Komplementaktivering med gassbobler in-vivo og in-vitro

Transkript

1 STF23 A Komplementaktivering med gassbobler invivo og invitro UNIMED

2 SBN M:\J3AHJEOO1.W5 Åpen FUDT (Statoil, Norsk Hydro, Saga Petroleum og Oljedirektoratet) Telex: sintf fl Beseksadresse: Olav Kyrresgt. 3 Postadresse: 7034 Trondheim SINTEF UNIMED 49 OPPDRAGSGIVER(E) Hjelde, A. FORFATTER(E) Ekstreme arbeidsmnjø e UNIMED Komplementaktivering med gassbobler invivo og invitro GLDEi 1911EL I jrappof ELEKTRONISK ARKIVKODE PROSJEKTNR. ARKIVKODE GRADEFUNG OPPDRAGSOIVERS REF. SAMMENDRAG RAPPORTNR. STF23 A GRUPPE i Helse Health GRUPPE 2 Dykking Diving EGENVALGTE Bobler Bubbies Telefon: (07) Telefax: (07) Etter luftdykk til 40 msw var det ingen sammenheng mellom invitro aktivering og symptomer på DCS. Plasmanivået av C5a er senket etter lufidykk både til 10 og 40 msw, de dykkere med lavest nivå før dykket utviklet mest bobler. Det kan være en sammenheng mellom C5a nivået 1224 timer etter dykk og STIKKORD NORSK ENGELSK C5a er blitt målt før og etter aktivering med gassbobler både hos mennesker og kaniner. Resultatene viser at aktiveringsgraden varierer betydelig over tid. Metoden kan ikke brukes til å vurdere dykkernes risiko for å utvikle DCS. forekomst av DCS. Komplement Complement ANTALL SIDER OG BILAG

3 1 1.1 Dykkefysiologi 6 i Innledning 6 Forkortelser Innholdsfortegnelse i Samrnendrag 3 Lnnholdsfortegnelse 2 Komplement 10 3 Materiale og metode 18 4 Resultater Generelt om komplement Metoder til å bestemme komplernent Aktivering av komplementsystemet Proteinen C5 og C5a Kaskadeprinsippene Problemstilling og mjsetting Komplementsystemet og DCS Kort presentasjon av tidligere studier Oppbygging av studien Prosedyre for blodprøver Bestemmelse av C5a ved hjelp av ELISA Forsøksprotokoll Dekompresjonssykdom (DCS) Resultater fra studie I Bobledeteksjon Statistikk Aktivering av komplementsystemet invir.ro Bobledannelse Gassenes egenskaper Studie Studie Studie i Intralinterindividueil variasjon i C5a over tid hos mennesker IntraJinterindividuell variasjon i C5a over tid hos kaniner 23

4 2 6 Konklusjon 43 5 Diskusjon Sammenhengen mellom invivo og invitro aktivering Sammenhengen mellom DCS og C5a Effekten av gassbobler på C5a og dose/responseffekt Sammenhengen mellom vaskulcere bobler og C5a i plasma Resultater fra studie Komplernentaktivering som følge av gjentatte dykk 36 Referanser 44 Vedlegg Kornplementaktivering av serum og nivået av komplement i plasma Sammenhengen mellom kontroliverdier og aktivering med gassbobler Resultater fra studie 2 30

5 3 mellom individer som har signifikant komplementaktivering, dvs, høy C5a og incidens av individ over tid. I denne oppgaven ble komplementaktivering som følge av gassbobler invitro og invivo Det er tidligere vist at gassbobler aktiverer komplementsysternet og at det er en sammenheng Sammendrag kontrollene. Aktiveringen ble stoppet ved å tilsette EDTA til en sluttkonsentrasjon på 10 mm. spesifikt mot aktiveringsproduktet C5a. Oppgaven er delt inn i tre studier. innen dykking. Kornplernentaktivering kan være en del av virkningsmekanismen for skader av Muligheten for gassbobledannelse i vev og blod under dekompresjon er et vesentlig problem gassbobler. Komplement iserum eller plasma akriveres av ulike stimuli, bl.a. gassbobler. ELISA (enzymelinked immunosorbent assay) som er basert på monoklonale antistoffer rettet Det ble tatt blodrver ved 6 forskjellige anledninger. Resultatene viser at gassbobler aktiverer undersøkt i serum og plasma. Mengden aktivert C5a ble målt hjelp av en teknikk som heter komplementsystemet og at C5a Øker med Økende mengde gassbobler. Graden av aktivering Studie 1: Serum fra 6 kaniner og 6 mennesker (4 menn og 2 kvinner) ble inkubert med til å aktivere komplement. dekompresjonssykdom. Det er også blitt hevdet at gjentatte dykk vil redusere individets evne gassbobler med økende gassflow. Serumprøver inkubert i fravær av gassbobler utgjorde med gassbobler var avhengig av utgangsnivåel av C5a (kontroliverdien). Det ble påvist store serurn til aktivering av C5a invitro. Alle dykkerne ble monitorert for gassbobler ved bruk av Studie 2: 19 profesjonelle dykkere utførte 23 luftdykk til 40 msw med bunntid på 60 eller 90 variasjoner i C5a ikke bare mellom de forskjellige individene, men også for ett og samme muskellleddsmerter, men behandling var ikke nødvendig. Nivået av C5a i plasma var ultralyd. 4 dykkere utviklet DCS og ble behandlet. 2 dykkere hadde forbigående minutter. Det ble tatt blodprøver, EDTAplasma til direkte måling av C5a aktivering invivo og signifikant lavere før og etter første dykk, men det var ingen signifikani forskjell i serumnivået ingen gassbobler. C5a aktivering var ikke forskjellig hos de fire dykkerne som utviklet DCS og graden av aktivering før og etter ett, to eller tre dykk. C5a nivået invivo var signifikant sammenlignet med de øvrige dykkerne. Det ble ikke påvist noen sammenheng mellom invivo og invitro aktivering. lavere hos de dykkere med mange vaskulære gassbobler sammenlignet med de med få eller Studie 3: 6 kvinner utførte 6 dykk til 10 msw med bunntid på 30 minutter, 2 dykk/dag over 3 dager. Det ble tatt blodprøver, heparinplasma til aktivering av C5a invitro, før første og femte

6 4 sammenheng mellom invitro aktivering og symptomer på DCS. De dykkere med lavest C5anivå før dykicet utviklet mest bobler. Plasmanivået av C5a var senket etter luftdykk både til 10 individer basert på deres evne til å aktivere komplement. Følgelig kan metoden ikke brukes til å vurdere dykkernes risiko for å utvikle DCS. Etter luftdykk til 40 msw var det ingen og 40 msw. dykk og etter siste dykk. Gjentatte dykk resulterte i en reduksjon av C5a. betydelig over tid. Studiene viser at det ikke er mulig å skille mellom sensitive/ ikke sensitive Studiene har vist at gassbobler aktiverer C5a invitro, og at graden av aktivering varierer

7 5 OPD ortho RIA = radioimmunoassay ELISA = enzyme rnsw = meter sea water linked immunoabsorbent assay diamin Forkortelser PBS = fosfatbufret saltvann phenylendiamin EDTA = ethylen tetraaceticacid DCS = dekornpresjonssykdorn ATA = atrnosfærer absolutt trykk atrn = atmosfære trykk

8 6 DCS. Symtomer på DCS og invivo aktivering av komplement har flere felles trekk som kløe, det oppstår DCS. i Innledning forbindelse med dekompresjon er sannsynligvis den utløsende årsak til at DCS oppstår Dekompresjonssykdom (DCS) er et sentralt problem innen dykicing. Gassbobler dannet i Tidligere studier med indirekte teknikk har vist at gassbobler aktiverer komplementsysternet in nedgang i tallet på hvite blodlegemer (22,26). Dette kan tyde på at kornplement kan være et Ødem, Øket vaskulær permeabilitet, nedgang i antall sirkulerende trorribocytter (blodplater) og aktiveringen av komplement med gassbobler, både hos mennesker og kaniner med bindeledd mellom gassbobler og DCS. (1,5,15). Men det er ikke noe klart årsaksforhold mellom mengde påviste bobler og DCS; det kan påvises større mengder med gassbobler i sirkulasjonssystemet under dekompresjon uten at vitro (28,3 1,34,36). Hensikten med denne oppgaven har vært å gjøre en systematisk studie på monoklonalt antstoff, for å se hvordan gassboblene påvirker komplementsystemet. Komplementaktivering kan være en viktig mekanisme for hvordan invivo gassbobler påvirker organismen og muligens forklare de patofysiologiske forandringer som skjer i forbindelse med kommer i tillegg til lufttrykket på 1 atrn (atmosfære trykk) ved havovertiaten. For hver tiende Ved dykking utsetter en kroppen for et øket trykk. Det hydrostatiske trykket (vanntrykicet) meter kommer trykket til å Øke med i kp/cm 1.1 Dykkefysiologi meters dyp vil en dykker vcere utsatt for 2 ATA (atmosfrer absolutt trykk), når en tar hensyn hovedsakelig av vceske som ikke komprimeres, dvs, ikke minsker i volum ved Øket trykk. til normalt atmosfcretrykic. i kp/cm For å kunne forstå problemer som kan oppstå i forbindelse med dykking er det nødvendig å si Gassenes egenskaper noen ord om gassenes egenskaper og årsaken til bobledannelse % karbondiolcsyd. I tillegg er det edelgasser som helium (Re), neon (Ne), argon (Ar) og Luft er en sammensetning av ulike gasser og består av % nitrogen, % oksygen, 2 = 760 mmhg latm = i bar. Menneskekroppen består 2 som tilsvarer i atm trykk. Det vil si at ved 10

9 7 Daltons lov: Pg = P * Fg hovedgrupper; gasser som ikke aktivt deltar i kroppens livsprosess (inerte gasser) og de som xenon (Xe), som tilsammen utgjør % (11). Disse gassene kan inndeles i to konstant. Fordobles trykket, halveres volurnet. Halveres trykket fordobles volumet. I en For en og samme gassmengde ved konstant temperatur er produktet av trykk og volum Boyles lov: p*vk forbindelse på grunn av sin kjemiske reaksjonstreghet. deltar aktivt. Inerte gasser er bare edelgasser, men også nitrogen regnes med i denne Her er K en konstant, p= trykk, v= volum og T= temperatur i K (kelvin). som følge av kompresjon og dekompresjon medfører at gassens trykk og temperatur endres Gasser er i høy grad komprimerbare i motsetning til faste legemer og vcesker. Volumendringer blanding av flere gasser vil hver av gassene utøve sitt eget partialtrykk (deltrykk). Det totale Om temperaturen holdes konstant går tilstandsioven over til etter en bestemt fysisk lov, som kalles gassens tilstandsiov (5,11). Henrs lov: Cg K*Pg Gassens tilstandsiov: p*vrf=k Kkonstant hvor Pg er partialtrykket av gassen og Fg er fraksjonen av denne gassen i blandingen. trykket er summen av de ulike partialtrykkene. Denne kalles Daltons lov. Mengden oppløst gass i en vske kan uttrykkes ved Henrys lov. hvor Cg er gasskonsentrasjonen, K løselighetskoeffisienten av gassen i det vevet og Pg løselighet i de forskjellige vev. Fettvev har f.eks fem ganger større løselighet for nitrogen enn kan tas opp i et vev ikke bare avhengig av gassens partialtrykk, men også av inertgassens ulike vil diffundere raskere enn nitrogen p.g.a. heliumgassens lave vekt. partialtrykk ved konstant temperatur. Som en ser av 1iiingen er mengden av inertgass som blod (11). Helium har lavere løselighet enn nitrogen i de fleste biologiske media, mens helium partialtrykket til gassen over væska. Mengden oppløst gass er direkte proporsjonal med gassens

10 8 NaC1 (0.155 M) Blod Plasma Olivenolje ml gass/mi væske ved] atm og 38 C (6). Tabell 1. Løselighetskoeffisienter for nitrogen og helium i forskjellige væsker angitt som inertgassens trykk i blod og de forskjellige vev, sier en at vevet er mettet. løselighetskoeffisient og liten gjennomblødning. Når det er likevekt mellom f.eks. En annen viktig parameter er også vevets blodgjennomstrørnning. Fettvev har både stor En dekompresjon kan føre til gassbobledannelse fordi en for rask reduksjon i omgivelses ikke elimineres raskt nok i forhold til det ytre trykket. Inertgass oppløst i blod og vev kan således gå ut av løsning og danne gassbobler. Muligheten for gassbobledannelse i vev og blod trykket vil føre til at iriertgass (helium eller nitrogen) som er akkumulert i kroppen under trykk Bobledannelse He N under dekompresjon er et vesentlig problem innen dykking. I følge Henrys lov vil mengden av inertgass som blit tatt opp av vevet under kompresjonsfasen være direkte proporsjonal med vev diffundere fra vevet og tilbake til blodet. En gassboble kan bare dannes dersom økningen av gassens partialtrykk. Under dekompresjonsfasen vil inertgassen i de forskjellige konseritrasjoiien av oppløst gass er større enn det som kan bli holdt i løsning. Ved en trykkreduksjon er mengden gass i løsning større enn metningskorisentrasjonen ved det aktuelle et vev vil være bestemt av forholdet rneliom gasstensjon i vev og arteriell gasstensjon (6,8). trykket. Dette forholdet blir kalit overmetning i forhold til det artenielle blodet. Overrnetning i Overskuddet av oppløst gass i vevene vil gå over til gassfase i form av bobler og ny likevekt vil bli opprettet. Bobledannelsen vil være avhengig av overmetningens størrelse, dens varighet og få blodårer sammenlignet med muskelvev, hvor nitrogenet raskere kan bli transportert over til blodgjennomstrømningen i de respektive vev. Fettvev har lavere blodgjennomstrømning p.g.a. den venøse sirkulasjonen for evntuelt å bli ftltrert i lungerie (10). dekompresjonsykdom avhengig av hvor gassboblene er lokalisert. Gassbobler er den primære Det er inertgassene som danner gassbobler, og dykkeren vil kunne få symptomer på. årsak til trykkfallsyke, selv om gassbobler ikke nødvendigvis resulterer i manifeste symptomer. 1.2 Dekompresjonssykdom (DCS)

11 9 Det er observert forskjellige syrnptomer på trykkfall.syke. Trykkfallsyke deles inn i to typer; Typel omfatter symptomer som leddsmerter på grunn av at gassbobler sitter i vevet nær ett Type I &2 (11,15). eller flere ledd. Kløe i huden er heller ikke uvanlig ledsaget av utslett som skyldes utvidelse av gassbkerer i huden. Gassboblene som kommer ut i blodet følger den venøse sirkulasjonssystemet til lungene hvor sanseorganer. lungefilteret og komme over i den arterielle delen av sirkulasjorieri. Dette kan skje hvis lungene de filtreres og utskilles via lungene. Oassboblene kan ved visse betingelser passere gjennom Type 2 er en atskillig mer alvorlig tilstand og omfatter skade på sentratnervesystemet og /eller utsettes for store gassvolum. Arterielle gassbobler kan følge blodstrmmen via halsarteriene og skade blodhjernebarrieren samt forårsake kroniske forandringer i sentralnervesystemet.

12 10 serum eller plasma. 2) Alternativ, som oppstår ved at gassbobler eller annet fremmedlegeme kommer i kontakt med 1) Klassisk, hvor antigen reagerer med et antistoff. Komplementsystemet kan deles i en klassisk og alternativ aktiveringsvei (2,19): 2.1 Generelt om komplement 2 Komplement av virus og bakterier, fremming av kjemotakse, som innebcerer evnen til å trekke til seg celler En av de viktige biologiske funksjonene til komplementsystemet i kroppen vår er ødeleggelse fra andre steder i kroppen, og infiammasjon, som er en ikkebakteriell betennelses reaksjon ved reaksjonsveien vil oftest først bli satt i gang og fungere som forsvarssystern mot invivo at vasoaktive aminer som histamin frigjøres og Øker permeabiliteten (2,21). Den alternative infeksjoner, da man normalt ikke har ferdigdannede antistoffer mot mikroorganismer. FØrst når eller direkte på cellemembrankornplekset. lymfocyttene er sensibilisert, kommer antistoffproduksjonen i gang og den klassiske ved aktiveringspeptidene som stimulerer kroppens egne leukocytter (anafylakse,kjemotakse) reaksjonsveien får større betydning. De biologiske aktiviteter som dannes er enten indirekte Utviklingen av rnonoklonale antistoffer mot spesielle komplementfaktorer har bidratt til en bedre forståelse av hvordan systemet fungerer under fysiologiske og ikke fysiologiske forhold. I løpet av de siste 30 årene er kornplementsystemets biokjerni relativt godt karakterisert (14,16,17,21). Det består av 2530 proteiner, hvorav over halvparten er reguleringsproteiner 2.2 Aktivering av komplementsystemet (19,20). Komplemeniproteinene fikk navn etter hvert som de ble oppdaget, CI, C2 osv. Aktivering av kornplementsystemet følger vanlige prinsipper for kaskadeaktivering. Aktivering av et protein kan illustreres ved spalting av et nativt (ikke aktivert) protein i to fragmenter og dette fører til endringer i antigen struktur. Dette er illustrert i figur i hvor tre proteiner er gitt benevnelsene 1, 2 og 3. Protein i aktiveres ved at et lite fragment la spaltes fra og frigjøres til vcskefasen mens resten av molekylet ib forandrer struktur og får affinitet til protein 2. Dette resulterer i at protein 2 spaltes til 2a og 2b. Det oppstår så et nytt aktivt sete på protein 2b.

13 11 & prinsippskisse ved aktivering av kaskaden (20). Komplekset lb2b (protein 3 konvertase) aktiverer protein 3 til 3a og 3b. I fig. i vises en I fig. 2 er det vist en forenklet oversikt over de proteinene som inngår i komplementsystemet, både når det gjelder den klassiske og alternative reaksjonsvei. Klassisk aktivering omfatter konvertase) som spalter C3 til C3a og C3b. Både klassisk og alternativ aktivering går via C3. proteinene Cl,C4 og C2. Alternativ aktivering starter med C3, B og D. Faktor B binder seg til C3b og spaltes tii Bb og Ba ved hjelp av faktor D. Det dannes C3bBb (alternativ C3 klassisk eller lternativ. Aktiveringen av C5 til C5a og C5b er den siste enzyrnatiske spalting i Resten av kaskaden (C59) aktiveres på samme måte enten den initiale aktiveringen har vcert kaskaden. Reaksjonskjeden fra C5b til C9 er karakterisert ved at de enkelte komponentene fortiøpende binder seg til hverandre og danner et makromolekyl som består av av C5b, C6,C7,C8 og C9. Dette er det terminale komplementkompleks (19,20). Fig. 1. Prinsipp for aktivering av en kaskade.

14 12 C5b9 05b C3 kor7vertaser C4bC2a ha C3bBb I I C2b cl Ba Klassisk aktivenng Alternativ aktlvering 2.3 Kaskadeprinsippene sett av proteiner som virker sammen på en bestemt måte for å utøve visse biologiske Komplementsysternet utgjør en av kroppens viktigste kaskader. Et kaskadesystem innebcerer et funksjoner. Et aktivert protein fungerer som enzym med neste komplementfaktor som substrat; det initieres en kaskade av reaksjoner. Konsekvensen av en slik kaskadeaktivering er at det oppnås et betydelig mangfold i biologisk funksjon fordi de enkelte proteiner og deres 2.4 Metoder til å bestemme komplement meget streng kontroll ved hjelp av reguleringsproteiner. aktiveringsprodukter er spesialisert til ulike funksjoner (19,20). Systemet er underlagt en ELISA. Påvisning og kvantitering av C5a aktivering kan gjøres ved hjelp av monoklonale antistoffer mot epitoper (antigene determinanter) i aktiveringsproduktet C5a, og som ikke finnes i det native C5 proteinet. Disse epitopene er altså spesifikke for aktiveringsproduktene og svært nyttige til å påvise komplementaktivering. Metoden blir kalt sandwich ELISA Fig. 2. Skjematisk oversikt over proteinene som inngår i komplementsystemet. 04 C2 C6 C7 08 C9 C 5a

15 13 antigenet, blir bundet til to antistoffer som har affinitet for to ulike epitoper. Matrix i Antistoff 2 Produkt Fig. 3. Prinsippskisse for deteksjon /ks anritering av komplementaktiveringsproduktet C5a (enzymelinked immunoabsorbent assay). Det innebærer at det stoffet en skal måle, dvs. Antistoff 1 bindes til en matrlx; polystyren i ELISA; Akriveringsproduktet, C5a, binder seg til en reaksjon der produktet blir farget. Dette avleses spektrofotometrisk, og ved å gå inn på en antistoffet. Antistoff 2 tilsettes og bindes til en annen epitop på antigenet C5a. Et enzym blir et polysakkarid og er en sterk aktivator til den alternative reaksjonsvei av komplementsystemet standardkurve bestemmes C5a nivået i prøven. Standardkurven lages ved å måle optisk tetthet tilsatt, og dette enzymet binder til seg biotin på antistoff 2. Dette enzyrnkomplekset katalyserer To andre metoder er tidligere blitt benyttet til å bestemme kornplement (C5a); leukocyttaggregering (12) og RIA, som er en radioirnmunoassay metode (27). (OD) på ulike fortynninger av et z mosanaktivert serum med kjent mengde C5a. Zymosan er Leukocyttaggregering går i korthet ut på å. tilsette en prøve med inkubert plasma eller serum til en suspensjon av leukocytter. Den forandring i lystransmisjonen som blir målt som følge av (2). Denne rnetoden blir beskrevet i mer detalj under kap RJA er en antigenantistoffreaksjon. RIA har til nå vært den mest sensitive metoden til å påvise leukocyttaggregering er et mål for komplenientaktivering i den prøven. rrietoden er tilgjengelig kommersielt. Men teknikken forutsetter at C5 felles ut før C5a kan komplementaktivering i serum eller plasma. Den kan detektere C5a ned til nanogram nivå og bestemmes. I en løsning tilsetter en radioaktivt merket antigen, umerket antigen (inkubert serum/plasma eller standard) og spesifilct antistoff. Etter en viss reaksjonstid separeres fritt antigen konkurrerer om bindingen til antistoff vil forholdet mellom radioaktivt merket antigen antigen fra antistoffbundet antigen og så måles radioaktiviteten. Fordi merket og umerket

16 14 kjemotaksisk på granulocytter ved at det frigjøres kjemotaksiske faktorer som øker 2.5 Proteinene C5 og C5a konsentrasjon av umerket antigen. monocytter, granulocytter og makrofager (20,35). Proteinet C5 er bygget opp av to polypeptid kjeder, c og 13 som blir holdt sammen av disulfidbroer. C5 splittes v.h.a. C5 konvertase ved C5bC6C7C8C9 dannes, frigjøres fragmentet C5a fra C5. C5a er imidlertid vanskelig å påvise tiltrekningen av granulocytter mot betennelsesstedet. Ved at det terminale komplekset antistoffkompleks (bundet) og ubundet radioaktivt merket antigen (fritt) minke med økende invivo p.g.a. sin meget korte halveringstid, da de meget raskt bindes til sine C5a reseptorer på C5b. Spaltingen skjer ved arginylpeptid bindingen med det resultat at alle C5a polypeptidene aktivering til C5a ut fra akjeden mens resten av c kjeden og den intakte 13kjeden inngår i får en argininaminosyre ved Cenden. permeabilitet og kontraksjon av glatt muskulatur som resultat (21). C5a virker også kalles også for anafylatoksiner, fordi de stimulerer til frigjøring av histamin med økt vaskuhær avspaltes fra et protein C5 under aktiveringen av komplement. Proteinene C5a, C3a og C4a Komplement består av ca. 30 proteiner, hvorav C5a er en av disse. C5a er et peptid som C5a står under regulering av enzymet karboksypeptidase N som inaktiverer C5a ved å spalte av karbohydratenheten som er på ca dalton, består av mannose, galaktose, glukosamin og C5a er det mest høypotente av anafylatoksinene og er følgelig vanskelig å inaktivere. C5a den terminale aminosyren arginin, men C5a des Arg har fortsatt litt biologisk aktivitet igjen. har ingen spesiell betydning for funlcsjonell aktivitet av proteinet (25). C5a er et glykopeptid og består av 74 arninosyrer og en oligosaccarid bundet til asparagin i posisjon 64 (16). Denne består av tre disulfidbroer med ca. 40 % av aminosyreenhetene i cthelix konformasjon. I tabell 2 er molekylvekt og plasmalconsentrasjon for C5,C5a og C5a des Arg satt opp og i tabell 3 er aminosyresammensetningen til humant C5a vist. C Tabell 2. Molvekt og plasmakonsenzrasjon for h.h.v. C5, CSa og CSa des Arg (21). C5a Komponent Molekylvekt Maksimal plasmakonsentrasjon (tgiml) C5adesArg 11400

17 15 Threonin 3 Proline i Lysin 8 Glycin 3 Tabell 3. Aminosyresammensetningen til humant CSa (16). Isoleucin 5 Aminosyre Antall aminosyrer Cystein 7 Methionin i Histidin 2 Arginin 5 Alanin 8 Asparaginsyre 6 Leucin 4 Tyrosin 2 Valin 5 Serin 4 Fenylalanin i Glutaminsyre Komplementsystemet og DCS interesse innen dykking. Det har vcrt foreslått at rnåling av C5a kan brukes for utvelgelse av Komplementsystemet er et viktig ledd i forsvarsrnekanisrnene mot infeksjon, men har også dykkere (29), ved at en på denne måten kan finne frem til individer med Stor motstandsevne påviste bobler og trykkfailsyke. Selv om det følges anbefalte standard dekompresjons komplementaktivering kan være en av disse. mot DCS. Det har til nå ikke vcert mulig å vise et klart årsaksforhold mellom mengde av individuelle faktorer som kan bidra til at det oppstår trykkfallsyke. Individets sensitivitet for prosedyrer så gir tabellene ingen garanti for at trykkfallsyke kan unngås. Det er en rekke Totalt antall enheter: 74 Moleicylvekt: 8285

18 16 menneske. 2.7 Problemstilling og målsetting Målsettingen med denne studien har vært å se på følgende faktorer: Vi disponerer en monoklonal C5a metodikk som sammen med en metode for produksjon av individ og uavhengig av boblemengden. gassbobler muliggjør studiet av kornplementaktivering i serum og plasma hos kanin og å aktivere kornplernent ikke variere over tid; den må vcere karakteristisk for hvert enkelt 4) Vil gjentatte dykk kunne påvirke graden av komplementaktivering? Det er tidligere vist at det er en sammenheng mellom individer som har signifikant 2) Kan C5a aktivering invitro bli brukt til å forutsi dekornpresjonsproblemer? også blitt hevdet at gjentatte dykk vil kunne redusere ens evne til å aktivere komplement med dermed beskytte vedkommende mot å utvikle DCS. Hvis dette skal vcrre tilfelle så må evnen til komplementaktivering, dvs, høy C5a, og incidens av dekompresjonsykdom (2831). Det er gassbobler invitro (32). Med andre ord så skulle dette resultere i en nedgang av C5a nivået og 3) Vil gassboblerinvivo føre til aktivering av komplement? aktivere kornplement? Andre studie. CSa aktivering og dens relasjon til gjentatte dype Iuftdykk (23 dykk), 2.8 Oppbygging av studien kalibrerte gassbobler ble dose/ respons kurven for kornplementaktivering invitro studert. I den første studien ble effekten av gassbobler på C5a aktivering studert hos kanin og FØrste studie. Variasjon i C5aakrivering over tid. Arbeidet er valgt delt inn i tre fortiøpende studier. ga.ssbobledannelse og DCS. menneske over et lengre tidsrom. Dette ble gjort for å. se om det var inter/ eventuelt intra individuelle forskjeller i C5a over denne tidsperioden. Ved infusjon av forskjellige mengder 1) Kan en differensiere mellom sensitive og ikke sensitive individer basert på deres evne til å dykk på aktivering av komplement, på forekornst av DCS og på forekomst av gassbobler in Studien er lagt opp til 23 gjentatte, dype luftdykk for å se effekten av gjentatte, belastende vivo hos mannlige dykkere.

19 Kost presentasjon av tidligere studier har på utviklingen av komplementaktivering hos kvinner. Denne studien er antall dykk Øket til 6 dykk for å se effekten av gjentatte, lite belastende dykk dykk). Tredje studie. CSa aktivering og dens relasjon til gjentatte grunne, lite belastende luftdykk (6 ett og to gjentatte luftdykk hos 18 dykkere (36). Den andre artikkelen er av Webb et al som publisert tre andre artikler, bl.a. av Zhang et al som måler bundet C3d invivo etter henholdsvis blod fra to grupper av dykkere; en som hadde hatt mye DCS og en med få tilfeller (34). Det er binder Ca og Mg og således blokkerer videre komplementaktivering. Den tredje er en artikkel meningsløst å aktivere plasma som på forhånd er tilsatt EDTA. EDTA har den egenskap at den bestemmer C3a og C5a sensitiviteten invitro ved å inkubere EDTA plasma med gassbobler i metningsdykic (24). Ingen av de nevnte forfattere har målt C5a ved hjelp av monokionale av Stevens et al som studerer C5a nivået i EDTAplasma hos 11 dykkere før, under og etter et antisto ffer. studier onikring komplementsensitivitet og dens relasjon til DCS (2833). I tillegg er det har vært nærmest enerådende på dettte felt, og det er Ward et al som har gjort en del invitro Det eksisterer få artikler som tar for seg dette tema. Men det er spesielt en gruppe som til nå

20 18 H20 Måling av komplementaktivering ble gjort ved å bruke monokionale antistoffer (MoAb) mot Mikrobiologi ved RIT (Regionsykehuset i Trondheim). Metoden krever ikke store mengder av kanin C5a og human C5a ved hjelp av ELISA (3,4). Disse antistoffene er utviklet ved Avd. for brukt til å måle C5a i forbindelse med aktivering av komplementsystemet med gassbobler. 3.1 Bestemmelse av C5a ved hjelp av ELISA EL!SA prosedyre: 3 Materiale og metode epitopen binder seg til antistoffet. Dette inkuberes i i 1/2 time etterfulgt av vasking med PBS til overflaten i en plastbrønn på en mikrotiterplate (Nunc, Roskilde, Danmark) og inkubert over T hvor alle andre proteiner vaskes bort. Deretter tilsettes et annet antistoff (biotinylert antistoff PBS som inneholder 0.05 % TWEEN20 (PBST) tilsettes, og aktiveringsproduktet (C5a) med å blokkere ledige proteinbindingssteder i 30 minutter. Prøven (serum eller plasrna) fortynnet i prøvestoff og følsomheten er stor, ofte på picogram nivå. Det er første gang denne metoden blir Antistoff i mot kanin C5a eller mot humant C5a i 0.1 M karbonatbuffer, pr 9.6, ble adsorbert produktet fra testprøven igjen i brønnen). Et enzym konjugert til streptavidin (streptavidin natten ved 20 C. Plastbrønnene behandles så med 1 % tørrmelk i fosfatbuffer ph 7.2 (PBS) for 2) som ikke treiger å vcere mot epitoper (fordi det på dette tidspunktet kun er aktiverings tilsetting av en substratiøsning orthofenylendiarnin (OPD) og H202 for enzymet. Ved tilsetting peroxidase konjugat) tilsettes og bindes til biotin på antistoff 2. Komplekset detekteres så ved mengden antigenantistoffkompleks på veggen i brønnen. Dette måles spektrofotometrisk ved av substrat vil enzyrnet gi en fargereaksjon. Peroxidase katalyserer reaksjonen mellom OPD og å tilsette 2 MH2S0 fremstilling av ELISA samt alle løsninger som ble brukt i forbindelse med ELISAanalysene er 2 som gir det gulaktige produktet 2,3diaminofenazin. Enzym reaksjonen ble stoppet ved standardkurve som ble laget ved å bruke kjente konsentrasjoner av C5a. En trinnvis OD 492 nm. Konsentrasjonen av C5a i plasma eller serum ble bestemt ved å relatere OD til en 3.2 Prosedyre for blodprøver lagt under vedlegg s. 48. Blodprver ble tatt av både mennesker og kaniner. Det ble tatt 10 ml venøst blod hos menneske og tilsvarende mengde arterielt blod fra den sentrale Ørearterien hos anesteserte (fluanisonlfentanyl) kaniner. Serum, heparin og EDTAplasma ble anvendt som prøvemateriale avhengig av hva som var av interesse. (EDTA ethylendiamintetraaceticacid). 4. Mengden produkt som dannes pr. tidsenhet vil vrere proporsjonal med

21 3.3.2 Studie Studie i dokumentere intravaskulær aktivering; invivo aktivering, ble EDTAplasma anvendt. EDTA kanin og menneske ble det benyttet serurnprøver som ble aktivert med luftbobler, henholdsvis Heparin og EDTA er antikoagulanter som reduserer blodets evne til å koagulere. For å kunne Det ble brukt 6 kaniner (Chinchilla) og 6 individer (4 menn og 2 kvinner) til denne snidien. Det 3.3 Forsøksprotokoll binder Ca og Mg og således blokkerer videre komplemeritaktivering. Heparin derimot tillater komplementaktivering ved senere inkubering med gassbobler. ble tatt blodprøver av alle kaninene; K949, K373, K365, K473, K349 og K493 og alle Til blodprøvetakingen ble det benyttet sterile rør. EDTA og heparinprøvene ble sentrifugert dets innhold av C5a ved hjelp av monoklonalt antistoff for henholdsvis kanin og humant C5a. umiddelbart eller eventuelt ble de oppbevart kaldt inntil plasma var separert fra. Serurnprøvene 0.5, 1 og 2 mllmin. Serumprøver inkubert i fravær av gassbobler utgjorde kontrollene. Det ble sto til full koagulering ca. 1/2 time før sentrifugering. Deretter ble serum og plasma separert individene; A,B,;D,E og F ved 6 forskjellige anledninger i løpet av et halvt års tid. Både hos bestemmelse av C5a, mens både heparin og serum ble aktivert med gassbobler invitro før fra og de ble lagret ved 30 C for senere eksperimenter. EDTA plasma ble brukt til invivo graden av C5a ble bestemt. anvendt identisk forsøksoppsett hos kanin og menneske. Prøvene ble fortiøpende analysert for denne studien. Over en fem dagers periode utførte de luftdykk til 40 msw (meter sea water) med bunntid på 60 eller 90 minutter. (Bunntid er den tiden fra man forlater overflaten til man dekompresjonen ble det brukt 50/50 % Heliox fra 30 til 10 msw, mens 100 % oksygen ble Dykkerne ble delt i 4 team; Team A,B,C og D. Gjennomsnittsalderen på dykkerne var 30.3 år brukt ncrrnere overflaten. begynner oppstigningen). Dekompresjonen ble utført med lmsw pr. min og under gassbobler ved å bruke ultralyd under selve dekompresjorisperioden og inntil 120 minutter (range 2046 år). 7 dykkere utførte tre dykk, 7 dykkere utførte to dykk og fem dykkere utførte bare ett dykk, da fire av dem utviklet symptorner på DCS. Alle dykkerne ble rnonitorert for 19 profesjonelle dykkere ved National Hyperbaric Center (NHC) i AberdeenlSkotland deltok i 19

22 20 I den tredje studien er antall dykk 6, med 2 dykk!dag over 3 dager. Dykkene ble utført ved Studie 3 Trondheim. Her ble serumprøvene aktivert med luftbobler, 2 mlimin i 30 min før EDTA ble analysert for dets innhold av C5a ved hjelp av ELISA. å komme over og delta. c 30 minutter og påfølgende dekornpresjon 10 meter/min. DCIEM (Defence and Civil Institute of Erivironmental Medicine) i Toronto/ Kanada. Det ble timer etter første, andre eller tredje dykket. Prøvene ble frosset og brakt på tørris tilbake til postdive. Det ble tatt blodprøver; serum til aktivering av C5a invitro og EDTAplasma til direkte måling av C5a aktivering invivo. Blodprøvene ble tatt umiddelbart før dykket og 2 utført 6 luftdykk til 2 ATA (10 meter) med en kompresjon på 10 meter/min. Bunntiden var på kvinnene; før l.dykk (1.dag), før 5.dykk (3.dag) og etter 6.dykk (4.dag). Blodprøvene ble 6 kvinner var med i denne undersøkelsen. Det ble tatt 3 blodprøver (heparinplasma) av alle fraktet på tørris tilbake til Trondheim hvor de ble aktivert med luftbobler; lmllmin i 30 i fravcer av gassbbbler. Deretter ble de analysert for dets innhold av C5a ved hjelp av ELISA. tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 10 mm. Til slutt ble både EDTAprøvene og serumprøvene minutter og deretter tilsatt EDTA til en sluttkonsentrasjon på 10 mm. Kontrollene ble inkubert Toronto, Canada og Sintef Unimed, seksjon for ekstreme arbeidsmilj, hvor jeg ble invitert til Denne studien var en del av et samarbeidsprosjekt mellom Prof. G. Ward ved Universitetet i

23 Compr.gas regulator Pressure towmeer 3.4. Aktivering av komplementsystemet invitro Fig.4. Det eksperimentelle oppsettet som ble brukt til å produsere gassbobler. stoppet ved å tilsette imi 20 mm EDTA i 0.9 % NaC1. Luftbobler med gjennomsnittlig kanin C5a og human C5a. som holdt 37 C mens kalibrerte luftbobler ble boblet igjennom i 30 minutter (fig.4). Blodprøvene ble tint. Et sterilt rør ble fylt med i ml serum eller plasma og plassert i et vannbad Prøver inkubert i fravrer av gassbobler tjente som kontroller. Komplernentaktiveringen ble henholdsvis 0.5, i eller 2 mljmin, som tilsvarer 220, 490, og 690 bobler/min. Resultatet av en diameter på 2 mm ble introdusert ved å bruke et kalibrert mikroflowmeter 3.5 Bobledeteksjon (Gilniont Instruments, Serial No , Barrington, IL). Det ble benyttet en gassflow på slik aktiveriig er at vi får frigjort C5a som kan måles ved hjelp av monoklonalt antistoff mot kan identifiseres som skarpe plystrelyder i Dopplersignaler eller som intenst lyse flekker i Detektering av intravaskulære gassbobler ble gjort ved hjelp av ultralyd. Prinsippet bak var essensielt i forsøkene. ultralyddeteksjon er at gassboblene refiekterer lyden mye bedre enn blodet (7,8). Refieksjonene ultralydbilder (9,13). Bruk av ultralyd muliggjør rask og noninvasiv bobledeteksjon, noe som sensitiv metode for bobledeteksjon. Ultralydbildene ble tatt opp med en 2 MHz ultralyd Under selve dekompresjonen ble ultralydrnålingene utført i kammeret av dykkerne selv. Det Etter dekompresjonen ble målingen gjort ved hjelp av ultralyd scanning, som gir en mer ble da benyttet ultralyd Doppler, og signalene ble evaluert av en Øvet person utenfor kammeret. TontmIHeat I Temp.sensar 21 Bubbledetector

24 22 indikerer enkelte bobler. Paret Student ttest ble benyttet for å undersøke forskjeller mellom kontroliverdier og de 3.6 Statistikk hvor 0 representerer fravær av gassbobler, mens 34 representerer massive bobler. Grad i og 2 monitorert for gassbobler under dekompresjonsperioden og inntil 120 minutter postdive. Boblemengden ble gradert etter en modifisert Spencerskala (7). Denne skalaen går fra 0 til 4 gassflow. Gjennornsnittsverdier med +1 SD ble brukt der en ønsket å vise effekten av transducer plassert utvendig på kroppen ved pulmonalarterien. Alle dykkerne i studie 2 ble i disse dataene. MannWhitney U test ble benyttet for sammenligning av data mellom to utgangsnivået (kontroliverdiene) og etter aktivering ved henholdsvis 0.5 ml, i ml og 2 ml luftbobler på generering av C5a for henholdsvis 0.5, i og 2 ml gassflow/min, samt spredningen inkubert i nærvær av gassbobler. Samme test ble også anvendt der en Ønsket å se på forskjeller mellom ett, to eller tre dykk. Korrelasjonsfaktor ble benyttet for å vise relasjonen mellom bobler. Signifilcante verdier for p <0.05. grupperinger; de med DCS og forbigående smerter mot de uten slike symptomer. Samme test ble også benyttet for å sammenligne de med ingen / få vaskulære bobler mot de med mange aktiverte verdier; dvs, mellom de som ble inicubert i fravær av gassbobler med de som ble

25 23 Det ble tatt serumprøver hos kanin og mennesker ved seks forskjellige anledninger og disse ble C5a) Intralinterindividuell variasjon i C5a over tid hos kaniner mot kanin C5a og human C5a. 4.1 Resultater fra studie i C minst sensitive med C5a på 438 nglml (range ) ved samme fiow (; absolutte verdier av sensitive m.h.t. C5a med 983 nglml (range ) ved imi flow/min, mens K365 er den viser en betydelig variasjon i komplementaktivering over tid, f.eks. K473 fig. 5 d, fra å vcere sensitiv den 18/4 til å vcere ganske upåvirket med hensyn til aktivering av komplement 2 mnd. senere (15/6). Det ble påvist en Økning i C5a ved økende mengde gassflow hos alle kaninene mi/min. Figuren viser også variasjonen i C5a aktivering mellom de forskjellige individene. sammenlignet med 847 % økning 1 mnd senere ved en fordobling av gassflowen fra 1 til 2 tre viste en redulsjon i C5a ved å Øke flowen fra 1 til 2 mllmin under aktiveringen. En annen ved alle 6 anledninger, bortsett fra hos K373, K473 den 18/4 og hos K493 den 16/5. Disse c anledninger (3/4, 18/4, 3/5, 16/5, 15/6 og 18/1). Første kolonne representerer en gassflow på forhold til kontrollene ved henholdsvis 0.5, 1 og 2 ml gassflow/min ved seks forskjellige observasjon var store prosentvise forskjeller i C5a respons for samme individ ved identisk gassflow ved forskjellige anledninger. F.eks. K349 viste bare 5 % økning i C5a den 3/4 Fig. 5 a,b,c,d,e,f viser individuelle data for 6 kaniner presentert som ng/ml økning i C5a i 0.5 mllmin, andre kolonne i mllmin og tredje kolonne 2 mllmin. Individuelle data fra kanin 4 Resultater aktivert økende mengde gassbobler. Aktivert C5a ble målt ved hjelp av monoklonalt antistoff Som et gjennomsnitt gjennom denne tidsperioden peker K349 seg ut til å være den mest

26 Ø K949/0.SmI (e) 0jri C J c 400 c Q I!) Ca) K37312m Ii.ii olr 200 (b) (d) V gassflow/min. K949, K373, K365, K473, K349 og K493 ved 6forskjellige anledninger ved 0.5, I og 2 ml Fig. 5 a,b,c,d,ej Konsentra.sjonen av øket C5a (ng/ml) presentert individuelt for 6 kaniner, R K949/2m ooo] S K349/2m Q K365/lmI 1400] Ø K47311m1 i G K36510.SrnI 1600 G K473/0.5m I G K949/1m K373/lmi i 1400 K34911m B 6004 I 600I.j i 1600 J D K449/O.5m1 D K m1 I 3/4 18/4 3/5 16/5 15/ /4 18/4 3/5 16/5 15/6 18/10 800]I 8001 i 3/ /5 16/5 15/6 18/10 3/4 18/4 3/5 16/5 1 5/6 18/10 Dato Dato Dato Dato III 3/4 18/4 3/ /6 18/10 3/4 18/4 3/5 16/5 15/6 18/10 K365/2m K47312m I I 1200] K493/2m G K49311m1 i Hr 2003 I ELIL A 1800 (c) 1800 Dato Dato liii Q K373/0.EmI i 1r44 1 i I i

27 ci ci 150 Q In In 0) Lfl (c) 2 0) A12m1 Q B10.5m DC (e) 100 0) D/2m 150 C/lmI D C/O.5m I N0.5m1 (a) 200 (b) IntraJinterindividuell variasjon i CSa over tid hos mennesker _ Fig. 6 a,b,c,d,e,f Konsentra.sjonen av øket C5a(ng/ml) presentert individuelt for 6 individer, individ A,B,C,D,E og F ved 6forskjellige anledninger ved 0.5, i og 2 ml gassflow/min. 8/ /12 18/12 3/1 16/1 8/11 21/ /12 3/1 16/1 r1:t: Co+jrlCl i 50 E1o.5m1 Dato Dato 8/11 21/11 4/12 18/12 3/1 16/1 8/11 21/ /12 3/1 16/1 () R Cm1 200 (d) Dato Dato 0d1iM 8/11 21/11 4/12 8/12 3/1 16/9 8/11 21/ /12 3/1 16/1 G J1mII G BIlmI tltrilria2r1 E 100 Ellmi G F/lmI F1df1 OfEIrjfI,41Ti 0 0) Dato Dato D D/0.5m1 Q FiJ.5mI G DflmI

28 26 2 mllmin Økning i C5a den 4/12 fra i til 2 ml gassflow/min, mens økningen den 3/1 var på 266 %. anledninger (8/il, 21/11, 4/12, 8/12, 3/1 og 16/9). Resultatene van full overensstemmelse med det som ble funnet hos kanin; graden av komplementaktivering varierer over tid for alle individene og kan derfor ikke fonnsies på forhånd. Videre sees en økning i C5a med økende individ B den 18/12 hvor det ble målt en 49 % reduksjon i C5a og individ C den 4/12 som var mengde gassflow som hos kanin, bortsett fra hos to individer ved ett tilfelle. Disse to var nærmest upåvirket i C5a respons ved å øke flowen fra i til 2 mllrniri. Det ble også målt store intraindividuelle forskjeller i C5a med Økende mengde gassflow; individ B har bare en 10 % kanin og humant serum (henholdsvis p <0.001 og p <0.001 ved paret Student ttest). Dose respons effekt ble påvist ved en signifikant større mengde C5a dannet ved en gassflow på i mllmin sammenlignet med en gassflow på 0.5 mllmin (kaninserum: p < og humant C gassbobler ved en flow på 0.5 mllmin og kontrollgruppen var statistisk signifikant for både Tabell 4 viser at tilstedewærelsen av gassbobler både i kanin og humant serum inkubert ved (458.3) (32.3) I mllmin (398.2) 81.5 (26.1) 0.5 mllmin (172.9) 57.5 (14.9) Kontroll (104.5) 40.6 (11.7) kaninserum humant serurn Stimuli C5a (nglml), (SD)* *( =36) Tabell 4. Effekten av luftbobler på generering av C5a hos både kanin og menneske Effekten av gassbobler på C5a og dose/responseffekt forhold til kontrollene ved henholdsvis 0.5, i og 2 ml gassflow/min ved seks forskjellige Fig. 6 a,b,c,d,e,f viser individuelle data for 6 mennesker presentert som ng/ml økning i C5a i 37 C har en klar innvirkning på dannelsen av C5a. Forskjellen mellom serum inkubert med seruin: p < 0.001). Tilsvarende ble det målt en signifikant større mengde C5a ved en gassflow på 2 mllmin sammenlignet med en gassflow på 1 mllmin (kaninserum: p <0.001 og humant serum: p < 0.001).

29 L).s 1200 (a) Kanin serum (b) Humant serum forskjellige anledninger. (n=36). på bare 32 %, mens humant serurn viste en tilsvarende økning på. 43 %. fordobling av gassflow fra i til 2 mllmin resulterte i en langt mer beskjedent økning for kanin Økning i C5a for kanin på 130 %, mens tilsvarende resultat for humant lå på 42 %. En Fig. 7 a,b (og tab. 4) viser at en økning i gassflow fra 0.5 til i mllmin resulterte i en kraftig cu mi/mn 1 mvmin 2 m/min 0.5 mi/niin 1 m/min 2 m/min Gass flow Gass flow humant serum. Verdiene er gjennomsnittsverdier med standardavvik for 6 individer ved 6 Fig. 7 a,b. Graden av komplementakrivering ved 0.5, i og 2 ml gassflow/min for kanin og

30 (c) 0 & aktivert med 0.5 ml flow/min, ng/ml aktivert med 2 ml flow/min, ng/ml (b) (a) Sammenhengen mellom kontrollverdier og aktivering med gassbobler Fig. 8 a,b,c. Sammenhengen mellom kontroliverdier (fravær av lziftbobler) og aktivering med Fig. 8 a,b,c viser at det er en sammenheng mellom koritrollverdiene for C5a og graden av 0.5, i og 2 ml flow/min hos kaniner. aktivering; dess høyere kontrollverdi dess høyere blir C5a etter aktivering. Med andre ord; 0.58 (p <0.0002). faktoren mellom kontrollverdiene og aktivering med 0.5 mllmin gassflow var på 0.94 graden av aktivering med gassbobler synes avhengig av utgangsnivået av C5a. Korrelasjons (p <0.0001). Tilsvarende verdier for 1 og 2 mllrnin var på henholdsvis 0.83 (p <0.0001) og , aktivert med 1 ml flow/min, ng/ml

31 29 og 0.68 (p <0.0001). (b) (c) aktivert med 0.5 ml flow/min, ng/mi (a) Fig. 9 a,b,c. Sammenhengen mellom kontroliverdier (fravær av luftbobler) og aktivering med 0.5,] og 2 tnlflow/minforhumantserum.. Fig. 9 a,b,c viser at det også for humant serum er en sammenheng mellom kontroliverdiene og 0.89 (p <0.0001). Tilsvarende verdier for i og 2 mi/min var på henholdsvis 0.80 (p < ) graden av aktivering for C5a; dess høyere kontroliverdi dess høyere bli C5a etter aktivering. Korrelasjonsfaktoren mellom kontroliverdiene og aktivering med 0.5 mllmin gassflow var på aktivert med i ml flow/min, ng/ml aktivert med 2 ml flow/min, ng/ml

32 30 c :: (3 200 c Li E Il, 2( E 150 (c) (d) post i.dyk pre 1.dykk (b) Komplementaktivering av serum og nivået av komplement i plasma 4.2 Resultater fra studie 2 utført. Første kolorine er blodprøver tatt før dykket og andre kolonne er prøver som ble tatt to sykdom og * innebærer at dykkeren hadde forbigående smerter, men behandling ble ikke etter andre eller tredje dykket. Dykkere som står oppført med bare en, eventuelt to kolonner er timer etter at de kom på overflaten. Tredje kolonne representerer prøver som er tatt to timer de som utviklet DCS eller de nye dykkerne som erstattet disse. 4 som ble rammet av DCS og måtte behandles. Disse ble erstattet av nye dykicere som 1.1 i Resultatene for henholdsvis serum og plasma er vist i fig. 10 og fig. 11. Av 19 dykkere var det Fig. 10 a,b,c,d. Konsentrasjonen av Øket C5a (ng/mi) i forhold til kontroliverdiene i serum hos dykkere i Team A, B, C og D presentert før 1. dykk, etter dykket og etter 2. eller 3. dykket. erstattet av dykker 1.1 som utviklet DCS umiddelbart etter at han kom på overflaten. Det ble team C, dykker i og 1.1 i team D. Dykker i i Team D som utvildet DCS etter første dykket ble team A, 2.2 i team C og 1.1 i team D. De som uwiklet DCS var dykker i i team A, dykker 2 i derfor ikke tid til å ta en ny blodprøve av han etter dykket. To dykkere hadde forbigående muskel og/eller leddsmerter, men behandling ble ikke utført. DCS står for dekompresjons CD 150 Ø postl.dykk 1 DCS * DCS i DCS1.1 DCS [.1 Ii post Z.dykk D post Z.drve R pre i I pre i.drve D posti.dive Team A Team B Team C Team 0 :: i,i[i,i Q post 3.ayck

33 .Ii (c) Team A Team 6 Team D I 30 post.3.dykk Ø post.1.d1k 50 dykk, etter dykket og etter 2. eller 3. dykket. før og etter ett, to eller tre dykk hos dykkerne (Student s paret ttest); noen stiger og noen Fig. 11 a,b,c,d. C5a nivået i plasma (ng/ml) for dykkere i Team A, B, C og D presentert før 1. Fig. 10 a,b,c,d viser at det var ingen signifikant forskjell i semmnivået og graden av aktivering 31 EDTA direkte under blodprøvetakingen og viser derfor C5a aktivering invivo som følge av dykk hadde ingen innvirlciing på C5a nivået i plasma. Fig.11 a,b,c,d viser C5a nivået i plasma for de samme dykkerne. Blodprøvene ble tilsatt ved Student s ttest), men ikke signifikant forskjellig etter 2. euer 3. dykk. Gjentatte vaskulære bobler. Nivået av C5a i EDTAplasma var signifikant lavere etter første dyk.k (p < Team C ore.1.dykk 1DCS 2* 3 4 i 2 3* posl2.dykk i DCS1,1 DCS D post.1.dykk G post 1.dykk pre.1.dykk (a) (b) G post 3.dykk pre.1.dykk Øvrige dykkerne som ikke hadde noen symptomer. vitro. Som figuren tydelig viser er det heller ingen forskjell i C5a aktivering mellom de fire faller. Gjentatte dykk påvirket med andre ord ikke graden av aktivering med gassbobler in dykkerne som utviklet DCS og de to som hadde forbigående smerter sammenlignet med de

34 32 0 cn c1 6 B. 2O0 L) U IJ E A. 80 p go.ssbobler invitro (B) Sammenhengen mellom DCS og C5a Fig. 12 A, B. Forholdet mellom DCS og C5a i serumkontroll (A) og etter akrivering med aktiveringsverdiene (B) for alle dykkerne tatt umiddelbart før første dykk. Dykkerne er delt i to Fig. 12 A,B viser henholdsvis kontroliverdiene for serurn (A) og den tilsvarende økning i grupper; gruppe 1 (n= 6 dykkere) fikk problemer og utviklet DCS som følge av dykk(ene) og dekompresjonssykdom, og de som er merket med en, er de to dykkerne som hadde gruppe 2 (n 13 dykkere) var symptornfrie. Kolonner merket med DCS indikerer de som fikk forbigående smerter. Lt ) c) Gr.1; n=6 dykkere Gr.2; n=13 dykkere Gr. 1; n=6 dykkere Gr.2; n=13 dykkere c.j cn rc.jjjjjjiii

35 Dykker no Dykker no (i 20 4Q.i og c). etter 1.dyklc for 17 av 19 dykkere. (2 dykkere er utelatt da de manglet plasmaprøver; dykker Fig. 13 a,b,c illustrerer forholdet mellom eventuelle vaskukere bobler og C5a i EDTAplasma Fig. 12 A representerer kontrolidataene. Denne viser stor spredning i dataene, som f.eks Sammenhengen mellom vaskukere bobler og CSa i plasma Gjennornsnittsverdien for gruppe 1 var 21 ng!ml (range 446), mens for gruppe 2 var verdien dykker no. 7 og dykker no.11. De to har et C5anivå på henholdsvis 60 nglml og 2 ng/ml. no.4 og dykker no.7). Det ble detektert gassbobler hos 12 dykkere etter første dykk. (fig. 13 b på 24 nglml (range 260). mange bobler, grad 3 eller 4 (c). dykkerne. Gruppe i har en gjennomsnittsverdi på 107 nglml og gruppe 2 har en gjennomsnittsverdi på 101 nglrnl. Hverken kontrollverdiene eller de aktiverte verdiene var signifikant forskjellig hos de 6 dykkerne som hadde problemer sammenlignet med tilsvarende resultater for gruppe 2. Med andre ord ble det ikke funnet noen direkte sammenheng mellom nivået av Fig. 12 B viser tilsvarende Økning i C5a i serum etter aktivering med gassbobler for de samme dykkere; 5 dykkere uten bobler (a), 7 dykkere med bobler grad 1 eller 2 (b) og 5 dykkere med Fig. 13 a,b,c. Forholdet mellom vaskukere bobler og C5a i plasma etter 1. dykk hos 17 E Lf L) C5a, aktivering invitro og DCS E L) 10 0 Dykker no E I ) r

36 34 signifikant. De med mange bobler lå signiffkant lavere i C5a (p <0.045, Mann Whitney U). (;ingen eller få bobler) og sammenligne den med gruppe c (;mange bobler) fant en at det var Gruppe a: dykker no. C5a før dykk (nglml) C5a etter dykk (nglml) I figur 13 a hvor ingen vaskukere bobler ble detektert hos de 5 dykkerne etter 1. dykk, var Gruppe b: dykker no. C5a før dykk (nglml) C5a etter dykk (nglml) middelverdien av C5a 15 nglml (range 422). Mens i figur 13 b og 13 c hvor vaskulcere bobler Gruppe c: dykker no. C5a før dykk (nglml) C5a etter dykk (ng]rnl) var detektert, gradert henholdsvis (12) og (34) ut i fra en modifisert Spencerskala, var middelverdien 12 nglml (range 730) og 8 nglml (range 515). Ved å slå sammen gruppe a og b Middelverdien av C5a før dykk for gruppe a var 18 ng/ml (range 63 1), gruppe b var 20 nglml dykk sammenlignet med gruppe a og b (p < 0.027, MannWhitney U). Nivået av C5a hos de (range 1433) og gruppe c var 9 ng/ml (range 616). Gruppe c lå signifikant lavere i C5a før med mange vaskulære bobler etter første dykk lå lavere både før og etter dykk sammenlignet med de Øvrige dyk.kerne med ingen eller få vaskulære bobler. symptorner, men ble ikke behandlet. I gruppe a hadde ingen dykker symptomer. Dykker no. 1, 2 og 3 fikk DCS og ble behandlet. Dykker no. 5 og 6 hadde forbigående Tabell 5. Nivået av C5a før og etter 1.dykk hos gruppe a, b og c