Eksamen i ERN :00-14:00

Transkript

1 Eksamen i ERN :00-14:00 Begynn hver deloppgave på nytt ark. Angi tydelig hvilken hovedoppgave deloppgaven tilhører ved å skrive f.eks oppgave 1A, oppgave 4C, osv Oppgave 1 A. Du er sulten og spiser et måltid mat. Du spiser fort og mye og etter ca 10 minutter så føler du at magen er full og at du er mett. i. Beskriv gjerne med bruk av en figur de nevro-endokrine mekansimene som gir deg følelsen av metthet i løpet av og etter et måltid. Sensorveiledning: Før et måltid vil syn, lukt og etter hvert smak føre til at hjernen «forbereder» magesekken på at det kommer mat. Dette skjer gjennom nervus vagus-stimulering av bukorganer og frigjøring av bla. Magesaft (Mucus, HCL og fordøyelsesenzym) Under et måltid fylles magesekken og den strekkes sakte. Deretter fylles øvre del av duodenum. Til sammen fører dette til strekkreflekser og frigjøring av en gruppe hormoner kalt inkretiner (bla. PYY, GLP-1 og GIP). Disse virker bla. direkte på hjernen og fører til frigjøring av hormoner fra flere indre organer inklusive pankreas. Et viktig hormon er insulin som virker anabolt på muskler og som metthetshormon i hjernen (hypotalamus). (3 poeng)

2 ii. Beskriv de nevro-endokrine mekanismene som fører til at kroppen kan «sense» energilagerene over tid. Sensorveiledning: Ved økt mengde fett i kroppen vil mengden av leptin øke som et resultat av flere fettceller. Leptin stimulerer reseptorer i nucleus arcuatus med frigjøring av alfa melanocytt stimulerende hormon (a-msh) fra POMC/CART. Leptin stimulerer også til hemming av sulthormonet nevro pepeptid Y (NPY) og hemmer frigjøringa av Aguti relatert protein (AgRP) fra nucleus arcuatus. AgRP hemmer frigjøring av a-msh. (3 poeng) Total for question 1 = 6 poeng B. Mellom to måltider så blir du sulten. i. Nevn minst et hormon som er sentralt for sultfølelsen din. Sensorveiledning: Ghrelin (2 poeng) ii. Hvor lages dette hormonet og hvordan kan dette hormonet stimulere sultfølelsen din? Sensorveiledning: Det lages i magesekken og frigjøres når magesekkens strekk er «lavt». Det stimulerer reseptorer i nucleus arcuatus med frigjøring av NPY (4 poeng) Total for question 2 = 6 poeng C. I hver celle er det et system som «senser» energinivåene dine? i. Beskriv hvordan dette systemet senser energinivået i en muskelcelle. Sensorveiledning: AMP kinase (AMPK). Den fysiologiske rollen til AMPK i cellen er å sense energi tilstanden i cellen ved å være følsom for forholdet mellom ATP og AMP. Katabolske prosesser lader opp batteriet ved å genere ATP fra ADP. I motsatt fall vil ATP forbrukende tilstander konvertere ATP til ADP, lade ut batteriet. I stressituasjoner vil ATP mengden avta og ADP mengden øke. Dette vil føre til at ADP overføres til AMP av adenylyl kinase. Økt mengde AMP sammen med lav ATP vil aktivere AMPK. AMPK vil gjenopprette energistatus ved å stimulere til katabolisme og hemme ATP-forbrukende prosesser. (3 poeng)

3 L A DI A T H P e m m e s UT LA DIN G x 2 ii. Forklar hvorfor en muskelcelle kan ta opp og metabolisere både fett og glukose a under trening. N v A Sensorveiledning: Ved behov for energi under trening vil AMPK føre til rekrutering av GLUT1 og 4 til membranen. G T Disse transportørene sørger for opptak av glukose selv om insulin er lav. I tillegg så vil P AMPK sørge for at fettsyrer tas opp via FAT/CD36. Mao. Muskel forbrenner både fett og glukose ved trening. (3 poeng) Total for question 3 = 6 poeng Oppgave 2 A. Hva er et adipokin og hvilke to adipokiner er overveiende uttrykt i fettceller? Nevn fem biologiske effekter adipokiner kan ha på ulike organsystemer i kroppen. Et adipokine er: Et protein/peptid produsert og utskilt av fettvev/fettceller med autokrin, parakrin eller endokrin effekt. (1 poeng) To adipokiner: Leptin og adiponektin (1 poeng each total 2 poeng) Biologiske efekter: (1) Lipid and lipoprotein metabolism, (2) Metabolism and energy, (3) Immune system and acute phase reactions, (4) Food intake and CNS activation (5) Vaculature and angiogenesis (6) Extracellular matrix metabolism. ( at least 5 for 4 poeng) Total for question 6 poeng B. Hva er et myokin og nevn to eksempler på myokiner Et myokine er: Et protein/peptid produsert og utskilt av muskelfibre med autkrin, parakrin eller endokrin effekt (2 poeng) De best kjente er IL-6 og myostatin, men det er mange andre som f. eks. IL-7, IL-15, leukocyte inhibitory factor (LIF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and angiopoietin-like protein4 (ANGPTL4) (4 poeng; 2 for each) Total for question 6 poeng

4 C. Definer hva en fettsyrer er. Nevn minst 7 biologiske funksjoner fett har i kroppen. Hvilken enkelte fettsyrer er det mye av i hjernen? Oftest en lineær hydrokarbon kjede med en metylgruppe i den ene enden og en karboksylsyregruppe i den andre. (1 poeng) Biologiske funksjnoner (7 of possible 10) 1- concentrated energy source 2- insulate 3-protect mechanically 4- electrical insulation of nerve cells 5-transport of fat-soluble vitamins (D,E,A,K) 6- essential in cell membranes 7-precursors for eicosanoids and/or docosanoids 8-ligand for transcription factors 9-carry or are taste molecules 10-provide texture to food (0,5 poeng each, at least 7 for 3,5 poeng) i hjernen: Stearin-, palmitin-, olje-, dokosaheksaen- og arakidonsyre (3 out of 5 0,5 poeng each, total 1,5 poeng) Total for question 6 poeng Oppgave 3 A. Beskriv oppbygningen av lipiddråper og gi eksempler på proteiner på overflaten av lipiddråper. ANSWER: Hydrophobic lipids in the core (TG, CE, retinoic esters, and more), surrounded by a single layer of phospholipids (the most common are phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine, followed by phosphatidylserine, spingolmyelin). Attached to the surface you will find a number of different proteins. (3 poeng) Examples of proteins: perilipins, lipases, CE- and TG- metabolism enzymes (synthesis and degradation of various lipids), trafficking proteins. (need to mention at least 3; 1 poeng each total 3 poeng) Total for question 6 poeng

5 B. Redgjør kort for regulering av lipolyse i fettvev med fokus på de forandringer som skjer på overflaten av lipiddråpen. Bruk gjerne figur til å illustrere dette. Regulering av lipolyse utgjør forskjellen mellom basal og stimulert lipolyse. Basal lipolyse angir frigjøringen fra lipiddråpen når organismen har nok energi, og egentlig er hormonelt innstilt på å lagre TAG i fettvevet (lekkasje fra lipiddråpen). Stimulert lipolyse beskriver tilstanden når kroppen mangler energi, og frigir lagret energi fra lipiddråpene i fettvevet. Det er først og fremst de molekylære forandringene på overflaten av lipiddråpene mellom basal og stimulert lipolyse som i sum medfører >100-gangers forskjell i lipolytisk hastighet (>100 ganger mer frigjorte fettsyrer). Basla lipolyse (represjon av lipolyse): I basal tilstand finnes perilipin1 i ikkefosforylert tilstand på LD-overflaten. Den C-terminale delen av Perilipin1 binder til seg cgi-58/abhd5. Denne interaksjonen hemmer sansynligvis aktiviteten til cgi- 58. Perilipin beskytter på denne måten innholdet i kjernen fra lipolyse og lite av lagret TAG degraderes. Stimulert lipolyse: Ved initiering av lipolyse aktiveres PKA grunnet via camp nivå. PKA fosforylerer hormone sensitive lipase (HSL) og perilipin1 Perilipin1 har potensielt 6 fosforyleringsseter. Denne fosforyleringen gjør at CGI-58 frigjøres fra perilipin 1 og isteden binder til adipose triglyderide lipase (ATGL). CGI-58 fungerer som en koaktivator av, og aktivering av dette komplekset gjør at ATGL katalyserer nedbrytning av TG til DG. Fosforylering i den N-terminale delen av perilipin1 rekrutterer HSL som vil katalysere nedbrytning av DG til MG. Fosforylering av sete 6 (Ser 517, C-terminalen) er nødvendig for at cgi58 skal frigjøres fra perilipin1. Fosforylering av sete 5 (Ser492) er nødvendig for fragmentering av LDer. Gir mer LD overflate, noe som er antatt å øke lipolytisk hastighet. Forsforylering i N-terminalen er viktig (men ikke essensielt) for rekrutering og binding av HSL til perilipin1 og LD overflaten. (full score om alt er med som er beskrevet her 6 poeng). C. Det finnes mennesker med mutasjoner i henholdsvis ATGL, HSL eller perilipin (perilipin1) hvor disse proteinene ikke lenger utøver sin normale biologiske funksjon. Hva vil være den konsekvensen av hver av disse mutasjonene, og hvilke typer celler/vev vil være mest affisert. Adipose triglyserid lipase (ATGL) bryter ned TAG til DAG+Fettsyre. Hormon sensitive lipase (HSL) bryter ned DAG til MAG+Fettsyre. Hormon sensitive lipase (HSL) bryter ned kolesterylester til kolesterol+fettsyre.

6 Perilipin beskytter lipiddråpen mot lipolyse. Mutasjoner i ATGL/HSL: Mennesker med mutasjoner i lipaser vil ha en senere nedbrytning av lipiddråper som inneholder substratet det normalt bryter ned. Mutasjoner i lipaser vil generelt føre til en akkumulering av lipider/lipiddråper i ulike vev. Mutasjon i ATGL vil føre til nedsatt nedbrytning at TAG og dermed opphopning av TAG. Mutasjoner i HSL vil hindre nedbrytning av DAG og CE, og dermed opphopning av disse. Redusert nedbrytning av DAG vil også kunne gi noe økt akkumulering av TAG. (3 poeng) Mutasjon i perilipin: Vil medføre at lipaser vil være mer aktive, og raskere degradere TAG i fettvevet: Mutasjon av perilipin vil dermed gi økt lekkasje fra lipiddråpene i fettvevet, med mindre kapasitet til å lagre TAG. Dette gir en lipodystrofisk tilstand (manglende fettvev), men en rekke tilhørende komplikasjoner. (2 poeng) Affiserte Vev (vanskelig oppgave tester studentenes evne til å benytte tilegnet kunnskap): Fettvev lagrer fortrinnsvis TAG mens f.eks makrofager lagrer mest CE. ATGL/HSL: Det er ikke nødvendigvis slik at de vevene som lagrer mest av disse blir mest affisert. Det er først og fremst i vev som normalt har høy degradering av TAG eller CE en vil få opphopning. I fettvev har en normalt lite lipolyse (kun ved faste er lipolysen aktiv). Derfor vil det være liten endring i akkumulering av TAG i fettvevet. Effekten av ATGL mutasjon vil være størst i celler som tar opp forbrenner mye fettsyrer (hjerte og oksidativ muskel). Effekt av HSL mutasjon vil i tillegg føre til opphopning av CE i vev som normalt tar opp og akkumulerer disse. (1 poeng) Total for question 6 poeng D. Beskriv oppbygningen av en klassisk kjernereseptor. Hvilke funksjon(er) har de ulike domenene? Kjernereseptorene er som de fleste andre transkripsjonsfaktorer bygd opp av ulike moduler med mer eller mindre overlappende roller. En tradisjonell kjernereseptor har et DNA-bindingsdomene (DBD), et ligandbindingsdomene (LBD), to aktiveringsfunksjoner (AF1 og 2) et som sitter i det N-terminale domenet (NTD) og et som er i LBD. I tillegg har de en liten fleksibel hengselsregion mellom DBD og LBD. Studentene forventes å kunne forklare godt hva LBD og DBD gjør. Disse ble viet mye oppmerksomhet i forelesningene. Kandidatene bør ha fått med seg at det finnes en ligand-uavhengig (AF1) og en ligandavhengig aktiveringsfunksjon (AF2). I tillegg til de funksjonene som ligger i navnet, bør Kandidatene også nevne at LBD binder kofaktorer og at denne bindingen er avhengig av type ligand som bindes. Posttranslasjonelle modifikasjoner kan forekomme over hele reseptoren og DBD og LBD bidrar til dimerisering (hetero- eller homo).

7 (full score om alt er med som er beskrevet her 6 poeng). E. Hvordan reguleres aktiviteten til kjernereseptorer i cellen? Nevn kort 4 mekanismer. Det finnes minst 6 ulike måter kjernereseptorenes aktivitet reguleres på: 1. genuttrykk (hvor og når og hvor høyt reseptoren er uttrykt), 2. cellelokalisering (cytoplasma, kjerne; kjernereseptorene utøver først og fremst sin funksjon i kjernen), 3. ligandbinding (agonist, antagonist), 4. protein-proteininteraksjoner (co-aktivatorer, co-repressorer), 5. post-translasjonelle modifikasjoner (aktiverende, represserende, her kan man gjerne nevne fosforylering, acetylering, sumoylering eller ubiquitylering), 6. bindingssetenes tilgjengelighet (er kromatin kondensert eller åpent). Her vektes alle likt, men det forventes at 2, for eksempel: ligandbinding og co-faktorinteraksjon nevnes som et minimum hvis man skal stå på denne oppgaven. 4 of 6 for full score 6 poeng Oppgave 4 A. Redgjør kort for mekanismer for insulinresistens inkludert O-GlcNAcylering og serinfosforylering av proteiner i insulin signaleringsveien. Bruk gjerne figur for å illustrere. [Det er et pluss om besvarelsen begynner med å beskrive hvordan insulin signalerer; at insulinreseptoren (IR) har tyrosin kinaseaktivitet, at IR tyrosinfosforylerer IRS-1, hvilket fører til at PI 3-kinase binder seg til fosforylert ITS-1 og blir aktivert og fosforylerer fosfatidyl-inositol 4,5-bifosfat til fosfatidyl-inositol 3,4,5-trifosfat. Det fører til Akt/PKB blir fosforylert og aktivert, hvilket igjen blant annet fører til translokasjon av glukosetransportøren GLUT4 til plasmamembranen-og økt glukose opptak i muskel og fettvev. Insulin er en viktig regulator av glukose og lipid metabolismen; Insulin hemmer glukose produksjonen i lever, lipolyse i fettevev og aktiverer glykogen lagring. Insulin er en vekstfaktor (anabolskt hormon) viktig for cellevekst og differensiering.]. Som eksempler på insulinresistens, har studentene lært at 1) serin-forforylering av IRS proteiner kan føre til insulinresistens. Pensumartikkel har vært insulin resistens i brunt fettvev; TNF signalering fører til aktivering av stress-induserte kinaser (JNK, MAPKs, IKK) som medfører ser-fosforyelring av IRS-1 (ser-307). Frie fettsyrer er også vist å aktivere kinaser som serin-fosforylerer og hemmer IRS. 2) Diabetisk muskel og fettceller (mus); glukose metabolisert til O-GlcNAc; økt O-GlcNAc i diabetisk muskel og fett. Insulin stimulering (10 min) gir translokasjon av OGT til plasmamembranen og Insulin-mediert Tyr-fosforylering og aktivering av OGT (negativ feedback). OGT O-GlcNAcylerer IRS-1 (hemmet binding IRS-1 til PI3- kinase), Akt (treonin 308), GSK3beta (serin 9) og Glykogen syntase. Økt O-GlcNAc hemmer på denne måten glukose opptak (mulig også via O-GlcNAcylering og hemming av proteiner involvert i Glut4 translokasjon til plasmamebranen) og glycogen lagring i respons på insulin. Ved insulin resistens og hyperglycemia i diabetes, O-GlcNAcyleres også transkripsjonsfaktoren Foxo som medfører økt glukoneogenese (glukose produksjon) i lever. Insulin hemmer vanligvis Foxo via

8 fosforylering slik at den holdes inaktiv i cytoplasma via binding til proteinet ) Besvarelsen kan også forklare hvordan frie fettsyrer kan hemme insulinsignalering f.eks. som produksjon av ROS (overskudd av fett kan også aktivere HBP og O- GlcNAc). (for å få full score må alt være med, 6 poeng) B. Hvorfor kalles hexosamin biosynteseveien en «nutrient sensing pathway»? Hexosamin biosynteseveien er en «nutrient sensing pathway» da den er avhengig av essensielle næringsstoffer og deres metabolske veier i cellen; Glukose metabolisme, aminosyre metabolisme, fettsyre metabolisme, nukelotid metabolisme. The students should mention the precursors and products in the hexosamine pathways that are impacted by glucose, amino acid, fatty acid and nucleotide metabolism. For example, glucose is converted to gluocse-6-phosphate and then to fructose-6-phosphate. Fructose-6-phosphate and glutamine from amino acid metabolism)forms glucosamine-6-phosphate. Glucosamine-6-phosphate and acetyl-coa from fatty acid metabolism forms N-acetylglucosamine-6-phosphate. N- acetylglucosamine-1-phosphate and UTP from nucleotide metabolism forms UDP-nacetylglucosamine (UDP-GlcNAc). (Det gir full poengsum, 6 poeng) C. Brusk inneholder en rekke makromolekyler, som bl.a. hyaluronsyre og proteoglykanet aggrekan. Disse har viktige funksjoner for støtdemping ved belastning av knærne. Dårlig ledd funksjon sees ved bl.a. revmatisk sykdom. Oppgave 5 Vil du anbefale bruk av glukosamin eller kombinasjonen glukosamin/kondroitin tilskudd som behandling for denne type lidelser? Gi en vurdering av kosttilskuddene og mulige virkningsmekanismer. Glukosamin er byggestein i hyaluronsyre. Kondroitin sulfat inneholder galaktosamin. Tilført glukosamin eller glukosamin/kondroitin må omdannes til UDP-glukosamin og UDPgalaktosamin. Syntese av hyaluronsyre er avhenging av tilførsel av UDP-glukosamin og UDP-glukuronsyre. Syntese av kondroitin sulfat er avhenging av dannelse av UDPgalaktosamin UDP-glukuronsyre. Tilførte tilskudd må diffundere fra blodbanen til kondrocyttene, som ansees som lite sannsynlig og er ikke dokumentert. Mulige positive effekter kan være sekundære via vekstfaktorer og kjemokiner og enzymehemmere som sitter bundet i preparatene. Mulige effekter hittil mye basert på metoder som er diskutable og mange er subjektive. Det er behov for mer objektive parametre for å måle effekter av denne type kosttilskudd. (for å få full score må alt være med, 6 poeng)

9 A) Proteinet PXR er medlem av kjernereseptorfamilien. PXR binder til spesifikke DNA sekvenser som heterodimer med retinoid X receptor (RXR). Plantestoffet genistein er vist å være ligand for PXR og aktiverer proteinet. Du fremsetter en hypotese at PXRproteinet regulerer genutrykket av GLUT4 (glucose transporter 4). Beskriv hvordan du eksperimentelt ville gå frem for å undersøke om PXR under påvirkning av genistein regulerer GLUT4 promoteren i reportergen-assayer. The students should describe in detail how they would perform a reporter gene assay. Fist they need to create the different plasmids that are required for the experiment. They will need to created a plasmid for the expression of PXR, another one for the expression of RXR and the GLUT4 reporter gene plasmid that consists of the GLUT4 promoter region cloned upstream of the luciferase reporter gene. They should mention that the plasmids are created using PCR and molecular cloning. Without expression plasmids for PXR it is harder to determine that genistein in activating PXR to regulate GLUT4. It is possible to use pharmacological intervention (specific antagonist for PXR), but they are not specific. Transfection of the different plasmids is a better approach. The plasmids need to be transfected into a cell line (human or mouse and immortalized or primary are all acceptable). Cells should be transfected with (1) reporter gene alone, (2) reporter gene and PXR alone, (3) reporter gene and RXR, and (4) reporter gene and PXR and RXR. All conditions should include the presence and absence of genistein. Increase in GLUT4 activation is measured by determining reporter gene activity or luciferase activity. Expected results, little to no reporter gene activity for condition (1), (2) and (3). A significant increase in reporter gene activity (luciferase activity should be observed in condition (4) but only in the presence of genistein. (all this for 5 points) To fully confirm the role of PXR, the student should mention that they would perform a sirna experiment to knockdown PXR. Cells will be transfected with the GLUT4 reporter gene plasmid and sirna against PXR. They should mention scrambled sirna as a control. Cells will be treated with and without genistein. Reporter gene activity in the presence of genistein should be decreased after PXR knockdown. (1 point). The cells should expression endogenous PXR, but they could also transfect in PXR as well. Total marks 6 points B) Forklar hvordan SYBR-green og TaqMan/probe baserte metoder blir brukt for å detektere amplifisert DNA under real-time PCR. Real-time PCR is based on exponential amplification of DNA (2 n where n = cycle number). To detect amplified DNA we use fluorescent dyes in which the fluorescent signal is directly proportional to the amount of DNA that is amplified. The fluorescent signal is measured after each PCR cycle, so the amount of amplified DNA can be viewed in real time. Two popular methods to detect DNA are SYBR-green and TaqMan. SYBR green is a chemical that fluoresces when it binds to double-stranded DNA. The fluorescence is detected by and the PCR is done in a real-time PCR machine. SYBR-green is not sequence specific and will bind to all/any doublestranded DNA. Therefore it is very important that the amplicon or amplified DNA is a

10 single product when using SYBR green. All that is needed for SYBR green to be used in a real-time PCR reaction is template DNA, forward (5`) primer, reverse (3`) primer and enzyme reaction mix that includes polymerase and SYBR-green. TaqMan is a probe based detection method that not only requires template DNA (gene of interest), forward (5`) primer, reverse (3`) primer and enzyme reaction mix, it also requires a sequence specific probe that is specific to DNA sequences in the amplified DNA (in between the forward and reverse primers). The probe consists of a reporter dye at one end and quencher dye at the other. The close proximity of the quencher dye blocks the fluorescent signal of the reporter dye. As the polymerase amplifies the DNA, its 5` to 3` exonuclease activity digests the probe that is bound to the amplified sequence causing the release of the reporter dye from the quencher dye. The fluorescence from the released reporter dye is detected in the real-time PCR machine. The addition of the probe makes TaqMan more specific compared with SYBR-green. All this for 6 points. C) Forklarer kort prosedyren og reagensene/verktøyene som trengs for å utføre koimmunopresipiterings (co-immunoprecipitation) assay for å bestemme om SREBP1 proteinet interagerer med PXR. Bruk gjerne figur for å illustrere. This experiment begins with an immunoprecipitation where the protein of interest and proteins that interact with it are captured using an antibody that recognizes your proteins of interest. In this case PXR and SREBP1. There is more then one way to begin (a) You will first start with transfection of plasmid vectors, one expressing PXR and one expressing SREBP1. The proteins could be tagged with FLAG or GFP or something similar OR not tagged. Cell extracts are then prepared. The conditions should include PXR alone, SREBP1 alone and in combination. (B) It is possible for the student to suggest that the cell or tissue extract contains endogenous protein. The extract would then be immunoprecipitated with an antibody against one of the proteins (PXR or SREBP1 OR the different tags). The antibody bound to the protein complex will be collected on beads (we did not spend time talking about protein A or protein G, so beads is sufficient). The collected beads are washed several times before eluting the protein complex, denaturing it in 1x running dye and boiling it before running a western blot. The samples are first separated using SDS-PAGE and travel towards the positive charge since they are negatively charged by SDS. Total input extracts are also run on SDS- PAGE to verify equal loading and protein expression. It is important to include a ladder or size marker as well as your samples. Voltage and speed/time vary. After separation by SDS-PAGE the proteins are transferred to a membrane either nitrocellulose or PVDF. Note PVDF needs to be activated with methanol. A transfer cassette is set up. Black part down (negative) sponge, filter paper, gel, membrane filter paper, and finally sponge. the cassette is closed and the transfer is started. The proteins will travel towards the negative charge. After the transfer is complete, the membranes are blocked with BSA or similar (skim milk) to prevent non-specific binding and incubated overnight with a primary antibody for the other protein to be studied. For example, immunoprecipitate with anti- PXR antibody blot with anti-srebp1 antibody. OR immunoprecipitate with anti-srebp1 antibody blot with anti-pxr antibody. After the primary antibody the membranes are washed and incubated with the appropriate secondary antibody. After the secondary the membranes are washed and then incubated with the appropriate developing reagent (for example, chemiluminescence). 4 points for the description of the assay

11 Results of the assay For the totals, the expression levels of PXR and SREBP1 should be similar for the different immunoprecipitation conditions. A protein such as b-actin can be used as a housekeeping gene to ensure equal loading of protein. If PXR interacts with SREBP1 we would expect there to detect a band corresponding to SREBP1 on the membrane after immunoprecipitation with PXR AND and PXR band on the membrane after immunoprecipitation with SREBP1. (1,5 points) It is also important to do immunoprecipitation with PXR and blot for PXR as well as immunoprecipitation with SREBP1 and blot for SREBP1 to ensure that both proteins are efficiently immunoprecipitated. This provides evidence that if no interaction is observe between PXR and SREBP1 it is not due to an inefficient or ineffective immunoprecipitation. (0,5 points) Total 6 points