1 KJ2053 Kromatografi (Analytiske metoder II) Lundanes Else, Reubsaet Léon, Greibrokk Tyge, Chromatography, Basic Principles, Sample Preparations and..., Wiley-VCH, 2014. ISBN:978-3-527-33620-3 (Gas Chromatography) 2.C. G(L)C med Kapillærkolonner 2. C. 1. Innledning 2.C. 2. (Kapillær-)kolonner 2.C.2. a. Veggmaterialet (og "SF-Bærematerialet ) 2.C.2. b. Stasjonære faser i veggbelagte kapillærkolonner 2.C. 3. Bruk av kapillærkolonner i separasjons-oppgaver 1
2 2. C. 1. Innledning Repet.: 3 hovedtyper (gass-væske-) kapillær-gc-kolonner: WCOT-kolonner A. pakkede kapillærkolonner.......... (lite brukt i GC) B. PLOT - (& SCOT )-kolonner......... (eng.: Porous Layer Open Tubular columns & Support Coated Open Tubular columns) C. Veggbelagte kapillærkolonner, WCOT-kolonner.. (eng.: Wall Coated Open Tubular columns) 2
3 2. C. 1. Innledning Not quite to scale! Kapillærkolonne-inndeling etter størrelse (kolonnediameter, WCOT-kolonner) : "Narrow bore" (fine bore,, mini-bore), typiske verdier ("standard", upolar ) i.dia. eff. (ca.) kapas. Film i.d. ~m SF ~V MF L (mm) (N/m) (ng) (mm) (mm) (mg) (ml) (m) (25 m l.) (25 m l.) ca.< 0,2 4000-5000 lav (~10) 0,2 0,15 2,5 0,45 10-20 Standard, "normal" 0,2-0,35 3000-4000 2000-3000 (~150) (~300) 0,25 0,5 0,25 0,32 5 12,5 1,25 2,0 15-60 15-60 Wide bore ("Mega-bore ) > 0,5 1000-1500 ~1000 1,0 0,53 40 5,5 10-30 NB : For super-rask GC er 0,1 mm-kolonner på 10m eller kortere aktuelle (High Speed GC). Til spesielle anvendelser som mikro-gc ( GC-on-a-chip ) er også rel. korte åpne kolonner med rektangulært eller kvadratisk (evt. triangulært) tverrsnitt blitt brukt (laget ved etsing på silikon-skiver, nanotechnology ). (Ved SFC og HPLC benyttes trangere (WCOT-) kolonner, hhv. 50 100 mm og << 50mm.) 3
4 2. C. 1. Innledning En kapillær-glc-kolonne - en WCOT-kolonne: F.eks. : 0,25mm i.d.kolonne ca. 15 μm polyimidbeskyttelse ca. 30 μm FS-vegg 1,0 μm SF-film (litt tykk) Faseforholdet: β = V MF /V SF 60 Hva er faseforholdet β i kolonna som dere bruker på GC-1-lab.-forsøket? 0,25mm i.d., 0,25 m filmtykkelse, 30m lang. 4
5 2. C. 1. Innledning Not quite to scale! Særtrekk ved kapillærkolonner : -- Høy effektivitet ( HRGC high resolution GC ) -- Lav prøvemengde-kapasitet Vedr: Høy effektivitet : 2 faktorer: (i) redusert platehøyde (H) - ingen Eddy-diffusjon og - redusert C-term - tynnere jevnere SF-film) Derfor: forenklet VAN DEEMTER-likning for pakket kol.: H = A + B/u + (C MF + C SF ) u blir til forenklet GOLAY-likning for kapillær-kol.: H = --- "Full" GOLAY-likning: H = 2 D MF /u + ( (1+6k+11k 2 ) d c + 2 k d 2 f ) u 96 (1+k) 2 D MF 3(1+k) 2 D SF B/u + (C MF + C SF ) u 3. ledd : ubetydelig ved tynn film (lav d f ) 5
6 2. C. 1. Innledning Særtrekk ved kapillærkolonner : -- Høy effektivitet ( HRGC high resolution GC ) -- Lav prøvemengde-kapasitet Vedr: Høy effektivitet: 2 faktorer: (i) A redusert platehøyde (H) ingen Eddy-diffusjon redusert C-term - tynnere jevnere SF-film) (ii) B : kapillærkolonner er mye lenger åpne (kapillær-)rør - mye mindre motstand mot gjennomstrømning mindre trykkfall pr. lengdeenhet. (sammenlignet med pakkede kolonner) MYE større kolonnelengde mulig - dermed (mye) større platetall Tynne væskefilmer i kapillærkolonner - lavere V SF (høyt faseforhold β (= V MF /V SF )) (husk : k = K V SF / V MF ) gir lave k-verdier (redusert retensjonen) - men : takket være et høyt platetall (WCOT-kolonne!) : oppløsningsevnen (R S ) forblir rel. høy. ==> lavere retensjonstider mulig ved ~samme temperatur (tidsgevinst, faktor ~10, v. lignende R S ) eller ==> lavere elueringstemperaturer (ca. 20 C; mildere analysebetingelser for samme k, men bedre oppløsning og mer skånsom). 6
7 2. C. 1. Innledning Not quite to scale! Særtrekk ved kapillærkolonner : -- Høy effektivitet ( HRGC high resolution GC ) -- Lav prøvemengde-kapasitet 2 faktorer: A lite kolonnevolum (2-4 ml for standardkolonner) og på toppen B høyt faseforhold β = V MF / V SF (ca.100-250 ), d.v.s. forholdsvis (enda) mindre stasjonærfase (totalt bare 5-20 mg for standardkolonner)... Dette krever: Spesialiserte injeksjonsteknikker følsomme, tilpassede detektorer (jfr. : kap. 2.C.3.) for å unngå at kolonnen overbelastes unngå for høye analytt-konsentrasjoner i fasene ikke-ideal oppførsel! 7
8 2. C. 1. Innledning Særtrekk ved kapillærkolonner : -- Høy effektivitet -- Lav prøvemengde-kapasitet Not quite to scale! Vedr.: Reduksjon av prøvemengde-kapasitet : Obs.! Selv om små prøvemengder injiseres: deteksjonsgrenser med kapillær-gc er ofte lavere (metoden mer følsom) enn med pakkede kolonner. Årsak: signal/støy-forholdet oftest klart høyere - rel. høyt signalnivå: (mindre fortynning av prøven) og - smalere topper (raskere passasje gj. detektoren) og - lavere støy - mindre kolonneblødning (mindre væskefase tilstede som kan "blø") - lavere eluerings-temperaturer (mindre bløding), og - generelt bedre utstyr (og operatører (?)) ved kapillær-gc. Gir kvalitativt, og kvantitativt, bedre analyser, spesielt for komplekse prøver, forutsatt Godt (spesial-)utstyr riktig tilpasset bruk - opplærte brukere! 8
9 2.C. 2. (Kapillær-)kolonner Not quite to scale! 2.C.2. a. Veggmaterialet (og "SF-Bærematerialet ): I bruk : "fused silica" ("silika") inert, mest brukt i dag glass: sodaglass rel. mykt, aktivt, svært lite brukt i dag, borosilikatglass hardere, mer inert, svært lite brukt i dag. Metall elastisk, robust, (ugjennomsiktig), elektisk leder; tidlig mye brukt, ute fordi for aktivt, Metall "gjenoppdaget" nylig: etter innvendig belegging med ultratynn fused silica -lag (Ultimetal, Mtx, Silicosteel) ang. "fused silica" : - høy-ren amorf SiO2, < 1 ppm forurenset, mye renere enn kvarts, (fremstilt syntetisk fra SiCl 4 ), - typisk veggtykkelse bare ca. 0,025 0,030 mm : rett kapillærrør, rel. fleksibelt - lar seg kveile, (men under konstant mekanisk spenning) - må beskytes utvendig mot kjemiske og mekaniske skader: utvendig belagt (polyimid-polymer (vanlig), metall), - innerveggen (= bærematerialet): inert, selv ved minimal forbehandling, - gjennomsiktig med polyimid-belegg (beige-brun farge fra polyimid), ugjennomsiktig med aluminium. I litteraturen ofte for veggbelagte silika-kapillærkolonner : "FSOT column" ( for "Fused Silica Open Tubular" column). 9
10 2.C. 2. (Kapillær-)kolonner 2.C.2. b. Stasjonære faser i veggbelagte kapillærkolonner Stasjonær-faser : i prinsipp de samme typene som nevnt i 2.B.5, men krav til kvalitet (lav flyktighet, kjemisk stabilitet, reproduserbarhet i egenskapene) er en del større enn for pakkede kolonner (mange "gamle" faser brukes derfor ikke lenger) Den høye effektiviteten til WCOT-kolonner gir god (nok) oppløsningsevne i mange (ikke veldig kompliserte) tilfeller : HRGC trenger derfor ofte bare et begrenset utvalg av SF (noe begrenset behov for finjustering av selektivitet). F. eks.: 1 upolar f.eks.: 100%-metyl- eller 95%-metyl-5%-fenyl-silikonfase, 1 mellompolar f. eks.: 50%-fenyl-50%-metyl-fase eller 14%-cyanopropyl-86%-metyl-silikonfase, 1 polar fase f.eks.: polyetylenglykol-fase eller cyanoalkyl-(>50%)-silikon-faser. Evt. Spesialfaser for spesialoppgaver (kiral separasjon, el. notorisk komplekse prøvetyper, f.eks. i miljøkjemi) Kolonner kjøpes som regel ferdiglaget (FSOT-kol. ca. kr. 4000-5000 og oppover) på kveil-holder (ramme) og (ofte) med individuell testkromatogram. I prinsipp er selv-laging mulig, men ganske krevende! 10
11 2.C. 2. (Kapillær-)kolonner 2.C.2. b. Stasjonære faser i veggbelagte kapillærkolonner Stasjonær-faser: krav til kvalitet er en del større enn for pakkede kolonner Vanlige modifikasjoner for kolonner til HRGC - for økning av termisk stabilitet (høyre MAOT s, lavere bløding) : > Kjemisk og fysisk stabilisering av SF ved - kryssbinding: vanligvis v. radikal-reaksjoner (knytter sammen alkylgrupper fra ulike polymerkjeder) - kjemisk binding: vanligvis kondensasjons-reaksjoner (binder hydroksyl-grupper i SF-molekyler til silanol-grupper på silka-kolonneveggen). > Endring av (silikon-)polymer-strukturen: - legge organiske grupper (fenylringer) inn i selve silikon-kjeden (silarylen-polymerer): (bremser termisk de-polymerisering av sikoksan-kjedene i vanlige polysiloksan-kjeder) ( høy-temperatur og low-bleed SF er, GC/MS-kolonner ). vanlig polysiloksan silarylen-polymer 11
12 2.C.2. c Bruk av kapillærkolonner i separasjons-oppgaver Testing: kontroll av kolonne-kvalitet - kolonnens egenskaper forandres over tid: SF-mengden reduseres ved bløding, kolonnen forkortes ved klipping i endene eller uhell, selve SF'en forandres kvalitativt ved termolyse, og/eller oksydering, hydratisering, fra forurensing med tungtflyktige prøvekomponenter ("skitne prøver") m.m., SF-filmens kvalitet kan endres ved filmavløsing, dråpedannelse... Derfor er fortløpende testing nødvendig (kolonne-tilstand, instrumentelle problemer). Eksempel her Grob -test på upolare siloksan-kolonner: Kol.-testing: Ny Utslitt 12
13 2.C.2. c Bruk av kapillærkolonner i separasjons-oppgaver Regel : Bruk ikke lengre kolonner enn at de gjør jobben bra nok. Første forsøk: på tilgjengelige standard-kolonner : middels dimensjoner, relativt upolar silikonfase, eller en polar fase og vedr. polaritet: utgangspunkt - likt brukes på likt. Problemer med R S :...selektivitet: skifte SF, (endringer i polaritet avh. av problemet skifte temperatur (f.eks. T-program-hastighet) skifte av filmtykkelse kan også forandre selektivitet litt...effektivitet: lengre kolonne (øke platetall, men maks. lengde 60-100m) tynnere kolonne (do. reduserer H MTm ) tynnere SF-film (do. reduserer H MTs )...retensjon: skifte filmtykkelse (vanligvis øke d f ved problemer) ved T-progr.: redusere oppvarmings-hastigheten (forbedrer også effektivitet - mer lignende på isotermisk). 13
14 2.C.2. c Bruk av kapillærkolonner i separasjons-oppgaver Hjalp ikke dette? vurder selektiv detektor, vurder flerdimensjonal analyse : GC-GC, GC-spektroskopi, vurder annen teknikk enn GC (SFC, LC, CE). 14
15 2.C.2. c Bruk av kapillærkolonner i separasjons-oppgaver Har du mange analyser? Vil du spare tid og penger!! følg regelen ovenfor - ikke lengre kolonner enn nødvendig, bruk isotermiske analyser (hvis mulig, kan spare temperatur-ekvilibrerings-tid), bruk tynnere kolonner med tynnere film - høyere effektivitet, og det ved høyere bæregass-hastigheter. Lykke til... For fun: https://www.youtube.com/watch?v=uo6x2gbradu 15
16 Som fortelleren sier : " UltiMetal GC columns can take it... even heavy traffic! " For fun: https://www.youtube.com/watch?v=uo6x2gbradu 16