Diagnostikk ved Nasjonalt referanselaboratorium for medisinsk mykologi Lonny M. Kløvfjell Fagbioingeniør Avdeling for mikrobiologi OUS-Rikshospitalet lklovfje@ous-hf.no
Referanselaboratorium
Referansefunksjoner Bistå primærlaboratorier med identifikasjon og resistensbestemmelse av alle Candidaisolat fra blodkultur, og å forvalte nasjonal stammebank for invasive Candidaisolat. Nasjonal overvåkning av Candidaresistens Bistå primærlaboratorier med identifikasjon og resistensbestemmelse av andre kliniske soppisolat.
Hvilke analyser har vi? Identifikasjon av gjærsopp, muggsopp og dermatofytter. - Maldi-TOF - Sekvensering - Mikroskopi - Selektive medier - Vitek2 Påvisning av sopp-dna (PCR). Utføres på molekylær-enheten for oss. Langtidsdyrkning mhp sopp Resistensbestemmelse av gjær- og muggsopp. Pneumocystis IF Serologi Antigenpåvisning (galaktomannan, utføres på virus).
LITT TALL I 2015 mottok vi 203 soppisolater fra blod, hvorav 199 var candida. Vi får også flere isolater fra andre lokalisasjoner enn blod. I 2015 var det 191 slike gjærsoppisolat og 79 muggsoppisolat. 32 dermatofyttisolater til identifikasjon i 2015. Candida albicans er hyppigst isolert ved candidemi, 67,8 %. C.glabrata utgjør 16,6 % mens andel av andre candidaarter er lav, C.tropicalis C.dubliniensis og C.parapsillosis er av disse hyppigst forekommende med 3-4 %.
Sopp - analyser Totalt antall analyser i 2015: 6989
SOPPTYPER GJÆRSOPP MUGGSOPP DIMORFE SOPP DERMATOFYTTER
Gjærsopp Får tilsendt alle isolater fra blodkultur, samt en del fra andre materialer. -Såes ut på Saboraud og kromskål Identifikasjon: Krom (grønn/ikke grønn) Maldi-TOF Evt. Vitek Sekvensering Resistensbestemmelse Fryses i vårt stammearkiv
Muggsopp Fra flere ulike prøvematerialer Hvis sendt på skål: Rask vurdering av farge og øvrig morfologi Lupe Mikroskopi (bomullsblått, tapeteknikk) Sub på ulike temperaturer (28/37/45/50+ C) Resistensbestemmelse dersom ønsket Maldi-TOF ID kommer nå Sekvensering
Aspergillus Penicillum Mucorales
Aspergillus sp 12 A.fumigatus A.flavus A.niger A.terrus 180 species Vel 30 assosiert med human sykdom
Aspergillus A.fumigatus A.flavus A.flavus A.niger
Penicillum
Mucorales
Dermatofytter Tinea pedis fot Tinea unguis (onychomycose) negler (hånd/fot) Tinea corporis kropp (ringorm) Tinea capitis hode (hår/skjegg)
Trichophyton rubrum Trichophyton mentagrophytes (interdigitale) Microsporum canis Microsporum audouinii Trichophyton soudanense Trichophyton violaceum
Identifikasjon av dermatofytter Direkte på prøvematerialet: Dermatofytt PCR Dyrkning og tilsendte isolat: Mikroskopi Kolonimorfologi Veksttemperatur Selektive medier Sekvensering
Trichophyton sp T.soudanense Reflexive hyfer Microsporum - makrokonidier
Dermatofytt-PCR Hud, hår og negler dyrkes ikke lenger rutinemessig, kun PCR Metoden påviser de vanligste artene: Trichophyton, Microsporum og Epidermophyton Realtime PCR Smeltepunktsanalyse:
Dimorfe sopp Gjærsoppform ved 37C Mugggsoppform 28C Histoplasma Blastomyces Coccidioides Penicillum marneffeii Sjelden i Norge Reiseanamnese! Immunsupprimerte (HIV) P3-lab
Histoplasma capsulatum
Viktig oppgave Rask og sikker Krever øvelse Oppslagsverk Mikroskopi Ulike metoder: CFW direkte på prøvemateriale Bomullsblått - Blokkpreparat - Nålepreparat - Tapeteknikk Lupe
Struktur Mikrokonidier Makrokonidier Sporangier («stilk») Forgreninger Vesikkel («hoder») Apophyse («hals») Phialider Fruktlegemer chleistotechia/pycnidia Røtter Størrelse Må alltid sees på sammen med kolonimorfologi og andre egenskaper. -veksthastighet -temperatur
Sekvensering + mikroskopi Maldi-TOF + mikroskopi
Mucorales Aspergillus Penicillum
BOMULLSBLÅTT - tapeteknikk Lactophenolblått Blank tape Objektglass Dekkglass
CALCOFLUORWHITE Flourescens farging Binder seg til chitin som finnes i celleveggen hos sopp. Direkte på prøvemateriale Rask diagnostikk Kan til en viss grad skille noen typer muggsopp fra hverandre.
Pneumocystis - Immunfluorescens Monoklonal, FITC merket antistoff BAL og Indusert sputum 1. Forbehandler med di-thio-threitol og PBS 2. Sentrifugerer 3. Bunnfall på objektglass 4. Tørkes 5. Fikseres 6. Farges 7. Mikroskoperes
Resistensbestemmelse av sopp Etest Flytmetode (ikke lenger anbefalt) RPMI-skåler Gjærsopp Muggsopp Vi bruker brytningspunkter anbefalt av EUCAST Ikke alle sopp har fått brytningspunkter Vi har som mål å starte med buljongfortynning (gullstandard metode) på blodkulturisolater.
Amphotericin Fluconazole Voriconazole Caspofungin Anidulafungin Micafungin Itraconazole Posaconazole Flucytosin Isovuconazole
Serologi Aspergillus antistoff (presipiterende antistoff mot aspergillus) - Utføres ved klinisk mistanke om aspergillose og lungeaspergillose. Liten verdi hos pasienter med kraftig nedsatt immunforsvar. - Elektroforese. - Titrering ved positivt funn. Galaktomannan (utføres hos virus-avdelingen) - Immunsupprimerte, langvarig nøytropene pasienter. - Komponent i celleveggen hos Aspergillus. - Enzym immuno assey; EIA-teknikk som påviser Aspergillus galactomannan antigen i serum (spinalvæske og BAL).
Fritekst... fritekst... fritekst
Dimorfe sopp (immundiffusjon): Utføres ved mistanke om sykdom/eksposisjon for dimorfe sopp (Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis)
Kryptokokk-antigen Ø-hjelp Utføres på spinalvæske, serum og BAL Hurtigtest fra IMMY Rimelig, rask og enkel
Påvisning av sopp-dna Spesifikke PCR analyser til bruk direkte på prøvematerialet Aspergillus sp og Aspergillus fumigatus DNA - Utføres vanligvis parallelt - Sterilt materiale - BAL hos immunsupprimerte Mucorales DNA - Rhizomucor sp - Lichtheimia sp (Absidia) - Rhizopus sp Pneumocystis jirovecii DNA - semikvantitativ - Pneumosystis IF på moderat og sterkt positive
Påvisning av sopp-dna direkte på prøvematerialet - Ulike målgener som er felles for de fleste sopparter - ITS2 og D1D2 - Der sopp-dna påvises, utføres en sekvensering - Gensekvensene sammenlignes med tilsvarende sekvenser i internasjonale databaser for sopp. - Arbeidskrevende metode.
Takk for oppmerksomheten Mykologi.no