Genetic characterisation of Flavobacterium psychrophilum isolates from Norway and Chile Patricia Apablaza Fiskesykdomsgruppen Institutt for biologi Universitet i Bergen FriskFisk konferanse Bergen, februar 2013
Oversikt 1. F. psychrophilum - bakgrunn 2. Mål 3. Genetisk variasjon av F. psychrophilum - PhD 4. Metoder 5. Resultater 6. Konklusjoner
1. Bakgrunn - F. psychrophilum Aerob Rett eller bøyde staver Vekst: 4 23 C, 0.8% NaCl gule kolonier Overlever lengre in ferskvann Danner biofilm ved suboptimale forhold RTFS (Rainbow Trout Fry Syndrome), akutt, vinter- septikemi, høy dødelighet Bilde: Asbjørn Dyrkorn Løland BCWD (Bacterial Cold Water Disease), kronisk, vinter- smolts, sår, lavere dødelighet
Laks ferskvann
Regnbuetørret sjøvann
2. Mål for PhD Hoved: Genetisk karakterisering av F. psychrophilum isolater fra vill og oppdrettslaks fra Norge og oppdrettslaks fra Chile, for å identifisere mulige genetisk variasjon og geografisk fordeling Delmål: Å finne genetiske markører for å skille isolater av F. psychrophilum med forskjellige virulens Kartlegging av viktige reservoar og smitterute for utvalgt isolater av F. psychrophilum
3. Genetisk variasjon F. psychrophilum (art) har forskjellige genetiske varianter som kan gi virulens forskjeller mellom isolater Genotyping er viktig for å separere varianter for: - Implementeres i produksjon - sporbarhet i smitteruter - bruke i risikoanalyse ved virulensforskjeller Metoder for genotyping: a) Multi Locus Sequence Typing (MLST) - Housekeeping gener b) Variable Number Tandem Repeats (VNTR), mikrosatetiler
4. Metoder Isolater fra Norge Isolater fra Chile * kun oppdrettslaks Eira Vosso Rogaland Smøla Osterøyfjord Antuco Melipeuco Curarrehue Hornopiren Rupanco Valdivia Llanquihue Puerto Cisnes Puerto Montt Panguipulli Chinquihue Quillaipe Quellon
Prøver wounds Spleen Vann - biofilm
Metoder Isolater: 18 (15 vill, 3 oppdrettslaks) F. psychrophilum fra Norge + 25 fra oppdrettslaks fra Chile + T.S. = 44 Dyrkning FLPA (24-72 t, 15 C) Gule Kolonier (fenotyping med morfologi, biokj. karakk.) DNA ekstraksjon Verifisering med 16S rrna seqvensering
Resultater Differensiering av isolater 16S => art nivå Housekeeping gener (tuf, trpb, murg, gyrb, fumc, dnak and atpa) Seqvensering MLST + 50 isolater Nicolas et al. 2008 = 96 Fylogeni
Resultater MLST (HK) Ja87-47-Ay-K; Ja87-46-Ay-K, ST1 No09-32-As-G, ST28 No10-43-As-K, ST27 Dn91-25-Rt-Sp, ST26 Fr98-24-Rt-K, ST25 Ch10-14-Rt-G, ST24 Ch10-18-Rt-G, ST23 Ch09-13-As-W, ST22 No10-34-T-G, ST21 Ch96-51-Rt-Sp; Gr95-49-Rt-Sp Ch06-1-Rt-E; Ch10-21-Rt-W ST20 Ch10-22-As-nd; Ch07-23-As-E-I Ch10-16-Rt-G, ST19 Ja92-32-Rt-K; Ja92-33-Rt-K, ST18 Is98-31-Rt-Sp, ST17 Ch07-3-As-E; Ch09-12-Rt-W ST16 Ch07-7-As-E Ch07-9-Rt-E-I, ST15 Us93-35-Rt-Sp, ST14 Ch07-24-Rt-E-I, ST13 Us95-34-Rt-nd, ST12 Sc91-29-Rt-Sp; Us91-28-Rt-K ST11 Sp91-30-Rt-L Fr86-27-Rt-K, ST10 Ch01-44-Cs-K Ch07-2-As-E; Ch07-20-Rt-E-I Ch08-8-As-E; Ch08-11-As-E ST9 Ch08-19-As-E; Ch09-6-As-E-I Fr03-43-T-ML, ST8 Ch08-10-Rt-E-I, ST7 No09-28-Rt-K; No11-45-As-W Fr88-42-Rt-Sp; Fr98-40-Rt-DL ST6 Fr99-37-Rt; Fr99-39-Rt-K Sw93-22-Rt-Sp; Dn90-38-Rt-Sp Fr99-45-Rt-Sp, ST5 Gr89-36-Rt-L, ST4 Us95-26-Rt-K, ST3 Ch10-25-nd-Sp, ST2 No09-26-As-K; No09-31-As-Eg, ST29 4.0 Ta91-1-As-EF; Ta91-2-As-EF Ta91-3-As-EF ST53 Us90-4-As-K, ST52 Fr92-5-Ca-G, ST51 Fr92-6-Te-K, ST50 No09-29-As-nd; No10-42-As-K No10-38-As-W; No10-39-As-W ST49 No10-44-As-M, ST48 Fr00-7-Rt, ST47 Fr95-8-Te Gr90-9-Te-L; Gr90-10-Te-Sp ST46 Us90-11-Cs-K; Bc84-13-Cs-K Ch01-12-Cs-Sc ST45 NCIMB1947; NCIMB1947, ST44 Ja84-14-Cs-K, ST43 No09-27-As-SK; No09-33-As-G No10-35-T-W; No10-36-T-W ST42 No10-37-T-W Ja90-15-Cs-PL, ST41 Ch10-15-As-F, ST40 Ch08-17-Rt-E, ST39 Ch07-4-Rt-E-I, ST38 Gr87-16-Ee-K Fr98-17-Ee-K ST37 No96-18-Rt-K; Ch09-5-Rt-E, ST36 No09-30-T-Sp, ST35 Gr90-19-Ca-Sp, ST34 Us86-21-Ct-K, ST33 Sw93-57-Rt-Sp, ST32 Fr97-20-T-K, ST31 Us81-23-CHs-K, ST30 Varianter i samme fiskelanlegg Grupper med lik isolater - Fra samme og forskjellig land - Fra samme og forskjellig fiske art
No10-44-As-M Gr95-49-Rt-Sp No10-38-As-W; No10-42-As-K Gr90-10-Te-Sp Fr97-20-Bt-K Us95-34-Rt Fr03-43-Bt-ML Fr98-17-Ee-K Gr90-9-Te-L Ch09-6-As-E-I;Ch08-19-As-E Bc84-13-Cs-K Fr99-39-Rt-K Ch10-18-Rt-G Fl. frigidarium NCIMB 13737 Fr92-5-Ca-G Ch01-12-Cs-Sc No10-36-T-W;No09-33-As-G Ja87-46-Ay-K No09-30-St-Sp Ch08-8-As-E;Ch07-2-As-E Ch07-7-As-E;Ch10-22-As-nd Ja84-14-Cs-K Gr89-36-Rt-L Fr-99-37-Rt Dn90-38-Rt-Sp Sp91-30-Rt-L Ta91-1-As-EF Fr99-45-Rt-Sp Sw93-22-Rt-Sp Gr87-16-Ee-K Ch09-13-As-W Fr92-6-Te-K Ch08-17-Rt-E NCIMB1947-Us-Cs-K No09-27-As-SK Ch96-51-Rt-Sp Ch10-15-As-F;NCIMB1947 Us90-11-Cs-K Fr98-40-Rt-DL Ch08-11-As-E Ta91-2-As-EF Us81-23-CHs-K Sw93-57-Rt-Sp Ta91-3-As-EF Ja90-15-Cs-PL No10-39-As-W;No09-29-As-nd Fr00-7-Rt Dn91-25-Rt-Sp Fr86-27-Rt-K No10-43-As-K;No09-32-As-G Ch08-10-Rt-E-I;Ch07-20-Rt-E-I No11-45-As-W;No09-28-Rt-K Fr95-8-Te Ch09-5-Rt-E Ch10-25-nd-Sp;Ch10-14-Rt-G No96-18-Rt-K Us95-26-Rt-K Is98-31-Rt-Sp No10-34-T-G Sc91-29-Rt-Sp Ja92-33-Rt-K No10-37-T-W;No10-35-T-W Fr98-24-Rt-K Us91-28-Rt-K Ch01-44-Cs-K Ja87-47-Ay-K Fr88-42-Rt-Sp Gr90-19-Ca-Sp Us86-21-Ct-K Ch07-4-Rt-E-I;Ch07-9-Rt-E-I Ja92-32-Rt-K No09-31-As-Eg;No09-26-As-K Us93-35-Rt-Sp Us90-4-As-K 90 67 68 Ch07-23-As-E-I Ch07-3-As-E; Ch10-21-Rt-W Ch10-16-Rt-G;Ch09-12-Rt-W Ch06-1-Rt-E;Ch07-24-Rt-E-I 100 gyrb-i gyrb-iii gyrb-iv gyrb-v gyrb-ii 100 Resultater Fylogeni gyrase B Oppdretslaks-vill
6. Konklusjoner F. psychrophilum ser ut som vanlig bakteria i will laks i Norge flere forskjellige isolater Flere genetiske varianter kan finnes i samme sted Betydelig variasjon i housekeeping gener, men ikke nok for å separare isolater Lignende isolater i flere land => Smitte gjennom transport av laks foster Forskjellige art kan være vert for lignende isolater (laks - rb) F. psychrophilum har vært oppdraget i forbindelse med sykdom i regnbueørret i full sjøvann
Variable Number of Tandem Repeats VNTRs of F. psychrophilum isolater fra Norge og Chile - Vector NTI 9 5 6 9 4 4 5 6 - Kort sekvenser som gjentas (AATCTG) - Forskjellig nummer av repetisjoner i forskjellige isolater => Genetisk markør