRSA Advanced-testen og den andre FDAgodkjente NAAT, var direkte kromogen kultur positiv for 4 prøver (MRSA ble bekreftet i alle 4 prøver ved diskrepansanalyse) og negativ for 1089 prøver. Tabell 8 Sammenligning av LightCycler MRSA Advanced-testen med buljongkultur Buljongkultur LightCycler MRSA Advanced-testen Positiv Negativ Totalt Positiv Negativ Totalt Positiv prosentvis overensstemmelse (95 % eksakt CI a ) 89,8 % (84,8 %, 93,5 %) Negativ prosentvis overensstemmelse (95 % eksakt CI a ) 96,8 % (95,6 %, 97,7 %) Merk: Totalt 1395/1402 evaluerbare prøver som hadde gyldig resultat for LightCycler MRSA Advanced-testen og buljongkultur, er inkludert i denne sammendragstabellen. Buljongkulturresultater var manglende/ugyldige for 7/1402 evaluerbare prøver. a CI = konfidensintervall Et sammendrag av resultatene for 1398 godkjente deltakere (én neseprøve per pasient) testet for MRSA ved hjelp av LightCycler MRSA Advanced-testen, den andre FDA-godkjente NAAT-testen, og direkte kultur er vist i tabell 9. Tabell 9 Sammenligning av LightCycler MRSA Advanced-testen, den andre FDA-godkjente NAAT og direkte kultur Direkte kultur LightCycler MRSA Advanced-testen 2. NAAT Positiv Negativ Totalt Positiv Positiv Positiv Negativ Negativ Positiv Negativ Negativ Totalt Totalt Merk:Kun evaluerbare prøver som bidrar til gyldige resultater både i LightCycler MRSA Advanced-testen og resultatene fra den 2. NAAT-testen og samsvarende resultater fra direkte kultur er tatt med i denne sammendragstabellen NO 26 Doc Rev. 5.0

27 Diskrepansanalyse Ytterligere undersøkelser (dvs. testing for meca-mediert oxacillinresistens ved hjelp av cefoxitindiskdiffusjonsmetode, fem- og meca-spesifikk PCR og sekvensering av SCCmec-regioner) ble utført på alle prøver som ga avvikende resultater mellom direkte kromogen kultur (kun prøver som ga samsvarende resultater for penselhode A og B) og LightCycler MRSA Advanced-testen eller mellom direkte kromogen kultur (kun prøver som ga samsvarende resultater for penselhode A og B) og den andre FDA-godkjente NAAT. Diskrepansanalysen bekreftet tilstedeværelse av MRSA i 30 av 44 prøver hvor LightCycler MRSA Advanced-testen ga et positivt resultat, men direkte kromogen kultur var negativ. Tilstedeværelse av MRSA ble bekreftet i 4 av 9 prøver hvor LightCycler MRSA Advancedtesten ga et negativt resultat, men direkte kromogen kultur var positiv. Tilstedeværelse av MRSA ble bekreftet i 13 av 76 prøver hvor den andre FDA-godkjente NAAT ga et positivt resultat, men LightCycler MRSA Advanced-testen og direkte kromogen kultur ga et negativt resultat. VURDERING AV ANALYTISK YTELSE A. Analytisk sensitivitet Den analytiske sensitiviteten for LightCycler MRSA Advanced-testen ble bestemt ved bruk av 3 stammer MRSA som representerer de tre RE-typene som denne analysen er rettet mot (høyre ekstremitet av SCCmec/orfX-krysset (RE) type 2, 3 og 7). Kulturer fra disse stammene ble kvantifisert, fortynnet til verdier som dekket et område på 100 til 400 koloniformende enheter (CFU) per pensel og absorbert inn i prøvepensler som tidligere var blitt dyppet i ulike transportmedier. Alle fortynninger nær LOD-verdien ble testet i replikater på minst 30. Den deteksjonsgrensen som ble oppnådd for hver stammetype og prøvepenseltype som ble testet, representerer det laveste antallet CFU/prøvepensel der et positivt resultat vil bli oppnådd med minst 95 % sikkerhet. Resultatene indikerer at LightCycler MRSA Advanced-testen vil produsere et positivt resultat med 95 % konfidens for en penselprøve som inneholder 240 CFU. Tabell 10 Påvisning av MRSA i forskjellige transportmedier Prøvepenseltyper CFU/pensel Liquid Stuart-transportmedier 240 Amies-gel uten kulltransportmedier 240 Amies-gel med kulltransportmedier NO 27 Doc Rev. 5.0

28 B. Analytisk spesifisitet Inklusivitet Ytelsen til LightCycler MRSA Advanced-testen for 137 godt karakteriserte MRSA-isolater som er representative for epidemiologiske kloner i USA, er vist i tabell 11. Stammene ble innhentet gjennom Network on Antimicrobial Resistance in Staphylococcus aureus (NARSA) Program, som støttes under NIAID/NIHkontrakt nr. HHSN C, og fra kliniske enheter. Alle stammer ble testet som kulturer ved en konsentrasjon på 10E5 cfu/ml. Alle unntatt 1 isolat testet positivt med LightCycler MRSA Advanced-testen (99,3 %). Tabell 11 MRSA-isolater som er representative for epidemiologiske kloner skaffet gjennom Network on Antimicrobial Resistance in Staphylococcus aureus (NARSA)-programmet og godt bestemte isolater fra kliniske enheter Eksklusivitet USA-type Antall isolater testet Isolater med positive resultater med LightCycler MRSA Advanced-testen * Ikke typbar/ ukjent 5 5 Totalt (99,3 %) *Av de 54 stammene av type USA 100 som ble testet, var en stamme (NRS642) negativ ved LightCycler MRSA Advanced-testen. Spesifisiteten for LightCycler MRSA Advanced-testen ble evaluert ved testing av kryssreaktivitet overfor patogene organismer og overfor kontaminanter som potensielt er til stede i normal nasal mikroflora. Testede arter bestod av 13 virale, 66 bakterielle og 7 sopp-species som angitt i tabell 12. Mikroorganismene ble testet enten som kulturer i konsentrasjoner på 10E6 til 10E7 cfu/ml eller som genomiske DNA-preparater i konsentrasjoner på 10 pg/pcr. I tillegg ble humant DNA i en konsentrasjon på 5 ng/reaksjon testet. Humant DNA og alle arter som ble testet, ble funnet negative overfor MRSA med LightCycler MRSA Advanced-testen NO 28 Doc Rev. 5.0

29 Tabell 12 Arter testet for kryssreaktivitet med LightCycler MRSA Advanced-testen Arter Staphylococcus aureus (MSSA) Haemophilus influenzae Staphylococcus cohnii ssp. cohnii Haemophilus parainfluenzae Staphylococcus epidermidis Herpes simplexvirus 1 Staphylococcus haemolyticus Humant DNA Staphylococcus hominis Influenza A (H1N1), A (H3N2) Staphylococcus intermedius Influensa type B Staphylococcus lugdunensis Issatchenkia orientalis (Candida krusei) Staphylococcus pseudointermedius Klebsiella pneumoniae ssp,ozeanae Staphylococcus saprophyticus Kocuria kristinae Staphylococcus schleiferi ssp. coagulans Kytococcus schroeteri Staphylococcus sciuri Lactobacillus delbrueckii ssp. delbrueckii Staphylococcus simulans Legionella pneumophila Staphylococcus warneri Metapneumovirus Staphylococcus xylosus Microbacterium testaceum Acinetobacter baumannii Micrococcus luteus Actinobacillus actinomycetemcomitans Moraxella catarrhalis Actinomyces odontolyticus Morganella morganii Adenovirus 7A Mycobacterium avium Aerococcus urinaeequi Mycoplasma pneumoniae Aspergillus fumigatus Mycoplasma salivarium Bacteroides fragilis Neisseria meningitidis Bacteroides uniformis Oerskovia jenensis Bacteroides vulgatus Parainfluensa 1 Bordetella bronchioseptica Parainfluensa 2 Bordetella parapertussis Parainfluensa 3 Bordetella pertussis Parvimonas micra (Peptostreptococcus micros) Burkholderia cepacia Peptostreptococcus stomatis Candida albicans Peptostreptococcus anaerobius Candida glabrata Planococcus maritimus Candida parapsilosis Proteus mirabilis Candida tropicalis Proteus vulgaris Citrobacter freundii Pseudomonas putida Coronavirus Pseudomonas aeruginosa Corynebacterium glutamicum Respiratorisk syncytialt virus (RSV A, B & A2) Corynebacterium amycolatum Rhinovirus Corynebacterium jeikeium Rhodococcus equi Cryptococcus neoformans Rothia mucilaginosa Eikenella corrodens SARS Enterococcus faecalis Streptococcus agalactiae Enterococcus faecium Streptococcus pneumoniae Enterovirus Streptococcus pyogenes Escherichia coli Streptococcus viridans Finegoldia magna (Peptostreptococcus magnus) Veillonella atypica Haemophilus aphrophilus Manglende kryssreaktivitet ble observert for 100 % av de testede organismene. I tillegg ble 117 isolater av meticillinresistente koagulasenegative stafylokokker, 104 isolater av meticillinsensitive koagulasenegative stafylokokker og 100 isolater av meticillinsensitiv Staphylococcus aureus skaffet fra forskjellige europeiske sentre og testet ved konsentrasjoner på 10E4 til 10E5 cfu/reaksjon. Alle tilleggsstammer testet negativt med LightCycler MRSA Advanced-testen NO 29 Doc Rev. 5.0

30 Reproduserbarhet En panel av prøver med varierende konsentrasjoner av MRSA og meticillinsensitive Staphylococcus epidermidis (MSSA) ble testet. To operatører på hvert av 3 steder utførte en analyseserie hver daglig i 5 dager på tre reagenssett (4 prøver x 3 replikater x 5 dager x 3 steder x 3 sett x 2 operatører). Det ble brukt et panel på 12 prøver av meticillinresistente Staphylococcus aureus (MRSA)-stammen ATCC fortynnet til konsentrasjoner som vist i tabell 13. Meticillinsensitive Staphylococcus epidermidis (MSSE) ATCC stamme ble inkludert i hver panelprøve ved konstant nivå for å oppnå en passende prøvekjerne. Panelet omfattet negative prøver, under LOD (20 CFU/pensel var forventet å gi en positiv frekvens mellom 30 og 70 %), svakt positive (300 CFU/pensel) og positive (800 CFU/pensel). Den negative panelprøven ga negative resultater fra et lavt 99 % til 100 %, LOD panelprøven under sin positive frekvens varierte fra 42 % til 47 %, den svakt positive panelprøvens positivitetsfrekvens varierte fra lavt 99 % til 100 %, og den positive panelprøvens positivitetsfrekvens varierte fra lavt 99 % til 100 % avhengig av sted. Tabell 13 Oppsummering av reproduserbarhetsresultater MRSA CFU/ pensel Prøvetype T M Gjennomsnitt ( C) T M Standardavvik T M CV (%) 0 Negativ n/a n/a n/a 20* 300 Under LOD Svakt positiv 59,56 0,22 0,4 59,48 0,20 0,3 800 Positiv 59,43 0,21 0,3 Lot Lot til lot Sted til sted Dag til dag Antall/ antall testet % Sted Antall/ antall testet % Dag Antall/ antall testet 1 90/ % 1 90/ % 1 53/54** 98 % 2 90/ % 2 89/90** 99 % 2 54/ % 3 89/90** 99 % 3 90/ % 3 54/ % 4 54/ % 5 54/ % 1 52/90 58 % 1 38/90 42 % 1 25/54 46 % 2 30/90 33 % 2 41/90 46 % 2 26/54 48 % 3 39/90 43 % 3 42/90 47 % 3 22/54 41 % 4 25/54 46 % 5 23/54 43 % 1 90/ % 1 89/90 99 % 1 53/54 98 % 2 89/90 99 % 2 90/ % 2 54/ % 3 90/ % 3 90/ % 3 54/ % 4 54/ % 5 54/ % 1 90/ % 1 90/ % 1 53/54** 98 % 2 90/ % 2 89/90** 99 % 2 54/ % 3 89/90** 99 % 3 90/ % 3 54/ % 4 54/ % 5 54/ % Merk: *Konsentrasjon som gir omtrent 30 til 70 % positive resultater. **Det var en tilsynelatende transposisjon av en positiv og en negativ prøve plassert ved siden av hverandre i samme analyseserie. Hvis disse prøvene ble ekskludert fra analysen, var resultatene fra reproduserbarhet for lot til lot, sted til sted og dag til dag 100 %. Smitte / krysskontaminering Det ble utført en analytisk studie for å vurdere potensialet for krysskontaminering mellom høykonsentrerte MRSA-prøver og MRSA-negative prøver som ble behandlet samtidig gjennom hele arbeidsprosessen for LightCycler MRSA Advanced-testen. For hver av de fem komplette analyseseriene som ble utført av to operatører (inkludert arbeid med prøvepreparering), ble femten penselprøver tilsatt 3,3 x 10E5 cfu av MRSA RE2 type, og femten penselprøver var uten tilsetning. Høye positive og negative penselprøver ble alternert gjennom prøveprepareringen, PCR-prepareringen og deretter plassert i LightCycler 2.0-instrumentet for PCR-testing. Det ble ikke observert noen falskt positive resultater som skyldtes krysskontaminering ved testing ved en konsentrasjon på 3,3 x 10E5 cfu/penselprøve. % NO 30 Doc Rev. 5.0

31 REFERANSER 1. Kuehnert MJ, et al. Prevalence of Staphylococcus aureus nasal colonization in the United States, JID 2006; 193: Wyllie DH, et al. Mortality after Staphylococcus aureus bacteraemia in two hospitals in Oxfordshire, : cohort study. BMJ. 2006; 333 (7562): Pinho MG, Filipe SR, de Lencastre H, Tomasz A Complementation of the essential peptidoglycan transpeptidase function of penicillin-binding protein 2 (PBP2) by the drug resistance protein PBP2A in Staphylococcus aureus.: J Bacteriol Nov; 183(22): Berglund C, Ito T, et al. Novel type of staphylococcal cassette chromosome mec in a methicillinresistant Staphylococcus aureus strain isolated in Sweden. Antimicrob Agents Chemother 2008 Oct; 52(10): Cosgrove SE, et al. Comparison of Mortality Associated with Methicillin-Resistant and Methicillin- Susceptible Staphylococcus aureus Bacteremia:A Meta-analysis. CID 2003:36, Engemann JJ, et al. Adverse clinical and economic outcomes attributable to methicillin resistance among patients with Staphylococcus aureus surgical site infection. Clin Infect Dis. 2003; 36(5): Abramson MA, et al. Nosocomial methicillin-resistant and methicillin-susceptible Staphylococcus aureus primary bacteremia: at what costs? Infect Control Hosp Epidemiol. 1999; 20(6): Muto CA, et al. SHEA guideline for preventing nosocomial transmission of multidrug-resistant strains of Staphylococcus aureus and Enterococcus. Infect Control Hosp Epidemiol. 2003; 24(5): Association for Professionals in Infection Control & Epidemiology, Inc (APIC). National prevalence study of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in U.S. healthcare facilities. Executive summary. June 25, Klevens RM, et al. Invasive methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections in the United States. JAMA. 2007; 298(15): Witte W. Nosocomial and community MRSA infections. EH ONLINE. Accessed November 7, Calfee DP, et al. Strategies to prevent transmission of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in acute care hospitals. Infect Control Hosp Epidemiol. 2008; 29(suppl 1):S62 S Richmond, J.Y. and McKinney, R.W. eds Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. HHS Publication Number (CDC) Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Protection of Laboratory Workers from Occupationally Acquired Infections. Approved Guideline-Third Edition. CLSI Document M29-A3. Wayne, PA:CLSI, International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 51 st Edition NO 31 Doc Rev. 5.0

32 Informasjon om dokumentrevisjon Doc Rev /2011 Avsnittet TRANSPORT OG OPPBEVARING AV PRØVER er revidert for å ta med at prøver tatt med Liquid Stuart-prøvepensler er stabile ved 15 til 25 C i opptil 5 dager, ved 2 til 8 C i opptil 5 dager, ved -15 til -25 C i opptil 1 måned. Dette avsnittet er også revidert for å ta med at prøver tatt med Amies-gelpensler (med eller uten kull) er stabile ved 15 til 22 C i opptil 4 dager. Avsnittene OPPBEVARING OG HÅNDTERING, KLARGJØRING AV PREPARERTE PRØVER OG KONTROLLER og PREPARERING AV PRØVER OG KONTROLLER er revidert for å angi at behandlede prøver og negative kontroller preparert fra Liquid Stuart-prøvepensler og Amies-gelpensler (med eller uten kull) er stabile i opptil 1 dag ved 15 til 25 C eller i opptil 5 dager ved 2 til 8 C eller i opptil 12 måneder ved -15 til -25 C. Avsnittet KLINISK YTELSE er revidert med en ekstra tabell med sammenligning av LightCycler MRSA Advanced-testen, den andre FDA-godkjente NAAT og direkte kultur. Doc Rev /2011 Avsnittet OPPBEVARING OG HÅNDTERING og avsnittet KLARGJØRING AV REAGENSER er revidert for å vise at: Working Master Mix må tillages ferskt og brukes innen 24 timer etter tillaging. Hvis det ikke brukes umiddelbart etter tillaging, må Working Master Mix oppbevares beskyttet mot lys ved 2 til 8 C i inntil 24 timer. Kontakt din lokale Roche-representant om du har noen spørsmål NO 32 Doc Rev. 5.0

33 LightCycler Advanced-lyseringskit og LightCycler MRSA Advanced-testen produsert av: Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ USA Medlem av Roche-gruppen Roche Diagnostics (Schweiz) AG Roche Diagnostics Industriestrasse 7 201, boulevard Armand-Frappier 6343 Rotkreuz, Switzerland H7V 4A2 Laval, Québec, Canada (For Technical Assistance call: Roche Diagnostics GmbH Pour toute assistance technique, Sandhofer Straße 116 appeler le: ) Mannheim, Germany Roche Diagnostics Roche Diagnostics S.L. 2, Avenue du Vercors Av. de la Generalitat, Meylan, France E Sant Cugat del Vallès Barcelona, Spain Distributore in Italia: Roche Diagnostics S.p.A. Roche Diagnostica Brasil Ltda. Viale G. B. Stucchi 110 Av. Engenheiro Billings, Monza, Milano, Italy Jaguaré, Building São Paulo, SP Brazil Distribuidor em Portugal: Roche Sistemas de Diagnósticos Lda. Estrada Nacional, Amadora, Portugal ROCHE, LIGHTCYCLER, FASTSTART, MAGNA LYSER, MRSA ADVANCED, LC og AMPERASE er varemerker som tilhører Roche. ROCHE RESPONSE CENTER er et servicemerke som tilhører Roche. BD CULTURESWAB er et varemerke for Becton, Dickenson and Company. BEPANTHEN er et varemerke for Bayer Healthcare. BRIJ er et varemerke for Croda International, PLC. COPAN TRANSYSTEM er et varemerke for Copan Diagnostics, Inc. INFECTOPYODERM er et varemerke for Infectopharm GmbH. KWIK-STIK er et varemerke for MicroBioLogics, Inc. MICROSOFT, WINDOWS, VISUAL STUDIO og SQL SERVER er varemerker for Microsoft. OTRIVEN er et varemerke for Novartis. TURIXIN er et varemerke for GlaxoSmithKline. Cyaninfargestoffene i dette produktet er underlagt patentrettighetene for GE Healthcare Bio-Sciences Corp. og Carnegie Mellon University og er lisensiert til Roche utelukkende for innlemmelse i forskningskomponenter og in vitro-diagnostiske kit. Enhver bruk av slike kit til annet formål enn forskning eller in vitrodiagnostikk krever underlisenser fra GE Healthcare Biosciences Corp., Piscataway, New Jersey, U.S.A. og Carnegie Mellon University, Pittsburgh, Pennsylvania, USA. Copyright Roche Molecular Systems, Inc. Med enerett. 05/2011 ( ENGL) Doc Rev NO 33 Doc Rev. 5.0