CELLEMEMBRANERS OSMOTISKE ELEKTRISKE EGENSKAPER

Transkript

1 Emne SIF4070 Cellebiologi år00 Labøving nr 4: Cellemembraner Labøving nr. 4 CELLEMEMRNERS OSMOTISKE OG ELEKTRISKE EGENSKER Oppgavens formål: ed bruk av humane røde blodceller (erythrocytter vil følgende egenskaper for cellemembraner bli demonstrert: Cellemembraner er permeable for vann men ikke for sukrose og monovalente ioner. Cellene hemolyserer når osmolariteten til omgivende løsning blir lav. Cellemembranene har lav elektrisk ledningsevne. Membrantykkelsen kan estimeres ut fra måling av frekvensavhengigheten til pakkede erythrocytters elektriske impedans. Oppgaven gir også praktisk erfaring i bruk av interferenskontrast og fasekontrast lysmikroskop.

2 Emne SIF4070 Cellebiologi år00 Labøving nr 4: Cellemembraner Teori. Cellemembraners oppbygning Oppbygningen av cellemembranen til ulike celletyper variere noe men hovedkomponentene er de samme for de aller fleste type celler slik som vist i Fig.. Ekstracellulær side Cytoplasmisk side Fig. Skjematisk illustrasjon av tversnitt gjennom cellemembranen til en human rød blodcelle (RC. Lag I (Glykocalyx består alt vesentlig av glykoproteiner og glykolipider. De to halvdelene til membran-lipid-dobbeltlaget (II og III består hovedsakelig av fosfolipider. Merk at under normale fysiologiske betingelser er hydrokarbonkjedene til fosfolipidene i væskefase. Tykkelsen på lipiddobbeltlaget er ca. 4 nm. men kan variere i området 3-0nm. Lipiddobbeltlaget inneholder også enkelte proteiner som strekker seg tvers gjennom dobbeltlaget. Disse proteinene har ulike roller blant annet cellekomunikasjon og aktiv transport av ioner og store polare molekyler over cellemembranen. Lag I består av et grovmasket nettverk (membranskjelettet av langstrakte fleksible proteiner (spektrin. Dette protein-nettverket er hovedansvarlig for den mekaniske styrken til cellemembranen. esikler bestående av reine lipiddobbeltlag har så lav mekanisk styrke at de brytes ned av skjærspenningene som oppstår selv når man bare rører forsiktig i vesikkelsuspensjonen f.eks. med en glass-stav.. ermeabilitet over membraner i kan skille mellom tre hovedtyper av membraner: Cellemembraner erforerte tynne plater av metall eller plast Finmasket nettverk av metalltråder plastfibre eller biopolymerer. Felles for alle tre typer er at ulike partikler (molekyler vil kunne ha ulik permeabilitet.

3 Emne SIF4070 Cellebiologi år00 Labøving nr 4: Cellemembraner J k m c ( hvor J masseflukstetthet (kg/m s k m permeabilitetskoeffisient (m/s c konsentrasjonsforskjellen over membranen (kg/m 3 ermeabilitetskoeffisienten avhenger av partiklenes (molekylenes størrelse (Fig men for lipiddobbeltlag vil også molekylenes ladning og løselighet i det hydrofobe indre av membranen være av stor betydning. k m artikkel/molekylstørrelse Figur Skjematisk illustrasjon av permeabilitetskoeffisientens avhengighet av partikkelstørrelsen. b Innenfor et gitt område av molekylvekten er k m am w hvor a og b er kalibreringskonstanter ed å måle k m for en partikkel med ukjent størrelse kan man derfor si noe om partikkelens størrelse. En enkel men ofte en meget effektiv metode..3 Osmotisk trykk En semipermeabel membran defineres som en membran som er impermeabel for enkelte typer partikler men permeable for andre. Når man skiller to løsninger med en semipermeabel membran der permeabilitetskoeffisienten er ulik for ulike partikler vil det bygge seg opp et trykk over membranen hvis initiell partikkelkonsentrasjon er ulik på de to sider. Dette fenomenet kalles osmose. Måleoppsett er vist i Fig 3 der ytre løsning inneholder reint løsningsmiddel og indre løsning har en viss konsentrasjon av partikler (molekyler. Høydeforskjell Løsning (f.eks. HO partikler Løsningsmiddel (f.eks HO Semipermeabel membran Figur 3: Enkelt oppsett for å måle osmotisk trykk. 3

4 Emne SIF4070 Cellebiologi år00 Labøving nr 4: Cellemembraner ed termodynamisk likevekt vil det kjemiske potensialet for vannmolekylene (Gibb's fri energi G pr. molekyl være det samme på de to sidene av den semipermeable membranen det vil si at: G µ N p T µ µ ( ( ( (3 hvor N antall vannmolekyler i trykket på side i i partiklenes molbrøk på side # partikler # H Omolekyler # partikler N N N N N Ser man bort fra kompressibiliteten til reint vann får man µ ( µ µ ( µ µ µ d ' d ' (4 (5 ruk av likevektsbetingelsen µ µ ( gir at ved likevekt gjelder ( µ d 0 µ d ' ' (6 idere følgende relasjoner gjelder: µ G N N G N v 0 (7 hvor vannets totale volum v 0 volum pr. vannpartikkel For tynne (ideelle løsninger har man µ µ 0 k T ln 0 (8 hvor 0 er løsningsmiddelets molfraksjon. For nær ideelle løsninger ln 0 ln ( (9 µ kt (0 Innsatt i likning 6 gir dette når v 0 antas å være uavhengig av trykket: ( k T v 0 ( 4

5 Emne SIF4070 Cellebiologi år00 Labøving nr 4: Cellemembraner som med tilnærmelsen hvor N N n n gir oss van't Hoff's likning (903: NRT nrt ( R den molare gasskonstant k N N antall partikler på side volumet til side n molare konsentrasjon av partikler på side N/ For ideelle løsninger gir måling av osmotisk trykk derfor antallstettheten av partikler på side. Dersom man kjenner totalvekten (dvs. konsentrasjonen til partiklene gir det videre partiklenes molvekt. Måling av osmotisk trykk er slik en viktig metode for å bestemme makromolekylers molekylvekt. Hvis molekylene har en størrelsesfordeling er estimatet som fås vha. osmose et antallsmiddel av molekylvekten: M n i N M i i N i i (3 Når et vannmolekyl passerer den semipermeable membranen fra side til side kommer to forhold inn: olumet til løsning øker. ga. moltrykket krever dette arbeid. Entropien i løsning øker. Dette reduserer den fri energi. annmolekylene vil derfor passere fra til inntil volumarbeidet pr. molekyl pga. moltrykket er lik fri energi gevinsten pga. økt entropi..4 Celler og osmolaritet Osmolariteten til en løsning er lik den molare konsentrasjonen av partikler (molekyler i løsningen som ikke kan passere gjennom den aktuelle membranen. Osmolaritet defineres altså som antall mol osmotisk aktive partikler (enhet: Osmolar. Noen eksempler: M sukrose Osmolar M NaCl Osmolar (NaCl Na Cl - M Na HO 4 3 Osmolar (Na HO 4 Na HO - 4 Merk: Osmolariteten er ikke gitt av løsningen alene. En 0 mm NaCl-løsning vil ha osmolaritet 0 mosmolar bare dersom Na og Cl - ikke kan passere gjennom den semipermeable membranen. Derimot vil osmolariteten være lik null hvis membranen er Na og Cl - permeabel. Regulering av osmolaritet er en viktig faktor i regulering av cellers volum bestemt av osmolariteten av ekstracellulær væske. De viktigste komponentene til blodplasma i osmolaritetsammenheng er 45 mm Na 4 mm K 03 mm Cl - og 4 mm HCO 3 -. Sammen med de øvrige komponentene så som glucose aminosyrer etc. gir dette en total osmolaritet av ekstracellulær væske på ca. 30 mosmolar. Da vann diffunderer fritt over plasmamembranen vil osmolariteten intracellulært også være ca. 30 mosmolar. ed likevekt vil alså osmolariteten 5

6 Emne SIF4070 Cellebiologi år00 Labøving nr 4: Cellemembraner innenfor og utenfor cellemembranen være lik. lle løsninger med samme osmolaritet overfor cellemembraner refereres til som isotone. Er osmolariteten høyere eller lavere refereres løsningene til som henholdsvis hypertone og hypotone. lasseres cellene i en hyperton løsning vil vannmolekyler diffundere ut gjennom cellemembranen til osmolariteten igjen er den samme på begge sider av membranen. Det vil si at cellevolumet minker men uten at cellemembranarealet samtidig minker. Dette gir skrukkede eller taggede celleformer. For røde blodceller kalles slike celler echinocytter. For en celle som er plassert i en hypoton løsning vil det motsatte hende. Her vil vannmolekyler diffundere inn i cellen inntil ny osmotisk likevekt over membranen er oppnådd. Dette gir en økning i cellevolumet slik at cellene virker oppblåste. Det er imidlertid her viktig å merke seg at det er en grense max for hvor mye cellevolumet kan økes for et gitt cellemembranareal. Dersom cellevolumet som svarer til osmotisk balanse over cellemembranen er større enn max fører fluksen av vann inn i cellen til at cellemembranen til slutt revner cellen sprekker. Dette skyldes at de trykk som ville kreves for å opprettholde ubalansen i ionekonsentrasjon er mye høyere enn det membranen tåler. Dette fenomenet kalles hemolyse (figur 4. Rød blodcelle Ghost Hb 30 mosm Hb Hemolyse 0 mosm Figur 4. Skjematisk illustrasjon av hemolyse av røde blodceller..5 Donnan-likevekt nalysen foran er kun gyldig for ideelle løsninger av nøytrale partikler. For ladede partikler må man i tillegg ta hensyn til at det må være elektrisk nøytralitet på begge sider av membranen og at det kan være et elektrostatisk potensial over membranen. - H O - H O Dissosiasjonen av den ladede partiklen (polyelektrolytten (Fig. 5 er gitt ved: z (4 I tillegg har man det fullt dissosierbare saltet (5 Figur 5. Fordeling av de molekylære komponentene i et eksperiment hvor Donnanlikevekten er av betydning. Membranen antas å være impermeabel for polyelektrolytten men fullt permeabel for H O og. ed termodynamisk likevekt er det kjemiske potensialet for enhver fri diffunderbar molekyltype 6

7 Emne SIF4070 Cellebiologi år00 Labøving nr 4: Cellemembraner 7 det samme på begge sider av den semipermeable membranen. ed diffusjon av ladede partikler (ioner fås viktige bidrag til det kjemiske potensialet fra eventuelle potensialdifferanser over membranen. ( ( O H O H µ µ (6 ( ( µ µ (7 ( ( µ µ (8 hvor og er elektrostatisk potensial på side og side. Krav om tilnærmet elektrostatisk nøytralitet gir z (9 Legg merke til at dersom dette kravet er oppfylt eksakt så vil vi ikke ha noen potensialdifferanse over membranen. Relativt sett neglisjerbare avvik er nok til å gi potensialdifferanse over membranen. Massekonservering: 0 (0 0 ( 0 ( Nederste indeks lik 0 angir kjent totalmengde. Dette gir 8 likninger til å bestemme 8 ukjente når den funksjonelle sammenhengen mellom O H µ µ og µ og de ulike variable er kjent. For ideelle løsninger av elektrolytter hvor effekten av trykkforskjellen er neglisjerbar har man: 0 ln ( ( ( T k e G G (3 ln ln e T k e T k D (4 hvor e elektronladningen. Dette gir oss Donnans regel : (5 Sammen med ligningen for elektronøytralitet (likn. 9 gir dette: 4 z z (6 Donnanpotensialet D er gitt ved: 4 ln ln z z e T k e T k D (6

8 Emne SIF4070 Cellebiologi år00 Labøving nr 4: Cellemembraner I celler er det normalt store mengder polyelektrolytter som ikke kan diffundere gjennom cellemembranen. Donnan-likevekten som dermed oppstår påvirker både ionefordelingen og det elektrostatiske potensialet over cellemembranene..6 Cellemembraners elektriske egenskaper Den høye diffusjonsbarrieren over cellemembraner for ioner forårsakes hovedsakelig av den lave løseligheten til ionene i det indre av lipiddobbeltlaget. Langt på veg er cellemembraner elektrisk isolerende og ved høye frekvenser vil den elektriske impedansen over membranen i hovedsak være av kapasitiv natur. i kan derfor betrakte cellemembraner som en parallell platekondensator med areal og avstand mellom platene d med hydrokarbonkjeder i væskefase (olje som dielektrikum. Kapasitansen C m til en slik membran vil være gitt ved likningen C ε ε m m 0 d (8 hvor ε m er den relative permittiviteten ε0er permittiviteten i vakuum og d (avstanden mellom platene i ekvilant platekondensator modell vi også svare til et estimat av membrantykkelsen. Forenklet kan man anta at tettpakkede erythrocytter pakker seg som vist i Fig. 6 og et elektrisk ekvivalentskjema til dette er vist i Fig. 7. Elektrode Cellelag N Cellelag N- l Elektrode Cellelag Fig. 6. Skjematisk skisse av pakkede erythrocytter mellom to elektroder. arameter l er avstanden mellom elektrodeplatene. ntallet lag med celler er N. 8

9 Emne SIF4070 Cellebiologi år00 Labøving nr 4: Cellemembraner C m R l R C R l C m Fig. 7 Elektrisk ekvivalentskjema til cellene vist skjematisk i Fig. 6. arameter R l og R l er lekkasjemotstand forårsaket av eventuell elektrolytt-løsning mellom cellene pga. at disse ikke er helt tettpakket. arameter R C er den elektriske motstanden for strøm gjennom cellenes cytoplasma. arameter C m er kapasitansen over den ene horisontale delen av cellemembranen til hver celle. Hvis man antar at R l >> R l får vi det forenklede elektriske ekvivalentskjema vist i Fig. 8 der R representerer lekkasjemotstander mellom cellene R elektrisk motstand inne i cellenes cytoplasma og C kapasitansen over cellenes plamamembraner. Den elektriske impedansen til kretsen vist i Fig. 8 er gitt ved (9 R R jωc R R C Fig. 8. Forenklet elektrisk ekvivalentskjema for tettpakkede celler. hvor j ω er vinkelfrekvensen og C er kapasitansen. Etter litt omskriving gir dette R jωc R ( R R jωc (30 mplitude- og fasegangen til (jω er vist i Fig. 9 og 0. 9

10 Emne SIF4070 Cellebiologi år00 Labøving nr 4: Cellemembraner ω ω lg ω Fig. 9. Skjematisk illustrasjon av frekvensavhengighet til amplituden til den elektriske impedansen. ω og ω. (R R C R C arg ω ω lg ω Fig. 0. Faseforløpet til den elektriske impedansen.. Materiale og apparatur. Løsninger Isoton saltløsning inneholdende 0 mosmolar fosfat-buffer ph mm NaCl. Denne løsningen kalles på engelsk for "hosphate buffered saline" og refereres ofte til som S. Isoton sukroseløsning inneholdende 0 mosmolar fosfat-buffer ph mm sukrose. Da sukrose ikke er elektrisk ladet er den elektriske ledningsevnen til denne løsningen mye lavere enn for S. 0

11 Emne SIF4070 Cellebiologi år00 Labøving nr 4: Cellemembraner. Humane erythrocytter Ca. 45 % av volumet til normalt humant blod utgjøres av erythrocyttene. De hvite blodcellene (leukocyttene utgjør normalt bare - % av det totale blodvolumet. i vil benytte to blodkilder: Noen dråper friskt blod fra studentens fingerkopp. Stikkes ut som vist i Fig.. Dette gir tilstrekkelige mengder blod til å utføre lysmikroskopidelen av denne laboppgaven. Foruten at det gir helt "blodferske" blodceller byr denne blodkilden på den fordelen at vedkommende student ikke behøver å bekymre seg for smittefare av noe slag fra blodprøven. lodlansett Figur. ruk av blodlansett til å punktere fingerkopp. tdatert blod fra blodbanken ved Regionsykehuset i Trondheim (RiT. t blodet er utdatert vil si at det er gått over 4 uker siden blodet ble tappet fra blodgiveren. Dette er blod som er testet blant annet for HI og hepatitt virus men man bør likevel bruke latex-hansker når det man utfører kan medføre risiko for blodsøl. Dette kan virke paradoksalt når man tenker på at man i samband med en eventuell innleggelse ved RiT kunne ha fått overført blod em intravenøst fra den samme blodposen. Når det til tross for at blodet skal være "00 % sikkert" likevel insisteres på bruk av latex-hansker ved håndtering av RiT-blodet er dette for å bevisstgjøre studentene vedrørende smittefaren ved håndtering av alt blod..3. pparatur hilips M590 frekvenssyntetisator Oscilloscope inn Celle Figur. Skjematisk skisse av måleoppsettet for måling av den elektriske impedansen til tettpakkede erythrocytter. vstanden mellom elektrodeplatene er l 3 mm. latenes aktive areal er.9 cm. R/Ω 0 00 k 0k 00k M

12 Emne SIF4070 Cellebiologi år00 Labøving nr 4: Cellemembraner Måleoppsettet er vist i Fig.. Sentrifugeringen og pakkingen av blodprøvene foretas f.eks. i Hettich universalsentrifuge type II. Sentrifugerørene balanseres (sikre lik vekt vha. en balansevekt (skålvekt (maks kg. Lysmikroskopet som brukes er et Olympus omvendt forskningsmikroskop. R inn R R C celle Figur3: Elektrisk ekvivalentskjema av måleoppsettet vist i figur. 3. Oppgave 3. reparering av pakkede blodceller Fra den utleverte blodposen (som inneholder konsentrerte røde blodceller fylles to sentrifugerør ca. /4 fulle med blod. Fyll opp rørene (volum ca 50 ml med sukroseløsning til de er ca. halvfulle og suspender (løs opp blodcellene. alanser deretter rørene vha. vekten ved å fylle på sukkerløsning. iktig: Den delvise fyllingen av rørene er for å unngå blodsøl. Dette har sammenheng med at menisken til væska i sentrifugerøret under sentrifugeringen er em vertikal og ikke horisontal slik den er mens du fyller sentrifugerørene som vist i Fig. 4. Sentrifuger ca. 0 min ved 70% av maks hastighet. Sug av den klare væska (supernatanten over de pakkede erythrocyttene ved hjelp av pasteurpipette. Sentrifugehastighet angis vanligvis ved å spesifisere RM (revolutions pr min eller relativt tyngdens aksellerasjon. C Etterfyll sentrifugerørene med isoton sukroseløsning og resuspender. Ta vare på ca. ml av denne cellesuspensjonen for inspeksjon vha. lysmikroskopet. D Sentrifuger og sug av som under pkt.. Menisk Menisk til pakkede celler Fig. 4 Menisken til væska i sentrifugerørene under sentrifugering. a ω r g

13 Emne SIF4070 Cellebiologi år00 Labøving nr 4: Cellemembraner E Hell alt blodet i ett sentrifugerør og plasser elektrodesystemet i røret. Fyll røret halvfullt med isoton sukroseløsning og resuspender. Fyll et annet sentrifugerør med vann pluss noen magnetrørere og balanser disse to rørene mot hverandre ved å fylle på vann eller isoton sukroseløsning som tidligere. F Sentrifuger som i pkt. og sug av supernatanten over blodcellene. 3. Måling av elektrisk impedans Røde blodceller estem den elektriske impedansen til de pakkede erythrocyttene ved bruk av apparatur oppsettet beskrevet i Fig.. ruk inn 0. Fra figur 3 ser en at Celle inn (3 R elges her R>> vil en ha at Celle inn R Det vil normalt være tilstrekkelig å velge motstanden R lik kω for at R>>. Mål amplituden til spenningene inn og celle ved et høvelig utvalg av frekevenser mellom khz og MHz. Registrer også faseforskjellen mellom inn og celle. (Man kan også bruke Y-display-moden til oscilloskopet og Lissajou-figurer til å vise faseforskjellen. Gangen i å bestemme de elektriske parametrene i likning 30 fra måleresultatene er som følger: estem først R fra: lim R estem deretter R fra: ω 0 lim R ω ( R R jωc RR R jωc R R estem tilslutt C fra: ω R C og kontroller mot ω (R R C C er den totale kapasitansen over N cellelag med n celler i hvert lag. Når C er målt kan kapasitansen c m over cellenes plasmamembran bestemmes. Den målte kapasitansen C skyldes kapsitansene i de horisontale cellelagene dvs paralellkoplede celler og i de vertikale cellelagene dvs seriekoplede celler. ed seriekopling er kapasitansen generelt gitt ved n C i c i ed parallellkopling er kapasitansen generelt gitt ved C n c i i 3

14 Emne SIF4070 Cellebiologi år00 Labøving nr 4: Cellemembraner ntall cellelag N og antall celler per cellelag n beregnes i det en betrakter de pakkede erythrocyttene som kuber med sidekant 4.4 µm og avstanden mellom elektrodene og elektrodenes aktive areal er gitt i figur. For membran-lipidene har man at den relative permittiviteten ε m 3. akuum permitiviteten er ε pf/m. 3.3 Observasjon av osmose i lysmikroskop I gropene til den utleverte keramikkplaten plasseres henholdsvis a 0 dråper isoton saltløsning (S. b 0 dråper isoton sukroseløsning. c 0 dråper 0 mosmolar fosfatløsning ph 7.6. Ta en dråpe blod om gangen ut fra fingeren og plasser en dråpe i hver av gropene beskrevet over. Rør godt rundt vha. pasteurpipetten før en dråpe av de utblandede prøvene plasseres på hvert sitt objektglass og deretter dekkes med et dekkglass. I tillegg taes en dråpe blod direkte fra fingeren og legges på et objektglass for deretter å dekkes med et dekkglass. å samme måte lages også et lysmikroskop-preparat fra det utdaterte RiT-blodet som ble tatt vare på som en del av prepareringen (pkt. C. N: Merk objektglassene tydelig med tusjpenn. C De fem prøvene inspiseres i lysmikroskopet ved bruk av objektiver med 40 gangers forstørrelse. For prøve c vil det være nødvendig å benytte fasekontrast eller interferenskontrast. Sammenlign geometrien til erythrocyttene i de fem lysmikroskop-prøvene. Hva forteller dette deg om permealiteten av Na Cl - og sukrose gjennom cellemembranen? 4. Rapport Skriv en kort rapport som inneholder. lot (på semilogaritmisk skala bruk et dataprogram Excel Sigmaplot el. lign av Celle og Celle arg inn inn som funksjon av ω ( πf for de pakkede erythrocyttene. Husk enheter akseangivelser og figurtekst. eregninger som estimerer cellemembranens tykkelse. Gi eventuelle kommentarer C En kort beskrivelse av lysmikroskop-observasjonene og hva disse forteller om cellemembranenes permeabilitet. D Gi eventuelle kommentarer til beregningene resultatene eller observasjonene. 4