Spørsmål i tilknytning til bruk av CRISPR. Notat oktober 2016 Sidsel Børresen, biolog cand.real UiO CRISPR er en ny genteknologisk metode, kalt genredigering. Den ble lansert for bare 3-4 år siden. Metoden har gitt oss nye muligheter innenfor human medisin. Optimistiske forskere mener at vi snart kan helbrede genetiske sykdommer, men mest lovende er bruk av CRISPR innen kreftbehandling. CRISPR har også vært anvendt for å genredigere menneskelige embryoer, og det har ført til en heftig etisk debatt, ikke minst blant forskere. Er dette noe vi bør åpne for? I den sammenhengen vises det til at CRISPR også kan ha utilsiktede konsekvenser. Skeptikere peker på at metoden griper inn i svært kompliserte biologiske systemer, som vi bare delvis har kunnskaper om. Det er også aktuelt å bruke CRISPR innen matproduksjon for å gi planter og dyr ønskede egenskaper. CRISPR-tilhengere peker på at metoden kan gi oss gris som er immune mot sykdom, steril laks som ikke vil ødelegge villaksstammene våre ved rømming og kanskje jordbær som er motstandsdyktige mot soppangrep. Men faren for utilsiktede konsekvenser er like stor for planter og dyr som ved anvendelse på mennesker. For planter og dyr som skal settes ut i naturen kommer i tillegg spørsmål om hvordan de vil fungere i et økosystem. Går dette rett og slett for fort for seg? Er det på tide å minne om føre-varprinsippet? Forklaring av ord/begreper: GEN: Arveanlegg MUTASJON: Endring i arveanlegg (gener) GENOM: Samlebetegnelse på alle genene til en organisme. GMO: En organisme som har fått genene sine forandret ved bruk av genteknologi. GENREDIGERING: En ny og enklere måte til å forandre gener. CRISPR/ Cas9, eller bare CRISPR: Den mest brukte genredigeringsmetoden. I dette notatet brukes betegnelsen CRISPR. Cas9: Et enzym som brukes som «saks» til å klippe DNA-tråden ved genredigering CRISPR PÅ CELLE/ ORGANISME-NIVÅ Genet som blir forandret eller skrudd av med CRISPR har i utgangspunktet en naturlig funksjon, og står sannsynligvis i samspill med andre gener i cellen. Hvordan kan man vite hvilke konsekvenser genredigeringen vil få for samspillet mellom gener internt i en celle, som ofte er svært komplisert? Det fins eksempler på at små forandringer i DNA kan få store konsekvenser for cellens funksjoner. CRISPR er en presis metode på den måten at man kan bestemme hvilken basesekvens i genomet (altså hvilket område i DNAet) som skal endres. Men man vet ikke om det fins andre steder i genomet som har samme oppbygning (genetisk adresse) som det stedet man ønsker å endre. Hvis dette er tilfellet, vil disse sekvensene også forandres. Dette kalles «off-target-effekt», og er en anerkjent risiko ved CRISPR. Analogi: Et hus i Kirkegata 6, som er en presis adesse, skal rives. Men denne adressen fins i mange byer! Det kan være i Oslo, Bergen, Tønsberg eller Bodø. Uten mer informasjon vet man ikke hvilken by det dreier seg om, og alle husene med denne adressen i ulike byer rives. (Dankel i Morgenbladet aug. 16). I genredigeringen har man ikke mulighet til å bestemme i hvilken «by» huset skal rives. En
forandring et annet sted i genomet enn der man hadde planlagt kan ha helt andre konsekvenser enn det man ønsket å oppnå. Hvor stor er risikoen for at off-targeteffekter skal inntreffe? En off-target-effekt kan identifiseres ved at man sekvenserer (kartlegger) hele genomet. Dette er arbeidskrevende. Enklere, men svært upresist, kan off-targetmutasjoner identifiseres ved å se etter fenotypiske endringer, altså endringer i utseende eller funksjon hos den genredigerte organismen. Hvor stor er faren for at off-target-mutasjoner ikke vil bli oppdaget tidlig nok? Svineavl er et område som er kommet langt med å bruke CRISPR for å gjøre griser immune mot en virussykdom ved å slå ut et gen i grisens genom. I dette arbeidet har man fått resultater som kan tyde på at CRISPR likevel ikke er så presis som metode. Man treffer målstedet i genomet, men det som skjer der kan variere. Det ble registrert variasjon på mellom 7 og 300 basepar (minste byggesteiner i DNA) som var slått ut. Hvis man ikke engang kan forutsi on-target-effektene, hvordan kan man da hevde å forutsi off-target-effekter? Så langt er det ikke publisert noen studier der off-target-effekter er analysert i de aktuelle CRISPR-grisene. Noen forskere snakker begeistret om hvordan de kan sette mange CRISPRmutanter inn i samme organisme for å gi den flere gode egenskaper samtidig. Det stilles allerede spørsmål ved hva én CRISPR-mutant kan forårsake av utilsiktede konsekvenser for en celles eller organsimes funksjon. Hvordan kan man tenke at det blir forsvarlig å skulle håndtere flere sett av samspillseffekter samtidig? Hvor ble det av føre-var-prinsippet? CRISPR KONTRA NATURLIGE, SPONTANE MUTASJONER Er en CRISPR-mutant det samme som en naturlig mutasjon? CRISPR-forkjemperne hevder at en CRISPR-mutant kunne ha oppstått i naturen. Men det har den ikke gjort. Den er menneskestyrt og har oppstått gjennom avanserte og smarte inngrep i cellens genom. Det kan sammenliknes med hacking av cellens harddisk. Den induserte mutasjonen må først greie å bryte seg gjennom cellens forsvarsverk mot angrep på genomet, og deretter sette cellens systemer for reparasjon av DNA ut av funksjon. Etter selve genredigeringen må CRISPR-mutanten bearbeides med prosedyrer i laboratoriet. En spontan (naturlig) mutasjon har over lang tid etablert seg og funnet sin funksjon i cellens interne prosesser og sin rolle i naturen. Den er blitt «godtatt» av samspillet på alle nivåer. En genredigert mutasjon presses med alle midler fram så raskt som mulig. (Spørsmålet utdypes i de to neste punktene) En indusert (unaturlig) mutasjon må gjennom prosedyrer i laboratoriet før den kan anvendes i avl. Planter må blant annet dyrkes i vevskulturer. Disse prosedyrene er i stor grad de samme som man bruker til «de gamle GMOene», og de lager tilleggsmutasjoner i DNA. I dette er det altså ingen forskjell på de gamle GMOene og CRISPR-mutanter. Hvordan kan man da si at en genredigert mutasjon er det samme som en naturlig mutasjon? I konvensjonell avl hjelper man en vellykket variant fram til å bli en nyttig kulturorganisme. Den vellykkede varianten (som altså er en naturlig mutant) har oppstått spontant. Spontane mutasjoner oppstår ved teknisk feil under celledelinger, eller ved påvirkning fra det naturlige miljøet omkring organismen. I konvensjonell avl
har vi «tatt fatt» i naturlige vellykkede mutasjoner. Avlsarbeidet består i krysninger og diverse tilbakekrysninger. Tilbakekrysninger er nødvendig for å bli kvitt uønskede egenskaper som ofte følger med. I dette arbeidet følger vi et slags evolusjonens spill for å hjelpe fram ønskede egenskaper, og det tar tid. Ved bruk av CRISPR lager ingeniøren selv mutantene. Det går raskt å få på plass aktuelle gener, og han tror han er i mål og har vunnet spillet i første runde. Men da overser han at evolusjonen er et langsiktig og mangfoldig spill med kompliserte regler som han ikke har oversikt over. Det er langt fram før man kan se om noe var vellykket i praksis og over tid. For en naturlig mutasjon som framkommer gjennom konvensjonell avl er spillet i stor grad avklart «under veis». For en CRISPR-mutant er spillet så vidt påbegynt i det øyeblikket mutanten foreligger i laboratoriet. Hvordan kan det da være dekning for å si at en CRISPR-mutant er det samme som en naturlig mutant? Og er det egentlig sikkert at CRISPR-avl er så effektiv når hele regnestykket gjøres opp? Til nå har det i avlsarbeidet vært laget mutasjoner ved hjelp av stråling eller kjemikalier. Dette er også et menneskestyrt inngrep i det genetiske materialet som kan gi uforutsigbare resultater. Slike mutanter må undersøkes nøye i etterkant. Metoden er omdiskutert, men den reguleres ikke av genteknologiloven! Mange mener dette er minst like «farlig» som genredigering, og at genredigering derfor heller ikke bør reguleres av GTL. Legitimerer i så fall én farlig prosedyre innføring av andre potensielt risikofylte inngrep? CRISPR PÅ ØKOSYSTEM-NIVÅ Kan en CRISPR-indusert mutasjon spre seg til beslektede planter i et økosystem? Man vet at de GMOene vi til nå har hatt kan spre seg til beslektede arter ved såkalt genflyt. Det er ingen grunn til å tro at en genredigert organisme ikke kan gjøre det samme. En lite diskutert side ved bruk av genredigering er det omfanget spredning av CRISPR-mutanter kan få i naturen dersom genredigering ikke blir regulert under genteknologiloven. Genredigering er en enkel og billig metode. Det sies at en masterstudent kan utføre genredigering, og det som trengs av «råmateriale» kan kjøpes på nettet for 1100 kr! Spontane mutasjoner som etablerer seg i naturen er uhyre sjeldne. Det anslås at bare én av 10 millioner spontane mutasjoner er vellykkede. De GMOene vi til nå har sett er gjennom genteknologiloven underlagt vurdering med hensyn på risiko for spredning til ville arter (til tross for dette har spredning forekommet). Ved uregulert bruk av genredigering kan økosystemer bli bombardert med CRISPR-mutanter Hvordan tenker man seg å kontrollere økosystemiske effekter dersom anvendelse av genredigerte organismer ikke skal reguleres? Med en videreføring av CRISPR-teknologien er det mulig å få fram egenskaper i en populasjon enormt mye raskere enn før. Og man kan utrydde arter, f.eks en uønsket insektart. Metoden kalles kalles gendriver. Alle høyere organismer har to utgaver av hvert gen. Gendriver-metoden endrer begge cellens gener for en egenskap samtidig, mens vanlige mutasjoner bare endrer det ene. Resultatet er at de tilførte egenskapene får forkjørsrett i evolusjonsprosessen. Det er vurdert å bruke metoden til å utrydde mygg som sprer det fryktede Zika-viruset ved å gjøre alle individene til hanner. I løpet av 2-3 generasjoner mener man myggen innenfor
et område være utryddet. Dette er gjort i laboratorieforsøk, men det er omdiskutert. Mange forskere mener det representerer for stor risiko, og advarer sterkt mot å ta det bruk i naturen. Hva kan komme inn i stedet for myggen på dens «plass» i økosystemet? Hva vil skje med de viktige funksjonene myggarter har? Og hva om gendrivere sprer seg til beslektede arter i naturen? CRISPR i FÔR OG MAT Er det farlig å spise CRISPR-mat? Dette er forskningsmessig upløyd mark. Vi vet ikke engang om det farlig med dagens GMOer. Siden USA og alle andre store GMO-produsenter ikke har obligatorisk merking av mat, vet ikke folk hva de spiser, og man kan derfor ikke etablere noe årsak-virkningsforhold mellom GMO og eventuelle helseplager. Argumentet om at det lenge har vært anvendt i USA holder derfor ikke mål, rent vitenskapelig. Forskerne strides. Ønsker forbrukere CRISPR-mat? Undersøkelser som til nå er gjennomført tyder på at norske forbrukere stort sett er skeptiske til genmodifisert mat. REGULERING AV CRISPR I følge genteknologiloven er en GMO en organisme som er framstilt ved hjelp av genteknologi. Det er helt klart at en CRISPR-mutant er framstilt ved hjelp av genteknologi, og faller innenfor lovens virkeområde. Genteknologiloven er det eneste juridiske verktøyet vi har som omhandler genmodifisering. Uten regulering via denne loven er det derfor ikke mulig å få til regulering. Og en uregulert CRISPR-organisme vil være umulig å overvåke. Mulige økologiske konsekvenser av en uregulert anvendelse av CRISPR-metoden er omtalt i siste punkt under økosystemnivå ovenfor. ER DET MULIG Å KONTROLLERE CRISPR? Det hevdes at en genredigert organisme ikke kan identifiseres i kontroller dersom det ikke er tilført fremmed DNA. Enzymet Cas9, som klart er et fremmed element, vil raskt brytes ned i cellen. En genredigert organisme kan derfor vanskelig identifiseres med de metodene man i dag bruker på GMOer. Man kan tenke seg at ansvaret for å gjøre en CRISPR-mutant identifiserbar legges på produsenten som søker godkjenning. En CRISPR-mutant kan trolig detekteres med sekvensering (kartlegging) av organismens DNA dersom forandringen er relativt stor. Hvis forandringene er for små til å kunne detekteres med sekvensering, er det trolig mulig å sette inn en tag for detektering i tillegg til selve genredigeringen. Forskes det i det hele tatt for å finne fram til metoder som kan identifisere CRISPRmutanter? Hvem vil være interessert i slik forskning dersom regulerende myndigheter ikke stiller krav om det?