Eksamen i ERN :00-13:00

Transkript

1 Eksamen i ERN :00-13:00 Begynn hver deloppgave på nytt ark. Angi tydelig hvilken hovedoppgave deloppgaven tilhører ved å skrive f.eks. oppgave 1A, oppgave 4C, osv. Hver oppgave teller like mye Eksamen består av 2 sider Ingen ekstra hjelpemidler utover penn og skrivesaker er tillatt Oppgave 1 (Svar kort, 1-3 setninger per deloppgave) (Totalt 6 poeng) A. Beskriv hovedinnholdet i Helsinkideklarasjonen. Beskriver etiske retningslinjer for forsøk med mennesker. Sentralt er informert samtykke. Slår fast at forskningen må følge aksepterte vitenskapelige prinsipper og utføres av vitenskapelig kvalifiserte personer. B. Hvilken rolle har Regional komite for medisinsk og helsefaglig forskningsetikk (REK)? Skal forhåndsgodkjenne alle medisinske og helsefaglige forskningsprosjekter Skal kontrollere at Helsinkideklarasjonen følges. Særlig ansvar å kontrollere forskning på svake grupper. Skal overvåke at kriteriene for det frie informerte samtykket er godt nok ivaretatt. Skal kontrollere at prosjektene holder vitenskapelig god nok kvalitet. Forsøkspersonene skal ikke utsettes for unødig ubehag eller risiko. Skal også forvalte Helseforskningsloven C. Beskriv hovedinnholdet i Vancouverkonvensjonen. Beskriver krav til manuskripter som innsendes til medisinske journaler. Definerer også krav til forfatterskap, medforfatteransvar, etiske hensyn ved publisering, redaktøransvar og innhold i manuskripter D. Hva er Helseforskningsloven? Helseforskningsloven regulerer medisinsk og helsefaglig forskning på mennesker, humant biologisk materiale og helseopplysninger i Norge 1

2 Oppgave 2 (Svar kort, 1-4 setninger per deloppgave) (Totalt 6 poeng) A. Hva er hensikten med en «run-in» periode i et klinisk forsøk? Skal redusere variasjon mellom forsøksdeltagere ved baseline. B. Hvilket forsøksdesign regnes som en «gullstandard» i kliniske forsøk hvor man skal undersøke om en behandling virker? Forklar hovedprinsippene ved dette forsøksdesignet. Randomisert kontrollert studie (RCT) Randomisering til to eller flere grupper Kontrollgruppe Placebo hvis mulig Blinding hvis mulig C. Hvilke forsøkstyper benytter man i systematiske kunnskapsoppsummeringer om kostholdets betydning for forebygging av livsstilssykdommer? Mekanistiske forsøk (celle og dyreforskning) Epidemiologiske studier, spesielt prospektive Kliniske forsøk, spesielt i. relativt korte RCT med biomarkører som endepunkt, eller ii. RCT med høyrisikopersoner med harde endepunkt Oppgave 3 (Totalt 6 poeng) En av metodene som ble brukt under de praktiske laboratorieforsøkene, var en «sandwich»- enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) for å detektere plasma interleukin 6 (IL-6) nivåer. A. Forklar kort prinsippet bak en sandwich-elisa. Bruk gjerne en figur for å illustrere. the assay requires a capture antibody and a detection antibody that recognize the target protein, IL-6 The protein is sandwiched between the two antibodies, hence its name A secondary antibody or streptavidin-biotin linked to horseradish peroxidase (HRP), or similar detection enzyme is needed to detect the signal B. Beskriv hvordan et sandwich-elisa-eksperiment gjøres for å finne ut konsentrasjonen av IL-6 i en plasmaprøve. 2

3 the capture antibody is coated on to 96 well plates or the equivalent, and washed the plasma sample and standard curve of known amount of IL-6 are added and incubated capture antibody binds IL-6 plates are washed and the detection antibody the recognize Il-6 is added and incubated. After washing, streptavidin-linked HRP is added to the plate and incubated After washing a substrate solution (Tetramethylbenzidine TMB) is added and incubated. The reaction is stopped by addition of H2SO4 (sulfuric acid) changing the color from blue to yellow. The absorbance is determined at nm 450. The concentration of IL-6 can be determined from the standard curve. Oppgave 4 (Totalt 6 poeng) Proteinet PPARgamma er medlem av kjernereseptorfamilien. PPARgamma binder seg til spesifikke DNA-sekvenser som heterodimer med retinoid X reseptor (RXR). Plantestoffet substans X er vist å være ligand for PPARgamma og aktiverer proteinet. Du fremsetter en hypotese om at substans X aktiverer PPARgamma-proteinet og regulerer genutrykket av Plin1 (perilipin 1). A. Hva kalles DNA sekvenser som PPAR/RXR heterodimeren binder seg til? Forklar kort prosedyren og reagensene/verktøyene som trengs for å utføre et kromatinimmunopresipiteringsforsøk for å bestemme om PPARgamma-proteinet binder seg til perilipin 1-promotoren i fettceller in vitro etter stimulering med substans X. Beskriv de forventede resultatene. Bruk gjerne en figur for å illustrere. The PPAR/RXR heterodimer prefers to bind to a direct repeat 1 (DR1), AGGTCAnAGGTCA. Fat cells in culture will be treated with substance X. After substance X treatment, cells are exposed to formaldehyde to crosslink protein (PPAR/RXR) with DNA. cells are lysed and the chromatin is sonicated (using an instrument called a sonicator) or could also be enzymatically digested to produce smaller fragments of chromatin (~500 bp). The sonicated extracts are incubated with an antibody that recognizes PPAR. The antibody PPAR bound DNA complexes are collected using beads, washed and the crosslinks reversed. The DNA is isolated and purified. Then use PCR primers are used to amplify the PLIN1 promoter region recognized by PPAR. A higher amount of PCR product means a higher level of PPAR bound to the BSEP promoter region. 3

4 Oppgave 5 (Totalt 6 poeng) Proteinet Farnesoid X reseptor (FXR) er medlem av kjernereseptorfamilien. FXR binder seg til spesifikke DNA-sekvenser som heterodimer med retinoid X reseptor (RXR). Gallesyrer (f.eks. chenodeoxycholic acid, CDCA) er vist å være ligand for FXR og aktiverer proteinet. Du fremsetter en hypotese om at FXR regulerer genutrykket av BSEP (Bile Salt Export Pump). A. Beskriv i detalj hvordan du eksperimentelt ville gått frem for å undersøke om FXR under påvirkning av CDCA regulerer BSEP-promotoren i reportergenanalyser i en HEK293-cellelinje som ikke endogent uttrykker FXR eller noen av RXR-isoformene. Beskriv de forventede resultatene. First, one needs to create the different plasmids that are required for the experiment. They will need to create a plasmid for the expression of FXR, another one for the expression of RXR and the BSEP reporter gene plasmid that consists of the BSEP promoter region cloned upstream of the luciferase reporter gene. They should mention that the plasmids are created using PCR and molecular cloning. The plasmids need to be transfected into the fat cell line using lipid carriers (lipofectamine), electroporation, or using virus (one method should be specifically mentioned). Cells should be transfected with (1) reporter gene alone, (2) reporter gene and FXR alone, (3) reporter gene and RXR, and (4) reporter gene and FXR and RXR. After transfection the cells will need to be treated with CDCA or solvent (i.e. DMSO) the amount of time does not need to be specified. Increased BSEP activation is measured by determining reporter gene activity or luciferase activity. Expected results, little to no reporter gene activity for condition (1), (2) and (3). A significant increase in reporter gene activity (luciferase activity) should be observed in condition (4) but only in the presence of CDCA. Oppgave 6 (Totalt 6 poeng) Liver X reseptor (LXR) er en viktig regulator av kolesterolmetabolismen og lipogenesen. Som en del av ditt masterprosjekt har du blitt spurt om å lage en human hepatocellulær cellelinje hvor LXR genet slettes ved bruk av genredigeringsverktøyet Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic repeats, CRISPR, Cas9. A. Forklar kort hva CRISPR Cas9-systemet er og hvordan teknikken kan brukes til å slå ut og sette inn et gen i et genom. 4

5 CRISPR-Cas9 originates from bacteria where it functions to protect the bacteria from foreign DNA, but recognizing foreign DNA from a previous infection and cleaving or cutting it. Cas9 is an RNA-dependent nuclease that cleaves DNA. Where it cleaves DNA depends on the sequence of the guiderna (grna). The grna or sgrna consists of nucleotides and a 5-NGG-3 protospacer adaptor motif (PAM). CRISPR-Cas9 binds to the site of interest based on the grna and causes a double strand DNA break near the PAM site. Due to error prone non-homologous end joining (NHEJ abbreviation is fine) insertions or deletions in DNA sequence might occur. These can lead to frame shifts (altered protein sequence) leading to a premature stop codon. When two grnas are used, the sequence in between them is removed and the DNA ligated back together. This method is used to remove large stretches of DNA and also to create genetically modified mouse or other animal models. To insert a gene, donor DNA containing the DNA to be inserted needs to be included in the transfection with CRISPR-Cas9 and grna. This donor DNA sequence needs to contain additional DNA sequence that is homologous with the target to permit insertion of the new DNA. This process relies on Homologous recombination (HR). Hence, upstream and downstream homologues regions need to be included in the donor DNA. 5