Hovedprosjekter ved Bioteknologisk studieretning våren 2004 1. Genotyping med kvalitetssikring som hovedmål I Den norske mor og barn undersøkelsen skal vi samle inn biologisk materiale fra 100 000 gravide kvinner, fedre og navlestrengsblod fra de nyfødte. Fra kvinnene tas det blodprøver både ved ultralydsundersøkelsen og ved fødselen. Prøvene blir tatt ved sykehus over hele landet og totalt vil det bli innsendt ca 360 000 prøvesett til biobanken. Ved ankomst til laboratoriet blir alle prøver registrert, DNA blir ekstrahert og det alikvoteres og lagres fullblod, plasma, urin og DNA. Hensikten er at dette skal bli en av verdens største biobanker som sammen med spørreskjemadata skal anvendes til forskning i mange tiår framover. Med så mange prøver trenger man et godt kvalitetssikringssystem. For tiden satses det mye på å bygge opp et godt kvalitetssikringssystem for laboratoriet. Som en del av det ønsker vi å undersøke om det ofte skjer forbytting av identitet for prøver - enten i vårt laboratorium eller på sykehusene. Dette skal skje ved genotyping av et utvalg av de to prøvene som tas fra de deltakende kvinnene. Vi vil type for HLA-DQA1 og DQB1 gener ved hjelp av sekvens spesifikk PCR (SSP). Vi bruker daglig denne metoden i laboratoriet hos oss, men da kun for noen utvalgte gener. Oppgaven går ut på: Etablere SSP genotyping for alle variantene av HLA -DQB1 genene HLA-DQA1 og DQB1 typing av DNA prøver fra deltakende kvinner i Den norske mor og barn undersøkelsen og konkludering for genotype Vurdering av resultatene og selve typingen som ledd i kvalitetssikringssystemet Gjennom denne oppgaven vil studentene få kunnskap om HLA og koblingsulikevekt (gener som oftere nedarves samlet enn forventet basert på avstand mellom dem på kromosomet), kvalitetssikring og innsikt i hvordan det er å være en del av et stort prosjekt. Oppgaven utføres ved: Biobanken for den Norske mor og barn undersøkelsen, Folkehelseinstituttet 2. Nedregulering av gener for DNA reparasjon Skader på DNA må repareres for å sikre stabiliteten av DNA fra generasjon til generasjon. Skader på DNA kan også medføre mutasjoner og kreft. Oppgaven går ut på å nedregulere DNA reparasjonsgenet FEN1. Dette genet er nødvendig for at en celle skal overleve, og det er derfor ikke mulig å lage mutante celler hvor genet mangler helt. Genet vil bli nedregulert med såkalt RNAi strategi (RNA interferens). Det vil si at cellene tilsettes et plasmid som produserer korte RNA sekvenser som har homologi til FEN1 genet. Disse vil dermed binde seg til mrna et for FEN1 og spesielle enzymer vil degradere mrna et. Ved slik nedregulering vil det være mulig å redusere mengden FEN1 med omlag 90%, og dermed få levedyktige celler. Slike celler vil videre bli karakterisert for sensititivet overfor DNA skadende agens og stabiliteten av genomet. FEN1 er et av kandidatgenene for
arvelige sykdommer hvor spesielle triplettsekvenser ekspanderer (f.eks Huntington). Vi ønsker å undersøke effekten av nedregulet FEN1 i celler fra blant annet Huntington pasienter. Figur 1. Substrat for FEN1. FEN-1 (flap endonuklease 1) sklir ned enkelttrådet DNA og utfører et endonuklease kutt i overgangen mellom enkelttrådet og dobbeltrådet DNA. Den skisserte DNA-strukturen oppstår som et intermediat under DNA-reparasjon og under Okazaki fragment replikering (Klungland og Lindahl, 1997). Oppgaven utføres ved: Seksj. for molekylærbiol., Inst for mikrobio., Rikshospitalet 3. Utvikling av kvantitativ multipleks PCR metode for påvisning av mutasjoner i cystisk fibrose gen. Matforsk har utviklet en ny multipleks kvantitativ DNA array basert PCR metode (MQDA- PCR). Denne metoden er generell og kan brukes i alle områder innen biologisk forskning hvor det er ønskelig å kunne påvise og kvantifisere multiple genområder samtidig. Metoden baserer seg på en totrinns PCR. I det første trinnet utføres noen få sykluser hvor det benyttes primere som inneholder en universell 5`HEAD region og en 3`region som er spesifikk for hver av genområdene. Dette fører til oppkonsentrering av nye DNA områder med like ender. Deretter degraderes ubrukte primere med en enkelt trådet DNA spesifikk exonuklease. I det andre trinnet benyttes primere som kun bindes til de like områdene i den universelle HEAD regionen. Alle de ulike gensekvensene oppkonsentreres dermed. For å påvise hvilke gensekvenser og hvilke mulige mutasjoner som disse har i seg, blir PCR produktene blottet over på nylonfiltre eller glassplater. Der blir de hybridisert med ulike oligonuleotidprober, som er merket. Påvisning av hvilke prober som bindes blir gjort i en såkalt DNA array metode som tillater multipelks påvisning. Matforsk har tidligere brukt kvantifisering av transgene mais i mat og for som et modell system for å vise metodens anvendbarhet. I dette hovedprosjektet ønsker vi å vise at metoden kan benyttes til å påvise mutasjoner i gen som er ansvarlig for cystisk fibrose. Den vil da være et viktig verktøy innen klinisk diagnostikk. Primere og prober tilknyttet de ulike mutasjonene
vil bli designet og testet. For å optimalisere systemet vil PCR og merkereaksjonene bli utført under ulike betingelser. Hybridiseringen vil bli testet både på nylon filtre og glass mikroarray. Oppgaven utføres ved: Matforsk, Ås 4. Uttesting av sædprøver Rettsmedisinsk institutt har stor interesse av å få vite om tørre og fuktige sædflekker på tøy kan smitte over på annet tøy. I tillegg skal det ses på hvordan sædavtrykk blir når sæden sprutes utover et tøystykke ved ejakulering i motsetning til hvordan avtrykket blir ved overføring for hånd. Årsaken til dette er blant annet en politietterforsket sak hvor en psykisk handikappet jente påstår å ha blitt misbrukt av stefaren sin. Det er funnet sædrester fra mannen på hennes klær. DNA fra mannen er identifisert ved Rettsmedisinsk institutt. Beviset avvises imidlertid med begrunnelse av at klærne har kommet i kontakt med hverandre i skittentøykurven, eller at jenta har funnet sædrester fra mannen og gnidd det utover tøyet sitt. Rettsmedisinsk institutt er interessert i å få dokumentert om det er mulig å overføre sædrester på den angitte måten. Studentene vil teste sædflekker på forskjellige stoffer (ull/bomull/syntetiske, både tykke og tynne). Det praktiske delen vil være å lage sædflekker på stoff, ha forskjellig tørketid, legge på rent stoff og la det ligge en viss tid. Tøystykkene skal belyses med UV lys og behandles med alkalisk fosfatase som påviser sæden. Deretter skal noen av sædflekkene klippes ut, sæden isoleres og mikroskoperes for å påvise sædceller. Oppgaven går videre ut på å ekstrahere DNA fra sædprøvene og oppkonsentrere bestemte fragmenter av DNA ved hjelp av PCR-reaksjon. Prøvene vil også bli testet på kapillærelektroforese. Oppgaven utføres ved: Rettsmedisinsk avdeling, Rikshospitalet 5. Epimerisering og karakterisering av alginat, og dannelse av gelkuler Bakgrunn Alginat er et uforgrenet polysakkarid som produseres av brunalger og enkelte bakterier. Polyanionet består av β-d-mannuronsyre (M) og α-l-guluronsyre (G). Polymeren består av kontinuerlige M-enheter (M-blokker), kontinuerlige G-enheter (G-blokker) og alternerende enheter (MG-blokker). Alginater danner geler med divalente kationer der G-blokkene er de som binder ionene sterkest og dermed gir de sterkeste gelene. Alginatets geldannende egenskaper blir brukt til immobilisering av ulike komponenter. Vi arbeider i hovedsak med immobilisering av insulinproduserende celler til transplantasjon av pasienter med sukkersyke (insulin avhengig diabetes mellitus). Kapselen er en inhomogen alginatkule (med størst konsentrasjon av alginat nær overflaten av kula) dekket med et lag av poly-l-lysin og så et lag med alginat som ytre coating. Poly-L-lysin laget gir kapselen en ønsket porøsitet samtidig som den hindrer at alginatgelen sveller ved utbytting av divalente mot monovalente ioner. Det er ulike krav som stilles til kapselen: Stabilitet: Kapselen skal kunne tåle å være i bukhulen i flere år uten å gå i stykker.
Næringstilførsel: For at cellene inni kapselen skal kunne leve krever det at næringsstoffer kan gå uhindret inn i kapselen og avfallsstoffer ut av kapselen. Stor kapsel og celler som gror utenpå kapselen kan begrense næringsgstilførselen. Immunoproteksjon: Hensikten med kapselen er å hindre kroppens immunsystem i å angripe de nye cellene som transplanteres inn i kroppen. Kapselens porøsitet er viktig å kontrollere slik at ikke uønskede immunceller og andre skadelige stoffer trenger inn i kapselen. Oppgaven Vi har i de senere år utviklet et unikt verktøy for strukturell skreddersøm av alginater. Dette er basert på en gruppe bakterielle exocellulære enzymer som kontrollerer blokkstrukturen i alginat ved å epimerisere polymert bundet mannuronsyre til guluronsyre. 7 ulike epimeraser er sekvensert, klonet, og kan produseres ved fermentering av rekombinant E.coli stammer. Alle epimerasene har ulik spesifisitet. Grovt sett kan vi si at noen lager alternerende strukturer av M og G mens andre er mer typisk G-blokkdannere. Ved å behandle alginat med ulike epimeraser kan vi kontrollere polymerenes struktur og dermed deres funksjonelle egenskaper. Får å øke næringstilførselen til cellene inne i kapselen er det ønskelig med så små kapsler som mulig. I tillegg må disse kapslene være stabile med hensyn på svelling. Ved å bruke enzymer (AlgE epimeraser) som omdanner M til G i polymeren, kan vi få dannet skreddersydde alginater med de egenskapene vi ønsker. Epimerisering med enzymet AlgE4 har for eksempel vist å gi både mindre og sterkere kapsler. Det gjenstår fortsatt en del forskning på hva slags egenskaper man kan få tilført ved å bruke ulike epimeraser på alginat. Oppgaven tar sikte på å framstille (epimerisere) ulike alginater fra et utgangsmateriale (et polyalternerende alginat) ved bruk av ulike epimeraser som innfører blokker av G inn i alginatkjeden. De framstilte alginatene må karakteriseres med hensyn på sammensetning av M og G (ved 1 H-NMR spektroskopi).videre er det aktuelt å bruke de framstilte alginatene for å danne gelkuler som da må karakteriseres med hensyn på svellestabilitet og porøsitet. I studier av porøsitet vil vi benytte flouresensmerkete antistoffer og confocal mikroskopi. Oppgaven utføres ved: NTNU 6. Utvikling av laboratorieoppgaver i organisk kjemi basert på prinsipper for grønn kjemi. Grønn kjemi er utvikling av kjemiske produkter og prosesser som reduserer eller minimaliserer bruk av skadelige stoffer. Grønn kjemi er innovativ kjemi med økonomiske og miljømessige fordeler. Grønn kjemi er interdisiplinær og har i seg aspekter fra biologi, økonomi og etikk. Grønn kjemi betyr at man utfører kjemi på en miljømessig forsvarlig metode. De tolv prinsippene i grønn kjemi brukes som retningslinjer når man utvikler nye synteser og prosesser. Disse prinsippene fokuserer på alle aspekter ved syntese og prosess slik som løsemidler, separasjoner, energiforbruk og minimalisering av avfall. Grønn kjemi er et relativ nytt felt og få pedagogiske resurser er tilgjenglige. Jeg ønsker å utvikle lab. kurset i organisk kjemi ved å ta inn konsepter fra grønn kjemi. Dette er f. eks. bruk av vann istedenfor tradisjonelle løsemidler. Jeg har samlet en del forskrifter og forslag til studentforsøk. Disse må testes ut og bearbeides slik at de kan benyttes ved vår skole. Den eller de som velger dette som prosjekt kan også komme med egne forslag til studentforsøk. Det publiseres stadig flere og noen av disse legge ut på nettet. Oppgaven utføres ved: Høgskolen i Oslo, Avdeling for ingeniørutdanning
7. Prosjekt på Rikshospitalet Institutt for klinisk biokjemi Sted: Institutt for Klinisk Biokjemi, Rikshospitalet Prosjektet vil ventelig være innenfor en av disse problemstillingene: 1. Måling av hydrolaseaktivitet i lunge skyllevæske samt blod (måling av enzymaktivitet fluorometrisk). 2. Måling av metylargininer i blod hos friske samt nyrepasienter (trolig HPLC). 3. Videreutvikling / validering av metodikk for måling av K-vitaminer i blod ( fokus på prøveopparbeidelse og validering - analyseteknikk er HPLC) Alle 3 prosjektene er initiert av Dr. Gaut Gadeholt - en lege med lidenskap for laboratoriearbeid og analytisk kjemi.
8. Uvikling av metode for rensing av tungmetaller i avrenningsvann fra skytebaner Sted: Forsvarets forskningsinstitutt (FFI), Kjeller Bakgrunn: Forsvaret er forvaltere av flere hundre skytebaner, hvor det hvert år deponeres flere tonn bly, kobber, antimon og sink. Enkelte av disse er anlagt slik at det skjer en utlekking av tungmetaller til bekker og grunnvann. Der tungmetallnivåene i avrenningsbekker er så høye at det kan forventes skade på økosystemet, må Forsvaret gjøre tiltak for å redusere avrenningen. Et type tiltak er rensing av avrenningsvannet. Målsetting: For å redusere problemene er det viktig at det blir utviklet og testet ulike filtermedier som eventuelt kan benyttes i filtersystemer for å rense sige- og bekkevann for tungmetaller. Filtermediet må kunne oppnå ønsket renseeffekt, være rimlig og ikke gi andre uønskede effekter. Prosjektoppgave: Det skal, under kontrollerte forhold, testes ulike filtermasser med tanke på volum-belastning og levetid i forhold til mengden tungmetaller i filtreringsvannet. Vannet som brukes er hentet fra skytebaner hvor avrenningen er stor og innholdet og fordelingen av tungmetaller er reell. Forsøkene skal utføres vha kolonner og ekstraksjon i laboratorium ved FFI. Analyser av tungmetaller skal utføres vha atomabsorbsjonsspektrometri. Ekstern veileder: Arnljot Strømseng Studentgruppe: Hedda Paulsen og Linn T. Pettersen Intern veileder: Per Ola Rønning 9. Kjemiske prosesser som kan føre til nettbasert og ikke nettbasert strøm-produksjon fra solceller. Kommentar: Oppgaven innebærer å redegjøre for tilvirkning av hele kjeden fra råstoffproduksjon, wafer-produksjon, solceller (PV-celler), modul og solcellepaneler til ferdig nettverk- eller ikke-nettverksinnstallasjoner. Virkesett, muligheter, begrensninger og anvendelser, tekniske som økonomiske vurderinger inngår i oppgaven. I h-prosjektoppgaven inngår litteraturstudier, søk på nettet og kontakt med aktuelle bedrifter. Studentgruppe: Heidi Kvaløy og Kjersti Andresen Intern veileder: Jan Stubergh