Parallel artificial liquid membrane extraction av et basisk legemiddel og dets polare metabolitter fra urin

Transkript

1 Parallel artificial liquid membrane extraction av et basisk legemiddel og dets polare metabolitter fra urin Patryk Oskar Grafinski Masteroppgave ved avdeling for farmasøytisk kjemi Faggruppen for legemiddelanalyse 45 studiepoeng Farmasøytisk institutt Det matematisk-naturvitenskapelige fakultet UNIVERSITETET I OSLO Mai/2017 I

2 II

3 Parallel artificial liquid membrane extraction av et basisk legemiddel og dets polare metabolitter fra urin Veiledere: Stig Pedersen-Bjergaard Professor ved seksjon for farmasøytisk kjemi Farmasøytisk institutt Universitetet i Oslo Astrid Gjelstad Førsteamanuensis ved seksjon for farmasøytisk kjemi Farmasøytisk institutt Universitetet i Oslo Kristine Skoglund Ask Stipendiat ved seksjon for farmasøytisk kjemi Farmasøytisk institutt Universitetet i Oslo III

4 Patryk Oskar Grafinski 2017 Parallel artificial liquid membrane extraction av et basisk legemiddel og dets polare metabolitter fra urin Patryk Oskar Grafinski Trykk: Reprosentralen, Universitetet i Oslo IV

5 Sammendrag For første gang ble det vist at parallel artificial liquid membrane extraction (PALME) var i stand til å ekstrahere et basisk legemiddel og tilhørende metabolitter med store forskjeller i polaritet (-1.2 < log P < 2.5) fra urin i ett prøveopparbeidelsestrinn. Modellsubstansene i dette prosjektet var legemidlet venlafaksin med tilhørende metabolitter, hvorav to av disse var glukuronider med zwitterioniske egenskaper. PALME ble utført fra kommersielle 96-brønnsplater. Modellsubstansene ble ekstrahert fra alkalisk urinprøve (donorfase), gjennom en supported liquid membrane (SLM) av organisk løsningsmiddel immobilisert i en porøs membran av polyvinylidenfluorid (PVDF), og inn i sur vandig akseptorfase. Etter ekstraksjon ble akseptorfasen analysert direkte med ultra-high performance liquid chromatography-mass spectrometry (UHPLC-MS). Optimalisering av ekstraksjonsbetingelser fokuserte i stor grad på den kjemiske sammensetningen av fasene i PALME. Donorfasen besto av 125 µl urinprøve som ble justert med 115 µl 0.75 M bikarbonat-karbonatbuffer med ph 10.5 og 10 µl intern standard (venlafaksin-d6 hydroklorid). SLM hadde et volum på 4 µl. Den var sammensatt av et helt nytt organisk løsemiddel i PALME sammenheng, tripentylfosfat, som ble blandet sammen med 25% av en bæremolekylløsning, Aliquat 336. Aliquat 336 er en teknisk blanding av alkylerte ammoniumklorider med trioktylammoniumklorid som hovedkomponent. Akseptorfasen var 50 µl av en 20 mm maursyreløsning. Ekstraksjoner foregikk i 45 min og ble fremmet av et orbitalt ristemønster med en hastighet på 900 rpm. Metoden gjennomgikk en evaluering basert på retningslinjer fra de europeiske legemiddelmyndighetene (EMA) der både intra- og interdaganalyse ble gjennomført. Korrelasjonskoeffisienter (r 2 ) for linearitet hadde verdier mellom 0.98 og Over 90% av resultatene fra evalueringen oppfylte krav med hensyn på presisjon og nøyaktighet. Det ble ikke observert overdrag i systemet. Resultatene bekreftet potensialet av PALME og åpnet veien for ytterligere applikasjoner med polare analytter eller analytter innenfor et betydelig polaritetsvindu. V

6 Forord Hei Kristine, Astrid og Stig. Valideringsresultater vises i tabellen under. Veiledningsvalidering Oppfølging (r 2 ) 1 Presisjon og nøyaktighet av Alle QC godt innenfor krav tilbakemeldinger Tilgjengelighet over tid Stabilt på svært høyt nivå Tilbakemeldingstid Svært kort Overdrag av negative følelser eller andre Aldri observert uønskede effekter Konklusjon: Valideringsresultater bekrefter ypperlig kvalitet av data. Det er derfor høyst nødvendig å takke for den hyggelige og spennende tiden jeg hadde på legemiddelanalyse siden det er vel fortjent. Tusen takk skal dere ha! Dere som alltid er «alle andre på avdelingen», Cecilie, Trine, Øystein, Leon, Chuixiu, Elisabeth, Inger, Marthe, Linda, Magnus og Maren takk for den trivelige tiden vi hadde sammen. Clarissa og Ida, det var gøy og vet dere hva deres navn slutter på a - what a coincidence. Elin Vyvy det ville vært altfor kjedelig og altfor stille uten deg. Gladys 我的朋友, 你是个非常独特人, 非常荣幸认识你 Så er det deg Bassem. Du gjorde de fem siste årene helt topp. Jeg kunne ha skrevet veldig mye om deg og det ville ha vært kun positive ting. Jeg tror at å kalle deg for en bror fra en annen mor oppsummerer alt. Mamma, pappa TAKK! Det er fint å bli ferdig men det var mange kule mennesker, mye lek på laben og med skrivingen så det er også trist. Vel, jeg har i hvert fall kjennskap til venlafaksin Oslo, mai 2017 Patryk VI

7 Innholdsfortegnelse Forkortelser Innledning Bakgrunn Hensikt Teori Analytter og matriks Venlafaksin og dens metabolitter Urin som biologisk matriks Prøveopparbeidelse Væske-væske ekstraksjon Væske-fase mikroekstraksjon Parallel artificial liquid membrane extraction UHPLC MS Elektrospray-ionisering To-dimensjonal ionefelle Materialer og metoder Fysikalsk-kjemiske egenskaper av analytter Utstyr Kjemikalier Løsninger og buffere Tillaging av buffere Løsninger Stamløsninger Arbeidsløsninger Standarder Internstandard Biologisk matriks Mobilfaser Instrumentelle betingelser UHPLC MS/MS Utførelse av PALME Vandige prøveløsninger VII

8 Biologiske prøveløsninger Utvelgelse av SLM Optimalisering av ekstraksjonen Optimalisering av organisk fase Optimalisering av mengden til ionisk bærer Optimalisering av buffer ph i donorfasen Optimalisering av styrken i akseptorfasen Optimalisering av ekstraksjonstid Optimalisering av bufferstyrken i donorfasen Evaluering av metoden Laveste deteksjonsgrense og kvantifiseringsgrense Linearitet Overdrag Presisjon og nøyaktighet Matrikseffekter Ekstraksjonsutbytte Beregninger Resultater og diskusjon Innledende forsøk Utvelgelse av SLM del Utvelgelse av SLM del Utvelgelse av SLM del Testing av ph-betingelser i donorfasen Utvelgelse av SLM del Utvelgelse av SLM del Utvelgelse av SLM ved samtidig testing av utvidede ph-betingelser i donorfasen del Utvelgelse av ionisk bærer Testing av ulike løsemidler og styrker i akseptorfasen Optimaliseringsforsøk Optimalisering av SLM Optimalisering av buffer ph i donorfasen Optimalisering av styrken i akseptorfasen Optimalisering av ekstraksjonstid Optimalisering av bufferstyrken i donorfasen VIII

9 Testing av motioner Evaluering Laveste deteksjonsgrense og kvantifiseringsgrense Linearitet Overdrag Presisjon og nøyaktighet Matrikseffekter Ekstraksjonsutbytte Konklusjon Referanseliste Appendix IX

10 Forkortelser A336 Aliquat 336 Arb C18 Cl CYP450 DBPi DCMA DMSO EMA EME ESI HCl HCOOH HEPT HF-LPME HPLC K LC LIT LLE LOD LOQ LPME Arbitrary units Oktadecyl Klor Cytokrom P450 Dibenzylfosfitt Dodecyltrimetylammoniumbromid Dimetylsulfoksid European Medicines Agency Electromembrane extraction (Elektromembranekstraksjon) Elektrospray-ionisering Hydrogenklorid Maursyre Høydeekvivalenten til en teoretisk plate Hollow-fiber liquid phase microextraction High-pressure liquid chromatography Kalium Liquid chromatography (Væskekromatografi) Linear ion trap (Lineær ionefelle) Liquid-liquid extraction (Væske-væske ekstraksjon) Laveste deteksjonsgrense Laveste kvantifiseringsgrense Liquid-phase microextraction (Væske-fase mikroekstraksjon) 1

11 m/z MS MS 2 Na NaCl NaOH NDV NNDODV NNDODVGLU NODV NODVGLU NPOE ODV PALME PVDF QC-prøve r 2 RF rpm RSD SDME SLE SLM SNRI Masse over ladning Mass spectrometry (Massespektrometri) Tandem massespektrometri Natrium Natriumklorid Natriumhydroksid N-desmetyl venlafaksin N,N-didesmetyl O-desmetyl venlafaksin N,N-didesmetyl O-desmetyl venlafaksin glukuronid N,O-didesmetyl venlafaksin N,O-didesmetyl venlafaksin glukuronid 2-nitrofenyloktyleter O-desmetyl venlafaksin Parallel artificial liquid membrane extraction Polyvinylidenfluorid Kvalitetskontrollprøve Korrelasjonskoeffisient Radiofrekvens Omdreininger per minutt Relativt standardavvik Single drop microextraction Supported liquid extraction Supported liquid membrane Serotonin-noradrenalin reopptakshemmer 2

12 SPE SRM TBAP TBP TDA TEAB TEHP TEHPi TFA TIOPi TOA TPP UDPGT UHPLC V VEN Å Solid phase extraction (Fast-fase ekstraksjon) Selected reaction monitoring Tetrabutylammoniumfosfat Tributylfosfat Tetradecylammoniumbromid Tetraetylammoniumbromid Tris(2-etylheksyl)fosfat Tris(2-etylheksyl)fosfitt Trifluoreddiksyre Triisodecylfosfitt Trioktylamin Tripentylfosfat UDP-glukuronosyltransferase Ultra-high-pressure liquid chromatography Volt Venlafaksin Ångstrøm 3

13 1. Innledning 1.1. Bakgrunn Det er et stort behov for å måle legemidler, dopingmidler, narkotiske stoffer eller deres metabolitter i biologiske væsker som blod, urin eller spytt. Nytten av slike målinger er spesielt synlig i terapeutisk legemiddelmonitorering, dopingkontroll eller rettstoksikologi. Slike målinger kan også ha høy relevans i legemiddelutvikling (drug discovery). Formålet med dem er å identifisere og bestemme konsentrasjonen av de nevnte stoffgruppene (1). Utfordringen er ofte en altfor kompleks sammensetning av matriks som forhindrer direkte injeksjon av prøven i det analytiske instrumentet. Faren for forurensing av instrumentet eller oppnåelse av unøyaktige resultater skaper behovet for et foregående trinn. Det er kjent som prøveopparbeidelsestrinnet. Dets hovedformål er å gjøre prøven kompatibel med etterfølgende separasjon og deteksjon (1, 2). De veletablerte teknikkene som væske-væske ekstraksjon (liquid-liquid extraction: LLE) og fast-fase ekstraksjon (solid phase extraction: SPE) er fortsatt mye brukt. Ekstraksjonsmekanismene er godt kjent og begge har mange anvendelsesområder (1, 3). Automatiseringspotensial, mindre prøvevolumer samt løsemiddel forbruk og forbedret tidseffektivitet var faktorer som initierte interessen for å miniatyrisere teknikkene. LLE ble videreutviklet til væske-fase mikroekstraksjon (liquid-phase microextraction: LPME) (4, 5). Hollow-fibre liquid phase microextraction (HF-LPME) er en form av LPME som ble introdusert på slutten av 1990-tallet (6). Den teknikken kan opereres i et tre-fase system som gir muligheten for en selektiv ekstraksjon av analytter fra den vandige donorfasen via supported liquid membrane (SLM) med organisk fase til den vandige akseptorfasen. Donorfasen inneholder prøven mens akseptorfasen er løsningen som kan injiseres direkte i LC-MS (7). Utfordringer knyttet til automatisering av den sistnevnte teknikken førte til utvikling av parallel artificial liquid membrane extraction (PALME) som i stor grad ligner på HF-LPME (8). PALME er konstruert av to 96-brønnsplater som klemmes sammen under ekstraksjon. Den ene kalles for donor- mens den andre for akseptorplaten og inneholder henholdsvis donor- og akseptorfasen. De separeres fra hverandre med en flat SLM som forsegler bunnen av akseptorplaten (8). Ekstraksjonsprinsippet baseres på diffusjonen av analytter fra donorfasen via SLM til akseptorfasen. Prosessen fremmes blant annet av riktig ph-justering som påvirker distribusjonskoeffisienter og risting av platene. Det organiske løsemiddelforbruket i PALME overskrider vanligvis ikke 500 µl for 96 prøver. Analytter, som for eksempel legemiddelstoffer, 4

14 i biologiske prøver med et volum på opptil 250 µl kan ekstraheres ved bruk av PALME (8). En av de store fordelene med PALME er akseptorfasen som er kompatibel med LC-MS. Fordampning av løsemiddel og gjenoppløsning i mobilfase før LC er således ikke nødvendig (8). Publikasjonen hvor PALME ble introdusert bekreftet at denne teknikken var egnet for ekstraksjoner av hydrofobe basiske legemidler som petidin, nortriptylin, metadon og haloperidol (8). De etterfølgende studier utvidet applikasjonsområdet med sure legemidler og viste at PALME hadde potensialet for å rense plasmaprøven opp fra fosfolipider (9, 10). I nylig publiserte artikler ble PALME benyttet for ekstraksjoner av analyttblandingen som besto av nye psykoaktive substanser og polare legemiddelstoffer (11, 12). I den sistnevnte studiens hadde de basiske legemidlene log P-verdier mellom 1.3 til Deres ekstraksjonsutbytter var mellom 50 og 89% (12). Disse studiene benyttet plasma eller fullblod som matriks og de benyttede analyttene var stort sett upolare forbindelser med log P>2 (8, 9, 11, 12). I denne masteroppgaven ble det benyttet en analyttblanding som hadde et bredere spekter av fysikalskkjemiske egenskaper i forhold til tidligere forskningsprosjekter. Analyttene omfattet således legemidlet venlafaksin (log P = 2.5), som var modersubstansen, og en rekke polare metabolitter. Disse inkluderte glukuronidene (log P = -1.2) som var de mest polare analyttene med amfotære egenskaper. Plasma og fullblod som matriks ble erstattet med urin. Polare metabolitter og særlig glukuronider er vanskelige å ekstrahere via SLM. Grunnen til dette er deres begrensede fordeling over i SLM (12). I et tidligere studie med HF-LPME ble det benyttet bæremolekyler i SLM for å fremme ekstraksjonen av polare legemidler der atenolol med log P på 0.01 var det mest hydrofile stoffet (13). Akseptorfasen besto av 50 mm HCl som ikke var det optimale løsemidlet for LC-MS på grunn av lav ph. En annen publikasjon relaterte til HF-LPME som studerte ekstraksjon av tre tetrasykliner som hadde log P-verdier mellom og -3.6 (14). Disse legemidlene hadde i likhet med glukuronider zwitterioniske egenskaper. Ekstraksjon ble oppnådd med bruk av NaCl i akseptorfasen som ble etterfulgt av HPLC-UV deteksjon, men i kombinasjon med LC-MS er dette systemet lite attraktivt. I tillegg tyder tendenser på at ultra-high-pressure liquid chromatography (UHPLC) koblet med et massespektrometer (MS) får enda større betydning i de kommende årene (15). Grunnen til det er at UHPLC er en kostands- og tidseffektiv separasjonsmetode mens MS klarer å operere med lavere konsentrasjonsnivåer og høyere selektivitet i forhold til andre deteksjonsteknikker (1). Få HF-LPME studier har beskrevet ekstraksjoner av analyttblanding som ligner på den fra denne studien ved samtidig bruk av LC-MS/MS. I en av dem ble østron, østradiol og 5

15 etinyløstradiol ekstrahert med tre tilhørende glukuronider. Denne analyttblandingen hadde log P-verdier mellom 1.1 og 4.2 (16). De var dermed to enheter høyere i forhold til dette prosjektet. Akseptorfasen besto i tillegg av høykonsentrert saltløsning. Det skapte dermed kompatibilitet utfordringer med MS (16) Hensikt Som nevnt ovenfor, fokuserte de tidligere PALME forskningsprosjektene i stor grad på blandinger av forholdsvis upolare legemidler eller narkotiske substanser. Det er også få HF- LPME publikasjoner i dette tema. Hensikten med dette prosjektet var å utvide applikasjonsområdet til PALME. Det var ønskelig å undersøke om denne teknikken kunne ekstrahere enda mer polare analytter som i tillegg hadde amfotære egenskaper. Fokuset ble lagt på ekstraksjoner av modersubstansen og de tilhørende metabolittene fra biologisk matriks for å etterligne en reel situasjon. Ekstraktene skulle videre analyseres ved hjelp av UHPLC-MS/MS. Dette konseptuelle arbeidet ble avsluttet med evaluering. Den hadde som formål å bekrefte kvaliteten av data. Hensikten med dette prosjektet oppsummeres i den punktvise oversikten: Utvikle en UHPLC-MS/MS-metode for identifikasjon og kvantifisering av analyttene Undersøke om PALME er egnet for ett-trinnsekstraksjon av et basisk legemiddel og dets metabolitter med et bredt spekter av fysikalsk-kjemiske egenskaper Forbedre ekstraksjonen ved testing av ulike organiske løsemidler i SLM Optimalisere ekstraksjonsbetingelser for PALME fra urin Utføre evaluering av metoden 6

16 2. Teori 2.1. Analytter og matriks Venlafaksin og dens metabolitter Venlafaksin er en serotonin-noradrenalin reopptakshemmer (SNRI). Virkningen påvirker hovedsakelig nevrotransmitterne serotonin og noradrenalin som blir værende i den synaptiske spalten for lengre tidsperioder slik at signaloverføringen mellom nervene blir forbedret. Venlafaksin er et legemiddel som brukes ofte ved behandling av depresjoner og angst (17, 18). De terapeutiske dosene i plasma varierer mellom 100 og 400 ng/ml. De blir optimalisert individuelt med hensyn til indikasjon og type pasient (19). Venlafaksin er et basisk legemiddel på grunn av tertiært amin i sin struktur, som metaboliseres i kroppen. Strukturen av venlafaksin og dens metabolitter er vist i figur 1. Cytokrom P450 (CYP450) systemet er en gruppe enzymer som er involvert i stor grad i de første trinnene av denne prosessen. Disse enzymene finnes i stort omfang i hepatocytter (20). Enzymet CYP2D6 spiller en avgjørende rolle i metabolismen av venlafaksin selv om 3A4 og 2C19 også er involvert. Individuelle genetiske variasjoner kan bidra til forandringer i metabolismeaktiviteten. CYP450 demetylerer venlafaksin og gjør den dermed mer polar (17, 20). Metabolitter fra fase I viser mindre potent farmakologisk effektivitet, der den mest virksomme er O- desmetylvenlafaksin (18). De metaboliseres videre ved hjelp av UDPGT enzymer i fase II metabolisme til glukuronider. Disse er enda mer polare forbindelser som i tillegg får amfotære egenskaper (17). Over 90% av venlafaksin og dens metabolitter skilles ut med urinen (18). 7

17 Venlafaksin NDV ODV NODV NNDODV NODVGLU NNDODVGLU Figur 1 Metabolismen av venlafaksin (17, 21) Urin som biologisk matriks Urin er et eksempel på en biologisk matriks. Den er enklere å samle opp enn blod, og sammensetningen er mindre utfordrende. Det er ingen fosfolipider, og forekomsten av proteiner er vanligvis svært liten. Det skyldes filtreringen i nyrene. I tillegg er den tilgjengelig i større volumer (22). Til tross for enklere sammensetning av urin, som i hovedsak består av vann, urea, kreatinin, ioner og en rekke organiske forbindelser, er den fortsatt uegnet for direkte injeksjon i de fleste analytiske instrumentene som eksempelvis LC-MS (22, 23). 8

18 Urin kan forårsake matrikseffekter som enten øker eller undertrykker signalet i LC-MS fra analytten når retensjonstiden er tilnærmet lik (2). Forandret desorpsjon av ioner i ionekilden, eller konkurranse om ladninger er mulige forklaringer for slike effekter i massespektrometre (1). Fortynningsgraden av urinen kan ha en viss effekt i denne prosessen. Kreatinin, som ofte blir brukt i målinger av fortynningsgrad, gir ikke alltid pålitelige resultater (2). Stor variasjon i betingelser mellom de ulike urinprøvene er også en utfordring ved måling av analytter. Ionestyrken og ph er faktorer som raskt kan påvirkes av forandret kosthold eller væskeinntak (1). Den store variabiliteten kan ha negative konsekvenser for nøyaktigheten av kvantitative målinger Prøveopparbeidelse Som nevnt ovenfor kan noen biologiske væsker ha en altfor kompleks sammensetning som umuliggjør direkte injeksjon i det analytiske instrumentet. Det er derfor viktig å ha et trinn som isolerer ønskede analytter og klargjør dem for analysen (1, 4). Prøveopparbeidelsestrinnet kan enten fjerne de uønskede komponentene eller isolere analytter. Det er et viktig trinn i analyseprosessen som bidrar til å minimere matrikseffekter på en mest mulig effektiv måte og å hindre kontaminering av instrumentet. Opprensning av prøven er spesielt viktig hvis analytter finnes i lave konsentrasjoner, typisk på nanogram per milliliter nivå (1, 3). Valg av riktig prøveopparbeidelsesteknikk vil være avhengig av flere faktorer. De kjemiske egenskapene og konsentrasjonsområde til analyttene, sammensetning av matriks eller type analyseinstrument er noen eksempler (1) Væske-væske ekstraksjon LLE er en veletablert prøveopparbeidelsesteknikk og samtidig utgangspunktet for utviklingen av den miniatyriserte versjonen som kalles for PALME (3, 8). Hovedprinsippet i LLE er å ekstrahere ønskede analytter fra den vandige biologiske prøven til den organiske fasen. Forutsetningen er at de to fasene ikke er blandbare med hverandre slik at det dannes to separate lag (1). Ekstraksjonen er mest effektiv for ikke ladede analytter siden de har bedre løselighet i den organiske fasen. For å gjøre dem mest mulig hydrofobe er det viktig å eliminere eventuelle ladninger på funksjonelle grupper. Avhengig av de kjemiske egenskapene til analyttene kan dette oppnås ved å holde prøven to ph-enheter under eller over i forhold til pka-verdien for henholdsvis syrer og baser (3). 9

19 Fordelingskoeffisienten (KD) beskriver distribusjonen av analytten basert på dens konsentrasjon i den organiske og vandige fasen. Ligning 1 som representerer det forholdet, viser at høy konsentrasjon i den organiske fasen krever en høy fordelingskoeffisient (1). K D = [A organisk] [A vandig ] (Ligning 1) I tillegg til ph blir fordelingen avhengig av egenskaper til det organiske løsemidlet og dets interaksjonsevner med analyttene. Blant de potensielle interaksjoner spiller hydrofobe van der Waals krefter, dipol- og hydrogenbindingsinteraksjoner en sentral rolle (1). Valg av det beste løsemidlet kan bli basert på Kamlet og Taft-parametere. De beskriver hydrogenakseptor, hydrogendonor og polaritet egenskaper til en rekke løsemidler (24). Temperatur er enda en faktor som kan påvirke fordelingen av analytten mellom to faser (25). Ekstraksjonsutbytte i LLE er bestemt av fordelingskoeffisienten og volumet av begge faser som vist i ligning 2. Flere etterfølgende ekstraksjoner med mindre volumer istedenfor en med større volum gir bedre utbytter (1). R = K D V organisk K D V organisk +V vandig (Ligning 2) R = ekstraksjonsutbytte Vorganisk = volum av organisk fase Vvandig = volum av vandig fase KD = fordelingskoeffisienten For å forbedre selektiviteten kan det innføres et ekstra trinn som kalles for tilbake-ekstraksjon. Analyttene ekstraheres først fra den vandige fasen til den organiske fasen. I det påfølgende trinnet ekstraheres de tilbake til den andre vandige fasen som vanligvis er justert til en ph som fremmer ionisering. Alle de nøytrale forbindelser blir værende igjen i den organiske fasen mens de ioniserte vil diffundere ut. Tilbake-ekstraksjonen kan fjerne behovet for fordampning og gjenoppløsning siden den vandige fasen med analyttene er kompatibel LC-MS (1). De store fordelene med LLE er fleksibilitet og svært mange anvendelsesområder. Evnen til å gi rene ekstrakter som fjerner de fleste forurensinger, muligheten for å oppnå konsentrerte prøver og relativt god kostnadseffektivitet er andre eksempler på de positive sidene ved denne teknikken. LLE er allikevel ikke fri for ulemper. Høyt forbruk av ofte toksiske løsemidler samt problemer som emulsjonsdannelse er utfordringer som må overvinnes. Det er også fortsatt få eksempler på automatisering av denne teknikken til tross for en del forsøk. Det gjør at teknikken er arbeidskrevende (25). Et eksempel på automatisert LLE er supported liquid extraction (SLE). 10

20 Prøven overføres til brønner og adsorberes av kiselgur. Påfølgende tilsetting av organisk løsemiddel tillater ekstraksjonen av analyttene. SLE kan utføres i 96-brønnsformat (1) Væske-fase mikroekstraksjon Disse ulempene var en av grunnene til utvikling av nye prøveopparbeidelsesteknikker i miniatyrisert skala. LPME er en miniatyrisering av LLE og ble introdusert i midten av tallet (5). Til tross for det var LLE og SPE fortsatt mye brukt i 2006 (4). Fra det tidspunktet ble det publisert signifikant flere artikler som beskrev LPME for ekstraksjoner av legemidler fra biologiske væsker (3). LPME kan utføres som single drop microextraction (SDME) og HF- LPME. Den sistnevnte teknikken var et mellomtrinn i utviklingen av PALME (3, 8). Begrenset forbruk av løsemidler, raskere opparbeidelse, automatiseringspotensiale og etter hvert grønn kjemi var drivkraften bak utviklingen av disse nye teknikkene (3, 4). HF-LPME er en teknikk som ble innført av Pedersen-Bjergaard og Rasmussen (6, 7). Den er presentert i figur 2. I dette systemet omringer prøven, som kalles for donorfasen, et rør som er laget av en porøs polymer. Polypropylen er et eksempel på materiale som brukes for slike formål. Innsiden av røret er fylt med akseptorfasen som er fysisk adskilt fra donorfasen. En egnet organisk løsning fanges i membranporene og danner en SLM (7). En organisk løsning som akseptorfase brukes i to-fase-systemer mens en vandig løsning brukes i tre-fase-systemer. Fordelingen av analytten i et tre-fase-system er representert i ligning 3 der kn er ekstraksjonskonstanter (26). k 1 k 3 A donor A SLM A akseptor (Ligning 3) k 2 k 4 Figur 2 Illustrasjon av tre-fase HF-LPME 11

21 Justering av ph i donor- og akseptorfasen er påkrevet hvis en selektiv ekstraksjon av sure eller basiske analytter er ønskelig. Løseligheten av analytten i donorfasen bør bli minst mulig for å fremme distribusjonen til SLM. Analytten bør derimot bli godt løselig i akseptorfasen for å fremme diffusjonen fra SLM. Riktig ph-justering hindrer også tilbake-ekstraksjon (7). Konsentrasjon i akseptorfasen kan bli beskrevet av en kinetisk modell under forutsetning av at massetransporten gjennom SLM er det hastighetsbegrensende trinnet som sikres av tilstrekkelig omrøring av donorfasen. Det er representert i ligning 4. Det er en funksjon av tid som viser at i tillegg til fordelingskoeffisienten og konsentrasjonen i donorfasen vil volumer i systemet spille en avgjørende rolle på den endelige konsentrasjonen i akseptorfasen (27). C Ai (t) = V 0 DC Di CDi (t)(v D +K di V m ) t t V lag (Ligning 4) A CA = konsentrasjon i akseptorfasen VD = volum av donorfasen CD = konsentrasjon i donorfasen Vm = volum av SLM VA = volum av akseptorfasen 12 Kd = distribusjonskoeffisient C 0 D = opprinnelig konsentrasjon i donorfasen t = tid tlag = tidsforsinkelse HF-LPME tillater flere modifikasjoner slik at denne teknikken åpner for mange anvendelsesområder. Blant mange studier som beviste fleksibiliteten, fantes forsøk som benyttet bæremolekyler for ekstraksjoner av polare stoffer eller belegg på membranen (kalt for moleculary imprinted polymer coated hollow fibers) (13, 28, 29). Bæremolekyler komplekserer med analyttene og danner et mer hydrofobt kompleks som er bedre løselig i den organiske fasen. De dissosierer fra hverandre på grenseoverflaten mellom organisk- og akseptorfase slik at analytten frigjøres mens bærer forblir i SLM (30). HF-LPME krever små volumer av organisk løsemiddel, er relativt enkelt og billig i bruk og ekstrakter egner seg for direkte injeksjon i kromatografiske instrumenter som eksempelvis LC- MS. På tross av stor vitenskapelig interesse for HF-LPME har det vært utfordringer knyttet til automatisering (31) Parallel artificial liquid membrane extraction PALME har mye felles med HF-LPME siden prinsipper bak transporten av analytten til akseptorfasen er svært like. Den store forskjellen er geometrien til membranen som er tynnere i forhold til HF-LPME og er flat. I tillegg er formatet av oppsettet basert på en plate med 96 brønner. De store fordelene med PALME er at teknikken er enklere å automatisere enn HF- LPME og at mange prøver kan ekstraheres parallelt (8, 31).

22 PALME består av en donor- og en akseptorplate. Begge platene er i 96-brønnsformat. Akseptorplaten er tildekket med et lokk for å hindre fordampning av akseptorfasen. Illustrasjonen av utstyret er presentert i figur 3. Donorplaten er laget av polypropylen, og hver brønn har et volum på 0,5 ml. Det optimale prøvevolumet ble funnet til å være 250 µl (8). Akseptorplaten som finnes i samme format, har en porøs polyvinylidenfluorid (PVDF) membran som forsegler bunnen av hver brønn. På denne måten blir begge fasene separert fra hverandre når platene klemmes sammen (8). PVDF er ikke det optimale materialet, spesielt for analytter i svært lave konsentrasjoner, siden utbytte og påliteligheten av resultater kan bli forverret (8). Grunnen til det er ikke-spesifikke bindinger mellom analyttene og membranen. For å dempe bidraget fra dem ble trioktylamin (TOA) tilsatt i noen av de tidligere prosjektene. Det hadde som formål å hindre slike interaksjoner (8, 11). Andelen av TOA var ofte lav, for eksempel 1% av den organiske fasen som immobiliseres i membranporene (11). Det vanlige volumet av organisk løsemiddel som danner SLM, varierte i de fleste tilfeller mellom 3 og 5 µl (32). Dets løselighet i de vandige fasene og flyktighet bør bli lavest mulig for å sikre høy stabilitet av systemet. Det er relevant spesielt ved ekstraksjoner som kan ta opptil to timer (9, 32). Donorfasen er en blanding av en biologisk væske, en buffer som justerer til riktig ph og demper ioniseringen av analyttene, og eventuelt en intern standard. Analyttene blir da ekstrahert via SLM til akseptorfasen (32). Volum på 50 µl er vanlig siden det sikrer god oppkonsentrering og er praktisk i bruk. Mindre volumer av akseptorfase er vanskeligere å håndtere ved pipettering og øker faren for punktering av SLM med pipettespisser (8). Avhengig av egenskapene til analyttene skal akseptorfasen bli riktig tilpasset for å sikre ionisering og diffusjon ut fra SLM. For basiske analytter er det vanlig å bruke en sur akseptorfase der maursyre er en mulig kandidat for slike formål. I tillegg til surgjøring har den god flyktighet og er dermed kompatibel med LC-MS (32). 13

23 Figur 3 Illustrasjon av PALME til venstre og en enkel brønn til høyre For å sikre kontakten mellom donorfasen og den organiske fasen blir de sammenklemte platene ristet. Agitasjonen gjelder også akseptorfasen og sikrer tilstrekkelig masseoverføring i systemet (8). PALME er et nytt konsept innenfor prøveopparbeidelse som allerede har klart å bevise et bredt spekter av anvendelsesområder. Denne teknikken klarte å ekstrahere både basiske og sure legemidler (8, 9). Det ble også dokumentert at PALME var effektiv for opprensing av prøven fra matrikskomponenter som eksempelvis fosfolipider (10). I likhet med HF-LPME er det en utfordring å transportere polare analytter med log P under 1-2 enheter gjennom SLM. Nylig ble det gjennomført forsøk med bæremolekyler som muliggjorde den transporten (12). Elektromembranekstraksjon (Electromembrane extraction: EME) er en modifisert utvidelse av PALME der den passive diffusjonen av analytter blir stimulert av elektrisk spenning som tillater kortere ekstraksjonstider av analytter (33) UHPLC UHPLC er en type væskekromatografi som blir benyttet i stadig større grad (34). Den erstatter gradvis sin forgjenger, high-pressure liquid chromatography (HPLC), som har den samme oppbygningen. Mobilfasen fra reservoaret pumpes via injektor mot kolonnen der separasjonen av analyttene finner sted. De separerte analyttene blir senere målt i en detektor som befinner seg bak kolonnen (35). Den generelle oppbygningen av UHPLC instrumentet er vist i figur 4. 14

24 Figur 4 Generell oppbygning av UHPLC Hovedfordelen med UHPLC ovenfor HPLC er mer robuste pumper som kan tåle trykk på inntil 1400 bar (1, 34). Muligheten for å pumpe med høyere trykk tillater bruk av stasjonærfasepartikler i sub-2-µm størrelsesområde. Partiklene er således vesentlig mindre enn i vanlig HPLC. Det er gunstig for oppnåelse av bedre effektivitet i systemet, som beskrives ved hjelp av høydeekvivalenten til en teoretisk plate (HEPT) (36). Van Deemter plot i figur 5 viser at mindre partikler selv ved høy hastighet av mobilfasen klarer å opprettholde relativt lave HEPT-verdier. Figur 5 van Deemter plot representerer endring av HEPT som en funksjon av økende mobilfasehastighet for ulike partikkelstørrelser der 5 og 3.5 µm anvendes i HPLC, mens 1.5 µm i UHPLC (1) 15

25 De bør bli lave for å sikre høy effektivitet med mindre innflytelse av uønskede faktorer som bidrar til båndspredning. Diffusjonen i mobilfasen (A), eddy diffusjon (B) og massetransporten mellom stasjonær- og mobilfase (C), som er beskrevet nærmere i van Deemters ligning (ligning 5), er hovedfaktorer ved siden av mobilfasehastigheten (u) som kan påvirke HEPT (35). HEPT = A + B + Cu (Ligning 5) u I UHPLC brukes ofte kolonner som er kortere, har mindre indre diameter og er pakket med mindre partikler i forhold til kolonner i HPLC-instrumenter (34). Den radiale fortynningen blir dermed mindre (ligning 6) i UHPLC slik at analytter blir eluert i mer konsentrerte bånd. Det vil gi bedre signal på konsentrasjonsfølsomme detektorer (36, 37). D = c 0 c max = επr 2 (1 + k) 2πLH/v inj (Ligning 6) D = fortynning c0 = konsentrasjonen i prøven cmax = konsentrasjonen i detektoren Ɛ = porøsitet L = lengden av kolonnen H = platehøyden Vinj = prøvevolumet som injiseres k = konstant r = radius av kolonnen I tillegg til forbedret sensitivitet oppnås lavere løsemiddelforbruk og kortere retensjonstider slik at tiden som kreves for analyse, reduseres. Disse fordeler gjør at UHPLC separasjoner kan utføres på kort tid, og at antall prøver som kan analyseres per time blir vesentlig høyere enn for HPLC (38). Begge instrumenter har utover det mange felles egenskaper. En av dem er stasjonærfasen. Det finnes mange ulike materialer som kan gi forskjellige retensjonsmekanismer. Omvendt-fasekromatografi er et av de viktigste prinsippene. Den kan baseres på sfæriske partikler som er laget av silika. De har ulike sidekjeder på overflaten. Oktadecyl, som også kalles for C18, er en vanlig sidekjede. Det er en svært hydrofob stasjonærfase som har mange anvendelsesområder (1, 36). Det er allikevel ikke mulig å feste C18-grupper på alle silanolgrupper på overflaten av silikapartikler. Grunnen til det er sterisk hindring. Det resulterer i dannelsen av såkalte restsilanolgrupper som kan føre til uønskede sekundære interaksjoner med basiske substanser. Endcapping, det vil si derivatisering av disse gruppene, gjør at muligheten for slike reaksjoner blir betydelig redusert (35). En annen viktig utfordring som er knyttet til silikabaserte materialer 16

26 er deres stabilitet i basisk eller svært surt miljø. Slike stasjonærfaser vil løses opp i ph under 2 og over ph 8. Det er dermed viktig å bruke mobilfaser som er justert til ph mellom 2 og 8 (35). Mobilfasen inneholder dermed en buffer i lav konsentrasjon som gjør at miljøet blir surt og stabiliteten til stasjonærfasen bevares. I tillegg spiller den en viktig rolle for retensjonen av analytter med funksjonelle grupper som lar seg ionisere. De andre bestanddeler av mobilfasen er vann og en organisk modifikator. Valg av organisk modifikator kan variere avhengig av ønsket anvendelse og type detektor. Metanol er ofte brukt for slike formål på grunn av lave kostnader og relativt lav toksisitet (1). Hvis stasjonærfasen baseres på C18-kjeder, bør det alltid være minst 5% av organisk modifikator for å opprettholde tilstrekkelig påsetingskapasitet. På denne måten sikres aktivisering av stasjonærfasen (36). Sammensetningen av mobilfasen kan endres i løpet av analysen slik at elueringsstyrken blir påvirket. Det kalles for gradienteluering og krever minst 2 reservoarer med mobilfasen og et egnet utstyr som kan blande dem sammen i riktige proporsjoner. Den type eluering er egnet for analytter med lang retensjonstid. Ulempen med gradienteluering er blant annet behov for reekvilibrering, det vil si at mobilfasesammensetningen må tilbakeføres til den opprinnelige tilstanden for å sikre like elueringsbetingelser for alle prøver (1). Prøveløsninger injiseres i mobilfasen og separeres på kolonnen. Retensjonen og dermed separasjonen er avhengig av fysikalsk-kjemiske egenskaper til analyttene. Retensjonen på omvendt-fase-kromatografi blir i stor grad avhengig av svake men frekvente van der Waalskrefter. De mest hydrofobe analyttene blir retardert kraftigere enn de mer hydrofile og vil dermed ha lengre retensjonstider. Mengden av organisk modifikator kan økes for å bryte de hydrofobe kreftene mellom analyttene og stasjonærfasen raskere slik at fordelingslikevekten blir skyvet mot mobilfasen. Det vil bidra til kortere retensjonstider. På slutten av kolonnen bør analyttene bli separert fra hverandre i smale bånd som overføres til detektor (1) MS UHPLC som er koblet sammen med MS er stadig mer brukt for bioanalyse deriblant applikasjoner som er knyttet til legemiddelmetabolisme (15). De kromatografiske toppene som dannes ved hjelp av UHPLC instrumenter, kan bli smale, og det er allment akseptert at en topp bør bestå av minst 10 målepunkter for å gi grunnlag for pålitelige kvantifiseringsdata (34, 39). Dette øker kravet til detektoren som må ha høyere dataoppsamlingsfrekvens (34). 17

27 Ionekilden, masseanalysator og detektor er tre hovedelementer i MS som muliggjør deteksjonen av analytter (1). Hovedfokus i kommende avsnitt blir lagt på elektrospray-ionisering (ESI) som ionekilden, lineær ionefelle (LIT) som masseanalysator og relevante deteksjonsmodus Elektrospray-ionisering ESI er en vanlig ionekilde som benyttes for analytter som uttrykker polare egenskaper, og som er mulige å ionisere. Den prosessen er vanligvis fremmet av riktig ph i mobilfasen som i tillegg må bestå av flyktige komponenter for å kunne bli brukt i MS detektoren (1). Skjematisk fremstilling av ESI er presentert i figur 6. Mobilfasen strømmer gjennom et kapillærrør som er koblet til en spenningskilde. Vanligvis er det +5 eller -5 kv som gjør at aerosoldråpene som dannes ved hjelp av nitrogengass, får ladning. Tilstrekkelig lav mobilfasehastighet må til for å danne aerosol som vil bidra til optimal ionisering og sensitivitet. Disse dråpene vil gradvis fordampe på sin vei mot masseanalysatoren. Det minkende overflatearealet vil ha samme antall ladninger som den opprinnelige større dråpen. Prosessen vil fortsette helt frem til dråpen oppnår Rayleigh-grensen. Det er det maksimale antall ladninger på en dråpe. Overskridelsen av denne grensen fører til ustabilitet av dråpen og Coulomb-fisjon. I den prosessen dannes mindre dråper. Til slutt er det kun ioner som er igjen når hele væsken fordamper. ESI blir brukt i positiv modus for å detektere ioner som har positiv ladning (1, 40). Figur 6 Skjematisk fremstilling av ESI To-dimensjonal ionefelle Ionefelle er en av flere tilgjengelige masseanalysatorer. De kan deles i to undergrupper som består av 3D og 2D ionefeller. LIT er et eksempel på en 2D ionefelle (1). Den har høyere kapasitet og klarer å fange ionene i betydelig større omfang i forhold til 3D. Den er sammensatt av fire staver som ligner på en kvadrupol med den forskjellen at de er separert fra hverandre i tre deler. Det er vist i figur 7. Ioner som strømmer inn fra ionekilden, blir fanget i den sentrale 18

28 delen av LIT. Det er mulig ved hjelp av riktig spenning som anvendes på begge ender av ionefellen (41). Radiofrekvent (RF) spenning er ansvarlig for å felle ioner radialt, mens likestrøm virker i den aksiale retningen. Helium, som er en kollisjonsgass, bremser ionene og hjelper til å fange dem i den sentrale delen (1, 41). Resonansen brukes for å skyte ut alle uønskede ioner fra LIT. Ioner som blir igjen i ionefellen, aktiveres, og ved hjelp av resonanseksitasjonen skjer det en fragmentering (41). Økende spenning skyter ut ionene fra ionefellen mot detektor der ioner med lavest m/z forlater fellen først. De treffer en elektronmultiplikator som er en detektor. Betydelig forsterket signal blir til slutt omdannet til et massespektrum av en egnet programvare (1). Figur 7 Lineær ionefelle med radial utskyting av ioner Beskrevet virkning av LIT relaterer til tandem MS. I dette systemet utføres to m/z-analyser som følger etter hverandre. Det ønskede molekylionet blir først isolert fra de andre ved hjelp av endring i radiofrekvensen og likestrøm. Etter fragmentering blir de spesifikke produktioner analysert på MS 2. LIT er en tandem-i-tid MS slik at alle operasjoner mellom ionisering og deteksjon av ionet foregår på samme sted. Instrumentet kan virke i ulike modus, men størst fokus blir lagt på det som kalles på engelsk for selected reaction monitoring (SRM). I SRM dannes et nytt massespektrum med helt unike fragmenter fra et bestemt ion slik at metoden sikrer høy spesifisitet og mye strukturelle informasjoner. I tillegg oppnås et mer gunstig forhold mellom signal og støy slik at bakgrunnsstøyen blir lavere (42). 19

29 3. Materialer og metoder 3.1. Fysikalsk-kjemiske egenskaper av analytter Tabell 1 presenterer fysikalsk-kjemiske egenskaper av alle analytter som ble benyttet i dette prosjektet. Molekylstrukturer er tilgjengelige i figur 1. Tabell 1 Fysikalsk-kjemiske egenskaper av analytter Analytt Molekylvekt (g/mol) Molekylformel pka log P Venlafaksin C17H27NO2 9.26± ±0.27 O-desmetyl venlafaksin C16H25NO2 9.33± ±0.26 N-desmetyl venlafaksin C16H25NO ± ±0.26 N,O-didesmetyl venlafaksin N,N-didesmetyl O- desmetyl venlafaksin N,O-didesmetyl venlafaksin glukuronid N,N-didesmetyl O- desmetyl venlafaksin glukuronid C15H23NO ± ± C14H21NO ± ± C21H31NO8 COOH 2.78±0.70 NH 10.24± C20H29NO8 COOH 2.78±0.70 Opplysninger er hentet fra [ ] (43) NH2 9.85± ± ± Utstyr Tabell 2 viser alle komponenter av PALME. Det omfatter begge platene og aluminiumsfolie som tildekket akseptorplaten. Tabell 2 Utstyr for PALME Komponent Beskrivelse Produsent By/Land Akseptorplate med lokk MultiScreen -IP 96-brønnsfilterplate MAIPN4550, klar styren, ikke steril, med Immobilon -P PVDF membran, porestørrelse 0.45 µm Millipore Darmstadt, Tyskland 20

30 Aluminiumsfolie Platemax Pierceable Aluminum Sealing Film Axygen Inc. Union City, CA, USA Donorplate 96-brønnsplate med 0.5 ml brønner, polypropylen Agilent Santa Clara, CA, USA Engangsutstyr som ble benyttet i løpet av prøveopparbeidelsen samt senere trinn av analyseprosessen er vist i tabell 3. Tabell 3 Forbruksmateriell og engangsutstyr Utstyr Beskrivelse Produsent By/Land Autosampler glassvialer Dramglass Eppendorfrør Filtreringsvialer Glassvialer for organisk fase Innsats til vialer Kork til vialer Kork til vialer med organisk fase Løsemiddel reservoar Vial Screw Neck N10-1.5, c, 11.6x32, flat Vials, glass, rolled rim, with plastic snap-cap, 10 ml Microcentrifuge tubes 1.5 ml med lokk, polypropylen Syringeless Filter Device Mini- UniPrep, PTFE filter media with polypropylene housing, porestørrelse 0.2 µm Clear 2ml Screw Top Vial 12 x 32 Mikroinnsats, klart glass, 15 mm topp, 0.1 ml, 31 x 6 mm 9mm PPShrtThrdCp, trans, PTFEvirginal, 53 D, 0.2mm 8mm Open Top Screw Cap, thread, 5mm hole, polypropylene, septum hvit silikon/rød PTFE VWR Reagent Reservoir, 25 ml, PS, ikke steril Nerliens Meszansky AS VWR International BRAND GMBH + CO KG Oslo, Norge Radnor, PA, USA Wertheim, Tyskland GE Healthcare Buckinghamshire, England Supelco VWR International Nerliens Meszansky AS Thermo Scientific VWR International Bellefonte, PA, USA Radnor, PA, USA Oslo, Norge San Jose, CA, USA Radnor, PA, USA ph-papir Universalindikator ph 0-14 Merck KGaA Darmstadt, Tyskland Urinbeger Steril, 100 ml, polypropylen VWR International Radnor, PA, USA 21

31 Pipetter og tilhørende utstyr som ble benyttet i dette prosjektet er vist i tabell 4. Tabell 4 Pipetter Utstyr Beskrivelse Produsent By/Land Mekanisk multikanal pipette med justerbart volum og 8 kanaler Mekanisk pipette med justerbart volum mline µl, µl Sartorius Göttingen, Tyskland Sartorius mline µl, 2-20 µl, µl, µl, µl, µl Pipettespisser Optifit Refill Tips µl, µl, µl, µl, µl, ikke steril Sartorius Sartorius Göttingen, Tyskland Göttingen, Tyskland Stepper Eppendorf Multipette Plus Eppendorf AG Hamburg, Tyskland Tabell 5 presenterer analyseinstrumenter inkludert kolonnen, gass og programvaren som var uforandrete variabler. Tabell 5 Analyseutstyr Utstyr Beskrivelse Produsent By/Land Gass Helium 6.0 Ultra Plus Yara Praxair Oslo, Norge Kolonne LC MS Acquity UPLC HSS T3 kolonne, 100 mm x 2.1 mm ID, partikkelstørrelse 1.8 μm og porestørrelse 100 Å Dionex UltiMate 3000 RS Pump, Column Compartment og Autosampler Thermo Scientific LTQ XL Linear Ion Trap Mass Spectrometer Programvaren Xcalibur version 2.2. SP1.48 Waters Thermo Scientific Thermo Scientific Thermo Scientific Wexford, Irland San Jose, CA, USA San Jose, CA, USA San Jose, CA, USA Elektroniske instrumenter som ble benyttet i ulike trinn av dette prosjektet er vist i tabell 6. Tabell 6 Diverse utstyr Utstyr Beskrivelse Produsent By/Land Analysevekt Mettler AE200 Mettler-Toledo International Inc. Analysevekt 2 Mettler Toledo XS205 Dual Range Mettler-Toledo International Inc. Columbus, OH, USA Columbus, OH, USA 22

32 Ovn Series FD Binder Tuttlingen, Tyskland ph-meter 744 ph meter Metrohm Herisau, Sveits Ristemaskin Heidolph Vibramax 100 Heidolph Instruments GmbH & Co.KG Vortexmaskin IKA MS 3 digital IKA -Werke GmbH & Co. KG Schwabach, Tyskland Staufen, Tyskland 3.3. Kjemikalier Tabell 7 presenterer identifikasjons- og kvalitetsdata av alle analyttene og intern standard. Tabell 7 Referansestoffer Analytt Venlafaksin hydroklorid O-desmetyl venlafaksin N-desmetyl venlafaksin N,O-didesmetyl venlafaksin N,N-didesmetyl O-desmetyl venlafaksin hydroklorid N,O-didesmetyl venlafaksin glukuronid hydroklorid N,N-didesmetyl O-desmetyl venlafaksin glukuronid Venlafaksin-D6 hydroklorid Chemical Abstracts Service (CAS) nummer Renhet Produsent By/Land % (HPLC) Sigma-Aldrich St. Louis, MO, USA % (HPLC) Sigma-Aldrich % Toronto Research Chemicals % Toronto Research Chemicals % Toronto Research Chemicals % Toronto Research Chemicals % Toronto Research Chemicals Certified reference material Sigma-Aldrich St. Louis, MO, USA Toronto, ON, Canada Toronto, ON, Canada Toronto, ON, Canada Toronto, ON, Canada Toronto, ON, Canada St. Louis, MO, USA 23

33 Alle organiske løsemidler og ioniske væsker som ble testet i dette prosjektet er vist i tabell 8. Tabell 8 Organiske løsemidler og ioniske væsker Kjemikalie CAS nummer Renhet Produsent By/Land 1-Butyl-1-metylpyrrolidinium bis(trifluorometylsulfonyl) imid 1-Heksyl-3- metylimidazolium heksafluorofosfat 1-Heksyl-3- metylimidazolium tris(pentafluoroetyl) trifluorofosfat 1-Metyl-3-oktylimidazolium heksafluorofosfat 1-Metyl-3-oktylimidazolium tetrafluoroborat 2-nitrofenyloktyleter (NPOE) High purity Merck KGaA % Merck KGaA High pure Merck KGaA % Merck KGaA % Merck KGaA % Sigma- Aldrich Bis(2-etylheksyl)fosfitt % Sigma- Aldrich Dekanol min 98% Sigma- Aldrich Dibenzylfosfitt NA Sigma- Aldrich Diheksyleter % Sigma- Aldrich Dodecylacetat % Sigma- Aldrich Pentylbenzen % Sigma- Aldrich Tributylfosfat % Sigma- Aldrich Triisodecylfosfitt NA Sigma- Aldrich Trioktylamin NA Cognis Corporation Tripentylfosfat min 97% STREM Chemicals Tris(2-etylheksyl)fosfat % Sigma- Aldrich Darmstadt, Tyskland Darmstadt, Tyskland Darmstadt, Tyskland Darmstadt, Tyskland Darmstadt, Tyskland St. Louis, MO, USA St. Louis, MO, USA St. Louis, MO, USA St. Louis, MO, USA St. Louis, MO, USA St. Louis, MO, USA St. Louis, MO, USA St. Louis, MO, USA St. Louis, MO, USA Cincinnati, OH, USA Newburyport, MA, USA St. Louis, MO, USA 24

34 Tris(2-etylheksyl)fosfitt NA Sigma- Aldrich NA = verdien er ikke tilgjengelig St. Louis, MO, USA Tabell 9 presenterer alle ioniske bærere som ble benyttet i dette prosjektet. Tabell 9 Ioniske bærere Kjemikalie CAS nummer Renhet Produsent By/Land Aliquat NA Cognis Corporation Dodecyltrimetyl ammoniumbromid Tetrabutyl ammoniumfosfat Tetradecyl ammoniumbromid Tetraetyl ammoniumbromid NA = verdien er ikke tilgjengelig Cincinnati, OH, USA approx. 99% Sigma-Aldrich St. Louis, MO, USA >97% Sigma-Aldrich St. Louis, MO, USA >99% Sigma-Aldrich St. Louis, MO, USA min 99% Sigma-Aldrich St. Louis, MO, USA Tabell 10 presenterer kjemikalier som ble benyttet ved tillaging av mobilfaser, buffere og modifiserte akseptorfaser. Tabell 10 Diverse stoffer Kjemikalie CAS nummer Renhet Produsent By/Land Dimetylsulfoksid min 99.5% Merck KGaA Darmstadt, Tyskland Kaliumjodid min 99.5% Merck KGaA Darmstadt, Tyskland Kaliumklorid min 99.5% Merck KGaA Darmstadt, Tyskland Magnesiumnitrat heksahydrat min 99% Merck KGaA Darmstadt, Tyskland Maursyre For mass spectrometry, 98% Metanol Hypergrade for LC-MS Natriumbikarbonat Pro analysi min 99.5% Sigma-Aldrich St. Louis, MO, USA Merck KGaA Merck KGaA Darmstadt, Tyskland Darmstadt, Tyskland 25

35 Natriumdihydrogenfosfat monohydrat Natriumhydrogenfosfat dihydrat % ACS Reag Ph. Eur % ISO Reag Ph. Eur Merck KGaA Merck KGaA Natriumhydroksid % VWR International Darmstadt, Tyskland Darmstadt, Tyskland Radnor, PA, USA Natriumjodid NA Sigma Aldrich St. Louis, MO, USA Natriumkarbonat Pro analysi min 99.9% Merck KGaA Darmstadt, Tyskland Natriumklorid min 99.5% Merck KGaA Darmstadt, Tyskland Trifluoreddiksyre ReagentPlus 99% Sigma-Aldrich St. Louis, MO, USA Urea min 99.5% Merck KGaA Darmstadt, Tyskland Renset vann NA = verdien er ikke tilgjengelig MilliQ water purification system Ultrapure water (type 1) Millipore Molsheim, Frankrike 3.4. Løsninger og buffere Tillaging av buffere Det ble brukt fosfat og bikarbonat-karbonatbuffere i forsøk. De hadde som formål å tilpasse ph til ønsket verdi i donorfasen. Buffere som er beskrevet i dette avsnittet ble tilberedt på bakgrunn av tabeller som finnes i vitenskapelig litteratur (44). Tillaging av bikarbonat-karbonatbuffer med bestemte ph-verdier 500 ml 0.1 M natriumkarbonat løsning g av natriumkarbonat ble oppløst til 500 ml med renset vann. 500 ml 0.1 M natriumbikarbonat løsning g av natriumbikarbonat ble oppløst til 500 ml med renset vann Disse løsninger ble deretter blandet med hverandre i oppgitte forhold. Styrken på alle buffere i Tabell 11 er 0.1 M. 26

36 Tabell 11 Bikarbonat-karbonatbuffer ph ph Natriumbikarbonat Natriumkarbonat Buffer ml 20 ml Buffer ml 30 ml Buffer ml 40 ml Buffer ml 50 ml Buffer ml 60 ml Buffer ml 70 ml Buffer ml 80 ml Tillaging av fosfatbuffer 100 ml 0.2 M natriumdihydrogenfosfat g av natriumdihydrogenfosfat monohydrat ble oppløst til 100 ml med renset vann 100 ml 0.2 M natriumhydrogenfosfat g av natriumhydrogenfosfat dihydrat ble oppløst til 100 ml med renset vann 19 ml av natriumdihydrogenfosfat ble blandet med 81 ml av natriumhydrogenfosfat. Den blandingen ble deretter fortynnet med 100 ml renset vann. Den endelige fosfatbufferen hadde styrke på 0.1 M, 200 ml volum og 7.4 ph-enheter. Tillaging av bikarbonat-karbonatbuffer med bestemte styrke Det ble veid bestemte mengder av natriumbikarbonat og natriumkarbonat som vist i tabell 12. De ble senere overført til målekolber som ble fylt til 100 ml med renset vann. Buffer med styrke på 0.1 M ble ikke tatt med i betraktning siden den var tilgjengelig fra før. Alle buffere representerer forhold 20:80 mellom henholdsvis natriumbikarbonat og natriumkarbonat. De hadde dermed lik ph på 10.5 enheter. Tabell 12 Bikarbonat-karbonatbuffer styrke Buffer styrke (M) Natriumbikarbonat (g) Natriumkarbonat (g)

37 Løsninger Maursyreløsninger I tabell 13 presenteres fremgangsmåten som ble brukt for tilbereding av alle maursyreløsninger. Tabell 13 Maursyreløsninger med ulike styrker fra 1 mm til 200 mm Styrke (mm) Tilberedelsesmetode 1 20 ml av 5 mm maursyreløsning ble blandet med 80 ml av renset vann 5 50 ml av 10 mm maursyreløsning ble blandet med 50 ml av renset vann µl konsentrert maursyre ble oppløst til 100 ml med renset vann µl konsentrert maursyre ble oppløst til 100 ml med renset vann µl konsentrert maursyre ble oppløst til 100 ml med renset vann µl konsentrert maursyre ble oppløst til 100 ml med renset vann µl konsentrert maursyre ble oppløst til 100 ml med renset vann µl konsentrert maursyre ble oppløst til 100 ml med renset vann µl konsentrert maursyre ble oppløst til 100 ml med renset vann 1 M NaOH-løsning g NaOH ble oppløst i 81.4 ml renset vann Organiske løsninger På grunn av et stort antall organiske løsemidler oppgis kun en generell beskrivelse av fremgangsmåten som ble anvendt i alle tilfellene. Det gjelder både for blandinger av organiske løsemidler samt blandinger med ioniske bærere. Alle blandinger baseres på (w/w) forholdet der komponenten med lavest vekt ble veid først. Analysevekten (Mettler AE200) ble benyttet i alle tilfeller. Trifluoreddiksyreløsninger (TFA) Tabell 14 presenterer fremgangsmåten for trifluoreddiksyreløsninger med tre ulike styrker. Tabell 14 Trifluoreddiksyreløsninger med ulike styrker fra 50 mm til 150 mm Styrke (mm) Tilberedelsesmetode µl konsentrert TFA ble oppløst til 100 ml med renset vann µl konsentrert TFA ble oppløst til 100 ml med renset vann µl konsentrert TFA ble oppløst til 100 ml med renset vann 28

38 Maursyreløsninger med DMSO I tabell 15 presenteres forhold mellom maursyreløsninger og dimetylsulfoksid i en 10 ml målekolbe. Tabell 15 Løsninger av maursyre med DMSO i ulike forhold DMSO (%) Tilberedelsesmetode mm maursyreløsning tilsatt 25% DMSO (v/v) mm maursyreløsning tilsatt 50% DMSO (v/v) mm maursyreløsning tilsatt 75% DMSO (v/v) «Kunstig urin» «Kunstig urin» er en blanding av natrium- og kaliumklorid med eller uten urea. Det er forbindelser som forekommer i størst mengde. Data i tabell 16 viser innveide mengder av forbindelser som ble oppløst i 100 ml vann der mengden av Na +, Cl -, K + og urea varierer. Mengden av Na +, Cl - og K + holdes konstant i løsninger med og uten urea. Mengder ble basert på rapporten som ble utarbeidet av Putnam (23). Tabell 16 Mengden av Na +, Cl -, K + og urea i «kunstig urin» Uten urea Med urea Høy andel Na +, Cl - og K + NaCl g g KCl g g Urea g Middels andel Na +, Cl - og K + NaCl g g KCl g g Urea g Lav andel Na +, Cl - og K + NaCl g g KCl g g Urea g Motioner i maursyreløsning I tabell 17 presenteres fire motioner hvorav tre har ulike styrker. Løsninger ble forberedt ved å oppløse den veide mengden av motioner med 20 mm maursyreløsning i en 10 ml målekolbe. Hver konsentrasjon av hvert motion ble laget som en separat løsning. 29

39 Tabell 17 Mengden av motioner med ulik styrke i 20 mm maursyreløsning Styrke (M) KI Mg(NO3)2*6H20 NaI NaCl g g g g 1.28 g g g 2.56 g 1.50 g 0.585g Stamløsninger Analytter ble veid ved hjelp av Mettler Toledo XS2015 Dual Range, og en bestemt mengde av metanol ble brukt for å oppløse dem til en konsentrasjon på 1 mg/ml. N,O-didesmetyl venlafaksin glukuronid er et unntak som ble oppløst til konsentrasjon på 0.8 mg/ml. Disse løsninger ble oppbevart ved -24 o C Arbeidsløsninger Arbeidsløsninger ble laget direkte fra stamløsninger. 100 µl av hver analytt og 125 µl av N,Odidesmetyl venlafaksin glukuronid ble pipettert til en målekolbe som ble deretter fylt opp til 10 ml med renset vann. Blandingen av analytter ble deretter fordelt i eppendorfrør. Hvert rør inneholdt 500 µl av arbeidsløsningen med en konsentrasjon på 10 µg/ml. Arbeidsløsninger ble benyttet for tillaging av analyttblandinger for både vandige og biologiske prøveløsninger. Arbeidsløsninger ble oppbevart ved -24 o C Standarder Standarder ble laget fra arbeidsløsninger. Et bestemt volum av arbeidsløsningen ble pipettert over til målekolben med et volum på 5 eller 10 ml. Kolben ble deretter fylt med renset vann opptil målestreken. Etter at løsningen ble ristet godt, ble den pipettert til innsats som ble plassert inn i vialer til UHPLC. Standarder ble oppbevart ved -24 o C Internstandard Venlafaksin-D6 hydroklorid representert i figur 8 var en ferdiglaget kommersielt tilgjengelig intern standard som ble benyttet i dette prosjektet. Det var en løsning i metanol med en konsentrasjon på 100 µg/ml. 30

40 Intern standard ble oppbevart ved -24 o C. Figur 8 Molekylstruktur til venlafaksin-d 6 hydroklorid Biologisk matriks Urin ble samlet fra forskjellige donorer på Farmasøytisk Institutt. Urinen ble enten umiddelbart brukt eller oppbevart i kjøleskapet mellom 2 o C og 8 o C Mobilfaser Mobilfase A 716 µl konsentrert maursyre blandes med 950 ml renset vann. 950 ml 20 mm av maursyreløsning blandes deretter med 50 ml metanol. Mobilfase B 38 µl konsentrert maursyre blandes med 50 ml renset vann. 50 ml 20 mm av maursyreløsning blandes deretter med 950 ml metanol. Mobilfase C/D 500 ml renset vann blandet sammen med 500 ml metanol. Seal wash 450 ml renset vann blandet sammen med 50 ml metanol Instrumentelle betingelser UHPLC UHPLC, kolonnen og programvaren som ble benyttet i dette prosjektet, er beskrevet i tabell 5. Metoden benyttet gradienteluering av mobilfase A og B. Den er beskrevet i tabell 18. Temperaturen var innstilt til 40 o C i løpet av hele sekvensen. Injeksjonsmetoden var partial loop og injeksjonsvolumet var 2 µl. 31

41 Tabell 18 Forholdet mellom mobilfase A og B i løpet av gradienteluering Tid (min) Mobilfase A (%) Mobilfase B (%) Mobilfase hastighet (ml/min) Kurve MS/MS Deteksjon med MS/MS som nevnes i tabell 5, var innstilt til følgende parametere fra tabell 19. Tabell 19 Innstillinger av MS/MS Kapillærspenning Segment 1 Segment 2 Segment 3 38 V 32 V 35 V Tube lens Segment 1 Segment 2 Segment 3 Kapillærtemperatur Sheath gas flow rate Sprayspenning Forstøvergass Tørkegass Ionisering Type scan 110 V 105 V 145 V 275 o C 26 arb 4.5 kv Nitrogen Nitrogen Positiv modus SRM Deteksjonen ble delt opp i tre segmenter. Oppdeling hjelper å oppnå flere punkter som danner en topp. Grunnen til det er at kun valgte overganger blir scannet i bestemte segmenter mens det ikke blir tatt hensyn til de andre. Første segment falt mellom 0 min og 1.80 min, den andre mellom 1.80 min og 3 min og den tredje mellom 3 min og 10 min. Mobilfasen ble ikke introdusert til MS i løpet av de første 0.5 min og etter 6.5 min. SRM-overganger for alle analytter er presentert i tabell

42 Tabell 20 SRM-overganger Analytt SRM overgang Kollisjonsenergi (%) Forløper Fragment Venlafaksin hydroklorid O-desmetyl venlafaksin N-desmetyl venlafaksin N,O-didesmetyl venlafaksin N,N-didesmetyl O-desmetyl venlafaksin hydroklorid N,O-didesmetyl venlafaksin glukuronid hydroklorid N,N-didesmetyl O-desmetyl venlafaksin glukuronid Venlafaksin-D6 hydroklorid Segment 3.6. Utførelse av PALME PALME ble benyttet for å utføre ekstraksjoner av analytter fra vandige (analyttblanding i vann) og biologiske (analyttblanding i urin) prøveløsninger. De biologiske prøveløsninger var urin. Illustrasjon av PALME er vist i figur 3 mens utstyrs detaljer er beskrevet i tabell Vandige prøveløsninger Donorfasevolumet var alltid 250 µl. Intern standard ble ikke brukt i forsøk med vandige prøveløsninger. Arbeidsløsningen med en konsentrasjon på 10 µg/ml ble fortynnet med renset vann og NaOH-løsning til 200 ng/ml. Styrken av NaOH var justert til 10 mm. Løsningen ble deretter overført til et løsemiddelreservoar, og denne blandingen ble pipettert over i donorbrønnene ved hjelp av en multikanalpipette. Etter hvert ble NaOH erstattet med bikarbonat-karbonatbuffer. Da ble det tilsatt 125 µl buffer til 125 µl av analyttblandingen. Analyttkonsentrasjoner i donorfasen forble som før på 200 ng/ml. 33

43 Den organiske fasen ble pipettert ut på PVDF-membranen fra donorplatesiden. Tabell 21 representerer løsemidler som ble testet i SLM. Volumet på 4 µl ble pipettert på membranen. Det gjaldt alle løsemidler som ble brukt for å danne SLM. De fordelte seg og ble immobilisert innen 60 sek. Etter den tiden ble SLM klar for bruk. Akseptorfasen var maursyre med og uten DMSO og trifluoreddiksyre. De ulike styrkene og forhold er presentert i tabell 21. Akseptorfasene ble også overført til et løsemiddelreservoar og pipettert ved hjelp av en multikanalpipette i akseptorbrønnene. De ble fylt med 50 µl. Volumforskjellen mellom donor og akseptor muliggjorde oppkonsentrering av analyttene med faktor fem når overnevnte volumer ble brukt. Aluminiumsfolie ble limt nøye på toppen av akseptorplaten. Det hadde som formål å begrense eventuell fordampning av akseptorfasen. Donorplaten som ble klemt godt sammen med akseptorplaten med aluminiumsfolien på toppen, ble festet på ristemaskinen Vibramax 100 slik at platene var ubevegelige. Ristefrekvensen var alltid innstilt til 900 rpm. Alle ekstraksjoner foregikk i 45 min. Ristingen ble stoppet nøyaktig etter 45 min. Aluminiumsfolien ble fjernet, og multikanalpipetten med volum innstilt til 50 µl ble brukt for å pipettere mest mulig av akseptorfasen over i innsats. Akseptorplaten ble holdt på skrå for å gjøre pipetteringen enklere og redusere sjansen for punktering av membranen, noe som ville medført tap av akseptorfasen. Innsats ble deretter plassert i UHPLC vialer. Tabell 21 Oversikt over betingelser som ble brukt for vandige prøveløsninger Donorfasen Akseptorfasen Organisk fase 250 µl analyttblanding i 10 mm NaOH 125 µl 0.1 M buffer µl analyttblanding Buffer ph: 9.4, 9.5, 9.8, 9.9, 10.1, 10.3, , 100, 200 mm maursyreløsning 20 mm maursyreløsning med 25, 50 eller 75% DMSO 50, 100, 150 mm trifluoreddiksyreløsning Dodecylacetat Diheksyleter Pentylbenzen NPOE Bis(2-etylheksyl)fosfitt Tributylfosfat Dekanol 1-Butyl-1-metylpyrrolidinium bis(trifluorometylsulfonyl) imid 34

44 Ioniske bærere 1-Heksyl-3-metylimidazolium heksafluorofosfat 1-Metyl-3-oktylimidazolium heksafluorofosfat 1-Metyl-3-oktylimidazolium tetrafluoroborat 1-Heksyl-3-metylimidazolium tris(pentafluoroetyl) trifluorofosfat Tris(2-etylheksyl)fosfat Tris(2-etylheksyl)fosfitt Triisodecylfosfitt Dibenzylfosfitt Tripentylfosfat Tetradecylammoniumbromid Dodecyltrimetylammoniumbromid Tetraetylammoniumbromid Tetrabutylammoniumfosfat Aliquat Biologiske prøveløsninger Urin erstattet renset vann i optimaliseringsfasen av prosjektet samt evaluering. Intern standard ble benyttet i tillegg. Det endelige donorfasevolumet var 250 µl i likhet med vandige prøveløsninger. Det var sammensatt av 115 µl buffer, 10 µl intern standard og 125 µl av en analyttblanding som ble laget i urin. Analyttene og intern standard hadde en konsentrasjon på 200 ng/ml i donorfasen. I noen forsøk ble konsentrasjonen av analytter endret. Konsentrasjonen av dem ble senket ned til 0.05 ng/ml i donorfasen. Bikarbonat-karbonatbuffer hadde som formål å justere ph fra 9.8 til 10.5, og den hadde varierende styrke fra 0.1 M til 1 M. Ristefrekvensen var 900 rpm i alle forsøk. Ekstraksjonstiden var 45 min for de fleste forsøk. Unntaket var forsøk som dannet grunnlaget for tidskurven. De syv målepunktene var spredt mellom 15 og 180 min. Både akseptor- og donorfasen ble analysert. Siden donorfasen besto delvis av urin, måtte den filtreres før overføring til innsats. Det ble gjort ved hjelp av vialer med filter fra GE Healthcare (Buckinghamshire, England). Maursyre i konsentrasjonsområdet mm ble testet. Volumet forble 50 µl. I enkelte forsøk ble det tilsatt NaCl, KI, Mg(NO3)2 eller NaI til akseptorfasen. De tre sistnevnte hadde ulike styrker som varierte mellom 0.1 M og 1 M. NaCl styrken var 1 M. 35

45 I et enkelt forsøk ble urinen i donorfasen erstattet av «kunstig urin», som beskrevet under avsnitt om løsninger. Den hadde samme volum og analyttblandingen ble tilsatt på samme måte som til urinen. Volumet av den organiske fasen forble uendret i forhold til ekstraksjoner fra vandig miljø. Den ble blandet med ioniske bærere for å finne det optimale forholdet. Alle andre operasjoner ble lik som ved ekstraksjoner fra vandige prøveløsninger. Tabell 22 Oversikt over betingelser som ble brukt for biologiske prøveløsninger Donorfasen Akseptorfasen Organisk fase Ioniske bærere Aliquat 336 Ekstraksjonstid 115 µl (bikarbonat-karbonat eller fosfat) buffer + 10 µl intern standard µl analyttblanding 115 µl NaOH + 10 µl intern standard µl analyttblanding 125 µl buffer µl analyttblanding 1, 5, 10, 20,50, 75, 100, 150, 200 mm maursyreløsning 1 M NaCl, 0.1, 0.5, 1 M KI, Mg(NO3)2 og NaI Tripentylfosfat med og uten 1% trioktylamin Tetradecylammoniumbromid 15, 30, 45, 60, 90, 120, 180 min 3.7. Utvelgelse av SLM Valg av det mest egnete løsemidlet for SLM ble gjennomført med vandige prøveløsninger. De ulike delforsøk er presentert i tabell 23. Suksesskriteriet var utbytte av analyttene. Den største vekten ble lagt på utbytter av de mest hydrofile stoffene som er vanskeligst å ekstrahere. Konsentrasjonen av analyttene i alle forsøk ble justert til 200 ng/ml i donorfasen. Standarder hadde konsentrasjonene på 50, 200, 500 og 1000 ng/ml. Hver konsentrasjon besto av fire paralleller. Delforsøk ble kjørt på ulike dager. Tabell 23 Organiske løsemidler som ble brukt for å finne den optimale SLM Med 1% trioktylamin (w/w) Uten trioktylamin Delforsøk 1 (n=5) Dodecylacetat Dodecylacetat Delforsøk 2 (n=5) Dodecylacetat Diheksyleter Diheksyleter Pentylbenzen Pentylbenzen NPOE NPOE 36

46 Delforsøk 3 (n=5) Delforsøk 4 (n=4) Delforsøk 5 (n=4) Bis(2-etylheksyl)fosfitt Tributylfosfat Dekanol Dodecylacetat 1-Butyl-1-metylpyrrolidinium bis(trifluorometylsulfonyl) imid 1-Heksyl-3-metylimidazolium heksafluorofosfat 1-Metyl-3-oktylimidazolium heksafluorofosfat 1-Metyl-3-oktylimidazolium tetrafluoroborat 1-Heksyl-3-metylimidazolium tris(pentafluoroetyl) trifluorofosfat Tributylfosfat Tris(2-etylheksyl)fosfat Tris(2-etylheksyl)fosfitt Triisodecylfosfitt Dibenzylfosfitt Tributylfosfat Tripentylfosfat Bis(2-etylheksyl)fosfitt Tributylfosfat Dekanol 1-Heksyl-3-metylimidazolium heksafluorofosfat 1-Metyl-3-oktylimidazolium heksafluorofosfat 1-Metyl-3-oktylimidazolium tetrafluoroborat Tris(2-etylheksyl)fosfat Tris(2-etylheksyl)fosfitt Triisodecylfosfitt Dibenzylfosfitt Delforsøk 1, 2 og 3 hadde fem paralleller av hver SLM. I delforsøk 2 og 3 ble dodecylacetat med 1% trioktylamin valgt som et sammenligningssystem. Alle analyser i disse forsøkene ble gjort med vandige løsninger der donorfasen inneholdt 10 mm NaOH. Delforsøk 4 og 5 brukte tributylfosfat som et sammenligningssystem. De ble utført med fire paralleller. Donorfasen i disse analysene var justert med bikarbonat-karbonatbuffer istedenfor NaOH. Akseptorfasen var 50 µl 20 mm maursyre i alle delforsøk Optimalisering av ekstraksjonen De optimaliserte parameterne ble benyttet i de etterfølgende forsøkene til tidspunktet der alle testede ekstraksjonsbetingelser ble bestemt Optimalisering av organisk fase Standarder hadde konsentrasjonene 50, 200, 500 og 1000 ng/ml. De var blandet sammen med intern standard som hadde konsentrasjonen på 200 ng/ml. 37

47 Donorfasen besto av en 125 µl analyttblanding justert med 115 µl 0.1 M bikarbonatkarbonatbuffer med ph 9.7 og 10 µl intern standard. Konsentrasjonen av analytter og intern standard i donorfasen var 200 ng/ml. Akseptorfasen var 50 µl 20 mm maursyre. I dette forsøket ble det undersøkt ulike sammensetninger av SLM som fremstilt i tabell 24. Tabell 24 Optimalisering av sammensetning til SLM (n=4) SLM 1 Tripentylfosfat SLM 2 Tripentylfosfat 1% trioktylamin SLM 3 Tripentylfosfat 1% trioktylamin 20% Aliquat 336 SLM 4 Tripentylfosfat 1% trioktylamin 3% Tetradecyl ammoniumbromid SLM 5 Tripentylfosfat 1% trioktylamin 20% Tetradecyl ammoniumbromid SLM 6 Tripentylfosfat 1% trioktylamin 3% Tetradecyl ammoniumbromid SLM 7 Tripentylfosfat 3% Tetradecyl ammoniumbromid SLM 8 Tripentylfosfat 20% Aliquat 336 SLM 9 Tripentylfosfat 3% Tetradecyl ammoniumbromid 20% Aliquat % Aliquat Optimalisering av mengden til ionisk bærer Andelen av den ioniske bæreren var 0, 10, 15, 20, 25 og 30 prosent i det organiske løsemidlet. Alle andre variabler ble holdt uforandret i forhold til det forrige optimaliseringstrinnet fra avsnitt Hvert forhold ble analysert med fire paralleller Optimalisering av buffer ph i donorfasen Det ble gjennomført to delforsøk som undersøkte ulike ph-verdier brukt til modifikasjonen av miljøet i donorfasen. Det var fosfat- og bikarbonat-karbonatbuffer i tillegg til NaOH som ble testet i de forsøkene. Konsentrasjonen av buffere var 0.1 M og 10 mm for NaOH. De testede ph-verdiene er representert i tabell 25. Tabell 25 ph-verdier av fosfatbuffer, bikarbonat-karbonatbuffer og NaOH-løsning (n=4) Buffer/løsning ph Delforsøk 1 Fosfatbuffer 7.4 Bikarbonat-karbonatbuffer 9.5, 9.7, 9.9, 10.1 NaOH-løsning

48 Delforsøk 2 Fosfatbuffer 7.4 Bikarbonat-karbonatbuffer 9.8, 9.9, 10.1, 10.3, 10.5 NaOH-løsning Optimalisering av styrken i akseptorfasen Den optimale maursyrestyrken ble valgt på bakgrunn av to delforsøk som ble vurdert i forhold til utbyttene. Verdier som ble testet, er presentert i tabell 26. Tabell 26 Styrke av maursyreløsning i akseptorfasen (n=4) Styrke (mm) Delforsøk 1 20, 50, 75, 100, 150, 200 Delforsøk 2 1, 5, 10, 20, Optimalisering av ekstraksjonstid Ekstraksjonen av analyttene ble undersøkt ved ulike tidspunkter. Målinger ble foretatt ved 15, 30, 45, 60, 90, 120 og 180 min både fra akseptor- og donorfasen. Forsøket ble vurdert i forhold til oppnådde utbytter og tidspunkter for innstilling av likevekt i tillegg til fordelingen av analyttene i systemet Optimalisering av bufferstyrken i donorfasen Bikarbonat-karbonatbuffere med styrke på 0.1, 0.25, 0.5, 0.75 og 1 M ble undersøkt. Alle buffere hadde ph Evaluering av metoden Det ble utført en evaluering av denne metoden som var basert på retningslinjer fra europeiske legemiddelmyndigheter (EMA) (45). Parametere fra avsnitt til ble undersøkt. Alle forsøk benyttet biologiske prøveløsninger Laveste deteksjonsgrense og kvantifiseringsgrense For å finne den laveste deteksjonsgrensen ble det laget seks fortynninger av analyttblandingen i urinen som hadde konsentrasjon på henholdsvis 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5 og 10 ng/ml. Hver konsentrasjon ble analysert med fire paralleller. Intern standard ble ikke brukt i dette forsøket. 39

49 Etter avsluttet analyse ble topphøyden av hver analytt sammenlignet manuelt med støyhøyden. Den laveste konsentrasjonen som kunne detekteres, ble bestemt på bakgrunn av forholdet på tre mellom signal og støy. Den laveste kvantifiseringsgrensen ble bestemt til å bli signal/støy = 10. Konsentrasjonen ble funnet ut ved hjelp av data som var tilgjengelige fra beregninger av den laveste deteksjonsgrensen Linearitet Kalibreringskurven besto av ti punkter med konsentrasjoner på 2, 5, 10, 20, 50, 100, 250, 500, 750 og 1000 ng/ml i urin. Hver konsentrasjon ble analysert med fire paralleller. En kvadratisk kurve med 1/x vekting ble benyttet for å finne r 2 -verdien. Hver analytt hadde sin egen kalibreringskurve. Lineariteten for NNDODV, NODVGLU og NNDODVGLU var undersøkt i konsentrasjonsområdet 20 til 1000 ng/ml. For alle andre analytter var det 2 til 1000 ng/ml Overdrag For å undersøke mulige overdrag fra påfølgende paralleller ble det gjennomført forsøk der to blanke prøver ble plassert bak de høyeste standardene som ble brukt for kalibreringskurven. De blanke prøvene var akseptorfaser etter ekstraksjon fra 250 µl urin uten analytter eller intern standard Presisjon og nøyaktighet Presisjon og nøyaktighet ble undersøkt i intradag- og interdaganalyse ved hjelp av QC-prøver. De hadde en konsentrasjon på 2, 6, 20, 60, 400 og 850 ng/ml. De ble laget uavhengig av standarder som ble brukt for kalibreringskurven. Hver konsentrasjon ble analysert med fem paralleller i serie 1 og ti i serie 2. Resultater ble sammenlignet med kalibreringskurven og eventuelle avvik ble vurdert i henhold til EMAs retningslinjer (45). For intradaganalyse ble det benyttet resultater fra serie 1 mens for interdaganalyse fra serie 1 og Matrikseffekter Dette forsøket benyttet Matuszewskis metode for vurdering av eventuelle matrikseffekter (46). Det ble ekstrahert 15 urinparalleller uten analytter. Deretter ble akseptorfasen av fem paralleller slått sammen. Til 120 µl av denne løsningen ble det tilsatt 30 µl analyttblandingen til konsentrasjonen på 6 ng/ml. Samme fremgangsmåte ble brukt for konsentrasjoner på 60 og 340 ng/ml. For å bestemme matrikseffekter ble det laget samme volum i samme konsentrasjoner 40

50 som benyttet ren akseptorfase istedenfor den som ble utsatt ekstraksjon. Matrikseffekter ble senere bestemt ved å finne forholdet mellom areal av analytt fra akseptorfasen utsatt for ekstraksjon og areal fra den intakte akseptorfasen. Matrikseffekter ble uttrykt i prosent Ekstraksjonsutbytte Ekstraksjonsutbytte ble beregnet ved å dele gjennomsnittlig areal av analyttene i QC-prøvene med gjennomsnittlig areal av analyttene som stammet fra akseptorfasen der analyttblandingen ble tilsatt etter ekstraksjonen. Gjennomsnittlige verdier ble basert på fem paralleller. De endelige resultatene ble funnet for tre konsentrasjonsnivåer 6, 60 og 340 ng/ml for VEN, ODV, NDV og NODV. De resterende analyttene hadde to konsentrasjonsnivåer 60 og 340 ng/ml. Ekstraksjonsutbyttene ble uttrykt i prosent Beregninger Avvik fra de nominelle verdiene som ble brukt ved vurdering av presisjon og nøyaktighet samt ved tillaging av kalibreringskurven, ble beregnet av Xcalibur-programvaren. Utbytte ble benyttet i avsnitt 4.1. og 4.2. De ble funnet ved å dele gjennomsnittet av alle paralleller med et tall som representerte 100% utbytte. Hensyn ble tatt til oppkonsentrering på grunn av volumforskjeller mellom fasene i PALME. Verdien ble uttrykt i prosent. RSD ble funnet ved å dele standardavviket av alle paralleller med gjennomsnittet. Verdien ble uttrykt i prosent. Matrikseffekter (ME), vist i ligning 7, ble beregnet ved å dele gjennomsnittlige areal av analyttene tilsatt til akseptorfasen etter ekstraksjon (B) med tilsvarende gjennomsnittlige areal fra en ren akseptorfase tilsatt analyttene (A) (46). Sluttresultatet ble uttrykt i prosent. ME = B 100% (Ligning 7) A Ekstraksjonsutbytte (RE), vist i ligning 8, ble benyttet i avsnitt 4.3. De ble beregnet ved å dele gjennomsnittlige areal av analytter fra QC-prøvene (C) med gjennomsnittlige areal av analytter fra akseptorfasen som ble tilsatt analyttblanding etter ekstraksjonen (C) (46). RE = C 100% (Ligning 8) B 41

51 4. Resultater og diskusjon 4.1. Innledende forsøk De innledende forsøkene ble utført fra vandige prøveløsninger, og den generelle fremgangsmetoden fra avsnitt ble brukt Utvelgelse av SLM del 1 I det første forsøket var det ønskelig å undersøke ekstraksjonseffektiviteten for alle analyttene. Fokuset ble dermed rettet mot SLM. Den ble ansett som en av de mest sentrale faktorene i ekstraksjonsprosessen. På bakgrunn av tidligere PALME-publikasjoner ble det bestemt at dodecylacetat var et hensiktsmessig valg (8, 11, 12). Grunnen til denne beslutningen var dens evne til å ekstrahere analytter med ulik polaritet og med lave RSD-verdier. Dodecylacetat ble testet med og uten 1% trioktylamin. Trioktylamin var benyttet i tidligere studier som en substans med maskeringseffekter på ikke-spesifikke bindingsseter i membranen (11). Analyttene ble ekstrahert via SLM fra basisk miljø i donorfasen som var dannet med 10 mm NaOH og til sur 20 mm løsning av maursyre. Den største vekten ved vurderingen av resultatene ble lagt på utbyttene av analyttene. Dodecylacetat med 1% trioktylamin viste høyere ekstraksjonsutbytter i forhold til SLM som besto av ren dodecylacetat. Utbyttene samt RSD-verdier for alle analytter er vist i tabell 27. Det er i samsvar med påstanden at trioktylamin kan redusere de ikke-spesifikke bindinger til PVDF membranen (11). Allikevel ble kun venlafaksin og N-desmetylvenlafaksin ekstrahert i større grad med utbytter på henholdsvis 84% og 52%. O-desmetylvenlafaksin hadde utbytte på 6% mens alle andre analytter var ikke detektert i akseptorfasen. Resultatene viste dermed at analyttene med de høyeste log P-verdiene ble ekstrahert i størst grad. De mer polare substansene hadde muligens svært liten fordeling over i den organiske fasen slik at de forble i den vandige donorfasen. 42

52 VEN ODV NDV NODV NNDODV NODVGLU NNDODVGLU Tabell 27 Utbytter og tilhørende RSD-verdier fra ekstraksjoner med SLM som besto av dodecylacetat med og uten 1% trioktylamin Akseptorfase: 50 µl 20 mm maursyreløsning. Organisk fase: 4 µl av løsemidler vist i tabell 27. Donorfase: 250 µl 10 mm NaOH med analyttblanding med konsentrasjon i donorfasen på 200 ng/ml. Ristehastighet 900 rpm. Ekstraksjonstid: 45 min. n=5. Dodecylacetat med 1% TOA 84% (7%) Dodecylacetat 24% (14%) 6% (5%) 3% (3%) 52% (6%) 26% (14%) NA = ikke tilgjengelig på grunn av ingen målbare signaler 2% (1%) 2% (6%) 1% (2%) NA NA NA NA NA Systemet med trioktylamin ble valgt til sammenligningsformål med andre organiske løsemidler som ble testet i etterfølgende forsøk Utvelgelse av SLM del 2 Det neste målet var testing av ulike organiske løsemidler. Spesiell interesse var knyttet til om noen av dem ville gi høyere utbytte for de mer polare analyttene. Som vist i avsnitt 3.7. tabell 23 ble det testet seks ulike løsemidler i delforsøk 2 både med og uten trioktylamin. De ble sammenlignet med SLM som besto av dodecylacetat og 1% trioktylamin. Alle andre ekstraksjonsbetingelser unntatt SLM var uforandret i forhold til avsnitt Hensikten med dette forsøket var å velge løsemidler som hadde et bredt spekter av fysikalskkjemiske egenskaper. Mange av dem var benyttet i tidligere PALME- og EME-prosjekter (9, 11, 47). Hvert løsemiddel ble testet med og uten TOA for å få ytterligere erfaringer med dette reagenset. Utfra de ulike løsemidlene klarte bis(2-etylheksyl)fosfitt og tributylfosfat, begge med tilsatt trioktylamin, å ekstrahere de fleste analyttene som fremstilt i figur 9. Utbyttene av VEN, ODV og NDV var over 60%. De skilte seg særlig fra utbytter av de mer polare metabolittene NODV og NNDODV. De var på opptil 20%. Ingen av disse systemene klarte dog å ekstrahere de mest polare glukuronidene. SLM med trioktylamin viste generelt bedre utbytter i forhold til sine korresponderende systemer som besto av rene løsemidler. Bis(2-etylheksyl)fosfitt var unntaket 43

53 Utbytte i denne sammenhengen. Grunnen var uklar, men en mulig forklaring var at dette løsemidlet besatt egenskaper som dempet ikke-spesifikke bindinger til PVDF-membranen.. Enkelte utbytter overskred 100%. Den registrerte konsentrasjonen i akseptorfasen var dermed høyere enn 1000 ng/ml som var representativ for 100% utbytte etter en fem gangers oppkonsentrering forårsaket av volumforskjellen mellom donor- og akseptorfasen. Dette kunne skyldes fordampningen av akseptorfasen som bidro til en litt høyere konsentrasjon, et lite avvik i beregningen fra kalibreringskurven eller avvik i beregningen av topparealet som gjorde at konsentrasjonen ble over 1000 ng/ml. De tilhørende RSD-verdiene fra dette forsøket er representert i tabell 28. SLM med bis(2- etylheksyl)fosfitt hadde RSD-verdier som ikke overskred 7% for noen av de ekstraherte analyttene. Verdiene fra systemer med og uten trioktylamin var lignende. Ren tributylfosfat hadde høyere RSD-verdier spesielt for mer polare metabolitter som ODV, NODV og NNDODV. Tilsetting av trioktylamin bidro til en reduksjon av dem. 120% 100% 80% 60% 40% 20% 0% VEN ODV NDV NODV NNDODV NODVGLU NNDODVGLU Figur 9 Ekstraksjonsutbytter som ble oppnådd med ulike organiske løsemidler i innledende faser av prosjektet Ekstraksjonsbetingelser, unntatt organisk fase, var uforandret i forhold til tabell

54 VEN ODV NDV NODV NNDODV NODVGLU NNDODVGLU Tabell 28 Tilhørende RSD-verdier for forsøk fra figur 9 Dodecylacetat + 1% TOA 5% 4% 2% 9% NA NA NA 2-nitrofenyloktyleter 5% 32% 12% NA 11% NA NA 2-nitrofenyloktyleter + 1% TOA 13% 17% 19% NA 23% NA NA Bis(2-etylheksyl)fosfitt 7% 6% 6% 4% 4% NA NA Bis(2-etylheksyl)fosfitt + 1% TOA 7% 7% 6% 5% 4% NA NA Dekanol 13% 13% 12% 37% 40% NA NA Dekanol + 1% TOA 6% 14% 9% 29% 40% NA NA Diheksyleter 13% 25% 38% 39% 82% NA NA Diheksyleter + 1% TOA 5% 13% 5% 3% 12% NA NA Pentylbenzen 10% 30% 8% NA NA NA NA Pentylbenzen + 1% TOA 11% 22% 3% NA NA NA NA Tributylfosfat 8% 16% 2% 22% 15% NA NA Tributylfosfat + 1% TOA 3% 7% 6% 15% 14% NA NA NA = ikke tilgjengelig på grunn av ingen målbare signaler Det var ønskelig å karakterisere disse løsemidlene og undersøke om det var sammenheng mellom deres fysikalsk-kjemiske egenskaper og deres ekstraksjonsevne. Tettheten, log P, antall hydrogenakseptor/donor og arealet av den polare overflaten var tatt i betraktning. Ingen av dem alene så ut til å ha særlig stor innflytelse på utbyttene. Kamlet og Taft-parametere derimot hadde et mer synlig mønster som ble ansett som relevant for oppnådde resultater. Disse parametere kategoriserer løsemidler med α, β og π* variabler som står for henholdsvis hydrogendonor, hydrogenakseptor og polaritet egenskaper (24). Tabeller som er tilgjengelige i vitenskapelig litteratur, tilbyr kun oversikten over et begrenset antall substanser. Bestemmelsen av verdier som er representert i tabell 29, ble dermed gjort på bakgrunn av stoffer med lignende strukturelle egenskaper. 45

55 Tabell 29 Estimerte Kamlet og Taft-parametere Organisk løsemiddel Kamlet og Taft-parametere α β π* Dodecylacetat Diheksyleter Pentylbenzen NPOE Bis(2-etylheksyl)fosfitt NA NA NA Tributylfosfat Dekanol NA = ikke tilgjengelig 1 Utgangspunktet ble tatt i etylacetat, propylacetat og butylacetat. β ser ut til å bli større med økende kjedelengde mens π blir litt lavere med økende kjedelengde. α-verdien forblir lik 0 (24). 2 Basert på dietyleter og dibutyleter. α er 0. β kan bli marginalt større med økende kjedelengde. π holder seg stabil på Basert på benzen, dimetylbenzen og trimetylbenzen. α er 0. β verdien ser ut til å bli veldig nært 0.1. π kan bli litt lavere. 4 Basert på nitrobenzen. Tall fra 2 til 5 er hentet den [ ] fra (48) Basert på tilgjengelige tall ble det antatt at organiske løsemidler som hadde null verdi for α, høy verdi for β og moderat π* uttrykte potensiale til å ekstrahere venlafaksin og dens metabolitter mer effektivt. Grunnen til bedre utbytter med bis(2-etylheksyl)fosfitt kan være dens evne til hydrogenbindingsinteraksjoner. Dette løsemidlet ble nylig brukt i EME-studier og bekreftet at det var anvendelig for ekstraksjoner av polare analytter med log P-verdier mellom og 1.3 (49, 50) Utvelgelse av SLM del 3 Ioniske væsker, oppgitt i tabell 23 delforsøk 3, var en annen gruppe av løsemidler som ble testet ut. Neglisjerbar flyktighet og lav toksisitet er blant de viktige fordelene (51, 52). Ioniske væsker har allerede blitt benyttet i HF-LPME der analytter med log P mellom og 1.63 ble ekstrahert til akseptorfasen (53). Det var en av grunnene for å teste dem ut i dette PALMEprosjektet. Det praktiske arbeidet avslørte utfordringer knyttet til viskositeten av disse væskene. Diffusjonen på PVDF-membranen ble betydelig redusert. I tillegg var det vanskelig å utføre repeterbare pipetteringer. De ioniske væsker ble dermed oppvarmet til 50 o C for å redusere 46

56 viskositeten. Det reduserte allikevel kontrollen over betingelser. Avkjølingshastigheten av væsken samt potensiell dekomponering var faktorer som kunne kreve en nøye overvåking. Ekstraksjonen ble utført under samme betingelser som i avsnitt med den forskjellen at ioniske væsker ble brukt for å danne SLM. Hver SLM ble testet med fem parallelle forsøk. Data (ikke vist her) viste ingen målbare topper for analyttene eller svært lave ekstraksjonsutbytter, ofte under 5%. 1-metyl-3-oktylimidazolium tetrafluoroborat med 1% trioktylamin ga ekstraksjon av begge glukuronidene med utbytte omtrentlig på 3%. Kamlet og Taft-parametere av disse væsker kan være en del av årsaken til de lave utbyttene. De har lave β, moderate α og høye π* verdier (54, 55). Det sto i kontrast til trender som ble observert i tabell 29. De antydet at løsemidler med høye verdier for hydrogenakseptor og fraværende hydrogendonor egenskaper klarte å ekstrahere flere analytter. Samtidig kunne den høye viskositeten bidratt til betydelig forlenget ekstraksjonstid. Tidligere studier fra HF-LPME viste at 8-12 timer var nødvendig for oppnåelse av likevekt av ekstraksjoner som stabiliserte seg på utbytter rundt 50-70% (53). Det var ansett som uakseptabelt langt i dette prosjektet. Ekstraksjonen av glukuronider kunne skyldes en interaksjon mellom kationet av den ioniske væsken og den ladede karboksylsyregruppen på analyttmolekylet. På denne måten kunne det være dannet et kompleks som diffunderte lettere inn i SLM. På overflaten mellom SLM og akseptorfasen ble det komplekset brutt slik at analytten ble frigjort i akseptorfasen. Den eneste ioniske væsken som ekstraherte glukuronidene ble testet i en blanding med bis(2- etylheksyl)fosfitt og tributylfosfat i forhold 1:1 og 1% TOA for å undersøke om de hadde supplerende effekt. Dette forholdet ble ansett som et forstandig utgangspunkt med potensiale for videre optimalisering. Ekstraksjonsutbytter viste allikevel at kun tre analytter (ODV, NODV og NNDODV) ble ekstrahert hvorav to under 8% (se Appendix II). Videreføring av denne ideen ble dermed forkastet i dette prosjektet. 47

57 Testing av ph-betingelser i donorfasen Analyttens polaritet er avhengig av hvilken ph de er oppløst i. Vanligvis justeres miljøet til et ph-område som fremmer fullstendig uionisert tilstand av analyttene i donorfasen (3). Sammenligning av hver enkelt profil tydet på at ph rundt 10 kunne gjøre analyttene mer upolare. De er presentert i figur 10 til 13 og viser log D-verdien (y-aksen) til analytten som en funksjon av ph (x-aksen). Alle profiler var baserte på estimerte algoritmer. Det var forventet at forandringen av ph-betingelser ville forbedre diffusjonen gjennom membranen. Figur 10 log D til VEN (blå), ODV (oransje) og NDV (grå) fremstilt som en funksjon av ph [hentet fra chemicalize.com den ] (56) Figur 11 log D til NODV som en funksjon av ph [hentet fra chemicalize.com den ] (56) 48

58 Figur 12 log D til NNDODV som en funksjon av ph [hentet fra chemicalize.com den ] (56) Figur 13 log D til NODVGLU (grønn) og NNDODVGLU (rød) som en funksjon av ph [hentet fra chemicalize.com den ] (56) 49

59 VEN ODV NDV NODV NNDODV NODVGLU NNDODVGLU Utbytte Bikarbonat-karbonatbuffer med ph 9.5 ble tilsatt til den vandige prøveløsningen i donorbrønnene istedenfor 10 mm NaOH. Alle andre ekstraksjonsbetingelser forble uendret i forhold til forrige forsøk. Utbyttene var høyere når buffer med lavere ph ble benyttet. Det gjaldt for alle analytter unntatt glukuronidene som ikke ble ekstrahert i vesentlig grad med de fire valgte organiske løsemidlene. Søylediagrammet i figur 14 viser at SLM med tributylfosfat hadde høyere ekstraksjonsutbytter enn de andre testede systemene. Samtidig var RSD-verdier, presentert i tabell 29, for dette systemet godt under 15% i motsetning til bis(2-etylheksyl)fosfitt som hadde verdier opp mot 100%. 120% 100% 80% 60% 40% 20% 0% VEN ODV NDV NODV NNDODV NODVGLU NNDODVGLU Dodecylacetat + 1% TOA Tributylfosfat + 1% TOA Bis(2-etylheksyl)fosfitt + 1% TOA 1-metyl-3-oktylimidazolium tetrafluoroborat + 1% TOA Figur 14 Utbyttene av analyttene etter ekstraksjoner med 4 ulike SLM og bikarbonat-karbonatbuffer ph 9.5 i donorfasen Akseptorfase: 50 µl 20 mm maursyreløsning. Organisk fase: 4 µl av løsemidler vist i figur 14. Donorfase: 125 µl 0.1 M bikarbonat-karbonatbuffer ph µl analyttblanding med den endelige konsentrasjonen i donorfasen på 200 ng/ml. Ristehastighet 900 rpm. Ekstraksjonstid: 45 min. n=5. Tabell 29 RSD-verdier for ekstraksjoner via fire ulike SLM med bikarbonat-karbonat buffer ph 9.5 i donorfasen Dodecylacetat + 1% TOA 5% 5% 9% 9% 5% NA NA Bis(2-etylheksyl)fosfitt + 1% TOA 84% 11% 105% 19% 28% NA NA 50

60 Utbytte Tributylfosfat + 1% TOA 2% 11% 5% 9% 7% NA NA 1-metyl-3-oktylimidazolium NA 24% NA 15% 24% 41% 31% tetrafluoroborat + 1% TOA NA = ikke tilgjengelig på grunn av ingen målbare signaler Utvelgelse av SLM del 4 Registrerte ekstraksjonsutbytter og RSD-verdier, spesielt ved bruk av tributylfosfat, gjorde at SLM med fosfater og fosfitter ble ansett som gode kandidater for videre utforskning. Løsemidler fra delforsøk 4 i tabell 23 ble testet i forhold til ekstraksjonsutbytter. I dette forsøket ble NaOH erstattet med 0.1 M bikarbonat-karbonatbuffer med ph 9.5. Alle andre ekstraksjonsbetingelser var uendret. Utvalget av disse løsemidlene ble tatt blant annet på bakgrunn av løseligheten i vann, som bør være lavere enn 1.2 g/l, og HMS-informasjon tilgjengelig fra sikkerhetsdatablader (57). Dodecylacetat som var tidligere brukt for sammenligningsformål ble erstattet med tributylfosfat. Grunnen til det var at det sistnevnte løsemidlet klarte å ekstrahere flere analytter med høyere utbytter og samtidig hadde avvik mellom paralleller innenfor krav som stilles av internasjonale retningslinjer for validering av bioanalytiske metoder (45). 120% 100% 80% 60% 40% 20% 0% TBP + 1% TOA DBPi DBPi + 1% TOA TEHP TEHP + 1% TOA TEHPi TEHPi + 1% TOA TIOPi TIOPi + 1% TOA VEN ODV NDV NODV NNDODV NODVGLU NNDODVGLU Figur 15 Utbytter etter ekstraksjoner med ulike SLM basert på fosfater og fosfitter Akseptorfase: 50 µl 20 mm maursyreløsning. Organisk fase: 4 µl av løsemidler vist i figur 14. Donorfase: 125 µl 0.1 M bikarbonat-karbonatbuffer ph µl analyttblanding med den endelige konsentrasjonen i donorfasen på 200 ng/ml. Ristehastighet 900 rpm. Ekstraksjonstid: 45 min. n=4. Figur 15 indikerer at ingen av de testede løsemidlene klarte å ekstrahere analyttene med høyere utbytter i forhold til tributylfosfat. Triisodecylfosfitt (TIOPi) har en log P-verdi høyere enn 12. Utbytter på under 20% kunne indikere at denne SLM var altfor upolar for de fleste analyttene. 51

61 Det var også en mulig forklaring for utbyttene som ble oppnådd med tris(2-etylheksyl)fosfat (TEHP) og tris(2-etylheksyl)fosfitt (TEHPi), som har log P rundt 9. Forskjellen mellom de to løsemidlene var en fosfat- og en fosfittgruppe. Resultater viste at fosfitt ga bedre utbytter for den mest upolare analytten VEN mens fosfat ga høyere utbytter av de mer polare metabolittene NODV og NNDODV. Noen av tidligere EME-studier beskrev bruk av både bis(2- etylheksyl)fosfitt og bis(2-etylheksyl)fosfat som kan relateres til TEHP og TEHPi (50, 58, 59). Begge disse løsemidlene ble brukt i EME for ekstraksjoner av polare analytter med log P på henholdsvis -0.4 og Fosfat i motsetning til fosfitt blir ladet ved basisk ph på det ene oksygen atomet og dermed kan delta i ioniske interaksjoner. Det kan være en hypotetisk forklaring av høyere ekstraksjonsutbytter for NODV og NNDODV. Ekstraksjonsutbytter under 30% ble observert for alle analytter unntatt VEN med SLM som besto av dibenzylfosfitt (DBPi). Dette løsemidlet hadde lavest log P-verdi i dette forsøket. Aromatiske sidekjeder kunne være mulige årsaken på grunn av bidrag til lavere Kamlet og Taft β-verdi (49). Det ble samtidig observert at trioktylamin ikke nødvendigvis var gunstig for ekstraksjonsutbytter av mer polare analytter. Utbyttene for NODV og NNDODV fra figur 15 viste at de var like eller litt høyere i systemer uten trioktylamin. En mulig forklaring var at de mer upolare analyttene hadde større affinitet til ikke-spesifikke bindingsseter på PVDF-membranen slik at trioktylamin hadde større effekt i disse tilfellene Utvelgelse av SLM del 5 Det var ønskelig å se om høyere andel av TOA i tributylfosfat kunne bidra til å maskere enda flere bindingsseter på PVDF-membranen og forbedre ekstraksjoner, og om utbytter av mer polare metabolitter ble påvirket. Tributylfosfat ble blandet i med 1, 10 og 20% trioktylamin. Resultatene fra tabell 30 viste at jo mer trioktylamin i SLM desto lavere utbytter av de mer polare metabolittene. Det ble dermed besluttet å bruke 1% i kommende forsøk. 52

62 VEN ODV NDV NODV NNDODV NODVGLU NNDODVGLU Tabell 30 Utbytter og tilhørende RSD-verdier fra ekstraksjoner der SLM hadde ulik mengde av trioktylamin Akseptorfase: 50 µl 20 mm maursyreløsning. Organisk fase: 4 µl av løsemidler vist i tabell 30. Donorfase: 125 µl 0.1 M bikarbonat-karbonatbuffer ph µl analyttblanding med den endelige konsentrasjonen i donorfasen på 200 ng/ml. Ristehastighet 900 rpm. Ekstraksjonstid: 45 min. n=4. Tributylfosfat + 1% TOA 124% (10%) 122% (16%) 105% (15%) 79% (24%) 62% (19%) NA NA Tributylfosfat + 10% TOA 121% (9%) 101% (5%) 88% (4%) 61% (7%) 46% (6%) NA NA Tributylfosfat + 20% TOA 130% (7%) 103% (4%) 84% (7%) 53% (5%) 38% (2%) NA NA NA = ikke tilgjengelig på grunn av ingen målbare signaler Utvelgelse av SLM ved samtidig testing av utvidede ph-betingelser i donorfasen del 6 Tripentylfosfat var et helt nytt løsemiddel i PALME-sammenheng. Det ble testet i forhold til tributylfosfat, som presentert i tabell 23 delforsøk 5. Tripentylfosfat har lavere løselighet i vann og høyere kokepunkt slik at fordampning fra membranen var redusert (43). SLM med dette løsemidlet ble dermed ansett som mer stabil. I tillegg hadde det mer gunstige HMS-egenskaper (57). Tripentylfosfat er blant annet ikke kreftfremkallende i motsetning til tributylfosfat, ifølge sikkerhetsdatablader. Formålet med dette forsøket var å undersøke ekstraksjonsutbytter og RSD-verdier med SLM som besto av tripentylfosfat i forhold til tributylfosfat. Samtidig var det ønskelig å teste flere buffere (beskrevet i tabell 21). Unntatt de nevnte forandringer i donorfasen og SLM ble andre ekstraksjonsparametere holdt konstant. Utbyttene av analyttene, vist i tabell 31, var bedre eller minst like gode for VEN, ODV, NDV og NODV med SLM som var basert på tripentylfosfat. Ekstraksjoner av den mer polare metabolitten NNDODV gav derimot høyere utbytte med tributylfosfat. Dette kunne skyldes høyere log P-verdi og dermed mer lipofile egenskaper for tripentylfosfat. Det sistnevnte løsemidlet ga RSD-verdier under 10%, og i mange tilfeller var RSD selv under 5%. Det ble 53

63 VEN ODV NDV NODV NNDODV NODVGLU NNDODVGLU bestemt at optimaliseringsforsøk skulle utføres med tripentylfosfat. Begrunnelsen for den avgjørelse var større stabilitet av SLM i løpet av ekstraksjonen. Det var synlig ved hjelp av RSD-verdier som i signifikant flere tilfeller var lavere for SLM som besto av tripentylfosfat i forhold til tributylfosfat. I tillegg var det et mer operatør- og miljøvennlig løsemiddel. Den andre delen av dette forsøket skulle undersøke om andre ph-betingelser kunne ha en effekt på ekstraksjonsutbyttene. Til sammen ble syv forskjellige bikarbonat-karbonatbuffer testet med ph mellom 9.4 til Ekstraksjonen av VEN og ODV var nesten fullstendige i alle tilfeller og så ikke ut til å bli påvirket av de små ph-endringene i signifikant grad. NDV derimot ble ekstrahert i betydelig større grad ved mer basisk ph. En mulig forklaring var høyere pka-verdi av denne analytten. Det kreves mer basisk miljø for at analytten skulle eksistere i sin uladede form. Ekstraksjonene av NODV og NNDODV via tripentylfosfat-baserte membraner viste at buffer med høyere ph kunne øke utbytter med henholdsvis 20 og 10%. Dette forsøket indikerte at selv en liten endring i ph på rundt en enhet kunne gi vesentlige forandringer av ekstraksjonsutbyttene. Forandring av ph-betingelser bidro ikke til signifikante forskjeller i RSD-verdier som forble under 15%. Tabell 31 Sammenligning av utbytter og tilhørende RSD-verdier for ekstraksjoner med tripentylfosfat og tributylfosfat i et ph-område mellom 9.4 til 10.5 Akseptorfase: 50 µl 20 mm maursyreløsning. Organisk fase: 4 µl av løsemidler vist i tabell 31. Donorfase: 125 µl 0.1 M bikarbonat-karbonatbuffer med ph-verdier fra tabell µl analyttblanding med den endelige konsentrasjonen i donorfasen på 200 ng/ml. Ristehastighet 900 rpm. Ekstraksjonstid: 45 min. n=4. Buffer 1 ph 9.4 TBP + 1% TOA 110% (5%) 97% (9%) 81% (8%) 61% (17%) 50% (11%) NA NA Buffer 1 ph 9.4 TPP + 1% TOA 113% (6%) 107% (6%) 74% (3%) 59% (4%) 40% (6%) NA NA Buffer 2 ph 9.5 TBP + 1% TOA 106% (4%) 92% (6%) 85% (2%) 60% (5%) 49% (3%) NA NA Buffer 2 ph 9.5 TPP + 1% TOA 104% (4%) 108% (3%) 86% (2%) 67% (3%) 42% (5%) NA NA Buffer 3 ph 9.8 TBP + 1% TOA 112% (5%) 93% (6%) 97% (11%) 68% (7%) 55% (8%) NA NA 54

64 Buffer 3 ph 9.8 TPP + 1% TOA 108% (5%) 111% (3%) 95% (5%) 71% (3%) 47% (5%) NA NA Buffer 4 ph 9.9 TBP + 1% TOA 106% (4%) 89% (5%) 91% (2%) 66% (4%) 53% (1%) NA NA Buffer 4 ph 9.9 TPP + 1% TOA 104% (9%) 108% (5%) 101% (5%) 76% (3%) 47% (4%) NA NA Buffer 5 ph 10.1 TBP + 1% TOA 106% (3%) 99% (7%) 102% (6%) 77% (14%) 62% (17%) NA NA Buffer 5 ph 10.1 TPP + 1% TOA 99% (8%) 108% (4%) 100% (3%) 77% (5%) 49% (5%) NA NA Buffer 6 ph 10.3 TBP + 1% TOA 105% (7%) 95% (5%) 102% (4%) 74% (7%) 59% (5%) NA NA Buffer 6 ph 10.3 TPP + 1% TOA 106% (4%) 108% (3%) 107% (6%) 77% (2%) 50% (2%) NA NA Buffer 7 ph 10.5 TBP + 1% TOA 110% (6%) 94% (7%) 104% (8%) 73% (12%) 60% (11%) NA NA Buffer 7 ph 10.5 TPP + 1% TOA 106% (3%) 113% (7%) 109% (5%) 81% (3%) 50% (4%) NA NA NA = ikke tilgjengelig på grunn av ingen målbare signaler Utvelgelse av ionisk bærer Ekstraksjon av glukuronidene var fortsatt ikke mulig med rene løsemidler til tross for at utbyttene av de andre analyttene var betydelig forbedret i forhold til det opprinnelige utgangssystemet som besto av dodecylacetat. De amfotære egenskapene var muligens en av hovedutfordringene. Karboksylsyregruppen i glukuronidstrukturen var ladet i det basiske miljøet i donorfasen. For å utnytte denne negative ladningen under ekstraksjon ble det bestemt å teste tilsetning av ioniske bærere med en positiv ladning til SLM. Aliquat 336 ble valgt på bakgrunn av tidligere erfaring fra en annen prøveopparbeidelsesteknikk (14). I tillegg ble fire andre forbindelser valgt der to av dem, tetradecylammoniumbromid (TDA) og dodecyltrimetylammoniumbromid (DCMA), ble oppløst i organisk fase mens de to andre, tetraetylammoniumbromid (TEAB) og tetrabutylammoniumfosfat (TBAP), ble løst i den vandige donorfasen. De ioniske bærerne er nevnt i tabell 21. Alle disse stoffene var kvartære aminer, og forskjellen mellom dem var oppbygningen av sidekjedene. TDA og DCMA ble blandet sammen med tributylfosfat og utgjorde 5% av den organiske fasen (ikke fullstendig oppløst). TEAB og TBAP utgjorde 2% av den vandige donorfasen 55

65 VEN ODV NDV NODV NNDODV NODVGLU NNDODVGLU Utbytte Analyttblandingen var oppløst i donorfasen som ble justert med bikarbonat-karbonatbuffer til ph 9.5. I to tilfeller ble det tilsatt ioniske bærere til donorfasen som nevnt ovenfor. Analyttene ble deretter ekstrahert til 20 mm maursyre via SLM. Alle andre ekstraksjonsbetingelser ble uforandret. 140% 120% 100% 80% 60% 40% 20% 0% VEN ODV NDV NODV NNDODV NODVGLU NNDODVGLU TBP + 1% TOA TBP + A336 (80:20) TBP + DCMA + 1% TOA TBP + TBAP + 1% TOA TBP + TDA + 1% TOA TBP + TEAB + 1% TOA Figur 16 Ekstraksjonsutbytter i systemer med ioniske bærere Akseptorfase: 50 µl 20 mm maursyreløsning. Organisk fase: 4 µl av løsemidler vist i figur 16. Donorfase: 125 µl 0.1 M bikarbonat-karbonatbuffer ph µl analyttblanding med og uten ioniske bærere. Analyttenes endelige konsentrasjon i donorfasen var 200 ng/ml. Ristehastighet 900 rpm. Ekstraksjonstid: 45 min. n=4. Tabell 32 Tilhørende RSD-verdier for ekstraksjoner med ioniske bærere fra figur 16 TBP + 1% TOA 12% 23% 12% 26% 18% NA NA TBP + A336 (80:20) 54% 54% 55% 48% 50% 10% 20% TBP + DCMA + 1% TOA 3% 10% 8% 10% 9% NA NA TBP + TBAP + 1% TOA 9% 14% 6% 20% 18% NA NA TBP + TDA + 1% TOA 9% 9% 4% 5% 13% 9% 8% TBP + TEAB + 1% TOA 5% 3% 6% 7% 11% NA NA NA = ikke tilgjengelig på grunn av ingen målbare signaler Ekstraksjoner av glukuronidene var vellykket med to systemer. Det gjaldt Aliquat 336 og TDA. Mekanismen bak var trolig en kompleksdannelse mellom negativt ladet analytt og ionisk bærer med positiv ladning. Komplekset var lipofilt nok til å distribueres over i SLM. På grenseoverflaten mellom SLM og akseptorfasen hadde det sure miljøet muligens bidratt til at 56

66 Utbytte karboksylsyren mistet ladningen slik at komplekset dissosierte, og glukuronider som i tillegg fikk ladning på aminogruppen, ble oppløst i akseptorfasen mens den ioniske bæreren forble i SLM. De andre ioniske bærerne fungerte ikke tilfredsstillende. Aliquat 336 bidro til en ekstraksjon på 16% for NODVGLU og 11% for NNDODVGLU. Ekstraksjonsutbyttene for de andre mindre polare analyttene var derimot lavere i forhold til SLM som ikke hadde tributylfosfat. En mulig forklaring bak det var viskositeten av Aliquat 336 som gjorde at ekstraksjonshastigheten ble forsinket. I tillegg kunne de fysikalsk-kjemiske egenskapene til SLM være forandret slik at fordelingskoeffisienten fra donorfasen ble redusert. SLM med TDA klarte å ekstrahere begge glukuronidene med utbytter på omkring 1%. Samtidig var utbyttene for alle de andre analyttene forbedret i forhold til SLM som besto av tributylfosfat med 1% trioktylamin. Grunnen til det var ukjent siden den kationiske bæreren ikke burde ha effekt på de basiske analyttene. Alle RSD-verdier med TDA var under 15% Testing av ulike løsemidler og styrker i akseptorfasen Tabell 21 viser at ulike løsemidler ble testet i akseptorfasen der både maursyre og trifluoreddiksyre hadde tre ulike konsentrasjoner. Hensikten med dette forsøket var undersøkelse av potensielle effekter av akseptorfasen på ekstraksjonsutbyttene av analyttene. Disse løsemidlene var valgt på bakgrunn av tidligere studier av PALME (12). Utvalg av potensielle kandidater var begrenset siden akseptorfasen måtte danne et surt miljø for å fremme ioniseringen av analyttene og samtidig være flyktig for å bli kompatibel med LC-MS. 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% VEN ODV NDV NODV NNDODV NODVGLU NNDODVGLU 20mM HCOOH 100mM HCCOH 200mM HCOOH 50mM TFA 100mM TFA 150mM TFA Figur 17 Ekstraksjonsutbytter med maursyre og trifluoreddiksyre som akseptorfaser Akseptorfase: 50 µl av løsninger vist i figur 17. Organisk fase: 4 µl TBP + 20% A336. Donorfase: 125 µl 0.1 M bikarbonat-karbonatbuffer ph µl analyttblanding med den endelige konsentrasjonen i donorfasen på 200 ng/ml. Ristehastighet 900 rpm. Ekstraksjonstid: 45 min. n=4. 57

67 VEN ODV NDV NODV NNDODV NODVGLU NNDODVGLU Donorfasen i dette forsøket var justert til ph 9.5 med bikarbonat-karbonatbuffer. De organiske løsemidlene i SLM var tributylfosfat med 20% Aliquat 336. Resultatene i figur 17 viser at de laveste konsentrasjonene av trifluoreddiksyre ga lignende ekstraksjonsutbytter i forhold til systemer som benyttet maursyre. Det gjaldt for de mest upolare analyttene. Ekstraksjonen av glukuronider med trifluoreddiksyre var derimot under 5% for alle konsentrasjoner av akseptorfasen. Grunnen til det kunne være redusert dissosiasjon av analytter fra komplekser med den ioniske bæreren. Resultatene viste at maursyre var den akseptorfasen som ga høyere utbytter. De så ut til å bli avhengige av konsentrasjonen til maursyre der 100 mm fungerte bedre for de fleste analyttene i forhold til de andre konsentrasjonene. Tabell 33 Tilhørende RSD-verdier for figur 17 20mM HCOOH 9% 8% 7% 18% 7% 6% 6% 100mM HCCOH 23% 23% 13% 16% 17% 10% 7% 200mM HCOOH 6% 9% 9% 6% 6% 24% 11% 50mM TFA 9% 2% 9% 10% 10% 16% 18% 100mM TFA 8% 8% 19% 15% 13% 30% 51% 150mM TFA 68% 71% 64% 62% 61% 119% 120% Den andre hypotesen var at DMSO, som er et organisk løsemiddel blandbar med vann, kunne bidra til høyere utbytter av analytter ved å øke deres fordelingskoeffisienter over i akseptorfasen. DMSO ble tilsatt til maursyre i tre ulike forhold som vist i tabell 21. Data (se Appendix III) viste at ekstraksjonsutbytter var lavere for alle analytter i forhold til akseptorfaser uten DMSO. Økende mengde av dette løsemidlet resulterte i redusert utbytte. DMSO er et løsemiddel som klarer å løse opp flere organiske forbindelser (60). Grunnen til reduksjonen av ekstraksjonsutbytter var dermed ukjent. 58

68 Utbytte 4.2. Optimaliseringsforsøk Optimalisering av SLM De innledende forsøkene viste at sammensetningen av SLM var en av de mest sentrale parameterne som påvirket ekstraksjonsprosessen av analyttene. Hensikten med forsøkene i dette avsnittet var å finne hvilke løsemidler og ioniske bærere som ga de høyeste utbyttene og RSD-verdier under 15%. Sammensetningen av de ni testede SLM er beskrevet i tabell 24. Ekstraksjonsbetingelser er beskrevet i avsnitt Den største vekten ved vurderingene av data ble lagt på de mest polare metabolittene. Ren løsning av tripentylfosfat både uten og med tilsetning av trioktylamin var ikke i stand til å ekstrahere glukuronidene. Det bekreftet behovet for en ionisk bærer. TDA var ikke fullstendig oppløst i noen av de testede SLMene. Tilsetningen av den ioniske bæreren i fast form ble derfor forkastet på grunn av begrenset løselighet. 120% 100% 80% 60% 40% 20% 0% TPP TPP + 1% TOA TPP + 1% TOA + 20% A336 TPP + 1% TOA + 3% TDA TPP + TOA 1% + TDA 20% TPP + TOA 1% + TDA 3% + A336 20% TPP + TDA 3% TPP + A336 20% TPP + TDA 3% + A336 20% Figur 18 Ekstraksjonsutbytter med ulike SLM-sammensetninger Akseptorfase: 50 µl 20 mm maursyreløsning. Organisk fase: 4 µl av løsemidler vist i figur 18. Donorfase: 115 µl 0.1 M bikarbonat-karbonatbuffer ph µl analyttblanding med den endelige konsentrasjonen i donorfasen på 200 ng/ml + 10 µl interstandard med den endelige konsentrasjonen i donorfasen på 200 ng/ml. Ristehastighet 900 rpm. Ekstraksjonstid: 45 min. n=4. SLM som besto av tripentylfosfat i en blanding med 20% Aliquat 336 klarte å ekstrahere alle analytter. Ekstraksjonsutbyttet av glukuronidene var opp mot 17 og 19%. Alle RSD-verdier for dette systemet var under 15%. Resultatene fra figur 18 viser i tillegg at tilsetning av trioktylamin bidro til reduserte utbytter. På bakgrunn av tilgjengelige data ble det konkludert med at videre trinn av optimaliseringsprosessen ble utført med SLM som besto av tripentylfosfat og Aliquat 336. VEN ODV NDV NODV NNDODV NODVGLU NNDODVGLU 59

69 RSD-verdier Utbytte I det neste steget i optimalisering av SLM ble det fokusert på mengden av ionisk bærer i SLM. De eksperimentelle betingelsene er beskrevet i flere detaljer i avsnitt % 100% 80% 60% 40% 20% 0% A336 0% A336 10% A336 15% A336 20% A336 25% A336 30% Mengde av A336 i blanding med TPP Figur 19 Ekstraksjonsutbytter med varierende mengde av Aliquat 336 i SLM Akseptorfase: 50 µl 20 mm maursyreløsning. Organisk fase: 4 µl av løsemidler vist i figur 19. Donorfase: 115 µl 0.1 M bikarbonat-karbonatbuffer ph µl analyttblanding med den endelige konsentrasjonen i donorfasen på 200 ng/ml + 10 µl interstandard med den endelige konsentrasjonen i donorfasen på 200 ng/ml. Ristehastighet 900 rpm. Ekstraksjonstid: 45 min. n=4. Ekstraksjonsutbyttene var økende i takt med høyere andel av Aliquat 336. Økningen var kontinuerlig for glukuronider mens utbyttene til de andre analyttene begynte å falle når mengden av Aliquat 336 ble økt fra 25 til 30 %. Ekstraksjonsutbytter er vist i figur 19 med tilhørende RSD-verdier i figur 20. En mulig forklaring var økende viskositet av den organiske fasen og redusert diffusjonshastighet til analyttene som ikke var avhengige av kompleksdannelsen. 40% 35% 30% 25% 20% 15% 10% 5% VEN ODV NDV NODV NNDODV NODVGLU NNDODVGLU 0% VEN ODV NDV NODV NNDODV NODVGLU NNDODVGLU TPP + A336 0% TPP + A336 10% TPP + A336 15% TPP + A336 20% TPP + A336 25% TPP + A336 30% Figur 20 RSD-verdier for tilhørende forsøk fra figur 19 60

70 VEN ODV NDV NODV NNDODV NODVGLU NNDODVGLU Basert på resultatene fra begge forsøk ble det bestemt at den optimale sammensetningen av SLM for venlafaksin og dens metabolitter var tripentylfosfat blandet med 25% A Optimalisering av buffer ph i donorfasen De innledende forsøk antydet at ph i donorfasen kunne påvirke ekstraksjonsutbyttene. Det var dermed ønskelig å finne den optimale ph-verdien som ville sikre de høyeste utbyttene for alle analytter. Fosfat- og bikarbonat-karbonatbuffer i tillegg til NaOH ble testet som nevnt i avsnitt Resultatene er vist i tabell 34. Fosfatbuffer ga utbytter på under 10% for de fleste analyttene unntatt venlafaksin. Grunnen til det var sannsynligvis at analyttene var til stede i ladet form ved ph 7.4 slik at de ikke kunne diffundere fra donorfasen til SLM. Bikarbonat-karbonatbuffer ga bedre utbytter enn fosfat og NaOH. Utbyttene økte i mer basisk miljø. Det ble allikevel observert et fall når NaOH-løsningen ble brukt. Det gjaldt hovedsakelig glukuronidene. Den hadde ph som var over to enheter høyere enn den mest basiske bikarbonat-karbonatbufferen fra dette delforsøket. Det var i samsvar med endring av polariteten som en variabel av endrende ph beskrevet i figur En nøye kontroll av ph-betingelser ble dermed ansett som nødvendig. Tabell 34 Ekstraksjonsutbyttene med tilhørende RSD-verdier for ekstraksjoner med ulike phverdier i donorfasen - delforsøk 1 Akseptorfasen: 50 µl 20 mm maursyreløsning. Organisk fase: 4 µl TPP + 25% A336. Donorfasen: 115 µl 0.1 M bikarbonat-karbonatbuffer ph som vist i tabell µl analyttblanding med den endelige konsentrasjonen i donorfasen på 200 ng/ml + 10 µl interstandard med den endelige konsentrasjonen i donorfasen på 200 ng/ml. Ristehastighet 900 rpm. Ekstraksjonstid: 45 min. n=4. Buffer ph % (5%) 10% (4%) 1% (6%) 1% (5%) 2% (8%) 0.2% (4%) 0.4% (7%) Buffer ph % (12%) 63% (13%) 35% (9%) 33% (10%) 37% (8%) 2% (30%) 5% (22%) Buffer ph % (6%) 67% (7%) 40% (6%) 37% (7%) 43% (5%) 2% (4%) 6% (4%) 61

71 VEN ODV NDV NODV NNDODV NODVGLU NNDODVGLU Buffer ph % (13%) 67% (13%) 44% (19%) 38% (14%) 47% (17%) 3% (29%) 6% (25%) Buffer ph % (12%) 49% (14%) 40% (12%) 36% (15%) 38% (19%) 4% (13%) 8% (10%) Buffer ph % (4%) 69% (6%) 40% (13%) 34% (13%) 37% (22%) 2% (21%) 3% (53%) Siden den mest basiske bikarbonat-karbonatbufferen fra tabell 34 ga høyest utbytte for glukuronidene, ble det gjennomført et supplerende forsøk som undersøkte et utvidet spekter av ph-verdier som var mulige å oppnå med den bufferen. Forsøk ble utført på ulike dager. Dermed har delforsøket fra tabell 35 inkludert en del like phstyrker for å bidra til større sikkerhet i den endelige beslutningen. Bikarbonat-karbonatbuffer med ph 10.5 viste de høyeste ekstraksjonsutbyttene for glukuronidene i forhold til andre systemene. Ekstraksjonsutbyttene av de andre polare metabolittene NODV og NNDODV var rundt 50% som er høyere enn med de fleste andre betingelser. Samtidig var RSD-verdiene mellom 0 og 6%. Disse betingelser ble ansett som optimale til tross for at ph 10.5 var igjen den ytre grenseverdien. Det betyr at de målte ekstraksjonsutbyttene hadde økende tendenser, spesielt for glukuronidene. Samtidig ble det observert at forskjeller mellom utbyttene var lave ved sammenligning av ph 10.1 eller 10.3 med 10.5 Det tydet på at kurvene for ekstraksjonsutbytter flatet ut og eventuell utforskning av mer basisk ph ikke ville ført til en vesentlig gevinst. Denne bufferen ble dermed brukt i de kommende forsøk. Tabell 35 Ekstraksjonsutbyttene med tilhørende RSD-verdier for ekstraksjoner med ulike phverdier i donorfasen - delforsøk 2 Ekstraksjonsbetingelser forble uendret i forhold til de som er beskrevet i tabell 34. Den eneste forskjellen var buffer ph. Tabell 35 viser de testede ph-verdier. Buffer ph % (6%) 11% (6%) 1% (2%) 1% (2%) 2% (2%) 0.2% (6%) 0.2% (4%) Buffer ph % (17%) 61% (18%) 38% (19%) 34% (14%) 41% (19%) 2% (21%) 5% (17%) Buffer ph % (38%) 55% (45%) 40% (42%) 34% (39%) 40% (43%) 3% (22%) 6% (18%) 62

72 Utbytte Buffer ph % (5%) 66% (8%) 54% (6%) 48% (4%) 52% (2%) 4% (6%) 8% (4%) Buffer ph % (14%) 63% (18%) 54% (14%) 47% (10%) 50% (13%) 5% (13%) 9% (10%) Buffer ph % (6%) 64% (5%) 57% (1%) 49% (3%) 50% (1%) 6% (4%) 10% (0%) Buffer ph % (5%) 68% (8%) 54% (5%) 38% (3%) 36% (3%) 3% (8%) 4% (8%) Optimalisering av styrken i akseptorfasen Avsnitt gir oversikt over betingelser som ble undersøkt for å finne den optimale styrken av maursyre i akseptorfasen. I likhet med de forrige forsøk ble den største vekten lagt på ekstraksjoner av glukuronidene. Konsentrasjonen av maursyre i et område mellom 20 og 200 mm ble undersøkt. Generelt økte utbyttene for de mest polare analyttene med minkende konsentrasjon av maursyreløsningene. På grunn av dette og siden 20 mm var den laveste konsentrasjonen testet i forsøket, var det ønskelig å undersøke om maursyreløsningene med lavere styrker kunne gi enda høyere utbytter. 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 20 mm HCOOH 50 mm HCOOH 75 mm HCOOH 100 mm HCOOH 150 mm HCOOH 200 mm HCOOH VEN ODV NDV NODV NNDODV NODVGLU NNDODVGLU Figur 21 Ekstraksjonsutbytter med akseptorfaser som hadde styrker mellom mm Akseptorfasen: 50 µl som vist i figur 21. Organisk fase: 4 µl TPP + 25% A336. Donorfasen: 115 µl 0.1 M bikarbonat-karbonatbuffer ph µl analyttblanding med den endelige konsentrasjonen i donorfasen på 200 ng/ml + 10 µl interstandard med den endelige konsentrasjonen i donorfasen på 200 ng/ml. Ristehastighet 900 rpm. Ekstraksjonstid: 45 min. n=4. Delforsøk 2 vist i figur 22 hadde til hensikt å studere konsentrasjonen av maursyre i området 1-50 mm. Økning av ekstraksjonsutbyttene fra 1 mm til 20 mm kunne skyldes at akseptorfasen ble surere og dermed sikret ladning av analyttene i økende grad. Følgende nedgang av 63

73 VEN ODV NDV NODV NNDODV NODVGLU NNDODVGLU Utbytte ekstraksjonsutbyttene ved høyere styrke av akseptorfasen kunne være en utsaltningseffekt som begrenset løseligheten av analyttene. Tabell 36 viser at RSD-verdier var under 15% i de fleste tilfeller. 20 mm maursyreløsning ble valgt til å bli den optimale akseptorfasen % 60.00% 50.00% 40.00% 30.00% 20.00% 10.00% 0.00% 1 mm HCOOH 5 mm HCOOH 10 mm HCOOH 20 mm HCOOH 50 mm HCOOH VEN ODV NDV NODV NNDODV NODVGLU NNDODVGLU Figur 22 Ekstraksjonsutbytter med akseptorfaser som hadde styrker mellom 1-50 mm Ekstraksjonsbetingelser forble uendret i forhold til de som er beskrevet i figur 21. Den eneste forskjellen var styrke av akseptorfasen. Figur 22 viser de testede styrker av akseptorfasen. Tabell 36 Tilhørende RSD-verdier for delforsøk 1 og 2 fra figur 21 og 22 Delforsøk 1 20 mm HCOOH 13% 8% 10% 4% 6% 12% 6% 50 mm HCOOH 11% 10% 11% 11% 9% 14% 12% 75 mm HCOOH 6% 6% 4% 8% 5% 16% 13% 100 mm HCOOH 3% 5% 2% 6% 7% 23% 19% 150 mm HCOOH 5% 8% 5% 5% 7% 9% 11% 200 mm HCOOH 5% 7% 5% 4% 6% 7% 6% Delforsøk 2 1 mm HCOOH 9% 9% 5% 4% 7% 2% 4% 5 mm HCOOH 12% 10% 6% 6% 6% 4% 6% 64

74 Utbytte 10 mm HCOOH 5% 3% 7% 4% 2% 4% 4% 20 mm HCOOH 8% 8% 8% 3% 8% 9% 4% 50 mm HCOOH 3% 7% 7% 5% 13% 4% 4% Optimalisering av ekstraksjonstid Tidskurve ble laget for å kunne bestemme den optimale ekstraksjonstiden. I avsnitt nevnes tidspunkter for målinger i dette forsøket. Både akseptorfasen og donorfasen ble analysert med UHPLC-MS i dette forsøket. Grunnen til det var et ønske om å ha større kjennskap til fordelingen av analyttene mellom de ulike fasene som funksjon av tid. De fleste kurvene steg kraftig til 30 min for så å jevne ut mellom 45 og 60 min. VEN og ODV konsentrasjonen i akseptorfasen falt deretter betydelig. Glukuronidene hadde en konstant og sakte økning av utbyttene som funksjon av tid, som flatet ut etter 90 min. 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% VEN ODV NDV NODV NNDODV NODVGLU NNDODVGLU Figur 23 Ekstraksjonsutbytter i akseptorfasen som en funksjon av tid Akseptorfase: 50 µl 20 mm maursyreløsning. Organisk fase: 4 µltpp + 25% A336. Donorfase: 115 µl 0.1 M bikarbonat-karbonatbuffer ph µl analyttblanding med den endelige konsentrasjonen i donorfasen på 200 ng/ml + 10 µl interstandard med den endelige konsentrasjonen i donorfasen på 200 ng/ml. Ristehastighet 900 rpm. Ekstraksjonstid: 15, 30, 45, 60, 90, 120 og 180 min. n=4. Kurvene fra donorfasen viste at mesteparten av alle analyttene ble fjernet fra denne fasen innen 15 min og holdt seg ganske jevnt over de tre kommende timene til tross for en liten økning etter 120 min for de mest upolare metabolittene. Dette kunne tyde på svak tilbake-ekstraksjon etter lang tid. 65

75 VEN ODV NDV NODV NNDODV NODVGLU NNDODVGLU Utbytte Resultatene tydet på at analyttene som ikke ble registrert verken i akseptor- eller donorfasen, befant seg andre steder. De kunne blitt fanget i SLM eller på brønnveggene. Den optimale ekstraksjonstiden ble valgt til 45 min. Ved dette tidspunktet var ekstraksjonsutbyttene på det høyeste for de fleste analytter, og det var ingen store forandringer i forhold til 60 min. Valg av 45 min fremfor 60 min bidro i tillegg til forbedret tidseffektivitet av prøveopparbeidelsestrinnet. RSD-verdier for disse forsøkene presenteres i tabell 37 og 38. Gjennomsnittlige relative standardavvik for analyttene i akseptorfasen var høyeste ved de to tidligste målingspunktene. De ble fulgt av lavere verdier spesielt ved 45 min der alle RSD verdier var under 6%. 12% 10% 8% 6% 4% 2% 0% VEN ODV NDV NODV NNDODV NODVGLU NNDODVGLU Figur 24 Ekstraksjonsutbytter i donorfasen som en funksjon av tid Ekstraksjonsbetingelser forble uendret i forhold til de som er beskrevet i figur 23. Tabell 37 RSD-verdier for akseptorfasen fremstilt i figur min 15% 16% 18% 15% 17% 16% 13% 30 min 18% 19% 15% 9% 7% 14% 12% 45 min 3% 6% 3% 3% 6% 6% 6% 60 min 7% 11% 1% 5% 3% 17% 12% 90 min 13% 17% 5% 5% 7% 4% 2% 120 min 15% 17% 5% 3% 5% 7% 5% 180 min 9% 11% 10% 6% 13% 2% 6% 66

76 VEN ODV NDV NODV NNDODV NODVGLU NNDODVGLU Tabell 38 RSD-verdier for donorfasen fremstilt i figur min 4% 5% 8% 5% 12% 5% 3% 30 min 8% 16% 33% 6% 3% 4% 4% 45 min 5% 8% 13% 6% 6% 4% 4% 60 min 8% 15% 16% 6% 5% 1% 3% 90 min 8% 14% 9% 9% 9% 5% 4% 120 min 23% 25% 41% 15% 14% 2% 4% 180 min 4% 5% 7% 2% 7% 5% 4% Optimalisering av bufferstyrken i donorfasen Ekstraksjonen av glukuronidene og de andre polare metabolittene varierte avhengig av prøven som de befant seg i. Det ble bekreftet ved hjelp av ekstraksjoner fra ulike urinprøver. Oppnådde ekstraksjonsutbytter er vist i figur 25. For å redusere denne variasjonen ble effekten av ulike bufferstyrker i donorfasen undersøkt. Høyere bufferstyrke reduserte innflytelsen av matrikskomponenter og bidro til en utsaltingseffekt i donorfasen. Til sammen ble det undersøkt fem ulike styrker som beskrevet i avsnitt Bikarbonat-karbonatbuffer med styrke på 0.75 M viste de høyeste ekstraksjonsutbyttene med hensyn til glukuronider og ble dermed valgt for videre arbeid. Det er presentert i tabell 39. Utbyttene av de andre metabolittene var sammenlignbare med buffere som hadde styrker på 0.5 og 1 M. Det ble utført et tilsvarende forsøk i forhold til det presentert i figur 25. Bikarbonatkarbonatbuffer med styrke på 0.1 M ble erstattet med 0.75 M. Det er vist i figur I i Appendix IV. Resultatene tydet på at variasjonen i ekstraksjonsutbytter var redusert med høyere bufferstyrke spesielt for de fem mest upolare analyttene. RSD-verdier (ikke vist her) for de to forsøkene var under 15% i de fleste tilfellene. 67

77 VEN ODV NDV NODV NNDODV NODVGLU NNDODVGLU Utbytte 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% Urin 1 Urin 2 Urin 3 Urin 4 Venlafaxine ODV NDV NODV NNDODV NODVGLU NNDODVGLU Figur 25 Sammenligning av ekstraksjonsutbytter oppnådd fra ekstraksjoner med ulike urin prøver Akseptorfase: 50 µl 20 mm maursyreløsning. Organisk fase: 4 µl TPP + 25% A336. Donorfase: 115 µl 0.1 M bikarbonat-karbonatbuffer ph µl analyttblanding med den endelige konsentrasjonen i donorfasen på 200 ng/ml + 10 µl interstandard med den endelige konsentrasjonen i donorfasen på 200 ng/ml. Ristehastighet 900 rpm. Ekstraksjonstid: 45 min. n=4. Tabell 39 Ekstraksjonsutbytter og tilhørende RSD verdier for systemer med ulik styrke av buffer i donorfasen Akseptorfase: 50 µl 20 mm maursyreløsning. Organisk fase: 4 µl TPP + 25% A336. Donorfase: 115 µl bikarbonat-karbonatbuffer ph 10.5 med bufferstyrke som vist i tabell µl analyttblanding med den endelige konsentrasjonen i donorfasen på 200 ng/ml + 10 µl interstandard med den endelige konsentrasjonen i donorfasen på 200 ng/ml. Ristehastighet 900 rpm. Ekstraksjonstid: 45 min. n=4. 0,1M 44% (8%) 41% (9%) 17% (13%) 14% (10%) 17% (9%) 0.1% (35%) 0.5% (29%) 0,25M 47% (3%) 44% (7%) 36% (7%) 27% (5%) 26% (4%) 0.8% (17%) 1% (12%) 0,5M (n=3) 47% (1%) 44% (6%) 42% (7%) 31% (1%) 27% (3%) 1% (18%) 2% (17%) 0,75M 43% (8%) 42% (6%) 38% (6%) 32% (1%) 27% (8%) 2% (6%) 2% (4%) 68

78 Utbytte 1M 44% (7%) 44% (10%) 39% (6%) 33% (3%) 27% (5%) 2% (19%) 2% (12%) Hypotesen bak variasjonen i utbyttene av glukuronider gjaldt mengden av salt i urinen som burde bli høyere hvis den var konsentrert. Forsøk med såkalt «kunstig urin», beskrevet i avsnitt , viste at salt mengden kunne ha en betydelig effekt hovedsakelig på ekstraksjonen av glukuronidene. Det er presentert i figur 26. Forsøk med urea viste tilsvarende utbytter og ekstraksjonsmønster som tydet på at saltkonsentrasjonen hadde større relevans. 50% 45% 40% 35% 30% 25% 20% 15% 10% 5% 0% Høy NaClK Medium NaClK Lav NaClK VEN ODV NDV NODV NNDODV NODVGLU NNDODVGLU Figur 26 Ekstraksjonsutbytter fra kunstig urin som simulerte tre saltkonsentrasjonsnivåer Akseptorfase: 50 µl 20 mm maursyreløsning. Organisk fase: 4µl TPP + 25% A336. Donorfase: 115 µl 0.1 M bikarbonat-karbonatbuffer ph µl «kunstig urin» i tre saltkonsentrasjoner med analyttblanding med den endelige konsentrasjonen i donorfasen på 200 ng/ml + 10 µl interstandard med den endelige konsentrasjonen i donorfasen på 200 ng/ml. Ristehastighet 900 rpm. Ekstraksjonstid: 45 min. n= Testing av motioner Figur 23 viser at glukuronidene hadde betydelig lavere ekstraksjonsutbytter i forhold til de andre analyttene. Samtidig tydet kurvene fra figur 24 på at glukuronidforekomsten i donorfasen var under 10%. En mulig forklaring var at de var fortsatt i SLM og klarte ikke å dissosiere fra komplekset med bæremolekyler. Det var dermed ønskelig å undersøke om tilsetting av et motion i akseptorfasen kunne forbedre ekstraksjonsutbytter. Motionet skulle ha større affinitet til de funksjonelle gruppene på bæremolekylet og analytten for å fremme dissosiasjonen. De var valgt på bakgrunn av den relative selektiviteten som de hadde (61). Til sammen var fire motioner testet som vist i tabell 22. Ingen av dem klarte å forbedre ekstraksjonsutbytter. Grunnen til det var ukjent. 69

79 4.3. Evaluering De endelige ekstraksjonsparameterne var 125 µl urin som ble justert med 115 µl 0.75 M bikarbonat-karbonatbuffer med ph 10.5 og 10 µl intern standard i donorfasen. SLM besto av 4 µl tripentylfosfat med 25% Aliquat 336 som ble immobilisert i PVDF-membranen. Akseptorfasen var 50 µl av en 20 mm maursyreløsning. Ekstraksjonstiden var 45 min og ristehastigheten var 900 rpm. Antall paralleller er beskrevet i avsnitt 3.9. Overnevnte ekstraksjonsbetingelser var like for tabeller 41 til Laveste deteksjonsgrense og kvantifiseringsgrense Avsnitt beskriver betingelser ved bestemmelsen av LOD og LOQ. Gjennomsnittlig høyde av hver analytt ble sammenlignet med gjennomsnittlig støyhøyde og på bakgrunn av det ble signal/støy forholdet funnet. Verdiene ble omregnet til konsentrasjoner oppgitt i ng/ml. LOQ var beregnet ved hjelp av LOD som ble multiplisert med 3.3. Signal/støy forholdet var da lik 10. Verdier presenteres i tabell 40. Tabell 40 Analyttens laveste deteksjons- og kvantifiseringsgrense Akseptorfase: 50 µl 20 mm maursyreløsning. Organisk fase: 4 µl TPP + 25% A336. Donorfase: 125 µl 0.75 M bikarbonat-karbonatbuffer ph µl analyttblanding som vist i avsnitt Ristehastighet 900 rpm. Ekstraksjonstid: 45 min. n=4. VEN NNDODV LOD 0.26 ng/ml LOD 4.25 ng/ml LOQ 0.87 ng/ml LOQ ng/ml ODV NODVGLU LOD 0.23 ng/ml LOD 2.56 ng/ml LOQ 0.76 ng/ml LOQ 8.53 ng/ml NDV NNDODVGLU LOD 0.42 ng/ml LOD 3.68 ng/ml LOQ 1.40 ng/ml LOQ ng/ml NODV LOD 0.55 ng/ml LOQ 1.82 ng/ml Linearitet Serie 1 representerte intradaganalyse mens serie 1 og 2 var brukt for interdaganalyse. Analyse av lineariteten i serie 2 var nødvendig for beregninger av nøyaktighet og presisjon. R 2 -verdier for alle analyttene i begge serier var over Det eneste unntaket var NODVGLU i serie 2 som hadde en verdi over Det er presentert i tabell 41. Verdier over 0.99 er viktige når 70

80 Area Ratio Area Ratio Area Ratio Area Ratio metoden skal brukes til kvantifisering (35). Verdier i nærheten av 1 tyder på god korrelasjon mellom toppareal og konsentrasjon. Kalibreringskurver for NNDODVGLU, NODVGLU og NNDODV var laget for et konsentrasjonsområde mellom 20 og 1000 ng/ml med syv ulike konsentrasjonsnivåer. Hvert nivå besto av fire paralleller. De resterende analytter hadde ti konsentrasjonsnivåer mellom 2 og 1000 ng/ml. Det oppfylte krav som stilles fra EMA retningslinjer (45). De krever minst seks konsentrasjonsnivåer. Minst 75% av alle tilbake kalkulerte konsentrasjoner oppfylte krav som stilles i forhold til avvik fra nominelle verdier. Tabell 41 Kalibreringskurver med tilhørende ligninger og r 2 -verdier for alle analyttene Serie 1 Serie 2 VEN ng/ml R^2 = VEN Y = *X e-008*X^2 R^2 = W: 1/X Y= *X e-008*X^2 VEN ng/ml R^2 = VEN Y = e *X e-008*X^2 R^2 = W: 1/X Y= e *X *X^ ng/ml ODV ng/ml R^2 = ODV Y = *X e-006*X^2 R^2 = W: 1/X Y= *X e-006*X^ ng/ml ODV ng/ml R^2 = ODV Y = *X e-006*X^2 R^2 = W: 1/X Y= *X e-006*X^ ng/ml NDV ng/ml R^2 = NDV Y = *X e-008*X^2 R^2 = W: 1/X Y= *X e-008*X^ ng/ml NDV ng/ml R^2 = NDV Y = *X e-008*X^2 R^2 = W: 1/X Y= *X e-008*X^ ng/ml ng/ml 71

81 Area Ratio Area Ratio Area Ratio Area Ratio Area Ratio Area Ratio NODV ng/ml R^2 = NODV Y = *X e-007*X^2 R^2 = W: 1/X Y= *X e-007*X^ ng/ml NNDODV ng/ml R^2 = NNDODV Y = *X e-008*X^2 R^2 = W: 1/X Y= *X e-008*X^ ng/ml NODVGLU ng/ml R^2 = Y = *X e-008*X^2 R^2 = W: 1/X NODV ng/ml R^2 = NODV Y = *X e-007*X^2 R^2 = W: 1/X Y= *X e-007*X^ ng/ml NNDODV ng/ml R^2 = NNDODV Y = *X e-008*X^2 R^2 = W: 1/X 0.6 Y= *X e-008*X^ ng/ml NODVGLU ng/ml R^2 = Y = *X e-008*X^2 R^2 = W: 1/X ng/ml NNDODVGLU ng/ml R^2 = Y= *X e- NODVGLU 008*X^2 Y= *X e- NODVGLU 008*X^2 Y= *X e- NNDODVGLU 008*X^2 Y = *X e-008*X^2 R^2 = W: 1/X ng/ml NNDODVGLU ng/ml R^2 = Y= *X e-008*X^2 NNDODVGLU Y = *X e-008*X^2 R^2 = W: 1/X ng/ml ng/ml 72

82 VEN ODV NDV NODV NNDODV NODVGLU NNDODVGLU VEN ODV NDV NODV NNDODV NODVGLU NNDODVGLU Overdrag Det ble gjennomført en visuell inspeksjon av kromatogrammer. Hensyn ble tatt til retensjonstider av analyttene og topper ble sammenlignet med den laveste kvantifiseringsgrensen. Det ble ikke observert tegn til overdrag for intern standard eller noen av analyttene Presisjon og nøyaktighet Tabell 42 presenterer RSD verdier som ble beregnet på bakgrunn av QC-prøver fra serie 1. Alle verdier var innenfor krav som stilles av EMA (45). Det tydet på at spredningen i resultatene var liten. Tabell 42 Evaluering - Presisjon fra intradaganalyse 2 ng/ml 4% 4% 7% 9% 6 ng/ml 7% 5% 4% 4% 20 ng/ml 8% 5% 6% 5% 13% 10% 11% 60 ng/ml 7% 6% 4% 8% 6% 7% 6% 400 ng/ml 5% 7% 4% 3% 6% 5% 6% 850 ng/ml 5% 5% 10% 8% 7% 9% 9% Nøyaktigheten fra serie 1 er presentert i tabell 43. QC-prøvene for VEN, NDV og NODV overskred kravene. Alle andre resultater plasserte seg innenfor kravene fra retningslinjer. Til sammen hadde 6 av 36 verdier ikke oppfylt EMA kravene. De er markert med understreking. Tabell 43 Evaluering - Nøyaktighet fra intradaganalyse 2 ng/ml 123% 93% 131% 116% 6 ng/ml 104% 107% 114% 118% 73

83 VEN ODV NDV NODV NNDODV NODVGLU NNDODVGLU VEN ODV NDV NODV NNDODV NODVGLU NNDODVGLU 20 ng/ml 105% 115% 117% 125% 109% 119% 120% 60 ng/ml 98% 104% 107% 116% 108% 109% 100% 400 ng/ml 96% 96% 98% 100% 103% 109% 101% 850 ng/ml 104% 105% 109% 112% 111% 112% 108% ODV, NDV og NODV fra interdaganalyse overskred 20% grensen for presisjon for de laveste QC-prøvene. Dette kunne skyldes en liten avstand fra LOQ. Alle andre verdier var innenfor krav som vist i tabell 44. Tabell 44 Evaluering - Presisjon fra interdaganalyse 2 ng/ml 18% 41% 27% 36% 6 ng/ml 6% 11% 10% 12% 20 ng/ml 10% 10% 10% 12% 14% 12% 14% 60 ng/ml 7% 6% 8% 11% 11% 13% 12% 400 ng/ml 5% 5% 7% 7% 7% 9% 10% 850 ng/ml 7% 5% 10% 12% 9% 11% 10% De laveste QC-prøvene for ODV var under (under 20%) mens var over (over 20%) kravene for NODVGLU. EMA stiller krav til ± 20% avvik for de laveste QC-prøvene og 15% for de med høyere konsentrasjoner (45). Det er presentert i tabell 45. Alle andre verdier var innenfor grensene. Tabell 45 Evaluering - Nøyaktighet fra interdaganalyse 2 ng/ml 109% 64% 102% 86% 6 ng/ml 101% 96% 103% 104% 20 ng/ml 96% 105% 107% 114% 110% 121% 118% 60 ng/ml 93% 101% 102% 108% 104% 109% 101% 74

84 400 ng/ml 94% 95% 102% 100% 101% 107% 102% 850 ng/ml 100% 103% 103% 104% 108% 105% 103% For 72 presisjonsmålinger i evaluering var 69 innenfor EMA kravene mens tre målinger var utenfor. For nøyaktighetsmålingene var 64 av resultatene innenfor kravene mens åtte målinger var utenfor. Dette prosjektet var konseptuelt og dermed anses disse resultatene som akseptable på nåværende stadium Matrikseffekter De to laveste konsentrasjonene for NDV og alle for VEN var under kravet på 15% i forhold til nøyaktighet. Det er presentert i tabell 46. Alle andre verdier var innenfor kravene. VEN og NDV hadde lignende retensjonstider som differensierte fra hverandre med 0.03 min. Det kan skje at litt av SLM lekket ut i akseptorfasen som funksjon av tiden, og at dette koeluerte med VEN og NDV under LC-MS analysene. På denne måten bidro den til ioneundertrykkelse i MS. Alternativt skyldes det noen ikke karakteriserte endogene forbindelser fra urinen som klarte å diffundere gjennom SLM. Dette bør undersøkes nærmere på et senere tidspunkt. Tabell 46 Matrikseffekter 6 ng/ml 60 ng/ml 340 ng/ml VEN 73% 78% 84% ODV 110% 102% 99% NDV 77% 83% 86% NODV 106% 100% 99% NNDODV 95% 96% NODVGLU 97% 98% NNDODVGLU 91% 94% Ekstraksjonsutbytte Bestemmelsen av ekstraksjonsutbytte er ikke et krav fra retningslinjer (45). Resultater er allikevel rapportert siden det er anbefalt for teknikker der analytter befinner seg i ulike faser under prøveopparbeidelsestrinnet (1). Det er tilfelle med PALME. Ekstraksjonsutbytter vises i tabell

85 Tabell 47 Ekstraksjonsutbytte 6 ng/ml 60 ng/ml 340 ng/ml 1 VEN 42% 40% 44% ODV 42% 45% 47% NDV 49% 50% 52% NODV 49% 53% 53% NNDODV 45% 46% NODVGLU 14% 15% NNDODVGLU 12% 12% 1 I motsetning til 6 og 60 ng/ml ble 340 ng/ml ikke beregnet i forhold til en tilsvarende QC-prøve konsentrasjon. Utgangspunktet ble tatt i en QC-prøve på 400 ng/ml som ble ganget med 0.85 som ga 340 ng/ml. Ekstraksjonsutbytter varierte fra 12% til 53%. Utbytter av glukuronidene var omtrent tre ganger lavere i forhold til de andre analyttene. Forskjeller mellom de ulike konsentrasjonene var neglisjerbare i de fleste tilfellene. Dette tydet på ekstraksjoner ikke var konsentrasjonsavhengige. 76

86 5. Konklusjon Resultatene fra dette prosjektet viste at PALME klarte å ekstrahere legemiddelet venlafaksin med tilhørende metabolitter i ett prøveopparbeidelsestrinn fra urin. Metabolitter inkluderte glukuronider som hadde amfotære egenskaper. PALME viste dermed for første gang at det var en egnet teknikk for ekstraksjoner av analyttblandinger med et bredt spekter av log P-verdier fra -1.2 til 2.5. Det var mulig ved hjelp av en omfattende optimalisering av ekstraksjonsbetingelser. Det innebar bruk av tripentylfosfat som var et helt nytt organisk løsemiddel i PALME-sammenheng. Det var blandet sammen med Aliquat 336 siden dens bæreregenskaper muliggjorde ekstraksjonen av glukuronidene. Denne blandingen var brukt for å danne SLM. En forsiktig justering av ph-betingelser i donorfasen med bikarbonat-karbonatbuffer fremfor en NaOHløsning var også nytt og tillot oppnåelsen av høyere ekstraksjonsutbytter. Akseptorfasen bestående av maursyreløsning ble til slutt injisert direkte i UHPLC-MS/MS. Ekstraksjonsutbytter var mellom 12 og 53% for henholdsvis polar NNDODVGLU og NODV. Evaluering av metoden var basert på retningslinjer fra europeiske legemiddelmyndigheter (EMA). Testing av linearitet, presisjon, nøyaktighet, overdrag og matrikseffekter var blant de undersøkte parameterne. Mange av de oppnådde verdiene var innenfor krav. Alle kalibreringskurver hadde r 2 -verdier over 0.99 unntatt en enkel måling av NODVGLU som plasserte seg over Over 90% av QC-prøver var i samsvar med retningslinjer. Evalueringsresultater var ansett som akseptable på grunn av den konseptuelle naturen av dette prosjektet. Videreutvikling av dette prosjektet kunne rette sitt fokus mot stabilitetsstudier for å få større kontroll over eventuell degradering av analytter ved brukte betingelser. Matrikseffekter for de mest upolare analyttene VEN og NDV burde også undersøkes nærmere i forhold til komponenter fra urinen eller lekkasje av SLM ut i akseptorfasen som kunne bidra til ioneundertrykkelse. Disse resultatene bekreftet igjen potensialet av PALME. Den teknikken er egnet for ekstraksjoner av analyttblandinger med et bredt område av log P-verdier. I tillegg tillater PALME ekstraksjoner av både basiske og zwitterioniske analytter i ett prøveopparbeidelsestrinn. Det åpner veien for nye anvendelsesområder som kan etter hvert 77

87 utnyttes for legemiddelmetabolismestudier i drug discovery eller monitorering av legemidler og tilhørende metabolitter på rutinelaboratorier. 78

88 6. Referanseliste 1. Hansen SH, Pedersen-Bjergaard S. Bioanalysis of Pharmaceuticals: Sample Preparation, Separation Techniques and Mass Spectrometry. Hoboken: Wiley; s. 2. Schlittenbauer L, Seiwert B, Reemtsma T. Matrix effects in human urine analysis using multi-targeted liquid chromatography tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 2015;1415: Bylda C, Thiele R, Kobold U, Volmer DA. Recent advances in sample preparation techniques to overcome difficulties encountered during quantitative analysis of small molecules from biofluids using LC-MS/MS. Analyst. 2014;139(10): Pawliszyn J, Pedersen-Bjergaard S. Analytical Microextraction: Current Status and Future Trends. Journal of Chromatographic Science. 2006;44(6): Jeannot MA, Cantwell FF. Solvent Microextraction into a Single Drop. Analytical Chemistry. 1996;68(13): Pedersen-Bjergaard S, Rasmussen KE. Liquid Liquid Liquid Microextraction for Sample Preparation of Biological Fluids Prior to Capillary Electrophoresis. Analytical Chemistry. 1999;71(14): Sarafraz-Yazdi A, Amiri A. Liquid-phase microextraction. Trends in Analytical Chemistry. 2010;29(1): Gjelstad A. Parallel artificial liquid membrane extraction: micro-scale liquid liquid liquid extraction in the 96-well format. Bioanalysis. 2013;5(11): Roldán-Pijuán M, Pedersen-Bjergaard S, Gjelstad A. Parallel artificial liquid membrane extraction of acidic drugs from human plasma. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2015;407(10): Ask KS, Bardakci T, Parmer MP, Halvorsen TG, Øiestad EL, Pedersen-Bjergaard S, et al. Parallel artificial liquid membrane extraction as an efficient tool for removal of phospholipids from human plasma. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2016;129: Vårdal L, Askildsen H-M, Gjelstad A, Øiestad EL, Edvardsen HME, Pedersen- Bjergaard S. Parallel artificial liquid membrane extraction of new psychoactive substances in plasma and whole blood. Journal of Chromatography B. 2017;1048: Pilarova V, Sultani M, Ask KS, Novakova L, Pedersen-Bjergaard S, Gjelstad A. Onestep extraction of polar drugs from plasma by parallel artificial liquid membrane extraction. Journal of Chromatography B. 2017;1043: Ho TS, Egge Reubsaet JL, Anthonsen HS, Pedersen-Bjergaard S, Rasmussen KE. Liquid-phase microextraction based on carrier mediated transport combined with liquid chromatography mass spectrometry: New concept for the determination of polar drugs in a single drop of human plasma. Journal of Chromatography A. 2005;1072(1): Shariati S, Yamini Y, Esrafili A. Carrier mediated hollow fiber liquid phase microextraction combined with HPLC UV for preconcentration and determination of some tetracycline antibiotics. Journal of Chromatography B. 2009;877(4): Rodriguez-Aller M, Gurny R, Veuthey J-L, Guillarme D. Coupling ultra high-pressure liquid chromatography with mass spectrometry: Constraints and possible applications. Journal of Chromatography A. 2013;1292: Kim HY, Yoon SH, Jeong T-Y, Yu S, Kim SD. Determination of conjugated estrogens in human urine using carrier-mediated hollow-fiber liquid phase microextraction and LC- MS/MS. Desalination and Water Treatment. 2016;57(34): Magalhães P, Alves G, Llerena A, Falcão A. Venlafaxine pharmacokinetics focused on drug metabolism and potential biomarkers. Drug Metabolism and Drug Interactions. 2014;29(3):

89 18. Holliday SM, Benfield P. Venlafaxine: A review of its pharmacology and therapeutic potential in depression. Drugs. 1995;49(2): Hiemke C, Baumann P, Bergemann N, Conca A, Dietmaier O, Egberts K, et al. AGNP Consensus Guidelines for Therapeutic Drug Monitoring in Psychiatry: Update Pharmacopsychiatry. 2011;21(06): Nemeroff CB, DeVane CL, Pollock BG. Newer antidepressants and the cytochrome P450 system. American Journal of Psychiatry. 1996;153(3): Howell SR, Husbands GEM, Scatina JA, Sisenwine SF. Metabolic disposition of 14Cvenlafaxine in mouse, rat, dog, rhesus monkey and man. Xenobiotica. 1993;23(4): Kohler I, Guillarme D. Multi-target screening of biological samples using LC-MS/MS: focus on chromatographic innovations. Bioanalysis. 2014;6(9): Putnam DF. Composition and concentrative properties of human urine. Technical Report. Washington: McDonnell Douglas Astronautics Company; Report No.: NASA- CR-1802 Contract No.: NAS Jessop PG, Jessop DA, Fu D, Phan L. Solvatochromic parameters for solvents of interest in green chemistry. Green Chemistry. 2012;14(5): Clement RE, Hao C. Liquid Liquid Extraction: Basic Principles and Automation. I: Pawliszyn J, red. Comprehensive Sampling and Sample Preparation. Oxford: Academic Press; s Pedersen-Bjergaard S, Rasmussen KE. Liquid-phase microextraction with porous hollow fibers, a miniaturized and highly flexible format for liquid liquid extraction. Journal of Chromatography A. 2008;1184(1): Gjelstad A, Jensen H, Rasmussen KE, Pedersen-Bjergaard S. Kinetic aspects of hollow fiber liquid-phase microextraction and electromembrane extraction. Analytica Chimica Acta. 2012;742: Bello-López MÁ, Ramos-Payán M, Ocaña-González JA, Fernández-Torres R, Callejón-Mochón M. Analytical Applications of Hollow Fiber Liquid Phase Microextraction (HF-LPME): A Review. Analytical Letters. 2012;45(8): Chimuka L, Cukrowska E, Michel M, Buszewski B. Advances in sample preparation using membrane-based liquid-phase microextraction techniques. Trends in Analytical Chemistry. 2011;30(11): Ho TS, Halvorsen TG, Pedersen-Bjergaard S, Rasmussen KE. Liquid-phase microextraction of hydrophilic drugs by carrier-mediated transport. Journal of Chromatography A. 2003;998(1): Carasek E, Merib J. Membrane-based microextraction techniques in analytical chemistry: A review. Analytica Chimica Acta. 2015;880: Gjelstad A, Andresen AT, Dahlgren A, Gundersen TE, Pederson-Bjergaard S. High- Throughput Liquid Liquid Extraction in 96-Well Format: Parallel Artificial Liquid Membrane Extraction. LCGC Europe. 2017;30(1): Eibak L, Parmer M, Rasmussen K, Pedersen-Bjergaard S, Gjelstad A. Parallel electromembrane extraction in a multiwell plate. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2014;406(2): Fekete S, Schappler J, Veuthey JL, Guillarme D. Current and future trends in UHPLC. Trends in Analytical Chemistry. 2014;63: Pedersen-Bjergaard S, Rasmussen KE. Legemiddelanalyse. 2. utg. Bergen: Fagbokforlaget; s. 36. Lundanes E, Reubsaet L, Greibrokk T. Chromatography : basic principles, sample preparations and related methods. Weinheim: Wiley-VCH; s. 37. Vissers JPC, Claessens HA, Cramers CA. Microcolumn liquid chromatography: instrumentation, detection and applications. Journal of Chromatography A. 1997;779(1):

90 38. Nováková L, Matysová L, Solich P. Advantages of application of UPLC in pharmaceutical analysis. Talanta. 2006;68(3): Steuer AE, Poetzsch M, Koenig M, Tingelhoff E, Staeheli SN, Roemmelt AT, et al. Comparison of conventional liquid chromatography tandem mass spectrometry versus microflow liquid chromatography tandem mass spectrometry within the framework of full method validation for simultaneous quantification of 40 antidepressants and neuroleptics in whole blood. Journal of Chromatography A. 2015;1381: Bruins AP. Mechanistic aspects of electrospray ionization. Journal of Chromatography A. 1998;794(1 2): Schwartz JC, Senko MW, Syka JEP. A two-dimensional quadrupole ion trap mass spectrometer. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 2002;13(6): Ando DJ, red. Mass spectrometry. 2. utg. Chichester: Wiley; s. 43. American Chemical Society. Substance Identifier. [hentet ]. Tilgjengelig fra: Stoll VS, Blanchard JS. Buffers: Principles and practice. Methods in Enzymology. 1990;182: Committee for Medicinal Products for Human Use - European Medicines Agency. Guideline on bioanalytical method validation: 2011 [hentet ]. Tilgjengelig fra: pdf. 46. Matuszewski BK, Constanzer ML, Chavez-Eng CM. Strategies for the assessment of matrix effect in quantitative bioanalytical methods based on HPLC-MS/MS. Analytical Chemistry. 2003;75(13): Seip K, Gjelstad A, Pedersen-Bjergaard S. The potential of electromembrane extraction for bioanalytical applications. Bioanalysis. 2015;7: Stenutz R. Kamlet-Taft solvent parameters. [hentet ]. Tilgjengelig fra: Huang C, Gjelstad A, Pedersen-Bjergaard S. Electromembrane extraction with alkylated phosphites and phosphates as supported liquid membranes. Journal of Membrane Science. 2017;526: Huang C, Seip KF, Gjelstad A, Pedersen-Bjergaard S. Electromembrane extraction of polar basic drugs from plasma with pure bis(2-ethylhexyl) phosphite as supported liquid membrane. Analytica Chimica Acta. 2016;934: Spietelun A, Marcinkowski Ł, de la Guardia M, Namieśnik J. Green aspects, developments and perspectives of liquid phase microextraction techniques. Talanta. 2014;119: Pabby AK, Sastre AM. State-of-the-art review on hollow fibre contactor technology and membrane-based extraction processes. Journal of Membrane Science. 2013;430: Tao Y, Liu J-F, Hu X-L, Li H-C, Wang T, Jiang G-B. Hollow fiber supported ionic liquid membrane microextraction for determination of sulfonamides in environmental water samples by high-performance liquid chromatography. Journal of Chromatography A. 2009;1216(35): Lee J-M, Ruckes S, Prausnitz JM. Solvent Polarities and Kamlet Taft Parameters for Ionic Liquids Containing a Pyridinium Cation. The Journal of Physical Chemistry B. 2008;112(5): Ab Rani MA, Brant A, Crowhurst L, Dolan A, Lui M, Hassan NH, et al. Understanding the polarity of ionic liquids. Physical Chemistry Chemical Physics. 2011;13(37): ChemAxon. logd vs ph. [hentet ]. Tilgjengelig fra: 81

91 57. EcoOnline AS. Sikkerhetsdatablad. [hentet ]. Tilgjengelig fra: Gjelstad A, Rasmussen KE, Pedersen-Bjergaard S. Electrokinetic migration across artificial liquid membranes: Tuning the membrane chemistry to different types of drug substances. Journal of Chromatography A. 2006;1124(1 2): Arjomandi-Behzad L, Yamini Y, Rezazadeh M. Pulsed electromembrane method for simultaneous extraction of drugs with different properties. Analytical Biochemistry. 2013;438(2): Balakin KV, Savchuk NP, Tetko IV. In silico approaches to prediction of aqueous and DMSO solubility of drug-like compounds: Trends, problems and solutions. Current Medicinal Chemistry. 2006;13(2): Simpson N, van Horne KC. Sorbent extraction technology. 2. utg. Harbor City, CA: Varian Sample Preparation Products; s. 82

92 ODV Venlafaksin Citalopram Paroksetin Fluoksetin Fluvoksamin Norfluoksetin Sertralin 7. Appendix I. Sammenligning av ulike ristemønstre og volumer i donor- og akseptorfasen Tabell I Utbytter og tilhørende RSD-verdier for ekstraksjoner utført med Vibramax 100 og Reax 2 ristemaskiner med ulike volum av donor- og akseptorfasen Akseptorfase: 50 µl 20 mm maursyreløsning. Organisk fase: 4 µl dodecylacetat + 1% TOA. Donorfase: 250 µl 10 mm NaOH-løsning med analyttblanding med den endelige konsentrasjonen i donorfasen på 250 ng/ml. Ristehastighet 900 rpm. Ekstraksjonstid: 45 min. n=5. Vibramax 200 µl Donor 100 µl Akseptor Vibramax 200 µl Donor 75 µl Akseptor Vibramax 200 µl Donor 50 µl Akseptor Vibramax 150 µl Donor 50 µl Akseptor Vibramax 250 µl Donor 50 µl Akseptor Reax 200 µl Donor 100 µl Akseptor Reax 200 µl Donor 75 µl Akseptor Reax 200 µl Donor 50 µl Akseptor Reax 150 µl Donor 50 µl Akseptor Reax 250 µl Donor 50 µl Akseptor 9% (8%) 10% (6%) 9% (8%) 18% (9%) 12% (13%) 14% (6%) 10% (24%) 11% (16%) 15% (13%) 9% (27%) 82% (6%) 79% (3%) 74% (4%) 86% (2%) 68% (6%) 92% (6%) 76% (18%) 77% (6%) 78% (5%) 62% (12%) 74% (14%) 67% (9%) 63% (8%) 81% (2%) 58% (9%) 85% (6%) 70% (23%) 70% (10%) 75% (10%) 58% (14%) 77% (20%) 72% (11%) 71% (12%) 88% (7%) 64% (15%) 95% (8%) 72% (29%) 81% (10%) 86% (12%) 69% (15%) 68% (26%) 64% (17%) 61% (14%) 94% (3%) 55% (15%) 92% (3%) 76% (29%) 82% (7%) 92% (10%) 64% (21%) 83% (10%) 78% (7%) 77% (6%) 90% (3%) 69% (9%) 89% (8%) 72% (28%) 81% (10%) 79% (12%) 70% (14%) 58% (15%) 54% (11%) 52% (7%) 66% (7%) 46% (7%) 71% (3%) 56% (27%) 57% (11%) 60% (16%) 47% (23%) 49% (22%) 46% (23%) 45% (11%) 71% (5%) 36% (16%) 79% (7%) 70% (24%) 73% (9%) 71% (14%) 49% (38%) 83

93 Tabell I viser resultater som ble oppnådd med en annen analyttblanding bestående av basiske legemidler. Den ble brukt i påvente av modellsubstansen venlafaksin og dens metabolitter. Formålet med dette forsøket var å finne ut om PALME kunne brukes med andre ristemønster og om ekstraksjonsutbytter ble betydelig påvirket. Vibramax 100 og Reax 2 begge fra Heidolph Instruments (Schwabach, Tyskland) ble brukt. Resultatene viste at PALME var mulig å bruke med en Reax 2. De tydet også på at optimale volumer burde justeres individuelt til hver ristemaskin. I tillegg ble det utført forsøk av tilsvarende omfang med andre ristemønstre. HulaMixer Sample Mixer fra Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA), festing av PALME-platen med 25 o på Vibramax 100 og bruk av magnetomrøring i både akseptor- og donorfasen ble testet. De førte allikevel til lavere ekstraksjonsutbytter, lekkasjer av fasene fra plater og perforasjon av membranen. Reax 2 og Vibramax 100 var testet for omvendte systemer. Det innebar at noen systemer ble snudd slik at donorfasen ble fylt i akseptorbønner og akseptorfasen i donorbrønner. Reax 2 viste at ekstraksjonsutbytter kunne oppnå samme nivå som for ikke omvendte systemer og samtidig bevarte RSD-verdier under 15%. Vibramax 100 ga lavere ekstraksjonsutbytter for omvendte systemer. Det ble også utført sammenligning av ekstraksjonstider mellom Vibramax og Reax. Tidskurvene hadde fem måletidspunkter fra 15 til 90 min. Både akseptor- og donorfasen ble testet. Resultatene har ikke vist tydelige forskjeller i ekstraksjonstid profiler. Til tross for høyere ekstraksjonsutbytter med Reax 2 i noen systemer ble det bestemt at Vibramax 100 var den foretrukne ristemaskinen. Grunnen til det var muligheten for oppnåelsen av høyere oppkonsentreringsfaktor, enklere bruk og redusert fare for lekkasjer. 84

94 VEN ODV NDV NODV NNDODV NODVGLU NNDODVGLU II. Blanding av bis(2-etylheksyl)fosfitt og tributylfosfat med 1-metyl-3- oktylimidazolium tetrafluoroborat Tabell II Utbytter og tilhørende RSD-verdier oppnådde med blanding av bis(2- etylheksyl)fosfitt og tributylfosfat med 1-metyl-3-oktylimidazolium tetrafluoroborat i forhold 1:1. Akseptorfase: 50 µl 20 mm maursyreløsning. Organisk fase: 4 µl av løsemidler vist i tabell II. Alle organiske faser inneholdt 1% TOA. Donorfase: 250 µl 10 mm NaOH-løsning med analyttblanding med den endelige konsentrasjonen i donorfasen på 250 ng/ml. Ristehastighet 900 rpm. Ekstraksjonstid: 45 min. n=5. Dodecylacetat 96% (8%) Bis(2-etylheksyl)fosfitt + 1-metyl-3-oktyl imidazolium tetrafluoroborat (1:1) Tributylfosfat + 1-metyl-3-oktyl imidazolium tetrafluoroborat (1:1) 7% (8%) NA 26% (14%) NA 6% (57%) NA = ikke tilgjengelig på grunn av ingen målbare signaler 63% (10%) NA 8% (13%) NA 5% (17%) NA 1% (7%) 4% (12%) 3% (9%) NA NA NA NA NA NA 85

95 VEN ODV NDV NODV NNDODV NODVGLU NNDODVGLU III. Tilsetting av DMSO til akseptorfasen Tabell III Utbytter og tilhørende RSD-verdier for ekstraksjoner med varierende mengde av DMSO i akseptorfasen Akseptorfase: 50 µl 20 mm maursyreløsning. Organisk fase: 4 µl TBP + 20% A336. Donorfasen: 125 µl 0.1 M bikarbonat-karbonatbuffer ph µl analyttblanding med den endelige konsentrasjonen i donorfasen på 200 ng/ml. Ristehastighet 900 rpm. Ekstraksjonstid: 45 min. n=4. 20mM HCOOH 69% (15%) 53% (7%) 60% (17%) 49% (21%) 51% (12%) 8% (14%) 15% (11%) 20mM HCOOH + 25% DMSO 34% (10%) 21% (8%) 38% (5%) 17% (7%) 11% (12%) 7% (18%) 9% (8%) 20mM HCOOH + 50% DMSO 20mM HCOOH + 75% DMSO 9% (33%) 4% (21%) 6% (29%) 2% (26%) 12% (49%) 2% (18%) NA = ikke tilgjengelig på grunn av ingen målbare signaler 5% (37%) 1% (21%) 3% (34%) 1% (118%) 2% (44%) NA 2% (56%) NA 86

96 Utbytte IV. Sammenligning av flere urinprøver med 0.75M bikarbonat-karbonatbuffer 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% Urin 1 Urin 2 Urin 3 Urin 4 VEN ODV NDV NODV NNDODV NODVGLU NNDODVGLU Figur I Sammenligning av ekstraksjonsutbytter oppnådd fra ekstraksjoner med ulike urin prøver Akseptorfase: 50 µl 20 mm maursyreløsning. Organisk fase: 4 µl TPP + 25% A336. Donorfase: 115 µl 0.75 M bikarbonat-karbonatbuffer ph µl analyttblanding med den endelige konsentrasjonen i donorfasen på 200 ng/ml + 10 µl interstandard med den endelige konsentrasjonen i donorfasen på 200 ng/ml. Ristehastighet 900 rpm. Ekstraksjonstid: 45 min. n=4. 87

97 V. Poster presentert på det 16. norske seminar i massespektrometri 88