Ekstracellulære vesikler (EV) status quo og veien videre

Transkript

1 Ekstracellulære vesikler (EV) status quo og veien videre Kari Bente Foss Haug Blodcellegruppen, Seksjon for forskning, innovasjon og utvikling, Avd. for medisinsk biokjemi, Oslo universitetssykehus, Ullevål Regionalt forskningsnettverk på ekstracellulære vesikler (RRNEV)

2 Medisinsk biokjemi: Væskefase Cellenivå Væskefase & Cellenivå - Ekstracellulære vesikler (EV) = «miniceller» i væskefase! - Kan EV utnyttes i medisinsk biokjemi???

3 Agenda Hva er EV? Hvorfor EV? EV forskningsfokus (RRNEV/Blodcellegruppen, Ullevål) EV i medisinsk biokjemi? Videre arbeid

4 Ekstracellulære vesikler (EV) Definisjon: Runde partikler med cellulær opprinnelse omsluttet av en fosfolipid dobbeltmembran med diameter fra 30 nm til 5 µm Samlebetegnelse for ulike membranvesikler Ulik opprinnelse og egenskaper Heterogen gruppe Edvin van der Pol (2014): Transmission electron microscopy image of extracellular vesicles from human urine.

5 Gyögy B et al (2011) Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci, Aug;68(16):

6 EV = «minicelle» Alle celler danner EV (prokaryote/ eukaryote) Kontinuerlig, aktiv og regulert prosess Skilles ut i alle kroppsvæsker Komponenter fra modercellen Membranen Intracellulære Mangler: Organeller Evne til nysyntese /ncrna Lipid Reflekterer modercellens tilstand Protein

7 2 viktigste ting om EV: Ekstracellulær væske Væskefase Modercelle EV Targetceller Raposo G, and Stoorvogel W J Cell Biol 2013;200: Snap shot av modercellens status 2. Bringer cellulær informasjon ut av cellen! Ekstracellulær væske Overføring av informasjon/materiale til targetceller

8 EV med stort biomarkørpotensiale! Potente mediatorer: Bærer med seg overflatemarkører fra oppshavscellen Fylt med genetisk materiale (RNA, DNA), proteiner og lipider Sammensetning, innhold, overflatemarkører situasjonsbilde av modercellen! Økt EV-sekresjon ved ulike sykdommer Stabile i alle kroppsvæsker Ikke invasivt avtrykk av celletilstand over lang avstand Interessant i diagnostikksammenheng!!!!

9 RRNEV (Regionalt forskningsnettverk for ekstracellulære vesikler) Støtte fra Helse SørØst: RRNEV-visjon: - Samle, løfte og spre EV-kunnskap - Utnytte OVERORDNET MÅL: Finne nye EV-baserte biomarkører Utnytte EV - Diagnostikk - Terapi

10 Utfordringer: Nytt fagfelt! EV = små!!! Stor EV-heterogenitet Ikke konsensus på metoder - isolering - karakterisering

11 EV forskningsfokus (RRNEV/Blodcellegruppen) 1. Metodeutvikling 2. Isolere 3. Karakterisere Biomarkører

12 Metoder 1. Isolering av EV Ulike sentrifugeringsregimer 2500g 17000g g Ulike kolonner Sukrosegradient Gelfiltrering (affinitet, str) Matrix-baserte /Presipitering Filtrering Ulike kommersielle kit! Magnetiske kuler Skille ulike EV-subgrupper Postere ISEV, bachelorstudenter, masterstudenter Manuskript under review, Journal of Extracellular Vesicles, mars 2017, Size and concentration analyses of extracellular vesicles by Nanoparticle Tracking Analysis: A variation study. Beate Vestad, Alicia Llorente, Axl Neurauter, Santosh Phuyal, Bente Kierulf, Peter Kierulf, Tore Skotland, Kirsten Sandvig, Kari Bente Foss Haug, Reidun Øvstebø

13 Metoder: 2. Karakterisering av EV Nanoparticle tracking analysis (NTA) Elektronmikroskopi (EM) Proteindeteksjon Western Blot Totalprotein (Qubit) Genekspresjon RT-qPCR / Array Flowcytometri ELISA teknikker/ Multiplex teknologi (Luminex / LS/MS)

14 Modellsystem: Prøvemateriale Isolere EV Karakterisere EV

15 EV - materiale EV fra: Cellelinjer Primære monocytter Fullblodmodeller In vitro Kroppsvæsker (plasma/serum, urin, tårevæske, spytt, morsmelk etc) Normalmateriale Pasientmateriale - Ustimulert /Stimulert - Frisk /Syk EV

16 EV-kilder: Plasma-EV Komplekst materiale Bidrag fra ulike celler Mye bakgrunn EV 1 EV 3 EV 2

17 «Separasjon av EV og protein i plasmaprøver Size exclusion chromatography (SEC) Metoder: SEC Isolering m/ magnetiske kuler Flowcytometry Proteinkonsentrasjon Fraksjonsnummer EV- fraksjon Protein-fraksjon Poster ISEV, Bachelorstudent, Manuskript u/ preparering: «Capture and characterization of specific plasma EVs from patients and healthy individuals by combining SEC-preclearing and magnetic bead isolation» Kari Bente Foss Haug, Beate Vestad, Tine Hiorth Schøyen, Hans Christian Dalbotten Aas, Bente Kierulf, Peter Kierulf, Ketil Winther Pedersen, Axl Neurauter, Elin H. Kure, Reidun Øvstebø

18 En rekke kliniske samarbeidsprosjekter: Ulike cancertyper: Prostata Colorektal Ovarial Pancreas Inflammasjon: Revmatoid artritt Sjøgrens syndrom Livsstilssykdommer HIV

19 Karakterisering av EV: Membrankomponenter Innhold (Cargo) RNA (transcriptomics) Protein (proteomics) Sammenlikne EV signatur Karakterisering Stimulert / Ustimulert Syk / Frisk

20 Funksjonelle studier: Mikrovesikler (MV) = Prokoagulante bomber i blodet Metodeutvikling: Trombingenerering (CAT) måler MV-assosiert TF-aktivitet (CAT) Generert en mengde kliniske samarbeidsprosjekter! MV-associated thrombin generation in normal pregnancy Alarminstudien Dyp venetrombose Immunologisk trombocytopeni FII-mangel, ny mutasjon Revmatoid artritt

21 Mekanismer og Funksjon EV og targetceller Modercelle Targetcelle Respons i targetcellen: EV-opptak Signaloverføring? Genekspresjon Proteinekspresjon Fenotype Funksjon Raposo G, and Stoorvogel W J Cell Biol 2013;200:

22 Medarbeidere: Anne-Marie S Trøseid Beate Vestad Berit S Brusletto Carola E. Henriksson Hans Christian D Aass Kari Bente Foss Haug Marit Hellum Ole Kristoffer Olstad Reidun Øvstebø Trude Asplin Lilly Alicia Steffensen Tine Hiorth Schøyen Tonje Bjørnetrø Peter Kierulf Petter Brandtzaeg Jens Petter Berg Veien videre: RRNEV: Totalt 15 grupper I posisjon til å: Isolere og karakterisere EV Mekanismestudier Samle inn pasientprøver/normalprøve opprette biobanker Samarbeidsprosjekter Lete etter biomarkører Sykdomsrelatert «EV-mønster» Utnytte EV i diagnostikk og terapi