Eksamen i ERN :00-12:00

Transkript

1 Eksamen i ERN :00-12:00 -Oppgavesettet er på 2 sider og består av 5 oppgaver som hver teller like mye. -Fem (5) av fem (5) oppgaver må være bestått for å bestå eksamen. -Begynn hver oppgavebesvarelse på nytt ark. - Skriv kort og presist. - Skriv tydelig. -Hjelpemidler tillatt: Ingen Oppgave 1 A) Beskriv hvordan nervus vagus sammen med ulike hormoner kommuniserer metthet og sult til hjernen fra abdomen. Navngi i din beskrivelse minst tre hormoner som regulerer metthet og sult. Sensor veiledning Vagale nervesignalene formidler informasjon om graden av ventrikkelstrekk og det kjemiske og hormonelle miljø i øvre tynntarm og sender denne informasjon inn til nucleus tractus olitarius som ligger i det dorsale vagus kompleks i hjernestammen. Hormoner som frigjøres fra øvre GI traktus har 3 ulike effekter, Inkretin-, sult- og metthetsformidlende effekter. Med inkretinvirkning menes det at de forsterker effekten av sekresjonsstimulerende stoffer på pankreas sekresjon. Inkretinvirkende hormoner er GLP-1(glukoagon-likt peptid 1), GIP (glukose-avhengig insulinotropisk polypeptid), OXM? (oxyntomodulin). I tillegg reduserer GLP-1 og OXM matinntak. Hormonet ghrelin frisettes hovedsaklig fra ventrikkelen og har en appetitt (sult)stimulerende virkning. Hormoner fra tarm som gir metthetesfølelse er CCK (cholecystokinin) som har en innvirkning på afferente vagale nerver. OXM og PYY (peptid YY) frisettes fra nedre tarmetraktus og PP (pankreatisk polypeptid) frisettes fra de Langerhanske øyer i pankreas. (6 poenger) B) Beskriv gjerne med en figur hvordan balansen mellom behovet for energi og fødeinntak styres av hypotalamus-hypofyse-binyre aksen. Sensor veiledning Hypotalamus-hypofyse-binyre aksen er en tilbakemeldingssløyfe av nevroner og hormoner med utgangspunkt i henholdsvis hypotalamus, hypofysen og binyrene. - De viktigste hormonene er kortikotropin-frigjørende faktor (CRF), arginin vasopressin (AVP) og adrenokortikotropin hormon (ACTH). - Tilbakemeldingssløyfen omfatter en negativ tilbakesignalering av kortisol til hypothalamus og hypofysen. 1

2 - Kortisol har et meget stort nedslagsfelt som inkluderer feks. økt blodglukose for å dekke økt energibehov, som feks. ved infeksjoner. - Kortisol virker også avdempende på immunresponsen ved å nedregulere frigjøring av cytokiner og andre immunmodulerende substanser. - Koblingen av ulike hjerneavsnitt som hypotalamus, den forlengede marg, hjernestammen, hippocampus og amygdala påvirket denne aksen. (6 poenger) Oppgave 2 A) Beskriv de molekylære endringene som skjer på overflaten av lipiddråper i fettvev når cellen responderer på hormoner som endrer den fra å lagre (basal tilstand) til å frigjøre (lipolyse) lagrede lipider. Sensorveiledning: I lagrende (basal) tilstand finnes perilipin1 i ikke-fosforylert tilstand på LD-overflaten. Den C-terminale delen av Perilipin1 binder til seg cgi-58/abhd5. Denne interaksjonen hemmer trolig aktiviteten til cgi-58. Perilipin beskytter på dene måten innholdet i kjernen fra lipolyse. Ved frigjørnde tilstand (lipolyse) aktiveres PKA grunnet økt endogen produksjon av camp. Aktiv PKA vil fosforylere hormon sensitive lipase (HSL) og perilipin1. Perilipin1 har potensielt 6 fosforyleringsseter, hvor fosforylering av disse gir ulike effekter. (merk at ytterligere informasjon om hva som skjer oppstrøms for PKA spørres det ikke etter, men studenten må ha med at PKA er involvert). Fosforyleringen i den C-terminale delen av perilipin1 gjør at CGI-58 frigjøres fra perilipin 1. Cgi-58 vil isteden binde seg til adipose triglyderide lipase (ATGL). CGI-58 vil fungere som en koaktivator av ATGL; enzymet som katalyserer nedbrytning av TG til DG, og øke ATGL aktiviteten (eventuelt «forankre» at ATGL til overflaten av LD i nærheten av substratet i LDkjernen). Fosforylering i den N-terminale delen av perilipin1 rekrutterer HSL som katalyserer nedbrytning av DG til MG. Disse molekylære forandringene gir >100-gangers forskjell i lipolytisk hastighet mellom basal og stimulert lipolyse. Følgende kan tenkes nevnt av A-kandidater : Fosforylering av sete 6 (Ser 517, C-terminalen) er nødvendig for at cgi58 skal frigjøres fra perilipin1. Fosforylering av sete 5 (Ser492) er nødvendig for fragmentering av LDer. Dette gir større LD overflate totalt sett i cellen, noe som er antatt å øke lipolytisk hastighet. Forsforylering i N-terminalen delen av perilipin1 er viktig (men ikke essensielt) for rekrutering og binding av HSL til perilipin1/ld-overflaten. (6 poenger) 2

3 B) Beskriv oppbygningen av en klassisk kjernereseptor med de ulike domenestruktureene. Hvilke funksjon(er) har de mest sentrale domenene i en kjernereseptor? Nevn og beskriv funksjonen til en kjernereseptor som er involvert i fettmetabolisme. Bruk gjerne eksempler på vevsuttrykk og/eller målgener i din beskrivelse. Kjernereseptorene er som de fleste andre transkripsjonsfaktorer bygd opp av ulike moduler med mer eller mindre overlappende roller. En tradisjonell kjernereseptor har et DNA-bindingsdomene (DBD), et ligandbindingsdomene (LBD), to aktiveringsfunksjoner (AF1 og 2) et som sitter i det N-terminale domenet (NTD) og et som er i LBD. I tillegg har de en liten fleksibel hengselsregion mellom DBD og LBD. Studentene forventes å kunne forklare godt hva LBD og DBD gjør. Disse ble viet mye oppmerksomhet i forelesningene. A-kandidatene bør ha fått med seg at det finnes en liganduavhengig (AF1) og en ligand-avhengig aktiveringsfunksjon (AF2). I tillegg til de funksjonene som ligger i navnet, bør A-kandidatene også nevne at LBD binder kofaktorer og at denne bindingen er avhengig av type ligand som bindes. Posttranslasjonelle modifikasjoner kan forekomme over hele reseptoren og DBD og LBD bidrar til dimerisering (hetero- eller homo). (4 poenger) Her stiller studentene ganske fritt, men det forventes at de må kunne nevne minst: fett-pparα-leveroksidasjon eller fett-pparγ-fettvev-lipognenese/adipogenese/lagring eller kolesterol(sukker)-lxrlever-lipogenese eller kolesterol-lxr-makrofager-revers kolesterol-transport eller gallesyrer-fxrlever-nedregulering av gallasyresyntese og lipognese. A- og B-studentene bør kanskje klare å nevne minst et målgen: PPARα: ACOX1, CPT1A, PPARγ: PLIN1, ADIPOQ, LXR: FAS, ABCA1, FXR: FAS, CYP7A1. Ikke nødvendig med eksakt navn eller akronym, men en beskrivelse av hva genet gjør. A-studenten bør kunne kommentere at disse systemene snakker sammen og påvirker hverandre, f.eks.: PPARα/PPARγ som begge aktiveres av fettsyrer men som dominerer i ulike vev og i fastet og fødd tilstand. PPARγ som aktiverer uttrykk av adipokiner som påvirker insulinsensitivitet i muskel der vi også finner PPARδ som også oppregulerer gener involvert oksidasjon av fett. Eller LXR og FXR som driver lipogenesen i motsatt retning i leveren. (2 poenger) Oppgave 3 A) Hva mener en med mikrobiota? Hva er mikrobiotas hovedfunksjoner i tarmen? Sensorveilening: Human mikrobiota omfatter den totale populasjonen av mikroorganismer (bakterier/virus/sopp etc.) som finnes på/i kroppen. Mesteparten av den totale mikrobiota finnes i tykktarmen. Mikrobiota i tykktarmen består av bakterier, virus og andre mikro-eukaryoter (blant annet sopp) men det har hittil vært størst fokus på bakteriene og sammensetningen av bakteriefloraen. Bakteriene i tykktarmen flyter enten rundt i lumen eller henger fast i tarmveggens slimlag. Her bidrar de til fermentering av de bestanddelene av kosten som ikke er blitt fordøyd lenger oppe i systemet. Dette omfatter blant annet de komplekse sukkerartene (fiber). 3

4 Bakteriene produserer også flere viktige vitaminer (vitamin K og noen B-vitaminer) og andre stoffer som vi har nytte av. I tillegg til næringsopptak spiller bakteriene en viktig rolle for tarmfunksjon og immunforsvar. Mens menneskets egne celler har ca. 20 gener som koder for fordøyelsesenzymer har tarmbakteriene i gjennomsnitt ca. 260 slike gener. Tarmbakteriene har altså gjennom evolusjonen utviklet en enorm spisskompetanse til å fordøye komplekse sukkerarter. Som vertsorganismer har vi utviklet et nytteforhold til disse bakteriene. Våre mikrobiotabakterier utgjør mer enn 800 forskjellige arter, alle med ulike genetiske spesialiteter. Mens noen bakterietyper tar seg av fordøyingen av komplekse sukkerarter er det andre bakterietyper som utnytter biproduktene som dannes i prosessen. Kortkjedete fettsyrer/«short chain fatty acids» (SCFA), metangass og hydrogengass er biprodukter av denne prosessen. Hydrogengass produsert av tarmbakterier kan få uheldige konsekvenser ved at de påvirker cellulær metabolisme og tærer på epitellaget. Noen bakterietyper (ruminant) har spesialisert seg på å omdanne hydrogengass til metangass og fungerer dermed som beskyttere av epitellaget. Metangass kan også utnyttes videre av andre bakterietyper som karbon- og energikilde. Det produseres også mange typer av SCFA, deriblant butyrat, propionat og acetat. Samtidig som de inngår som energiressurs er disse kortkjedete fettsyrene viktige aktører i reguleringen av immunrespons. (6 poenger) B) Hvordan påvirkes mikrobiota av kosthold? Sensorveiledning Vi mennesker har ulike genetiske sammensetninger og vi blir påvirket av variasjoner i miljø og livsstil. I hvor stor grad vi blir påvirket av miljøet er avhengig av den genetiske sammensetningen. Vår respons til kostholdet som miljøpåvirkning avhenger også i stor grad av sammensetningen av mikrobiota og de millioner av gener som de inneholder. Tarmens bakterier skiftes ut ofte og har svært kort generasjonstid (noen dobles i løpet av 1 time). Det pågår derfor et kappløp mellom de ulike bakterietypene om å kolonisere tarmen. De bakteriene som er best tilpasset miljøet vil ha større muligheter til å formere seg enn de bakteriene som ikke forholdene ligger til rette for. Fordi maten vi spiser danner næringsgrunnlaget for bakteriene vil bakteriefloraen påvirkes av maten vi spiser. Veldig grovt kan man se at fasting reduserer diversiteten i bakterieflora mens spising øker diversiteten. I tillegg ser det ut til at inntak av enkelte næringsstoffer kan ha spesiell betydning for moduleringen av mikroflora. Dersom kosten for eksempel består av mye komplekse karbohydrater vil forholdene ligge til rette for oppblomstring av bakterier som kan fermentere dette. I motsetning til dette vil fravær av komplekse karbohydrater gjøre at man sulter bakteriefloraen som er tilpasset dette, og antallet av denne bakterietypen blir mindre. På den annen side vil inntak av kjøtt øke behovet for fermentering av proteiner, fett, hemejern og heterosykliske aminer og dermed føre til oppblomstring av bakterier som er spesialiserte i å fordøye dette. Ved å sammenlikne befolkningsgrupper som har ulikt kostholdsmønster har man funnet sammenhenger mellom kostholdsmønster og bakterieflora. «Western diet», et kosthold som kjennetegnes av et høyt inntak av rødt kjøtt, mettet fett og lite fiberholdig mat inkludert lite frukt og grønt, er assosiert med mindre diversitet i mikroflora mens et kosthold rikt på plantefiber er assosiert med større diversitet. Det er foreslått at denne endrede 4

5 mikrofloraen kan være med på å forklare den økte risikoen for livsstilssykdommer som er forbundet med «western diet». Assosiasjonene mellom fiberholdig kosthold og beskyttelse mot utvikling av vestlige livsstilssykdommer har vært kjent over flere tiår. Allerede i 1960 fant Burkitt ut at afrikanere som levde på tradisjonell fiberrik kost hadde et nesten totalt fravær av ikke-infeksiøse tarmsykdommer. En mekanistisk forklaring på hvordan fiber beskytter mot disse sykdommene har imidlertid vært ukjent. Senere forskning tyder nå på at en mulig mekanistisk forklaring ligger i samspillet mellom fiberinntak og mikroflora. Fiber er en samlebetegnelse på den fordøyelige andelen av plantematen som grovt inndelt har to komponenter: Uløselige fibre (primært cellulose og lignin) og løselige fibre slik som galakto-oligosakkarider og frukto-oligosakkarider (FOS). Fiber består totalt sett av mange forskjellige typer karbohydrater, med og uten kjemiske modifiseringer, som er lenket sammen med mange ulike kjemiske bindinger. Fermenteringen av fiber krever derfor bakterier med ulike spesialiteter for å håndtere denne store kjemiske variasjonen. Dette kan være en mulig forklaring på at et fiberholdig kosthold er assosiert med høyere mikrofloradiversitet sammenliknet med en fiberfattig «western diet». Ved mikrobiell fermentering av fiber dannes SFCA, blant annet acetat, propionat og butyrat. Acetat lages av de fleste bakteriene i tarmen og utgjør 60 % av total SFCA produksjon. Disse kortkjedete fettsyrene kan påvirke mange ulike prosesser både i tarmen og i andre organer. Acetat kan også metaboliseres videre til å danne butyrat. Propionat og butyrat lages av færre typer bakterier og utgjør henholdsvis 25 % og 15 % av SFCA produksjonen. Bakteriene som hører inn under Clostridiales, Bacteroides og Prevotella, samt Bifidobakteriene er kjente butyratprodusenter. Acetat, propionat og butyrat ser ut til å spille forskjellige fysiologiske roller. Butyrat er den foretrukne energikilden til epitelcellene i tarmveggen og er forbundet med redusert risiko for flere sykdommer. Butyrat kan blant annet regulere immunrespons og er foreslått å være sentral i å hindre makrofagene i å angripe mikrobiota i tarmen. Propionat vil finne veien til lever hvor den inngår i gluconeogenese mens acetat, som det blir produsert mest av i tarmen, er funnet i høye konsentrasjoner i blod. I likhet med butyrat er acetat vist å kunne påvirke immunsystemet. På grunn av de høye konsentrasjonene i blod tror man at acetat er viktig for å påvirke immunsystemet andre steder i kroppen. Acetat er også vist å kunne påvirke stabilitet av epitellaget i tarmen og kan derfor motvirke lekkasjer. (6 poenger) Oppgave 4 A) Et tidlig klinisk tegn på nyreforandringer ved diabetes er mikroalbuminuri. Nyrenes filtreringsenhet, glomeruli, endres ved diabetes, blant ved at basalmembranen fortykkes. I denne sammenheng har den ekstracellulære matriks viktige funksjoner. Hvordan bidrar kollagen IV og andre matrikskomponenter, som glykert kollagen IV, proteoglykaner og sulfatering av proteoglykaner til endringer i basalmembraner i glomeruli i nyrer hos pasienter med diabetes? 5

6 Sensor veiledning: Fortykket basalmembran skyldes: Økt syntese av kollagen IV og andre matriks-komponenter som fibronektin og laminin. Økt glykering (ikke glykosylering) som gir økt protease-resistens og lavere turnover. Økt mengde matriks gir økt lagring av vekstfaktorer som så stimulerer til mer matrikssyntese. Nedsatt proteoglykansyntese gjør at ratio melllom proteoglykaner og andre matrikskomponenter endres og gjør matriks mer disorganisert og tykkere. Nedsatt sulfatering av proteoglykaner endrer binding til andre matrikskomponenter og vekstfaktorer som vil påvirke matriksomsetningen. (6 poenger) B) Hvor i cellen foregår N-acetyl-glukosamin modifisering? Hvilke aminosyrer modifiseres? Gi eksempel på to proteiner som modifiseres av N-acetylering og hvilke effekter en slik modifisering kan ha på proteiner? Sensorveiledingen Fasit: Mono-O-GlcNAcylering foregår i kjernen, cytoplasma og mitokondrier, men ikke i Golgi. Her inngår UDP-GlcNAc som tidlige byggesteiner i komplekse glykosyleringskjeder. O-GlcNAc konjugeres til OH-gruppen på Ser og Thr. Eksempler på modifiserte proteiner kan være LXR, ChREBP, FOXO, Myc, prb, PGC1α. Modifisering med N-acetyl-glukosamin kan som ved andre PTMer påvirke stbailitet, loklaisering, aktivitet og/eller interaksjon med andre proteiner. (6 poenger) Oppgave 5 A) Proteinet PPAR er medlem av kjernereseptorfamilien. PPAR binder til spesifikke DNA sekvenser som heterodimer med retinoid X receptor (RXR). Marinstoffet oxofa er vist å være ligand for PPAR og aktiverer proteinet. Du fremsetter en hypotese om at PPAR-proteinet regulerer genutrykket av Plin1 (perilipin 1). Hva kalles DNA sekvenser som PPAR/RXR heterodimer binder til? Beskriv hvordan du eksperimentelt ville gått frem for å undersøke om PPAR under påvirkning av genistein regulerer Plin1 promoteren i reportergen-assayer. PPAR inds to a direct repat 1 (DR1) sequence. The students should describe in detail how they would perform a reporter gene assay. First they need to create the different plasmids that are required for the experiment. They will need to create a plasmid for the expression of PPAR, another one for the expression of RXR and the Plin1 reporter gene plasmid that consists of the Plin1 promoter region cloned upstream of the luciferase reporter gene. They should mention that the plasmids are created using PCR and molecular cloning. Without expression plasmids for PPAR it is harder to determine that oxofa in activating PPAR to regulate Plin1. It is possible to use pharmacological intervention (specific antagonist for PPAR), but they are not specific. 6

7 Transfection of the different plasmids is a better approach. The plasmids need to be transfected into a cell line (human or mouse and immortalized or primary are all acceptable). Cells should be transfected with (1) reporter gene alone, (2) reporter gene and PPAR alone, (3) reporter gene and RXR, and (4) reporter gene and PPAR and RXR. All conditions should include the presence and absence of genistein. Increase in PLIN1 activation is measured by determining reporter gene activity or luciferase activity. Expected results, little to no reporter gene activity for condition (1), (2) and (3). A significant increase in reporter gene activity (luciferase activity should be observed in condition (4) but only in the presence of oxofa. (all this for 6 points) Total marks 6 points B) Bruk gjerne figur og forklar kort prosedyren og reagensene/verktøyene som trengs for å utføre et ko-immunopresipiterings (co-immunoprecipitation) assay for å bestemme om ChREBP1 proteinet interagerer med FXR. This experiment begins with an immunoprecipitation where the protein of interest and proteins that interact with it are captured using an antibody that recognizes your proteins of interest. In this case FXR and ChREBP1. There is more than one way to begin (a) You will first start with transfection of plasmid vectors, one expressing FXR and one expressing ChREBP1. The proteins could be tagged with FLAG or GFP or something similar OR not tagged. Cell extracts are then prepared. The conditions should include FXR alone, ChREBP1 alone and in combination. (B) It is possible for the student to suggest that the cell or tissue extract contains endogenous protein. The extract would then be immunoprecipitated with an antibody against one of the proteins (FXR or ChREBP1 OR the different tags). The antibody bound to the protein complex will be collected on beads (we did not spend time talking about protein A or protein G, so beads is sufficient). The collected beads are washed several times before eluting the protein complex, denaturing it in 1x running dye and boiling it before running a western blot. The samples are first separated using SDS-PAGE and travel towards the positive charge since they are negatively charged by SDS. Total input extracts are also run on SDS- PAGE to verify equal loading and protein expression. It is important to include a ladder or size marker as well as your samples. Voltage and speed/time vary. After separation by SDS-PAGE the proteins are transferred to a membrane either nitrocellulose or PVDF. Note PVDF needs to be activated with methanol. A transfer cassette is set up. The proteins will travel towards the negative charge. After the transfer is complete, the membranes are blocked with BSA or similar (skim milk) to prevent nonspecific binding and incubated overnight with a primary antibody for the other protein to be studied. For example, immunoprecipitate with anti-fxr antibody blot with anti-chrebp1 antibody and the reverse immunoprecipitate with anti-chrebp1 antibody blot with anti-fxr antibody. After the primary antibody the membranes are washed and incubated with the appropriate secondary antibody. After the secondary the membranes are washed and then incubated with the appropriate developing reagent (for example, chemiluminescence). 4 points for the description of the assay Results of the assay 7

8 For the totals, the expression levels of FXR and ChREBP1 should be similar for the different immunoprecipitation conditions. A protein such as b-actin can be used as a housekeeping gene to ensure equal loading of protein. If FXR interacts with ChREBP1 we would expect there to detect a band corresponding to ChREBP1 on the membrane after immunoprecipitation with FXR AND a band for FXR band on the membrane after immunoprecipitation with ChREBP1. (1,5 points) It is also important to do immunoprecipitation with FXR and blot for FXR as well as immunoprecipitation with ChREBP1 and blot for ChREBP1 to ensure that both proteins are efficiently immunoprecipitated. This provides evidence that if no interaction is observed between FXR and ChREBP1 it cannot be due to an inefficient or ineffective immunoprecipitation. (0,5 points) Total 6 points 8