Bruk av DNA-sekvensering i mikrobiologisk diagnostikk Øyvind Kommedal Haukeland Universitetssykehus
Hvordan sekvensering revolusjonerte mikrobiologien
Bakterienes morfologi
Fenotypisk identifikasjon
Fylogentisk analyse av Mycobacterium aureum ATCC stammer M. aurum ATCC 21498 M. petoleophilum M. aurum ATCC 23070 M. fluoranthenivorans M. aurum ATCC 23071 M. neoaurum M. aurum ATCC 23366 T M. aureum M. aurum ATCC 25791 M. bacteremicum M. aurum ATCC 25793 M. chlorophenolicum M. aurum ATCC 25798 M. laticola M. aurum ATCC 25799 M. laticola M. aurum ATCC 25800 M. laticola M. aurum ATCC 25803 M. laticola M. aurum ATCC 27277 M. neoaurum Simmon et al.; IJSEM 2009 and Brown-Elliot et al.; JCM 2010
Wexler et al.; IJSEB, 1996 «Bacteroides gracilis»
1970: DNA-DNA-hybridisering Modified from The University of California, Museum of Paleontology, Berkeley
1970: DNA-sekvensering Ex: Sammenligning mellom 16S rrna-genet for Streptococcus pneumoniae og Streptococcus pyogenes
16S rrna-genet et molekylært kronometer BP 1 BP 1542 BP 333-354 BP 784-803 BP 1094-1114 V1 V2 V3 V4 V5 V7 V8 V9 V6 BP 4-27 BP 506-535 BP 905-938 BP 1490-1511 1. Tilstede i alle organismer du vil sammenligne 2. Vekselsvis variable og konserverte områder 3. Jevn, forutsigbar mutasjonsrate 4. Mutasjonsrate som er egnet for det du vil undersøke
Wexler et al.; IJSEB, 1996 Fylogenetiske trær
Begynnelsen av 1990-tallet Automatisering av DNA-sekvensering Automatisering av PCR-reaksjonen Opprettelsen av GenBank Tilgang til GenBank via internett Identifikasjon av bakterier v.h.a 16S rrna-gene sekvensering i diagnostiske laboratorier 16S PCR
Identifikasjon av nylig beskrevne/uvanlige agens Fenotypisk identifikasjon Høre om bakterien Mistenke bakterien Etablere tester for bakterien Type-stamme for kontroll 16S rrna sekvensering Rutinemessig Tidligere måtte man lære om en bakterieart før man kunne identifisere den. Nå lærer man om den fordi man har identifisert den.
Tolkningskriterier 16S 99 % homologi med en god referanse for species ID I tillegg > 0,8 % avstand til neste alternative species 97 % homologi for ID på genus-nivå (e.g Prevotella sp.)
16S rrna versus DNA-DNA hybridisering Adekambi et al.; IJSEB, 2008
RpoB versus DNA-DNA hybridisering
DNA preparation Initial sample processing (10 min) Bacterial lysis (5 min) DNA extraction (45 min) 60 min Amplification Real-time SYBR Green PCR (60 min) PCR Clean-up Exo-Sap IT enzymatic degradation (45 min) Cycle sequencing (50-165 min) 270-385 min Sample purification (40 min) Capillary electrophoresis With POP 7 (75 min) Interpretation BLAST/GenBank (5 min/sample) 5 min/sample
Praktisk øvelse Analyse av 16S-sekvens
Men nå har vi da Maldi-TOF!
16S sekvensering 16S rrna-genet Døde/levende bakterier Bakterielt DNA PCR (DNA-oppkopiering) DNA-sekvensering (leser oppkopiert DNA) Sammenligning med kjente bakteriesekvenser E. Coli 100 % match ID 19
Bacillær angiomatose «An atypical subcutaneous infection assosiated with acquired immune deficiency syndrome» Stoler et al.; Am J Clin Pathol; 1983 Relman et al.; NEJM 1990
«The agent of bacillary angiomatosis» Relman et al.; NEJM 1990 B.
Dyrkningsbasert diagnostikk er upålitelig hvis pasienten har fått antibiotika før prøvetaking og ved infeksjoner med anaerobe, kravfulle eller atypiske mikrober Direkte 16S er et universelt, dyrkningsuavhengig supplement Sample type Antibiotics Culture Direct 16S sequencing Campylobacter gracilis Liver No Fusobacterium nucleatum abscess Streptococcus intermedius Streptococcus intermedius Aortic Doxycyclin (7 d) No growth Streptococcus pneumoniae abscess Ovarial abscess No No growth Chlamydia trachomatis 22
Fordeler 16S sekvensering vs. MALDI Kan gå direkte fra prøvematerialet trenger ikke levende mikrober som kan vokse i lab Kan plassere tidligere ukjente mikrober i sin fylogenetiske kontekst Større database som oppdateres fortløpende Platform-agnostisk database
Utfordringer knyttet til 16S sekvensering direkte fra pasientprøvene
Kryssreaktivitet mot humant DNA Kommedal et al., JCM 2012 25
PCR-reagenser inneholder bakterielt DNA Konsekvensen av bakgrunns-dna er at direkte 16S sekvensering blir vesentlig mindre sensitivt En spesies-spesifikk PCR er omkring 100 ganger mer følsom! 26
Polymikrobielle prøver A. aphrophilus S. intermedius A G T T C T T T C G G T A G C T C T G T T G T T Kommedal et al.; JCM; 2008 NB! Lyseringen må være like effektiv for både G + og G- mikrober 27
Typisk blandet DNA-kromatogram RipSeq Mixed: Unik basecalling og søkealgoritme Kan identifisere inntil 3 mikrober fra en blandet sekvens Kommersielt foreleser har eierinteresser 28
Begrensninger universell amplifikasjon Polymikrobiell prøve Universell 16S PCR Prøve Resultat dyrkning Resultat 16S sekvensering Hjerneabsess Actinomyces meyeri Fusobacterium nucleatum?! Campylobacter gracilis Fusobacterium nucleatum Peptostreptococcus sp. 29
Gruppespesifikke PCR 1-3 BAKTERIER RATIO 1:10 ALLE BAKTERIER PCR U PCR A G+ AEROBE G- AEROBE PCR B 1-9 BAKTERIER RATIO 1:1000 PCR C ANAEROBE 30
Resultater gruppespesifikke PCR 37 spp. 51 spp. Prøvetype Antall Absesser 17 Galle 2 Empyem 6 95 spp. Kommedal et al., JCM 2011 31
Utvalgte eksempler PRØVETYPE DYRKING UNIVERSELL PCR GRUPPESPESIFIKK PCR Pleuravæske Hjerneabsess Miltabsess S. intermedius A. meyeri F. nucleatum Enterococcus sp. S. epidermidis F. nucleatum P. micra S. intermedius C. gracilis F. nucleatum Peptostreptococcus sp. E. gallinarum E. faecalis F. nucleatum P. micra S. intermedius A. meyeri C. gracilis Eikenella sp. F. nucleatum Peptostreptococcus sp. E. gallinarum E. coli E. faecalis F. nucleatum S. anginosus S. epidermidis 32
Relevante prøver Spinalvæske ved spm. om bakteriell meningitt Hjerteklaffer ved spm. om endokarditt Leddvæske/vev ved spm. om proteseinfeksjoner Aspirat fra spondylodiskitter Vevsprøver fra dype infeksjoner (polymikrobielle) Pleuraempyem (polymikrobielle) Abscesser (polymikrobielle)
Typiske ikke-relevante prøver BAL (lite/fortynnet materiale, forurensing) Parafin-innstøpte preparater (lite materiale, forurensing) Små biopsier fra diverse lokalisasjoner (lite materiale) Områder med normalflora (kompleksitet)
Når skal man gjøre direkte 16S? Strategi 1 Definere viktige og egnede prøvetyper Vente å se om man finner noe på dyrkning Gjøre 16S hvis dyrkning er negativ Strategi 2 Definere viktige og egnede prøvetyper Gjøre 16S umiddelbart hvis det er gitt antibiotika eller det er mistanke om atypiske mikrober evt. anaerobe
Kasuistikker
Universell amplifikasjon av andre mikroorganismer fra en bakgrunn av Sopp - JA humant DNA? Parasitter NEI, for likt humant DNA Virus NEI, ingen/liten homologi mellom ulike slekter/familier
Universell sekvensering av sopp Khot et al., Applied and Environmental Microbiology, 2009
Annen sekvensering Typing av virus fra cellekultur eller direkte fra klinisk materiale (kryssreaktivitet!) Påvisning av resistens som skyldes genmutasjoner f.eks rpob-sekvensering for rifampicin-resistens hos M. tuberkulosis Klassifisering av resistensgener, f.eks CTX-M typer Sekvensering av alternative gener for sikker ID der 16S er utilstrekkelig Utbruddskartlegging (MLST, Spa etc.) Troubleshooting PCR
Hva du trenger Vite hvilken del av genet som er viktig for det du vil undersøke Noenlunde stabile områder for primer-design En database med relevante referanser (GenBank eller mer spesialiserte) Hvis direkte fra prøvemateriale sjekk for kryssreaktivitet Hvis du skal klassifisere/identifisere: Cutoffverdier
Genotyping av Hepatitt C Utdrag Hepatitt C genomet (start5 NTR)gccagccccctgatgggggcgacactccaccatgaatcactcccctgtgaggaactattgtcttcacgcaga aagcgtctagccatggcgttagtatgagtgtcgtgcagcctccaggaccccccctcccgggagagccatagtggtctgcggaac cggtgagtacaccggaattgccaggacgaccgggtcctttcttggataaacccgctcaatgcctggagatttgggcgtgcccccg caagactgctagccgagtagtgttgggtcgcgaaa(dpof)ggccttgtggtactgcctgatagggtgcttg cgagtgcc ccgggaggtctcgtagaccgtgcacc(startcore)atgagcacgaatcctaaacctcaaagaaaaaccaaacgtaacac caaccgtcgcccacaggacgtcaagttcccg(417f)ggtggcggtcagatcgttggt ggagtttacttgttgccgcgcag gggccctagattgggtgtgcgcgcgacgaggaagacttccgagcggtcgcaacctcgaggtagacgtcagcctatccccaagg cacgtcggcccgagggcaggacctgggctcagcccgggtacccttggcccctctatggcaatgagggttgcgggtgggcggg atggctcctgtctccccgtggctctcggcctagctggggccccacagacccccggcgtaggtcgcgcaatttgggtaaggtcatc gatacccttacgtgcggcttc gccgacctcatggggtacat(752r)accgctcgtcggcgcccctcttggaggcgctgcc agggccctggcgcatggcgtccgggttctggaagacggcgtgaactatgcaacagggaaccttcct ggttgctctttctcta tcttcct(874r)tctggccctgctctcttgcctgactgtgcccgcttcagcctaccaagtgcgcaattcctcggggctttaccatgt caccaatgattgccctaactcgagtattgtgtacgaggcggccgatgccatcctgcacactccggggtgtgtcccttgcgttcgcg agggtaacgcctcgaggtgtt
Praktisk øvelse HCV-genotyping og gdh-sekvensering for mitis/oralis/pneumoniae
Sekvensering av PCR-produkt PRIMER 5-3: REVERSERT 3-5: C G C G G C T G C T G G C A I I I A I T T R G C C G R T T I A I I I A C G G T C G T C G G C G C INVERTERT: G C Y A A I T I I I T G C C A GCA G C C G C G C C A G A A A G G G A C G G C T A A C T A C G T G C C A G C AG C C G C G A
En siste kasuistikk Pasient med pneumoni og pleuraempyem. Negativ dyrkning. Nå lungebiopsi til 16S. Acidovorax temperans Diaphorobacter nitroreducens Francisella tularensis
Dye-terminator sequencing
Trouble shooting PCR Utdrag Humant poliovirus I med våre primere: ggctaacgccatgggacgctagatgtgaacaaggtgtgaagagcctattgagctacttaagagtc ctccggcccctgaatgcggctaatcccaaccacggagcaggtgccttcaacccagagggtggcct gtcgtaacgcgcaagtctgtggcggaaccgactactttgggtgtccgtgtttccttttatctttt atatggctgcttatggtgacaatcatagattgttatcataaagcgacttggattggccatccggt aaaatacaaacacat