RNA interferens et nyoppdaget immunforsvar og et nytt genteknologisk verktøy

RNA interferens et nyoppdaget immunforsvar og et nytt genteknologisk verktøy Da Edward Jenner smittet en liten engelsk gutt med kukopper i 1796 håpet han å bevise at vaksinering virket mot det dødelige kopperviruset. I dag, 200 år etterpå, går vi alle rundt med arr etter de store vaksineprogrammene. Nå er et nytt immunforsvar oppdaget, kalt RNA interferens (RNAi), noe som gir oss muligheten til å skru av gener like enkelt som vi i dag vaksinerer barn mot meslinger eller røde hunder. Dette fenomenet har også gitt oss innsikt i de naturlig forekommende RNA-mediert genregulering som en ny type epigenetisk regulering av genuttrykking. Ennå er det for tidlig å si hvilke konsekvenser dette vil få, men mulighetene synes store. mangler Å skru av et gen kan virke litt komplisert og fjernt, så la oss først se på hva som skjer når man injiserer en vaksine inn i armen på en skolegutt eller et spedbarn. Proteinene i vaksinen er tatt fra sykdomsbakterier eller virus. Når kroppen lærer disse proteinene å kjenne, vil de kunne gjenkjenne bakteriene og virusene som bærer dem og dermed kunne nedkjempe sykdommen. Dette skjer i flere trinn (Figur 1). Først blir vaksine-proteinet spist og delt opp i mange biter av celler i immunforsvaret. Disse immun-cellene kommer i mange varianter. Noen er enkle patruljerende politimenn (eller Askeladder kanskje), som plukker opp og tar vare på alt rusk og rask de kommer over. De kalles antigen-presenterende celler, der antigenet er det proteinet som skal generere et antistoff, som igjen er det stoffet som spesifikt kan binde bakterier og virus. Offiserer i hæren av immunceller inspise-

Naturen nr. 4 2004 53 slikt. At lymfeknutene er hovne og såre er fordi de er fulle av immunceller som vokser og deler seg. Når det er puss i et sår er dette massive tilstimlinger av hvite immunceller. Figur 1. Et enkelt skjema for immunrespons mot invaderende antigener eller for vaksinering mot en sykdom. rer patruljerende fotsoldater og kikker på antigenene de holder opp. Dersom offiserene oppdager et rusk eller et rask de ikke har sett før, setter de i gang masseproduksjon av antistoffet mot akkurat dette antigenet. Elegant nok gjøres dette ved at de cellene som binder best til det invaderende proteinet blir stimulert til å dele seg. Slik blir darwinistisk seleksjon brukt også hver dag inne i kroppene våre. Så et enkelt skjema for sykdomsbekjempelse ved vaksinering er: 1) Et fremmed protein blir delt i biter og husket for fremtidig bruk. 2) Ved en infeksjon vil cellene som kan binde seg til proteinbitene stimulert til å formere seg voldsomt. 3) Så blir antistoffene mot det fremmede antigenet sprøytet ut overalt der invasjonen er detektert. For oss som pasienter kan dette merkes hver gang vi er syke ved at masse slim og snørr begynner renne. Dette er, mellom annet, antistoffer som skal binde og uskadeliggjøre bakterier. Overalt i kroppen skjer Nytt immunforsvar oppdaget 200 år etter Jenner Immunforsvaret er egentlig uhorvelig komplisert og man kan bruke hele livet på å studere dets kompleksiteter. Det klassiske immunforsvar har vi utforsket i over 200 år, og nylig, i 1998, oppdaget en amerikansk forsker ved navn Andrew Fire et revolusjonerende nytt immunforsvar i en liten jordorm ved navn C. elegans. Eksperimentet Fire og hans kollegaer gjorde er såpass elegant at det fortjener en ekstra kikk. Selv om C. elegans bare er 1 mm lang, og bare har 959 celler der mennesket har ca. 10 000 000 000 000 celler, så har C. elegans omtrent 19 000 gener, der mennesket har ca. 30 000. Den lille ormen er med andre ord forbausende avansert, genetisk sett. I alle fall har den overraskende mange gener. Så et viktig spørsmål er å finne ut hva disse genene gjør. En måte å gjøre dette på er å ødelegge genene med mutasjoner. Men det Andrew Fire drev med var å prøve skru dem av ved å injisere komplementær RNA, også kalt antisense RNA. Denne måten å skru av gener på skal vi kikke litt nærmere på. En glidelås i vranglås Vårt arvestoff kan ligne på en glidelås, der hver tann i glidelåsen inneholder informasjon. Glidelåsen, eller DNA, kan enkelt kopieres ved å åpne den, og så bygge en ny glidelås ved å sette tann etter tann etter tann (Figur 2). En slik kopiering kan brukes til å lage ny DNA og nye kromosomer, dersom cellen skal dele seg eller organismen skal

Naturen nr. 4 2004 54 Figur 2. DNA blir kopiert, tann for tann, til ny DNA eller RNA-kopier. formere seg. Kopieringen kan også brukes til å lage RNA kopier til eget bruk (kalt mrna, for messenger RNA), slik vi kopierer sider ut av en bok på biblioteket. Det er disse mrna, som koder for proteinene, som gjør mesteparten av arbeidet i cellene. Som glidelåser flest kan både DNA og RNA gå i vranglås dersom noe rusk havner i maskineriet (Figur 3). Ideen til Andrew Fire var å pøse cellen full av kunstige glidelåskopier, her RNA, som passet perfekt til de genene han var interessert i. Da kunne han blokkere produksjonen av et spesifikt protein, og dermed på en måte skru av genet. Dette er egentlig en gammel ide fra tidlig 1980-tall, og mange forskjellige typer antisense-molekyler hadde blitt prøvd ut, men ingen hadde helt hadde fått det til å fungere særlig bra. Andrew Fire fikk heller ikke til noen sterke effekter, men mens han holdt på med sine eksperimenter oppdaget han noe mystisk og merkelig. I et eksperiment så tar man med kontrolleksperimenter som ikke skal virke, såkalte negative kontroller. Dette for å være sikker på at ikke noe uventet skal skje. Andrew Fire tenkte som så at dersom hans komplementære RNA ville blokkere mrna, så ville injisert komplementær RNA sammen Figur 3. Cellenes maskiner, proteinene, blir bygget bit for bit (aminosyre for aminosyre) etter instruksjoner i mrna. Dersom man kan blokkere mrna, vil man blokkere et gen. med kunstig mrna ha ingen virkning (fordi den selv ville være blokkert), noe som da ville sees som en kontrast til den relativt svake effekten han forventet. Så han injiserte dobbelt-trådet RNA som en kontroll. Siden denne dobbelt-trådete RNA ikke altså har noen tenner ledig, var det ikke ventet at den skulle kunne blokkere noen tenner i gen-kopien mrna. Det var da de så den dramatiske effekten. Som så mange ganger før hadde Andrew Fire oppdaget noe oppsiktsvekkende nytt ved et uhell. Kontroll-eksperimentet så ut til å være fantastisk mye mer effektivt enn eksperimentet selv. Dobbelt-trådet RNA, som på en måte var blokkert av seg selv, skrudde av genet mye mer effektivt enn komplementær- RNA. I begynnelsen, i 1998, visste ingen hvordan dette fungerte, men Andrew Fire døpte denne effekten RNA interferens, siden den stopper gen-uttrykk på RNA-nivå. Der det klassiske immunforsvar gjenkjenner (og får ødelagt) strukturer i invaderende bakterier og virus, gjenkjenner RNA interferens sekvenser eller ord nede på det mer fundamentale genom-nivået. Man har de siste 6 årene opp-

Naturen nr. 4 2004 55 daget at RNA interferens er et komplisert immunforsvar som kan lese bokstavene og ordene i genenes bok, og sensurerer de ordene det ikke liker. Dette gjør man så forbausende enkelt som ved å sprøyte inn dobbelt-trådet RNA i celler. Cellen selv skrur så av det ene genet som er kodet for i det kunstige RNA. Dette fungerer nesten overalt der man har prøvd det. Ikke bare i små ormer, men i planter, i bananfluer, i edderkopper, i sopp, i mus og mennesker. Metoden er enkel og storartet effektiv og har skapt noe av en sensasjon i vitenskapens verden. I 2002 kåret de to største vitenskapsjournalene Science og Nature RNA interference til årets nyhet. RNA interferens sloss mot virus Men hvorfor skulle den lille ormen ville skru av gener? Antagelig så er det slik at gener blir skrudd av bare som en bieffekt. Cellene i den lille ormen tror nemlig at den er blitt angrepet av virus, og på samme måte som vi begynner å produsere slim, hoster og harker, så skrur ormen på RNA interferens for å komme viruset til livs. Og hvordan kan RNAi stoppe et virus? Figur 4. RNA interferens kan stoppe virus, transposoner og cellens egne gener. Dobbelt-trådet RNA (dsrna) blir gjenkjent av cellen og kuttet opp i småbiter (sirna) av proteinet Dicer. Disse blir så brukt av proteinkomplekset RISC (RNA Induced Silencing Complex) til å finne RNA med tilsvarende sekvens og ødelegge disse. Ved å introdusere syntetiske sirna, for eksempel ved sirna transfektering, kan man manipulere cellen til å ødelegge mrna, og dermed skru av gener.

Naturen nr. 4 2004 56 Grunnen til dette ligger i at gener og virus ligner svært mye på hverandre. Dobbelttrådet RNA blir oppfattet som et invaderende virus liksom vaksinens proteiner blir oppfattet som en bakterieinfeksjon og delt opp i små biter. Disse små bitene blir så brukt til å gjenkjenne virus-arvestoffet og ødelegge dette (Figur 4). Et godt eksempel på hvordan RNAi allerede har blitt brukt mot farlige sykdomsvirus, kommer fra AIDS-forskningen. AIDS er i dag en av de største ulykker i verden. AIDS betyr Aquired Immune-Deficiency Syndrome. Selve immunforsvaret blir sykt og faller sammen. Dette fører til at vi blir forsvarsløse overfor alle de organismer som vokser rundt oss, på oss og inne i oss. Grunnen til at det er så vanskelig å stoppe AIDS selv om vi nå har lykkes godt i stoppe selve spredningen i den vestlige verden først og fremst grunnet moderne immunologisk- og genteknologisk forskning er fordi virus er parasitter som lever inne i cellene våre. Enkelte virus, slik som HIV, viruset som gir AIDS, kopierer seg faktisk inn i selve arvematerialet vårt i cellene som bygger opp kroppen vår. Senere begynner viruset å sende ut kopier av seg selv ved å bygge nye partikler. Det kan minne om koloniseringen av Stillehavet. Små, skjøre kanoer krysset enorme havstrekninger mellom et par av de tusenvis av øyer som finnes. Stormer, vannmangel og sult drepte mange, men når en øy først var kolonisert var den en usynkelig base og ble en base for bygging av nye kanoer videre spredning av mennesker, helt til man etter tusenvis av år nådde frem til fjerne plasser som Hawaii og Påskeøya. Det klassiske immunforsvaret kan prøve stoppe nye virus-partiklene fra å spre seg videre, men viruset selv sitter nå trygt plassert i kjernen av cellene. Moderne medisiner mot AIDS hindrer på samme måte viruset fra å spre seg, ved å hindre proteinene i viruset å fungere skikkelig. Men er det ingen mulighet til å gjøre noe med viruset selv. Det har nemlig blitt en del av selve arvestoffet vårt. Livets bok er overalt skrevet i 4 enkle bokstaver (eller glidelåstenner) Arvestoffet DNA er forbausende likt en bok skrevet i fire bokstaver. Slik kan det se ut: TGGCCGGCGCTTCAGGCACTA- CAAATACTG Dette er en sekvens-bit av koden for det genet som blir skrudd på når du får en rift i fingeren, nemlig Tissue Factor (TF), utløseren av blod-størkning. Her, på den andre side, har du noe av koden for HIV-viruset: TAATTAGGTCTGAAAATTTCACG- GACAA Dersom du ikke klarer å se noe særlig forskjell, så er du enig med de fleste av oss. Alle levende ting, fra bakterier via 100 meter høye sequoia-tre og honningbier til mennesket selv, bruker disse fire bokstavene. Ja, selv semi-levende ting som virus bruker DNA til å bære instruksjonene til å lage nye kopier av seg selv. Og hemmeligheten til liv er som kjent å kopiere seg selv. Jim Watson og Francis Crick oppdaget hvordan arv blir kodet i DNA allerede for 51 år siden. Men noe er å oppdage og kartlegge et digert kontinent. Noe helt annet er å dyrke opp prærien, bygge en jernbane tvers over landet, eller reise skyskrapere som World Trade Center. Først i år 2000 klarte vi å lese hele det enorme arvestoffet i mennesket, men ennå har vi bare sett kystene og enkelte smale elver i dette enorme kontinentet av sekvenser. Det gikk mange hundre år fra Manhattan ble solgt for 24 dollar til det ble nervesenteret i vår sivilisasjon. Så selv om vi i dag kjenner genenes sekvenser, så forblir de nesten like utilnær-

Naturen nr. 4 2004 57 melige som fjerne stjerner. Det som oppdagelsen av RNA interferens plutselig har gitt oss, er et verktøy til å manipulere sekvensene i arvestoffet, både til å forstå genene bedre, men også til å gjøre inngrep der det måtte være nødvendig. Som en bonus får vi muligheten til å stoppe virus, siden virus og gener altså er grunnleggende sett like. RNA interferens kan stoppe HIV og andre virus Men dette blir kanskje litt for billedlig og svulstig for de mer praktiske av oss, så la oss derfor ta et praktisk eksempel fra AIDSforskningen. I begynnelsen fikk man ikke til RNA interferens i mennesker og andre pattedyr. I fluer og ormer, ja visst, men ikke i mennesker. Først da tyskeren Thomas Tuschl i 2001 lagde små syntetiske RNA, kalt sirna (short interfering RNA) kunne man forske på menneskeceller (Figur 4). Likevel, det var et problem å få levert disse syntetiske sirna dit de skulle virke, inne i celler. Løsningen på problemet var å manipulere celler til å produsere slike sirna selv, og ett av de mest dramatiske demonstrasjonene i 2002 var at man klarte stoppe HIV-virus. Ved å dyrke opp HIV-virus, og tilsette disse til menneskeceller dyrket i skåler, vil man vanligvis se at virusene sprer seg. Men de cellene som John Rossi og kollegaer hadd fått til å uttrykke sirna mot HIV-viruset stoppet spredningen av virussekvensene. Senere har flere grupper gjort lignende eksperimenter, og mange ulike virus, som poliovirus, RSV og hepatitt er blitt uskadeliggjort, selv om det ennå bare er gjort i enkle celle-kulturer. Det er ennå langt igjen til at vi kan lage medisiner mot virus basert på RNAi, men i prinsippet er dette er et kraftig og meget generelt våpen mot sykdommer. Og ikke bare virus-sykdommer, men av sykdommer som kommer av feilfungerende gener. Eksempler på dette har vi fått i dusinvis av artikler som viser stopping av kreftgener. Og mulighetene for å gjøre noe med mange andre genetisk baserte sykdommer synes lys. RNA interferens og epigenetikk Så vi kan nå til en viss grad manipulere uttrykket av gener, men hva har dette med epigenetikk å gjøre? Hva har RNA interferens med cellens hukommelse og evne til å bygge hundrevis av ulike vev og celletyper? Forbausende nok så viser det seg at ennå uutforskede deler av RNAi-isfjellet styrer utvikling av kroppen, i alle fall i lavende organismer. I C. elegans styrer slike små RNA overgangen mellom puppestadier. Dersom disse mikro-genene går i stykker, ved mutasjoner, blir ormen aldri voksen, eller blir voksen altfor fort. Det blir som om et spedbarn plutselig skulle fått skjegg. Man har også kartlagt hundrevis av slike hittil ukjente mikro-gener hos mennesket, men ennå vet ingen klart hva de gjør. I tillegg til disse til nå godt skjulte mikrogenene kan det også være at små RNA virker tilbake på arvestoffet selv og gi epigenetiske effekter. Da må vi først snakke litt om noen av klodens merkelikeste dyr, nemlig transposoner. Et transposon er et 1-dimensjonalt dyr som lever i DNA. Det kan hoppe rundt langs DNA-strengen og kopiere seg selv. Den er med andre ord nok en parasitt som kan leve inne i menneskekroppen, liksom bendelorm, tarmbakterier, karies, HIV-virus, malaria-parasitter og mange, mange mer. I motsetning til disse andre dyrene er transposonet stort sett bare ren informasjon. Alle andre parasitter har en ekstern fase der de går fra et vertsdyr til et annet. Transposoner kan bare bevege seg innad i DNA og har ikke

Naturen nr. 4 2004 58 noen egentlig ekstern eksistens, selv om det kan lage RNA kopier av seg selv når det hopper. Da er vi tilbake til RNA interferens. Det er vist, igjen i den lille jordormen C. elegans, at dersom RNAi ikke virker, så begynner transposoner å hoppe helt vilt. Dette ble oppdaget ved at ormene begynte å mutere raskere enn før. Når transposoner hopper kan de av og til hoppe rett inn i et gen og ødelegge det. Konklusjonen er klar: RNA interferens har ikke bare som oppgave å stoppe virus, men også transposoner. Et problem med transposoner er at det er så mange av dem. Du som leser dette, har tusenvis på tusenvis av transponer i hvert eneste av cellene dine. Faktisk ser over 40 % av kromosomene våre ut til å være gamle (og døde) transposon-sekvenser, men det er en annen historie som vi ikke skal inn på i dag. Av og til hopper transposonene, og da kan de føre til skade. Det er ikke kjent hvordan de blir holdt i sjakk, men vi antar nå at RNA interferens er en slik mekanisme. Men hvordan stopper RNA interferens transposoner? En måte er nok å ødelegge RNA-mellomleddet, men ting tyder på at RNAi kan spore transposonet tilbake til plassen på DNA hvor transposonet hoppet fra, og sørge for at det ikke skjer igjen. Denne mekanismen er ennå ikke utforsket skikkelig. Det lille vi vet har vi fra planter og RNA virus i disse planteceller. RNA virus i planter kan skru av gener på kromosomer Planteforskere har i mange år strevd med at planter ofte motsetter seg å bli genmanipulert. Om man setter inn flere kopier av et gen, så skrur plantet like greitt av disse ekstra genene, og som en bonus, det tilsvarende genet hos planten selv (se også artikkelen til Aalen). Figur 5. En blå petunia motsto genmanipulering ved å skru av de innsatte ekstra genene. Som en bieffekt ble plantens egne gener for det blå pigmentet også avskrudd. Et eksempel på dette kunne man se i blå petunia. Man ville gjøre blåfargen sterkere og dypere ved å sette inn flere kopier av genet for denne blåfargen. Resultatet var at planten ikke ble blåere, men faktisk hvit. Ikke bare ble de ekstra blå-genene skrudd av, men plantens eget pigment-gen ble også avskrudd (Figur 5). Det har vist seg at denne motstanden mot genmanipulering er et aspekt av RNA interferens. Et meget interessant eksperiment i denne henseende er eksperimenter med

Naturen nr. 4 2004 59 RNA virus i genmanipulerte planter. Dersom man går omveier, som vi ikke skal gå inn på her, kan man klare å sette inn gener i planter. Morsomt nok, kan disse gen-sekvensene bli avskrudd dersom vi infiserer planten med et RNA virus, dersom RNA viruset har sekvenser til felles med det introduserte genet. Slik har for eksempel potetplanter blitt gjort immune mot plagsomme potetvirus. Mekanismen bak dette fenomenet ennå fullstendig ukjent. Men faktum er at en sekvens så liten som 30 basepar, på plantekromosomer med milliarder på milliarder av basepar, pakket i proteiner og foldet tett i tett dypt inne i kjernen, kan bli funnet og uskadeliggjort dersom cellen oppdager et RNA virus med samme sekvens. For å se at dette er så fantastisk merkelig, så må man tenke på at slike små RNA virus ikke går inn i celle-kjernen i det hele tatt. RNA virus kopierer seg selv, via en dobbelt-trådet RNA form (der har vi den igjen ) ute i cytoplasmaen, og går aldri selv inn i kjernen der DNA ligger. Det vi tror i dag er at ennå ukjente RNAi-systemer kan bruke RNA sekvenser til å finne igjen sekvenser dypt inne i DNA i kjernen, og så skru disse av med de samme mekanismer vi kjenner fra epigenetiske systemer. Mekanismer som DNA-metylering, histon-acetylering og andre metoder beskrevet i andre artikler i denne utgaven av Naturen. Kommer RNAi-epigenetikk til mennesket? Ingen vet ennå Ennå er ikke slike RNA-indusert genregulering kjent fra mennesket, selv om RNA virus altså kan utløse metylering av DNA i planter. Fra gjærarten Schizosaccaromyces pombe vet vi at små dobbeltrådige RNA er involvert i regulering av heterokromatin, med tilhørende histonmanipulering. Og fra bananfluen Drosophila har enkelte rapportert at RNA kan utløse avskruing av gener. Så kan man spørre, hva har disse eksotiske fenomenen i underlige dyr med mennesket å gjøre? Vel, det er i de rare modellorganismene, som fluer, ormer og planter, at vitenskapen gjør raskest fremskritt. Det har skjedd gang på gang at oppdagelser i modellorganismene senere blir overført til mennesket, ikke minst RNA interferens selv. Det er selvsagt vanskelig å spå. Spesielt om fremtiden, som en av atombombens fedre Niels Bohr pleidde legge til. Forskningen på menneskeceller, og dermed på medisin og legevitenskap, går relativt sakte i forhold til forskning på enklere organismer som fluer, mus og små ormer. Ikke at disse dyrene ikke er avanserte. Nede på celle-nivå er de like vanvittig kompliserte som oss. Men de kan manipuleres og forskes på enklere, og dermed går forskningen raskere i slike modellorganismer. Dessuten har vi muligens allerede et eksempel fra mennsker. I X-kromosominaktivering i mennesket er man på frenetisk jakt etter små, dobbelt-trådete RNA, siden det ser ut som det blir dannet en lang, dobbelt-trådet RNA sentralt i denne prosessen. Så RNAi er ennå ikke fullstendig koblet til epigenetiske mekanismer i mennesket, men med den farten denne forskningen går, skal det ikke gå så mange år før vi vet svaret. En salve ved reisens slutt Dette har vært en lang og muligens forvirrende og springende reise, kjære leser, med mange innslag av merkelige dyr, planter og vesener. Men slik er også forskningen, i sine overraskende, eksotiske og stimulerende sprang ut i det ukjente. Vitenskapen gir jo ikke bare nye medisiner og redskaper til å forandre og forbedre verden. Den gir, kanskje viktigere, en åndelig stimulans som gir livet mening og innhold.