Ekstracellulære vesikler hos frisk og syk

Transkript

1 Ekstracellulære vesikler hos frisk og syk Kari Bente Foss Haug Enhet for Blodcelleforskning Seksjon for forskning Avdeling for Medisinsk Biokjemi Oslo Universitetssykehus, Ullevål

2 Ekstracellulære vesikler (EV) Definisjon Historie Nomenklatur Biogenese Innhold Funksjon Studier av EV Regionalt forskningsnettverk Forskningsprosjekter

3 def ~ Ekstracellulære vesikler (EV) Runde partikler med cellulær opprinnelse omsluttet av en fosfolipid dobbeltmembran med diameter fra 30 nm til 5 um Samlebetegnelse for ulike membranvesikler Register av ulike mekanismer Vesikler med ulik opprinnelse og egenskaper Heterogen gruppe Edvin van der Pol (2014): Transmission electron microscopy image of extracellular vesicles from human urine.

4 This image cannot currently be displayed. Historie 1940-tallet: Randolph West: Viste at plasma inneholder subcellulære vesikler fra blodplater ( platelet dust ) med innhold av en faktor som bidrar til clotting av blod Ultrasentrifugering av humant cellefritt plasma: Økt Clotting time Pellet: the clotting factor of which the plasma is deprived Rekonstitusjon av pelleten til plasma: Normal Clotting time igjen (Chargaff E and West R (1946). The biological significance of the thromboplastic protein of blood. J Biol Chem, 166: ) Electron microscopy images of platelet-derived vesicles

5 Historie 1980-tallet: Phil Stahl: Oppdaget vesikler frigjort fra reticulocytter (sau og rotte) Inneholdt Transferrin-receptor Ikke tilstede i modne erytrocytter Postulerte: Vesicle externalization could be a mechanism for shedding of specific membrane functions, which are known to diminish during maturation of reticulocytes to erythrocytes Harding C, Heuser J and Stahl P (1983). Receptor-mediated endocytosis of transferrin and recylcling of the transferrin receptor in rat reticulocytes. J Cell Biol. 98(2):329-39

6 Siden 80-årene: Akseptert: cell debris - ikke bare forurensninger Skjuler seg et eget fagfelt - Extracellular vesicles (EV) Heterogen samling biologiske aktive blærer i nanostørrelse Skilles ut fra alle celletyper Aktivt fagfelt Penetrerer de aller fleste etablerte medisinsk/naturvitenskapelige fagmiljøer Internasjonalt satses store midler på EV-forskning

7 EV - Nomenklatur Historisk: Benevning etter opprinnelig modercelle Prostasomer: EV fra prostata-celler Dexosomer: EV fra dendritiske celler Matrix-vesikler: EV fra ben, brusk, aterosklerotiske plaque Synaptiske vesikler: EV fra neuroner I de senere år ( ): Benevning etter type vesikkel Exosomes Microvesicles (Shedding vesicles, Shedding microvesicles, Microparticles) Apoptotic vesicles (Apoptotic blebs, Apoptotic bodies) Ectosomes Membrane particles Exosome-like vesicles

8 Théry C, Ostrowski M and Segura E (2009). Membrane vesicles as conveyers of immune responses. Nature Reviews Immunology 9,

9 Forslag: 4 ulike eukaryote EV: Utifra biogenese Nomenklatur / Biognenese: Tett forbindelse Exosomes Microvesicles (Shedding vesicles, Shedding microvesicles, Microparticles) Apoptotic vesicles (Apoptotic blebs, Apoptotic bodies) Ectosomes (Membrane particles) Exosome-like vesicles Ikke konsensus..

10 10 Gyögy B et al (2011) Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci, Aug;68(16):

11 Schematic representation of the extracellular vesicles. Major populations include exosomes, microvesicles and apoptotic bodies. Gyögy B et al (2011) Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles. Cell Mol Life Sci, Aug;68(16):

12 Key features of membrane vesicle populations Exosomes Microvesicles Apoptotic bodies Size range Approximately nm 100 1,000 nm (~ nm in blood plasma) 1 5 µm Mechanism of generation By exocytosis of MVBs By budding/blebbing of the plasma membrane By release from blebs of cells undergoing apoptosis Isolation Differential centrifugation and sucrose gradient ultracentrifugation 100, ,000g, vesicle density is g/ml Differential centrifugation 18,000 20,000g Established protocols are essentially lacking; most studies use co-culture with apoptotic cells instead of isolating apoptotic bodies Detection TEM, western blotting, mass spectrometry, flow cytometry (bead coupled) Flow cytometry, capture based assays Flow cytometry Best characterized cellular sources Immune cells and tumors Platelets, red blood cells and endothelial cells Cell lines Markers Annexin V binding, CD63, CD81, CD9, LAMP1 and TSG101 Annexin V binding, tissue factor and cell-specific markers Annexin V binding, DNA content

13 Figure 1 The formation and release of MPs, exosomes and apoptotic bodies Beyer, C. & Pisetsky, D. S. (2009) The role of microparticles in the pathogenesis of rheumatic diseases Nat. Rev. Rheumatol. doi: /nrrheum

14

15 The linked image cannot be displayed. The file may have been moved, renamed, or deleted. Verify that the link points to the correct file and location. Biogenese av exosomes: Biogenesis of exosomes. Copyright 2014 American Heart Association

16

17 Review Exosomes: Extracellular organelles important in intercellular communication Suresh Mathivanan et al Journal of Proteomics Volume 73, Issue 10, 10 September 2010, Pages

18

19 Biogenese av mikrovesikler McDaniel 1, McDaniel et al (2013) Functional role of microvesicles in gastrointestinal malignancies Annals of Translational Medicine, Vol1, No 1

20 Mikrovesikler 20

21 Biogenese av apoptotiske vesikler

22 Hvor finnes EV? Alle eukaryote celler danner EV Kontinuerlig prosess Alle biologiske væsker inneholder EV Urin, CSF, Blod, serum, plasma, Ascites, Morsmelk, Sæd Cellesupernatant fra cellekulturer Overalt: I vann, i havet, i øl..

23 Biological samples contain multiple types of extracellular vesicles Buzas, E. I. et al. (2014) Emerging the role of extracellular vesicles in inflammatory diseases Nat. Rev. Rheumatol. doi: /nrrheum

24 EV-Funksjon

25 Er EV aktive substanser? eller Mediatorer Transportfunksjon, Signaliseringsmoduler og Cellens Ryddemannskap? Utfører aktive prosesser? Syntese, drifter seg selv Det er kjent at: Sekresjon av EV ut i extracellulær matrix Aktiv prosess? Intracellulær trafficking = styrt biologisk prosess (Exosomer) Oppryding i cellen EV binder seg til target cells - Aktiv endocytose/fagocytose-prosess Overfører signaler Avleverer Cargo Educating target cell Sannsynligvis blanding av flere mekanismer

26 EV Target celler Væskefase

27 Target cells EV Biological fluids Donor cells mrna / mirna, Protein, lipids Educating mrna / mirna, protein, lipids Intercellular communication

28 EV og target cell Raposo G, and Stoorvogel W J Cell Biol 2013;200:

29 Mulige opptaksmekanismer for EV i target cell

30 Mulige opptaksmekanismer

31 Funksjon av vesikler i normale celler: Harrison P, Gardiner C and Sargent I (2014). Extracellular vesicles in health and disease. Pan Standford Publishing Pte.Ltd

32 Funksjon av vesikler fra tumorceller

33 Funksjon av vesikler fra virusinfisert celle

34 Funksjon av vesikler fra bakterier

35 EV som: a) Terapeutisk target b) Terapeutisk agens

36 EV = Potente mediatorer Viktig Å få tak i EV ene Lære mer om mekanismene

37 Isolering av EV viktig å skille ulike EV-subgrupper: Ulike sentrifugeringsregimer 2500g 17000g g Ulike kolonner Sukrosegradient Gelfiltrering (size exclusion) Filtrering Matrix-baserte Magnetiske kuler

38 Ingen konsensus på isolering!!! Ulike EV: forskjellig metode Bruke flere metoder Velge metode etter hvilke karakteriseringsanalyser VIKTIG: Hva undersøkes det på? (Exosomer, Mikrovesikler, Apoptotiske vesikler) Hva ønsker vi å finne ut? Krav til renhet

39 Utfordringer Ulike EV-subtyper ikke fullstendig adskilt mhp str, egenskaper vanskelig å separere i rene fraksjoner EV = små!!! Begrensninger i å få visualisert (nær nedre grense) Tap underveis i prosedyre Aggregerer, binder seg til proteiner, lipider, komplekser, koagel. Tilsvarende str eller karakteristika som andre biologiske makromolekyler

40 Karakterisering av EV: NTA Partikkelteller (Nanosight) T-Resistive Pulse Sensing (qnano) Elektronmikroskopi Flow cytometry Dynamic light scattering (DLS) Small Angle X-ray Scatter Magnetiske kuler Ulike Image-teknikker Fluorescence PCR, RT-qPCR, Mikroarray, HTS, ELISA, Western, EM mm Konsentrasjon Størrelse EV-subtype Membranmarkører Innhold Proteiner Lipider mrna microrna gdna? Organeller?

41 Cell contribution: Plasma 55% Buffy Coat Leucocytes and Platelets < 1% Erythrocytes 45%

42 Avd for medisinsk biokjemi: Biologiske væsker Hunting for Biomarkers EV: Mulig ikke invasiv biomarkør I seg selv (kons og subtype) - Frisk vs Syk EV-pattern - Frisk vs Syk Innhold - Frisk vs Syk

43 EV isolasjon : Separere korrekte vesikler Other stuff!!!!

44 Plasma may be challenging to analyze for EV. Rich in macromolecules Proteins, Lipids, Lipoproteins, Complexes and Aggregates., :. ;, ;.:. Huge diversity of EV Secreted from from different cells Choice of method - depending on: What questions to be answered! What to be analyzed!

45 Mange utfordringer Spennende fagfelt Vi er IKKE alene om å synes dette

46 ( Egen open access tidsskrift ( (JEV) American Society for Exosomes and Microvesicles ( European Network on Microvesicles and Exosomes in Healt and Disease ME-HAD

47 Enhet for Blodcelleforskning, Seksjon for forskning, OUS, Ullevål: Høsten 2012: Tildelt midler for 3 år fra HSØ til etablering av forskningsnettverk på EV Regionalt forskningnettverk på ekstracellulære vesikler i Helse-Sørøst: Hensikten med regionale forskningsnettverk er: Skape gode samarbeidsrelasjoner Styrke forskningen innen et fagområde

48 Fra HSØ sine føringer: Et regionalt forskningsnettverk består av: Et ansvarlig koordinerende kjernemiljø med en leder og evnt. en nestleder (Vi) Flere deltagende forskningsgrupper fra miljøer i regionen innenfor et avgrenset fagområde Regionalt forskningsnettverk: Må omfatte forskningsmiljøer ved minst to helseforetak i regionen (OUS, Ahus) Kjernen og hovedtyngden av nettverket må befinne seg i Helse Sør-Øst Nettverket kan samarbeide med andre forskningsmiljøer nasjonalt eller internasjonalt

49

50 Blodcellegruppen, MBK, OUS, Ullevål = Coordinating group Reidun Øvstebø (leder) Kari Bente Foss Haug (nestleder) Beate Vestad (nettverksingeniør) Marit Hellum Jens Petter Berg Peter Kierulf Anne-Marie Siebke Trøseid Carola Henriksson Hans-Christian D. Aas Berit Brusletto

51

52 Hovedformål Etablere og drive et aktivt, funksjonelt forskningnettverk Initiere og drive samarbeidsprosjekter Arrangere faglige møter (Workshops, Årsmøter) Delta på internasjonale møter Oppsøke fagmiljøer med profesjonell kompetanse Danne nettside Spre kunnskap om fagfeltet innad i nettverket og omkringliggende fagmiljøer

53 EV-forskning i Blodcellegruppen, OUS, Ullevål: Implementering og validering av ulike metoder: Isolering, Karakterisering (str og innhold) Mikrovesikler og prokoagulant aktivitet Knyttet mot Meningokokk sepsis, Monocytt-modell Endocytose av EV i Monocytt/Makrofager og ikke fagocyterende celler microrna-profiler i plasma fra ovarial-cancerpasienter

54

55

56

57

58

59

60 Sammendrag: Ekstracellulære vesikler (EV) = endogene nanopartikler som dannes og skilles ut fra alle humane celler Finnes i alle kroppsvæsker Heterogen gruppe (exosomer, mikrovesikler, apoptotiske legemer) Dannes ved ulike mekanismer Har med seg strukturer/komponenter fra modercellen Membrankomponenter, proteiner, lipider, nukleinsyrer, (organeller?) Aktive substanser (?) Kan overlevere signaler og komponenter til andre celler Kan tas opp i andre celler Intercellulær kommunikasjon Viktige for normale cellulære prosesser Viktige for utvikling av ulike sykdommer Kan bli viktige biomarkører i diagnostikken

61 forts Sammendrag: Mange utfordringer Viktig å studere EV EV-Standardisering : Konsensus metoder Isolering Karakterisering Subtyper Dannelse Størrelse Antall Innhold Funksjon/Aktivitet

62 Cryo-electron micrograph of a placental vesicle labeled with annexin-av gold. Courtesy of Prof. Alain Brisson, Univ. of Bordeux, France.