Kreftrisiko forbundet med kloreringsbiprodukter i drikkevann (5) Inger-Lise Steffensen, Folkehelsa

Transkript

1 Innledning Drikkevannssikkerhet påvirker en større andel av enhver populasjon enn noe annet offentlig helsespørsmål, fordi alle må ha drikkevann. Desinfeksjon av drikkevann er en av de viktigste måtene å sikre god helse ved at det forhindrer smittsomme sykdommer forårsaket av virus, bakterier og andre skadelige mikroorganismer som ellers kan spres via kontaminert drikkevann. I verden sett under ett er diaré p.g.a. smittestoffer ansvarlig for flere dødsfall hvert år enn antallet som dør av kreft og AIDS til sammen (1). For å hindre vannbårne infeksjoner er første regel å velge den minst kontaminerte vannkilden. Med en god vannkilde vil desinfeksjon og annen behandling av drikkevannet hovedsaklig være en forsikring mot tilfeldig kontaminering. Men ved økende avhengighet av overflatevann og kontaminert grunnvann blir desinfeksjon og andre behandlingsprosesser som fjerner og inaktiverer sykdomsfremkallende mikroorganismer viktigere. Introduksjon av klorering av offentlig drikkevann tidlig på 1900-tallet var en hovedfaktor i kampen mot vannbårne sykdommer. Klorering er den mest utbredte og kostnadseffektive desinfeksjonsmetoden. Denne desinfeksjonsmetoden brukes over hele verden, og når brukt korrekt, fører den til kontroll med vannbåren sykdom. I 1970-åra ble det oppdaget at klor kunne reagere med naturlig forekommende organiske forbindelser i drikkevannet og danne små mengder av klorerte biprodukter, f.eks. kloroform. Dette skjer særlig ved bruk av overflatevann, som inneholder mye humus (nedbrutt plantemateriale). Denne reaksjonen kan beskrives slik: Cl2 + H2O HOCl + HCl, HOCl + humus CHCl3 (kloroform) + andre kloreringsbiprodukter. Siden den gang er det oppdaget et stort antall potensielt helseskadelige kloreringsbiprodukter med svært forskjellig kjemisk struktur og reaktivitet; trihalometaner, halogenerte eddiksyrer, acetonitriler, karbonylforbindelser, karbonsyrer, fenoler, klorerte hydrokarboner m.fl. Stoffene forekommer i drikkevannet i konsentrasjoner på nanogram/liter (parts per trillion, ppt) til mikrogram/liter (parts per billion, ppb). Mye forskning har blitt gjort og pågår fremdeles for å påvise disse stoffene, måle konsentrasjonene av dem i drikkevann og vurdere betydningen av dem for menneskers helse. Laboratorieforsøk viste at konsentrater fra klorerte drikkevannsprøver, men ikke konsentrater fra samme vannkilde før klorering, kunne gi høye nivåer i bakterier av endringer i arvestoffet, DNA, såkalte mutasjoner (Ames test). Hvis dette også gjaldt mennesker kunne det bety at klordesinfeksjon av drikkevann utsatte en stor del av befolkningen for kronisk, livslang eksponering for lave nivåer av mutagene forbindelser. Mange kreftfremkallende stoffer virker ved å gi DNA-skader. Ut fra et folkehelsesynspunkt ble det viktig å avklare om disse mutagene kloreringsbiproduktene også kunne være kreftfremkallende, og om de kunne føre til arvelige mutasjoner i kjønnscellene, hos mennesker som drakk klorert vann. I tidlige forsøk hvor man studerte mutagen aktivitet av konsentrater fra klorerte drikkevannsprøver eller fra et modellsystem med klorert humussyre, fant man at de kjente klor-

2 organiske forbindelsene tilstede i disse ekstraktene utgjorde <10% av den totale mutagene aktiviteten testet i bakterier (2). Andre ennå ukjente forbindelser måtte derfor også være tilstede i vannet. I 1981 fant Holmbom et al. at et stoff som ble identifisert som 3-klor-4-(diklormetyl)-5- hydroksy-2[5h]-furanon, og kalt mutagen X (MX) (Figur 1), var ansvarlig for opptil 50% av den mutagene aktiviteten i klorert avløpsvann fra treforedlingsindustrien (3,4). I 1986 påviste Hemming et al. (5) at MX også var tilstede i klorert vann fra en finsk innsjø med svært høyt humusinnhold. Senere er MX påvist i drikkevann fra en lang rekke land, bl.a. Finland, U.S.A., Storbritannia, Canada, Japan og Kina i konsentrasjoner på 0,8-67 nanogram/liter, og er estimert til å utgjøre mellom 5 og 67% av mutageniteten i drikkevannet, målt i bakterien Salmonella typhimurium, stamme TA 100, uten tilsetning av metabolske enzymer. Det vil si at det er MX selv, og ikke et omdannelsesprodukt, som er mutagent. MX er et av de mest potente stoffer som overhodet er testet i Ames test, og kan indusere opptil revertante bakteriekolonier/nanomol stoff. MX forårsaker ulike typer mutasjoner, både utbytting av enkeltbyggesteiner i DNA (baseparsubstitusjoner) og endring i avlesningen av byggesteinene (rammeskiftmutasjoner). Hvis metabolske enzymer tilsettes, blir mutageniteten av MX redusert med 90%. MX bidro altså i stor grad til den totale mutageniteten i drikkevann, på tross av at det var tilstede i så lave konsentrasjoner. MX kunne dermed utgjøre en potensiell helsefare, og studier av de toksikologiske effektene av MX ble satt i gang. Cl 2 HC Cl Cl Cl H H HO O O HO O O 3-Klor-4-(diklormetyl)-5- hydroksy-2[5h]-furanon (MX) Figur 1. Klorhydroksyfuranoner 3,4-Diklor-5-hydroksy- 2[5H]-furanon (mukoklorsyre acid, MCA) Etterhvert er det påvist en lang rekke lignende klorhydroksyfuranoner. I vårt prosjekt har vi i tillegg til MX også studert 3,4-diklor-5-hydroksy-2[5H]-furanon, mukoklorsyre (MCA) (Figur 1). Forskjellen mellom MX og MCA i kjemisk struktur ligger i posisjon 4, hvor MX har en diklormetyl-gruppe, mens MCA har et klor. MCA fins i konsentrasjoner på 0,4-60 nanogram/liter klorert drikkevann, men er ca. 4 potenser mindre mutagent enn MX, dvs. induserer 1,3-10 revertante kolonier/nanomol i bakteriestammen TA100 uten tilsetning av

3 metabolske enzymer. Epidemiologiske studier av sammenhengen mellom inntak av klorert drikkevann og forekomsten av kreft ble også utført. Kreft er et aktuelt endepunkt å undersøke, p.g.a. den livslange eksponeringen for drikkevann. Hvis man ser disse studiene under ett, tyder de på at inntak av klorert drikkevann kan være assosiert med en noe forhøyet risiko for kreft i urinblære, og i lavere grad for kreft i endetarm og kanskje tykktarm (6). I slike studier er det ofte usikkerhet angående hvilke kloreringsbiprodukter i drikkevannet befolkningen faktisk har blitt eksponert for og mengdene av disse. Mange andre faktorer enn drikkevannet kan også forårsake kreft. Det er derfor vanskelig å vurdere den reelle kreftrisikoen fra klorert drikkevann for en populasjon kun ut fra epidemiologiske studier. International Agency for Research on Cancer (IARC) konkluderte i 1991 med at det er utilstrekkelig bevis for økt kreftrisiko p.g.a. klorert drikkevann (7). Den relative risikoen for kreft ved inntak av klorert drikkevann i forhold til inntak av ikkeklorert vann beregnes i disse studiene til å være lav. Dette spørsmålet er likevel av stor viktighet p.g.a. det store antallet mennesker som eksponeres for klorert drikkevann. En annen og mer direkte måte å studere forholdet mellom klorert drikkevann og risiko for kreft, er å undersøke om bestemte DNA-skadende forbindelser som er tilstede i kjente mengder i klorert drikkevann kan påvirke kreftutviklingen i eksperimentelle dyremodeller, og studere mekanismene for disse forbindelsenes effekter. Data fra dyreforsøk er essensielle for å beregne størrelsen av en eventuell kreftrisiko hos mennesker. For å kunne vurdere betydningen av resultatene fra dyreforsøk, som utføres med relativt høye doser, til mennesker, som utsettes for lavere doser, men gjennom hele livet, er det viktig å forstå mekanismene som er involvert i effektene av disse stoffene. Man vet lite om hvordan MX kan skade DNA. I vårt prosjekt har vi derfor studert DNA-skadende, såkalte gentoksiske, effekter av MX, og undersøkt om MX og MCA kan forårsake dannelse av forstadier til kreft, kalt aberrante kryptfoci, eller svulster, i tarmen på rotter og mus. Gentoksiske effekter Mange studier har vist at de forskjellige klorhydroksyfuranonene i tillegg til å være mutagene i bakterier, også er gentoksiske i ulike tester av pattedyrceller studert i cellekulturer, og at de kan gi forskjellige typer skader på arvestoffet, både på nivå av enkeltgener og på hele kromosomer (8-10). Høyere konsentrasjoner trengs som oftest i pattedyrceller (mikromolar) i forhold til konsentrasjoner som er mutagene i bakterier (nanomolar). Dette kan skyldes at i pattedyrceller ligger arvestoffet inne i en cellekjerne med DNA-trådene rullet opp på beskyttende proteiner. Pattedyrceller er også større enn bakterieceller og inneholder mange beskyttende molekyler. Det er vist at mutageniteten av MX i cellekulturer blir redusert med proteiner eller små molekyler som L-cystein og glutation tilstede. De mutagene og gentoksiske effektene av MX skyldes sannsynligvis at forbindelsen skader arvestoffet, DNA, direkte. Analyser av DNA behandlet med MX har vist at MX særlig reagerer med en av de fire byggesteinene i DNA, guanin-basen (11). Det er vist i cellekulturer at MX lager brudd på den ene av de to trådene i DNA uten at det

4 tilsettes metabolske enzymer (12). Når stoffer som er hemmere av den naturlige reparasjonen av slike DNA-skader som alltid foregår i celler, ble tilsatt cellekulturene, økte nivåene av DNAskader i cellene (12). Det gjaldt også hvis disse reparasjonshemmerne ble tilsatt cellene etter MX. Det tyder på at MX kan lage en stabil endring i DNA, som kan gjenkjennes og repareres relativt raskt av DNA-reparasjonsenzymene i cellene. Forsøk med flere ulike typer cellekulturer viste også at MX gir mer skader i celler som deler seg enn i ikke-delende celler. Positive utslag i tester i cellekulturer innebærer ikke nødvendigvis at stoffene er gentoksiske i forsøksdyr eller mennesker. Slike såkalte in vitro-tester kan brukes som indikasjon på at et stoff kan innebære en helserisiko, men kan ikke brukes til en kvantitativ vurdering av helserisiko for mennesker. Det har vært vanskeligere å påvise gentoksiske effekter av disse klorhydroksyfuranonene i levende dyr (in vivo). Det kan skyldes at de omdannes raskt i kroppen til mer uskadelige forbindelser (metaboliseres) og/eller utskilles raskt, slik at de ikke er tilstede i høy nok dose eller i lang nok tid til å forårsake en ikke-reparérbar skade. Det kan også tenkes at de ved å bindes til proteiner og andre molekyler i kroppen blir uskadeliggjort før de rekker å skade DNA. Noen studier har imidlertid funnet f.eks. økt celledeling p.g.a. DNA-skader i mageslimhinnen hos rotter (13), og skader i cellekjernene i tarmen hos mus (14). Disse stoffene er kun moderat giftige ved akutt eksponering av forsøksdyr. Vi har vist at når mus ble behandlet med hemmere av reparasjon av DNA-skade kunne man i større grad påvise slik DNA-skade (DNA-enkelttrådbrudd) forårsaket av MX i flere organer (12). Denne gentoksiske effekten som ble påvist i mus støtter antagelsen om at den kreftfremkallende effekten av MX (15) skyldes at MX forårsaker en direkte skade på DNA. MX setter også i gang apoptose, også kalt programmert celledød, i celler i kultur (16). Dette er en naturlig prosess i cellene som sørger for nødvendig utskifting av gamle celler i et vev og som normalt også er et vern mot ukontrollert celledeling som kan føre til kreft. Disse funnene kan muligens også forklare hvorfor MX er kreftfremkallende i forsøksdyr. MX er gentoksisk. Det kan tenkes at noen celler som har nivåer av DNA-skade som er for lave til at de dør i stedet kan begynne å dele seg som et indirekte resultat av at MX forårsaker apoptotisk celledød i vevet rundt. Dermed blir DNA-skadene overført til dattercellene uten å bli reparert og denne prosessen vil kunne føre til flere mutasjoner i genomet, og dermed økt kreftrisiko. Konsentrasjonene som gir apoptose i disse forsøkene med cellekulturer er imidlertid høye i forhold til konsentrasjonene som er målt i drikkevann. Kreftfremkallende effekter Vi har i en rekke forsøk undersøkt om MX eller MCA kan påvirke dannelse av forstadier til kreft, såkalte aberrante kryptfoci, i tarmkanalen hos rotter og mus (17). Tarmene fikseres i formalin og farges med metylenblått, før de studeres mikroskopisk. Vi undersøkte både om disse stoffene kunne føre til nydannelse av slike kreftforstadier eller påvirke veksten av dem. Vi har også sett etter effekter på kreftsvulster i tarmkanalen. MX eller MCA ble gitt til forsøksdyrene i drikkevannet, tilsvarende en human situasjon, eller via en sonde ført inn i rektum. Sistnevnte

5 administrasjonsmåte ble brukt for å sikre at stoffene virkelig nådde målorganet vi ville studere effekten på, nemlig tarmen, uten å bli inaktivert under passasjen gjennom magetarmkanalen ved binding til proteiner eller annet. Vi fant ingen effekter verken av MCA eller MX på dannelse eller vekst av kreftforstadier når stoffene ble gitt i drikkevann. Selv ikke i en stamme mus (Min-mus), som har mutert et gen kalt Apc som er viktig for utvikling av tarmkreft og som får spontan kreft i tykktarm og tynntarm, fant vi noen effekt av MX gitt i drikkevannet. Når vi gav MCA med sonde rett i tarmen, fant vi en svak effekt på dannelse av kreftforstadier i tykktarm på mus. Både MCA og MX gitt med sonde kunne påvirke veksten av kreftforstadiene; MCA i rotter og mus, og MX i mus. Sannsynligvis oppnås høyere lokal dose i tarmen når stoffene gis direkte med sonde enn når stoffene gis i drikkevannet. Man kan også spekulere på om denne effekten på veksten av kreftforstadier skyldes en generell økende effekt på celledelingen i tarmslimhinnen, i og med at det er vist tidligere at MX kan øke celledeling i mageslimhinnen hos rotter (13). MX og MCA påvirket heller ikke antallet svulster i tarmen dannet av andre kreftfremkallende stoffer, i disse forsøkene. Våre resultater er i overensstemmelse med den eneste langtids-kreftstudien med MX som er publisert hittil (15). Når MX ble gitt i drikkevannet til Wistar-rotter i to år ble det funnet økt hyppighet av svulster i skjoldbruskkjertel, lever og binyrer i begge kjønn, i lunger, bukspyttkjertel og hud i hanner, og brystkreft, lymfom og leukemi i hunner. MX er altså klart kreftfremkallende i rotter. Men MX forårsaket ikke dannelse av svulster i magetarmkanalen hos disse rottene. Både denne langtids-kreftstudien og våre korttids-forsøk med kreftforstadier tyder altså på at magetarmkanalen ikke er noe hovedmålorgan for effekter av kloreringsbiprodukter som MX eller MCA i mus og rotter. Selv om man ikke fant kreftforstadier i tarm eller svulster i urinblære eller tarm hos forsøksdyr med MX, dvs. i de organene med antydning til forhøyet kreftrisiko ut fra epidemiologiske studier med klorert drikkevann, utelukker det ikke at kloreringsbiprodukter som MX skulle kunne føre til dannelse av kreft også hos mennesker, siden det generelt er lite samsvar mellom i hvilke organer svulster dannes i ulike arter ved eksponering for gentoksiske kreftfremkallende stoffer. Risikovurdering av kloreringsbiprodukter Ca. 60% av Norges befolkning får drikkevann desinfisert ved klorering. Det er ikke gjort analyser av MX i norsk drikkevann ennå. I Norge brukes vanligvis lave klordoser. Det er derfor liten grunn til å tro at nivået av MX vil være høyere enn i andre land. Selv med det høyeste nivået av MX som er påvist i noe drikkevann (67 nanogram/liter) vil inntaket hos mennesker være mye, mye lavere (nanogram/kilo kroppsvekt) enn de nivåene MX som rottene i kreftstudien (15) drakk (milligram/kilo kroppsvekt). Det er beregnet at ved livslangt inntak av drikkevann med denne konsentrasjonen av MX vil den økte kreftrisikoen for mennesker være svært lav. Den påviste økningen i visse kreftformer som er antydet i epidemiologiske undersøkelser må derfor trolig tilskrives andre årsaker enn kloreringsbiprodukter, andre kloreringsbiprodukter enn MX, eventuelt summen av slike biprodukter.

6 Det må uansett være et mål å holde dannelsen av MX og andre kloreringsbiprodukter lavest mulig. Det kan for eksempel gjøres ved å fjerne naturlig organisk materiale fra vannet før klorering, slik at man kan redusere klormengden under desinfeksjon, eller ved å bruke alternative desinfeksjonmetoder. Det er imidlertid utilstrekkelig toksikologisk og epidemiologisk informasjon tilgjengelig for å kunne sammenligne helserisikoen forbundet med bruk av ulike desinfeksjonsmidler. Det er viktig at ikke klorering blir erstattet av andre prosesser hvor man kjenner enda mindre til dannelsen av eventuelt helseskadelige biprodukter. Per i dag synes det som om den potensielle helserisikoen assosiert med kloreringsbiprodukter er ubetydelig i sammenligning med den mikrobielle risikoen som er tilstede uten tilstrekkelig desinfeksjon. Referanser 1. Craun, G. F., R. J. Bull, R. M. Clark, J. Doull, W. Grabow, G. M Marsh, D. A. Ojun, S. Regli, M. D. Sobsey & J. M. Symons: Balancing chemical and microbial risks of drinking water disinfection. I. Benefits and potential risks. J. Water SRT-Aqua. 1994, 43, Meier, J. R., H. P. Ringhand, W. E. Coleman, J. W. Munch, R. P. Streicher, W. H. Kaylor & K. M. Schenck: Identification of mutagenic compounds formed during chlorination of humic acid. Mutat. Res.1985, 157, Holmbom, B. R., R. H. Voss, R. D. Mortimer & A. Wong: Isolation and identification of an Amesmutagenic compound present in kraft chlorination effluents. Tappi 1981, 64, Holmbom, B., R. H. Voss, R. D. Mortimer & A. Wong: Fractionation, isolation, and characterization of Ames mutagenic compounds in kraft chlorination effluents. Environ. Sci. Technol. 1984, 18, Hemming, J., B. Holmbom, M. Reunanen & L. Kronberg: Determination of the strong mutagen 3- chloro-4-(dichloromethyl)-5-hydroxy-2(5h)-furanone in chlorinated drinking and humic waters. Chemosphere 1986, 15, Morris, R. D.: Drinking water and cancer. Environ. Health Perspect. 1995, 103, IARC: Chlorinated drinking-water; chlorination by-products; some other halogenated compounds; cobalt and cobalt compounds. International Agency for Research on Cancer, Lyon. IARC Monogr. Eval. Carcinog. Risks Hum. 1991, Brunborg, G., J. A. Holme, E. J. Søderlund, J. K. Hongslo, T. Vartiainen, S. Lötjönen & G. Becher: Genotoxic effects of the drinking water mutagen 3-chloro-4-(dichloromethyl)-5-hydroxy-2[5H]- furanone (MX) in mammalian cells in vitro and in rats in vivo. Mutat. Res. 1991, 260, Jansson, K., J. Mäki-Paakkanen, S.-L. Vaittinen, T. Vartiainen, H. Komulainen & J. Tuomisto: Cytogenetic effects of 3-chloro-4-(dichloromethyl)-5-hydroxy-2(5H)-furanone (MX) in rat peripheral lymphocytes in vitro and in vivo. Mutat. Res. 1993, 229, Mäki-Paakkanen, J., K. Jansson & T. Vartiainen: Induction of mutation, sister-chromatid exchanges, and chromosome aberrations by 3-chloro-4-(dichloromethyl)-5-hydroxy-2(5H)-furanone in Chinese hamster ovary cells. Mutat. Res. 1994, 310, Marsteinstredet, U., G. Brunborg, M. Bjørås, E. Søderlund, E. Seeberg, L. Kronberg & J. A. Holme: DNA damage induced by induced by 3-chloro-4-(dichloromethyl)-5-hydroxy-2[5H]-furanone (MX) in HL-60 cells and purified DNA in vitro. Mutat. Res. 1997, 390, Holme, J. A., U. Haddeland, K. Haug & G. Brunborg: DNA damage induced by the drinking water mutagen 3-chloro-4-(dichloromethyl)-5-hydroxy-2[5H]-furanone (MX) in mammalian cells in vitro and in mice. Mutat. Res. 1999, 441,

7 13. Furihata, C., M. Yamashita, N. Kinae & T. Matsushima: Genotoxicity and cell proliferative activity of 3-chloro-4-(dichloromethyl)-5-hydroxy-2(5H)-furanone [MX] in rat glandular stomach. Water Sci. Technol. 1992, 25, Daniel, F. B., G. R. Olson & J. A. Stober: Induction of gastrointestinal tract nuclear anomalies in B6C3F1 mice by 3-chloro-4-(dichloromethyl)-5-hydroxy-2[5H]-furanone and 3,4-(dichloro)-5- hydroxy-2[5h]-furanone, mutagenic byproducts of chlorine disinfection. Environ. Mol. Mutagen. 1991, 17, Komulainen, H., V.-M. Kosma, S.-L. Vaittinen, T. Vartiainen, E. Kaliste-Korhonen, S. Lötjönen, R. K. Tuominen & J. Tuomisto: Carcinogenicity of the drinking water mutagen 3-chloro-4- (dichloromethyl)-5-hydroxy-2(5h)-furanone in the rat. J. Natl. Cancer Inst. 1997, 89, Marsteinstredet, U., R. Wiger, G. Brunborg, J. K. Hongslo & J. A. Holme: Apoptosis in HL-60 cells induced by 3-chloro-4-(dichloromethyl)-5-hydroxy-2[5H]-furanone (MX). Chem. Biol. Interact. 1997, 106, Steffensen, I.-L., J. E. Paulsen, D. Engeset, L. Kronberg & J. Alexander: The drinking water chlorination by-products 3,4-dichloro-5-hydroxy-2[5H]-furanone (mucochloric acid) and 3-chloro-4- (dichloromethyl)-5-hydroxy-2[5h]-furanone do not induce preneoplastic or neoplastic intestinal lesions in F344 rats, Balb/cA mice or C57BL/6J-Min mice. Pharmacol. Toxicol.1999,85,56-64.

8