(12) UTLEGNINGSSKRIFT (i9) NO oi) (13) B NORGE (si) Int Cl 5 C 07 K 15/14, 15/04 Styret for det industrielle rettsvern (21) Søknadsnr (22) Inng. dag (24) Løpedag (41) Alm. tilgj. (44) Utlegningsdag (62) 845131 20.12.84 13.04.84 20.12.84 02.03.92 (86) Int. inng. dag og søknadsnummer 13.04.84, PCT/US84/00561 (85) Videreføringsdag 20.12.84 (30) Prioritet 27.04.83, US, 489187 13.04.84, US, 598673 (71/73) Søker/Innehaver President and Fellows of Harvard College, 17 Quincy Street, Cambridge, MA 02138, US (72) Oppfinner(e) Myron E. Essex, Sharon, MA, US Tun-Hou Lee, Newton, MA, US (74) Fullmektig Lars Brevig, Bryns Patentkontor AS, Oslo (54) Benevnelse Vesentlig rent polypeptid (56) Anførte publikasjoner Europeisk (EP) patentsøknad, publ. nr. 105465, Britisk (GB) patentsøknad, publ. nr. 2122343, USA (US) patent nr. 4126671, 4434157, Jouro of Virology, vol. 38, s 906-15, juni-81, Virology, vol. 122, s 297-305, Science, vol. 218, s 571-573, feb. 1983, Proe. Nat. Acad. Sei. USA vol. 78 s 6476-6480 og vol. 79, Nature, vol. 294, s 271-273 og s 268-271, nov. 1981 J. Exp. med. vol. 154, s 1957-1964, des 1981. (57) Sammendrag Et første glykoprotein med en molekylvekt på omkring 61.000-68.000 dalton i MJ, C5-MJ, C91PL eller HUT-102 cellelinjer, hvorav 46.000-48.000 er den ikke-glykosylerte delen, oppnås fra celler infisert med humant T-celle-leukemivirus. Et annet glykoprotein som har en molekylvekt på omkring 45.000-52.000 dalton oppnås også fra slike celler og er for en stor del identisk med NH 2 -terminalenden til det første glykoproteinet. Tilstedeværelsen i en biologisk prøve av antistoff til den antigeniske determinanten til hver av disse proteinene antyder tilstedeværelsen av celler infisert med humant T-celle-leukemivirus. En analyse for antistoffet er en nyttig diagnostisk metode for bestemmelse av en slik infeksjon i biologiske prøver.
1 Foreliggende oppfinnelse vedrører vesentlig rent polypeptid, og mer spesielt nye rensede former av glykoprotein som finnes i celleoverflatemembranen til celler infisert med humant T- celleleukemivirus. Oppfinnelsen kan anvendes for detektering i en biologisk prøve av tilstedeværelsen av et antistoff til de antigeniske determinantene som er tilstede i nevnte glykoproteiner. Det humane T-celleleukemivirus (HTLV) er kjent for å være nær beslektet med en spesiell type human leukemi, T-celletypen hos voksne mennesker. Det har også blitt vist at alle mennesker hvis legemer inneholder antistoffer til dette virus tilsynelatende er latent infisert med viruset. Essex, J.N.C.I., Vol. 69, 981-5 (1982). Hovedkjerneproteinene i viruset har blitt studert, og en immunofluoriserende analysemetode for antistoffer til de infiserte cellene har blitt beskrevet og innebærer fiksering av celler fra en cellelinje av infiserte humane celler slik som MT1 eller MT2, føring av de fikserte cellene i kontakt med testserumet som skal analyseres, og bestemmelse av om binding av serumet til celleoverflaten har oppstått ved etterfølgende anbringelse i kontakt med et fluorescensmerket antistoff til humant IgG. Hinuma et at., Proe. Nati. Acad. Sei., Vol. 78, 6476-6480 (1981). Denne analysemetode er tidkrevende og vanskelig å bruke fordi bare 1-5 56 av de fikserte cellene utviser de nødvendige antigeniske egenskapene. Det er også blitt foreslått å benytte en tildels analog celleoverflateimmunofluorescens-analyse hvorved en kultur av infiserte celler inkuberes med testserumet, deretter med fluorescensmerket kanin-antistoff til humant IgG for å bestemme om binding av serum til celler har funnet sted. Robert-Guroff et al., Science, Vol. 215, 975-978 (1982). En radioimmunoanalyseprøve for antistoffer til p24 og pl9, to av kjerneproteinene i HTLV, har også blitt beskrevet. Posner et al. J. Exp. Med., Vol. 154, 333-344 (1981). Denne analysemetode gir imidlertid ikke positive resultater for alle individer som har blitt eksponert for infeksjonsviruset og utsettes derfor
2 for risiko, idet det ikke foreligger detekterbare nivåer av antistoffer til de to nevnte antigenene. Det er nå funnet at spesielle polypeptider eller glykoprotelner som er tilstede på celleoverflaten til humane T- celler infisert med HTLV, 1 renset og isolert tilstand inneholder en antigenisk determinant eller determlnanter som gir en høy grad av sensitivitet og immunospesifisitet for antistoff til humane celler infisert med HTLV, til humane T- celleleukemiceller, og/eller til HTLV. De vesentlig rene glykoproteinene eller deres ikke-glykoslyerte grupper er følgelig nyttige som diagnostisk verktøy for analyse av biologiske prøver for å bestemme om de Inneholder celler som har blitt infisert av HTLV. Andre polypeptider som Inneholder Immunologisk kryssreaktive antigeniske determinanter er nyttige for samme formål. Med angivelsen "polypeptider som Inneholder immunologisk krysseraktive antigeniske determinanter" menes polypeptider som til felles har antigeniske determlnanter med hvilke et gitt antistoff vil reagere. Slike andre polypeptider innbefatter de ikke-glykosylerte gruppene i glykoproteinene. Andre nyttige polypeptider eller proteiner som har de nødvendige immunogene determinantene, innbefatter syntetiske polypeptider. De innbefatter også antistoffer eller fragmenter derav som er anti-idiotyplske mot den aktive determinant eller determinantene på glykoproteinet ifølge oppfinnelsen. Det har nylig blitt vist at de anti-idiotypiske monoklonale antistoffene kan indusere en immunorespons mot og beskytte mot infeksjon av smittsomme organismer som bærer antigeniske determinanter som er de samme som eller vesentlig de samme som de på de anti-idiotypiske antistoffene (Fields et al., Nature, 300:19-23 (1982); Sacks et al., J. Exp. Med. 4:1108-1119 (1982)). Det har også blitt vist at antiidiotypiske reagenser er nyttige som diagnostisk verktøy for detektering av antigener som har seter som er immunologisk krysseraktive med de på antistoffene (Potocnjak et al., Science 215: 1637-1639 (1982) inkorporert heri ved henvisning. Således kunne en analyse for HTLV utføres ved hjelp
3 av et anti-idiotypisk antistoff eller immunologisk aktivt fragment derav som bærer et antigenisk sete eller seter derpå som på immunologisk måte ligner det antigeniske setet eller setene på glykoprotelnet ifølge oppfinnelsen. Slike antiidiotypiske antistoffer kan settes opp mot første antistoffer som har spesifisitet mot de antigeniske setene på glykoprotelnet ifølge oppfinnelsen (dvs. de anti-ldiotypiske antistoffene er anti-antistoffer). Fortrinnsvis benyttes monoklonale anti-ldiotypiske antistoffer. Ifølge foreliggende oppfinnelse er det tilveiebragt et vesentlig rent polypeptid, som er kjennetegnet ved at det er valgt fra gruppen bestående av: a) et glykoprotein som har en molekylvekt på 61.000-68.000 dalton og som har en ikke-glykosylert del på 46-48 kd, hvor glykoprotelnet er isolert fra celleoverflaten til celler som er infisert med humant T-celleleukemivirus; b) et glykoprotein som har en molekylvekt på 45.000-52.000 dalton, hvor glykoprotelnet er isolert fra celleoverflaten til celler som er infisert med humant T-celle-leukemivirus; og c) den ikke-glykosylerte del av a) ovenfor. En analysemetode for HTLV-infeksjon er viktig fordi viruset lett kan overføres fra de perifere blod-leukocyttene hos antistoff-positive mennesker til leukocytter hos antistoffnegative mennesker når de to dyrkes sammen. Popvic et al., Science, Vol. 219, 856-859 (1983). Det viser seg følgelig at det er en stor fare for infeksjon ved transfusjoner av helt blod når det transfuserte blod inneholder infiserte celler. I tillegg er an analysemetode av viktighet fordi biologiske prøver fra individer som utviser ervervet immunomangelsyndrom (AIDS) også gir en positiv test for antistoffer til
4 den antigeniske determinant letter diagnosen av denne sykdom. i det nye glykoprotein og dermed En metode for bestemmelse av en biologisk prøve med henblikk på tilstedevaerelse av antistoff til HTLV-infiserte celler, kan innbefatte inkubasjon av nevnte prøve med foreliggende polypeptid som har en antigenisk determinant eller determinanter som er immunologisk kryssreaktive med dem til et glykoprotein som har en molekylvekt på omkring 61.000-68.000 dalton, hvorav omkring 46-48.000 dalton er den ikke-glykosylerte del, eller med et glykoprotein som har en molekylvekt på omkring 45.000-52.000 dalton, hvilke glykoproteiner befinner seg på celleoverflaten til celler infisert med HTLV og bestemmelse av om hvorvidt et immunokompleks er dannet mellom nevnte antistoff og nevnte polypeptid. Oppfinnelsen kan også anvendes for bestemmelse av en biologisk prøve med henblikk på tilstedeværelsen av antigenisk determinant eller determinanter som er immunologisk kryssreaktive med determinantene i glykoproteiner med molekylvekt 61.000-68.000 dalton, eller 45.000-52.000 dalton. Determinantene som skal bestemmes, kan befinne seg på selve de angitte glykoproteinene eller på andre polypeptider. De kan være i fri sirkulasjon i kroppsvæskene eller i lymfocytter. Bestemmelsen kan utføres ved hjelp av kjente immunoanalysemetoder ved bruk av antistoffer, monoklonale eller flerverdige, som har immunreaktivitet med de antigeniske determinantene som finnes på de angitte glykoproteinene. For eksempel kan konkurrerende immunoanalyser eller immunometriske ("sandwich")-analyser benyttes. Glykoproteinene ifølge foreliggende oppfinnelse har som nevnt en molekylvekt på 61.000-68.000 dalton og omkring 45.000-52.000 dalton bestemt ved natriumdodecylsulfat (SDS)- gelelektroforese og er oppløselige i SDS-buffer bestående av 0,15 M natriumklorid, 0,05 M tris-hydroklorid, ph 7,2, 1 % "Trinton X-100", 1 % natriumdeoksykolat, 0,1 h> natrium-
5 dodecylsulfat og 1 mm fenylmetylsulfonylfluorid. "Triton X- 100" er en ikke-ionisk detergent (oktylfenoksypolyetosky (9-10) etanol). Den Ikke-glykosylerte delen av 61.000-68.000 d glykoprotelnet har en molekylvekt på 46.000-48.000 dalton og inneholder vesentlig den samme antigeniske determinant eller determinanter som selve glykoproteinet. Glykoproteinene kan oppnås fra HTLV-infiserte celler. En rekke forskjellige cellelinjer har blitt fremstilt, hvilke er permanent og vedvarende infisert med HTLV; blant disse kan nevnes MJ, C5-MJ, C91PL, og HUT-102. Det kan være at de nøyaktige størrelsene til de nye glykoproteinene er noe forskjellig i forskjellige linjer, den felles immunologisk kryssreaktive delen i glykoproteinene er imidlertid den samme uansett cellelinje fordi den er et protein indusert av HTLV. Således kan en hvilken som helst celle som inneholder viruset være en hensiktsmessig kilde for de nye glykoproteinene. For å oppnå proteinet fra hvilke som helst infiserte celler som bærer viruset, blir cellene merket metabolisk (for eksempel med 35 S-metionin) og immunoutfelt med antisera oppnådd fra ETLV-infiserte individer. De nye glykoproteinene kan deretter detekteres og isoleres ved gelelektroforese. Den her benyttede betegnelse "HTLV" er ment å innbefatte viruset generisk. Således innbefattes hvilke som helst og alle former, undertyper eller variasjoner av viruset. Glykoproteinene er for eksempel tilstede ved celleoverflatene til de humane T-celleleukemikulturene MJ, C5-MJ, C91PL og HUT-102. En prøve av MJ og av C5-MJ ble deponert hos the American Type Culture Collection den 26 april 1983 som ATCC nr CRL-8294 og CRL-8293, respektivt. Glykoproteinene kan lett separeres fra cellene til disse cellelinjer ved hjelp av lyse derav og SDS-gelelektroforese. De rensede og isolerte glykoproteinene eller et hvilket som helst antigen som er immunologisk kryssreaktivt dermed, kan anvendes som et standard antigen i en hvilken som helst
6 konvensjonell analysemetode for detektering i biologiske prøver av tilstedeværelsen av antistoffer som er spesifikke til disse, og således tilstedeværelsen i prøven av celler som er infisert med HTLV og/eller symptomatisk for AIDS. Antistoffene som er spesifikke til slike HTLV-antigener, finnes i pasienter som har slike sykdommer som hepatitt som ikke ledsages av HTLV-infeksjon. Glykoproteinene eller polypeptidene som er immunologisk kryssreaktive dermed, kan merkes ved hjelp av konvensjonelle metoder med 125 j eller ^ S eller H for bruk i radioimmunoanalyse, med fluoresceln for fluorescensimmunoanalyse, med enzym for enzym-immunoanalyse eller med biotin, for biotinavidin-forbundede analyser. Det kan anvendes, merket eller umerket, etter ønske, i konkurrerende immunoanalyser samt i dobbelt antistoff-analyser ved bruk av to antistoffer, enten av idiotype:antistoff-typen ved bruk av anti-fc-antistoff eller andre analysemetoder. De nye glykoproteinene eller polypeptidene som er immunologisk kryssreaktive dermed, kan alternativt immobiliseres på en uoppløselig fase, slik som en uoppløselig harpiks, og detektering av anti-glykoprotein-antistoffene utføres ved å måle deres binding til den uoppløselige fasen. Uoppløselige faser innbefatter også latekspartikler som, når de er belagt med det nye glykoproteinet eller dets immunologisk kryssreaktive polypeptider og utsatt for anti-glykoproteinantistoff, vil agglutinere. Andre uoppløselige faser innbefatter reagensrør, ampuller, titreringsbrønner og lignende, hvortil det nye glykoproteinet eller dets immunologisk kryssreaktive polypeptid kan bindes, og antistoffet dertil detekteres ved dobbelte antistoff-teknikker eller protein-a-avhengige teknikker. Ovennevnte analysemetode for antistoff til HTLV kan benytte glykopropteinet eller glykoproteinene med molekylvekt 61-68.000 og 46-52.000, respektivt, i uren form, og er ikke
7 begrenset til bruk av disse proteiner i vesentlig ren form. For eksempel kan glykoproteinet (glykoproteinene) først renses i vesentlig grad og deretter blandes sammen. Alternativt kan også råere blandinger anvendes. Analysebestemmelsen for tilstedeværelse av antistoffer mot HTLV kan innbefatte detektering av ytterligere antistoffer i prøven slik som de mot HTLV-kjerneproteiner pl9, p24 eller en blanding av de to sistnevnte. Ved en slik utførelse foretas inkubering av prøven med en reagens omfattende 1) ett eller begge glykoproteinene ifølge oppfinnelsen (det vil si 61.000-68.000 og/eller 46.000-52.000 d eller immunokryssreaktive polypeptider) og, eventuelt 2) HTLV-kjerneproteiner p24 eller pl9 eller begge, og bestemmelse av hvorvidt et immunokompleks er dannet mellom antistoffer i prøven og reagensen. De elementer som er nødvendig for utførelse av den ber tidligere beskrevne diagnostiske metodikk, kan befinne seg i en utstyrsbeholder. En slik utstyrsbeholder omfatter en bærer som er romindelt for mottagelse der i av en eller flere beholdere, idet hver av de nevnte beholdere omfatter ett eller flere elementer som skal til for å utføre testene. Den første beholderen kan for eksempel inneholde den ene av eller begge av de rensede glykoproteinene eller deres immunologisk kryssreaktive polypeptider i detekterbar merket eller i uoppløselig form. En annen beholder kan omfatte anti-igg-antistoff, polyklonalt eller monoklonalt, som er nyttig i dobbelt antistoffbindingsanalysebestemmelse eller elementer som skal til for detektering av merkingen på glykoproteinet eller dets immunologisk kryssreaktive polypeptider (for eksempel kromogene substrater). Ytterligere beholdere kan omfatte varierende mengder av et av glykoproteinene eller dets immunologisk kryssreaktive polypeptider som kan benyttes for tilveiebringelse av en
8 standard kurve i hvilken eksperimentelle resultater kan interpoleres. Materialene kan være tilstede i utstyret som sådanne, i oppløsning, frysetørket, eller i blanding med andre inerte materialer slik som inerte proteiner og lignende. De biologiske prøvene som testes, kan innbefatte blod, serum, lymfocytter, urin, vev, spytt, faeces og lignende. Av spesiell interesse er bedømmelsen av blod i blodbanker, for å sikre at blodet ikke er forurenset med HTLV. Bestemmelse av blodavledede produkter slik som vaksiner kan også foretas ved bruk av foreliggende oppfinnelse. Følgende spesifikke eksempler skal illustere oppfinnelsen. EKSEMPEL 1 Fremstilling av merket glykoprotein A. Humane T-celleleukemiceller fra de to cellelinjene MJ og C5-MJ ble separat høstet ved deres logfase for vekst. Etter en vasking med metionin-fritt McCoy's 5A medium ble hver prøve av cellene resuspendert i et merke-medium bestående av metionin-fri McCoy's 5A, 10 % fosfatbufret saltoppløsning (PBS), dialysert storefefosterserum og 100 p Ci/ml 35 S-metionin. Ved slutten av en 2-4 timers pulsing ble de radioaktivtmerkede cellene vasket tre ganger med kald PBS. Cellepelleten ble deretter lysert ved 0,6-1,0 ml kald lyseringsbuffer (RIPA) (0,15 M natriumklorid, 0,05 M trishydroklorid ph 7,2, 1 % "Triton X-100"-fuktemiddel, 1 % natriumdeoksykolat, 0,1 $ natriumdodecylsulfat, og en 1 mm fenylmetylsulfonylfluorid). Etter 10 minutter med intermitterende vlrveldannelse, ble behandlingen sentrifugert i 1 time ved 100.000 x g ved 4 C. Lysat-supernatanten ble forklaret for ikke-spesifikke bindingskomponenter ved absropsjon i 1 time ved 4 C på karbohydratkuler (sefarose CL-4B) belagt med protein-a.
9 B. Merking av celleoverflate-membranprotein ble utført ved laktoperoksydasekatalysert radioiodering. Tre aliquoter av 5 x 10^ celler av hver. linje med over 99 % levedyktighet, ble iodert separat med 1 mci av bærerfritt natrium 125iodid 1 nærvær av 50 JJI bærerunderstøttet laktoseperoksydase og glykosidase (enzymobeads, Bio-Rad Labs.) og 25 jai 1 % beta-dglykose. Etter at reaksjonen var ferdig ble de tre aliquotene av ioderte celler slått sammen og utsatt for de samme lyserings- og for-klaringsmetoder som beskrevet i (A) ovenfor. C. MJ og C5-MJ celler ved deres topp-logfase for vekst ble høstet separat og deretter resuspendert 1 glukosefritt RPMI-1640 medium supplert med 1 mg/ml natriumpyruvat i 2 timer. Etter denne glukose-utsulting ble cellene merket med 100 ji Ci/ml %-glukosamin (New England Nuclear) i 5-6 timer. Metoden resulterer i tritium-merking av bare de glykoproteiner som er tilstede i cellene. De merkede cellene ble deretter underkastet lyserings- og for-klaringsmetoder som beskrevet i (A) ovenfor. Fremstilling av merket ikke-glvkosvlert del av glykoprotein D. MJ og C5-MJ celler ved deres topp-logfase for vekst ble separat innhøstet og resuspendert i McCoy's 5A medium supplert med 10 % storfefosterserum, 1 i antibiotiskantimykotisk blanding, og 20 JJ g/ml tunicamycin i 2 timer. Etter dette trimmingstrinn ble cellene merket med 100 JJ Ci/ml 35S-metionin i nærvær av 20 ji g/ml tunikamycin i 2 timer. Det merkede materialet ble deretter utsatt for de samme lyserings- og for-klaringsmetoder som beskrevet i (A) ovenfor. Dannelse av protein-antistoff-kompleks E. Følgende ble bundet til aliquoter av protein-abelagte kuler (a) positivt referanseblodserum for individ som
10 man vet har antistoffer mot celler infisert med HTLV; ("b) negativt kontrollserum fra individer som er fri for infeksjon; og (c) serum fra ukjente individer som skal testes. Hver aliquot av de belagte kulene ble deretter reagert med en aliquot av hvert for-klaret lysat oppnådd fra MJ og fra C5-MJ fra avsnitt (A) ovenfor ved 4 C i 1-2 timer for å gi adgang for kompleksdannelse eller immunoutfelling mellom det bundede lysatprotein og eventuelt tilstedeværende antistoff i serummaterialene. Ved slutten av reaksjonen ble kulene vasket 4 ganger med bufferen (RIPA) og en gang med en buffer inneholdene 0,05 M tris-hydroklorid ph 7,2 og 1,15 M natrixunklorid for å fjerne ikke-kompleksdannet lysatprotein. Kulene ble deretter nedsenket i en prøvebuffer (0,1 M Cleland's reagens, 2 % natriumdodecylsulfat, 0,08 M trishydroklorid ph 6,8, 10 % glycerol og 0,2 % bromfenolblått) og underkastet koking ved 100 C i 2 minutter for å eluere proteiner fra kulene og for å dissosiere komplekser. Karakterisering av protein F. Hver prøve fra den foregående metode (A) ble analysert ved elektroforese, idet proteinene ble separert på en 12,5 % SDS-polyakrylamidgel med 3,5 s6 "stable"-gel ved bruk av Lemmli-buffersystemet. Molekylvektmarkører ble samtidig kjørt i en parallell kolonne. De benyttede markører innbefattet -merket fosforylase b (92.500), storfeserumalbimin (68.000) og ovalbumin (46.000) karbonisk anhydrase (30.000) og cytokrom C (12.000). For visualisering ved fluorgrafi ble gelene først fiksert med 10 # eddiksyre, 10 $ trikloreddiksyre og 30 % metanol i 1 time, deretter nedsenket i Enhancer-oppløsning i 1 time. Etter skylling med destillert vann og tørking under vakuum ble gelene eksponert og "Kodak SB-5"-film for tilveiebringelse av autoradiografier. Flekkene ble renset og isolert 61.000-68-000 molekylvektglykoprotein og av 45.000-52.000 molekylvekts-glykoprotein
11 viste seg tydelig i alle av kolonnene av serum (a), men ingen av de av serum (b). I motsetning til dette viste kjerneproteinene pl9 og p24 seg ikke i noen av prøvene av serum (a). Tilsynekomst av glykoproteinet i ukjent sera (c) indikerte tilstedeværelsen i nevnte sera av celler infisert med HTLV. Sera fra individer med AIDS viste også tydelig tegn på antistoffer til 61.000-68.000 molekylvekt-glykoprotein ved denne metode. Lignende resultater har blitt oppnådd ved å erstatte de merkede glykoproteinene i avsnitt A med hver av de i avnsitt B eller C. De kan også byttes ut med den merkede ikkeglykosylerte delen i avsnitt D, i hvilket tilfelle den rensede og isolerte merkede delen viser seg i gelkolonnen ved et sted tilsvarende molekylvekt 46.000-48.000. Umerket glykoprotein og umerket ikke-glykosylert del kan oppnås ved å sløyfe merketrinnene i de foregående metoder. Lignende resultater har blitt oppnådd ved å benytte cellelinjer C91PL eller HUT-102 istedet for MJ eller C5-MJ. Aminosyrefrekvens-analyse (35s)cystein-merkede glykoproteiner med en molekylvekt på omkring 61.000 dalton og på omkring 45.000-46.000 dalton, respektivt, ble utfelt fra 36 x 10 8 Hut-102-celler merket metabolisk med 5mCi (^S)cystein (spesifikk aktivitet 1011.2Ci/mmol, New England Nuclear) i 30 ml cystein-frie RPMI-1640 media inneholdene 15 % storfefosterserum (Grand Island Biological Co.) i 10 timer. De to glykoproteinene ble fjernet fra NaDodSC^-polyakrylamidgeler og deretter individuelt utsatt for elektroforetisk eluering i nærvær av 50 mm tris-acetat ph 7,8-buffer inneholdene 0,01 NaDodS0 4 i 12-16 timer. Prøver ble dialysert en gang med 10 mm ammoniumbikarbonat-buffer inneholdene 0,002 % NaDoDSO^ 12-16 timer. Enda en analyse ble foretatt med 10 mm ammoniumbikarbonatbuffer uten NaDodS04 i 12-16 timer. Hver prøve ble deretter
12 lyofilisert og aminosyresekvens-analyse ble foretatt ved hjelp av metodene beskrevet av Coligan et al., J. Immun. Meth., Vol. 47, 1-11 (1981) og Meth. Enzymol., Vol. 91, 413-434 (1983). Kort ble automatisert Edman-nedbrytnlng av radiomerkede peptider foretatt ved anvendelse av et Beckman 890C-sekvensapparat med kaldfelle-modifikasjon og 0,1 M Quadrol program 121078. Butylklorid-ekstraktet fra hver sekvenstrinn ble tørket ved bruk av ^-fordamping i 7,0 ml scintillasjonsampuller. Etter tilsetning av "Biofluor" (NEN), ble radioaktivitet bestemt på en Beckman 890C-vaeske-scintillasjonsteller. ( 35 S)topper ble funnet ved rester 6, 7, 21 og 28, hvilket indikerer tilstedevaerelsen av cystein ved disse posisjoner i proteinsekvensen til 61-000-68-000 d glykoproteinet. Det repeterende utbytte for denne sekvens var 88 1o, hvilket indikerer at alle restene er de samme i frekvensen. Små topper ved posisjoner 4 og 13 skriver seg antageligvis fra små mengder (mindre enn 5 #) av forurensende proteiner. Disse resultater indikerer at 61.000-68.000 molekylvekt-glykoproteinet er innkodet, i det minste delvis, med env-genet til HTLV, og at leder sekvensen til env-genet består av 20 rester. Lignende analyse ble utført med (^S)cystein-merkede glykoproteiner med molekylvekter på omkring 67.000 d og 50.000-52.000 d, respektivt. Cysteinrester ble detektert ved posisjoner 6, 7 og 21 når de første 22 NH 2 -terminalrestene ble analysert. Dette viser at dette glykoprotein også er innkodet, i det minste delvis, med den samme til env-genet. NEtø-terminalende
13 P a t e n t k r a v 1. Vesentlig rent polypeptid, k a r a k t e r i s e r t v e d at det er valgt fra gruppen bestående av: a) et glykoprotein som har en molekylvekt på 61.000-68.000 dalton og som har en ikke-glykosylert del på 46-48 kd, hvor glykoproteinet er isolert fra celleoverflaten til celler som er infisert med humant T-celle-leukemivirus; b) et glykoprotein som har en molekylvekt på 45.000-52.000 dalton, hvor glykoproteinet er isolert fra celleoverflaten til celler som er infisert med humant T-celle-leukemivirus; og c) den ikke-glykosylerte del av a) ovenfor. 2. Polypeptid ifølge krav 1, k a r a k t e r i s e r t v e d at det er et glykoprotein som har en molekylvekt på 61.000-68.000 dalton og som har en ikke-glykosylert del på 46-48 kd, hvor glykoproteinet er til stede på celleoverflaten til celler som er infisert med humant T-celle-leukemivirus. 3. Polypeptid ifølge krav 1, k a r a k t e r i s e r t v e d at det er et glykoprotein som har en molekylvekt på 45.000-52.000 dalton, hvor glykoproteinet er isolert fra celleoverflaten til celler som er infisert med humant T- celle-leukemivirus. 4. Polypeptid ifølge krav 1, k a r a k t e r i s e r t v e d at det har en molekylvekt på 46.000-48.000 dalton og at det er en ikke-glykosylert del av et glykoprotein som har en molekylvekt på 61.000-68.000 dalton, hvor glykoproteinet
14 er isolert fra celleoverflaten til celler som er infisert med humant T-celle-leukemivirus. 5. 5 Polypeptid ifølge krav 1, k a r a k t e r i s e r t v e d at glykoproteinet er isolert fra celleoverflaten til humane T-celle-leukemicellelinjer CRL-8294 eller CRL-8293. 6. 10 Polypeptid ifølge krav 1-5, k a r a k t e r i s e r t v e d at det er oppnådd fra MJ, C5-MJ, C91PL eller HUT-102- celler. 7. 15 Polypeptid ifølge hvilket som helst av kravene 1-6, k a r a k t e r i s e r t v e d at det er detekterbart merket ved en radiomerking. 8. 20 Polypeptid ifølge krav 1, k v e d at den ikke-glykosylerte merket. a r a k t e r i s e r t delen er detekterbart 25 50 35