LISS/Coombs ID-Card Indirekte og direkte antiglobulin test Produkt Identifikasjon: 50531 Introduksjon Polyspesifikt antihuman globulin (AHG) reagens brukes i rutinen til deteksjon og identifisering av irregulære alloantistoffer, forlik og direkte antiglobulin test (DAT). Den viktigste funksjonen til det polyspesifikke AHG reagenset er å detektere tilstedeværelse av IgG antistoffer. Relevansen av antikomplement i AHG reagenset kan diskuteres, ettersom antistoffer som kan påvises kun på grunn av deres evne til å aktivere komplement, er heller sjeldne. Derimot er det viktig at man ved utførelse av direkte antiglobulin test (DAT) ved utredning av autoimmun hemolytisk anemi (AIHA) kan påvise forekomst av komplement ved hjelp av anti-c3d [4]. Positiv DAT er generelt et tegn på at erytrocyttene er dekket med immunglobuliner og/eller komplement in vivo. Mikrobrønnene i ID-Kortet LISS/Coombs inneholder polyspesifikt AHG som er egnet til antistoffscreening, antistoffidentifisering, forlik og DAT. Ved utførelse av indirekte antiglobulin test (IAT) er det ikke behov for å vaske prøven, ettersom prøvematerialet ikke kommer i kontakt med AHG under inkubasjonen. Dette på grunn av at cellesuspensjonen tilsettes i brønnene før plasma/serum og dermed skaper en barriere over gelen som hindrer nøytralisering av AHG med IgG proteiner fra plasma/serum. Det antihumanglobulinet IgG som anvendes i ID-Kortet LISS/Coombs er ikke spesifikt for heavy chains og kan derfor reagere med Kappa (k) og Lambda (I) light chains i IgA- og IgM-molekyler. ID-Kortet LISS/Coombs er egnet til DAT, forlik, antistoffscreening med ID- DiaCell og antistoffidentifisering med ID-DiaPanel.
2 Reagenser ID-Kortet LISS/Coombs med 6 mikrobrønner inneholder polyspesifikt AHG (kanin anti-igg og monoklonalt anti-c3d, cellelinje C139-9) tilsatt i gelblandingen. Konserveringsmiddel: < 0,1% NaN 3 Skal ikke oppbevares i nærheten av varme, air condition eller utløp fra ventilasjon. Holdbarhet: Se utløpsdato på etikett. Øvrige reagenser ID-Diluent 2: modifisert LISS til erytrocyttsuspensjon. ID-DiaCell, ID-DiaPanel: Testcellereagenser. (se aktuelt pakningsvedlegg). Øvrig materiale ID-Dispenser ID-Pipetor ID-Tips Rør til erytrocyttsuspensjoner ID-Working Table ID-Incubator 37 C ID-Centrifuge 6, 12 eller 24 Prøvemateriale For å oppnå best mulig resultater, skal det brukes ferske prøver, eller i samsvar med lokale laboratorieprosedyrer. Fortrinnsvis skal det brukes prøver med tilsatt antikoagulant; citrat, EDTA eller CPD-A. Fullblod uten antikoagulant kan også brukes. Ved bruk av serum i stedet for plasma skal prøven s s T a T D 1 2 E b T b t c O d U B o e I 1 2
3 0 sentrifugeres ved 1500 g i 10 minutter før bruk. Dette for å unngå fibrinrester, som kan påvirke reaksjonene. Tilberedning av blodprøver a) Erytrocyttsuspensjon til DAT eller autokontroll Tilbered en 0,8% erytrocyttsuspensjon i ID-Diluent 2 på følgende måte: Diluenten skal være romtemperert før bruk. 1. Tilsett 1,0 ml ID-Diluent 2 i et rent rør. 2. Tilsett 10 µl pakkede erytrocytter, bland forsiktig. Erytrocyttsuspensjonen kan benyttes umiddelbart. b) Erytrocyttsuspensjon til forlik prosedyrer Tilbered en 0,8% erytrocyttsuspensjon i ID-Diluent 2 som over. Om det benyttes fullblod direkte fra et segment av en blodpose, tilsettes 20 µl blod til 1,0 ml ID-Diluent 2. c) Plasma eller serum til indirekte antiglobulin test (IAT) prosedyrer Om testen ikke skal utføres umiddelbart, skal prøvene oppbevares ved 2-8 C i maksimalt 48 timer etter separasjon (se også under Prøvemateriale ), deretter ved -20 C eller i samsvar med lokale/nasjonale retningslinjer. Utførelse Benytt ikke ID-Kort som viser tegn til uttørring, har bobler, skadet folie eller om det finnes dråper av gel eller supernatant i øvre del av mikrobrønnene eller under folien. I. Direkte antiglobulin test (DAT) 1. Merk det antall mikrobrønner som behøves til testen i ID-Kortet LISS/ Coombs med pasientens eller blodgiverens navn eller nummer. 2. Ta av aluminiumsfolien fra så mange mikrobrønner som behøves, hold ID- Kortet i oppreist stilling.
4 3. Pipetter 50 µl av erytrocyttsuspensjonen til aktuell mikrobrønn. 4. Sentrifuger ID-Kortet 10 minutter i en ID-Centrifuge. 5. Les av og registrer resultatene. II. Antistoffscreening (IAT) Bruk testcelleragens ID-DiaCell. Testcellereagenser og prøvemateriale skal være romtemperert før bruk. 1. Merk det antall mikrobrønner som behøves til testen i ID-Kortet LISS/ Coombs med pasientens eller blodgiverens navn eller nummer. 2. Ta av aluminiumsfolien på så mange brønner som behøves, hold ID-Kortet i oppreist stilling. 3. Pipetter 50 µl av hver testcelle i mikrobrønnene (som er merket med tilsvarende testcelle) 4. Om det skal inkluderes en autokontroll, pipetteres 50 µl av prøvens erytrocyttsuspensjon til en mikrobrønn. 5. Tilsett 25 µl av pasientens eller blodgiverens plasma eller serum i hver mikrobrønn. 6. Inkuber ID-Kortet 15 minutter ved 37 C i ID-Incubator. 7. Sentrifuger ID-Kortet 10 minutter i ID-Centrifuge. 8. Les av og registrer resultatene. III. Antistoffidentifisering (IAT) Bruk testcelleragens ID-DiaPanel. Testcellereagens og prøvemateriale skal være romtemperert før bruk. 1. Merk to ID-Kort LISS/Coombs med pasientens eller blodgiverens navn eller nummer. 2. Ta av aluminiumsfolien på så mange brønner som behøves, hold ID-Kortet i oppreist stilling. 3. Pipetter 50 µl av hver testcelle ID-DiaPanel i mikrobrønnene (merket 1-11) 4 5 6 7 8 I 1 2 3 4 5 6 7 8 T A P N
5 0 4. Pipetter 50 µl av prøvens erytrocyttsuspensjon til den 12. mikrobrønnen (autokontroll). 5. Tilsett 25 µl av pasientens eller blodgiverens plasma eller serum til alle de 12 mikrobrønnene. 6. Inkuber ID-Kortet 15 minutter ved 37 C i ID-Incubator. 7. Sentrifuger ID-Kortet 10 minutter i ID-Centrifuge. 8. Les av og registrer resultatene. IV. Forlik 1. Merk det antall mikrobrønner som behøves til testen i ID-Kort LISS/ Coombs med pasientens eller blodgiverens navn eller nummer. 2. Ta av aluminiumsfolien på så mange brønner som behøves, hold ID-Kortet i oppreist stilling. 3. Pipetter 50 µl av blodgiverens erytrocyttsuspensjon til aktuelle mikrobrønner. 4. For autokontroll pipetteres 50 µl av pasientens egen erytrocyttsuspensjon i en mikrobrønn. 5. Tilsett 25 µl av pasientens plasma eller serum til hver mikrobrønn. 6. Inkuber ID-Kortet 15 minutter ved 37 C i ID-Incubator. 7. Sentrifuger ID-Kortet 10 minutter i ID-Centrifuge. 8. Les av og registrer resultatene. Tolkning av resultate.ne A) Tolkningskriterier Positiv: Agglutinerte celler danner en rød linje i det øverste gelsjiktet, eller agglutinatene er spredt i gelen. Negativ: Alle cellene ligger samlet i bunnen av mikrorøret.
6 B) Reaksjoner for: I. Direkte antiglobulin test (DAT) En negativ reaksjon indikerer fravær av detekterbare IgG-antistoffer eller C3d-komplement komponenter på erytrocyttene. En positiv reaksjon (± til ++++) indikerer at erytrocyttene er sensibilisert (dekket med IgG-antistoffer og/eller C3d). II. Antistoffscreening En negativ reaksjon indikerer fravær av detekterbare irregulære antistoffer i pasientens eller blodgiverens serum eller plasma. En positiv reaksjon indikerer tilstedeværelse av irregulære antistoffer. Noter de oppnådde resultatene i antigrammet som medfølger testcellene. Kontroller at lotnummeret på testcellereagensene ID-DiaCell I-II eller ID- DiaCell I-II-III stemmer overens med lotnummeret på antigrammet. Ved å sammenligne resultatene med antigenkonfigurasjonen på testcellene, kan man få en indikasjon på hvilket antistoff det dreier seg om. Utfør antistoffidentifisering etter gjeldende rutiner. Positiv reaksjon med en eller flere testceller og negativ autokontroll tyder på nærvær av irregulære antistoffer (se Anmerkninger ). Positiv reaksjon med samtlige testceller og positiv autokontroll kan skyldes uspesifikke reaksjoner. Om man oppnår positiv reaksjon med samtlige testceller samt positiv autokontroll, men der en eller flere testceller viser en sterkere positiv reaksjon enn autokontrollen, skal pasientens prøve testes ytterligere for å undersøke muligheten for underliggende alloantistoffer. III. Antistoffidentifisering En positiv reaksjon indikerer tilstedeværelse av irregulære antistoffer. Noter de oppnådde resultatene i antigrammet. Kontroller at lotnummeret på testcellereagenset ID-DiaPanel stemmer overens med lotnummeret på antigrammet. I A S o m F a
7 0 Ved å sammenligne resultatene med antigenkonfigurasjonen på testcellene, kan man i de fleste tilfeller identifisere hvilket antistoff det dreier seg om (autokontrollen må være negativ). En positiv reaksjon med samtlige ID-DiaPanel testceller og negativ autokontroll kan tyde på uspesifikke reaksjoner eller alloantistoffer rettet mot et høyfrekvent antigen. En positiv reaksjon med samtlige ID-DiaPanel testceller og positiv autokontroll kan tyde på uspesifikke reaksjoner. En positiv reaksjon med samtlige ID-DiaPanel testceller og autokontrollen, men der en eller flere testceller viser en sterkere positiv reaksjon enn autokontrollen, kan tyde på underliggende alloantistoffer og prøven skal undersøkes ytterligere. IV. Forlik En negativ reaksjon indikerer at blodet fra blodgiveren er forlikelig med mottakeren. En positiv reaksjon indikerer at blodet fra blodgiveren er uforlikelig med mottakeren pga tilstedeværelse av erytrocyttantistoffer mot antigener på blodgiverens erytrocytter. Ytterligere tester bør utføres for å identifisere antistoffet sin spesifisitet. Anmerkninger Som for alle metoder som følger GLP-regler, skal sensitiviteten for overnevnte prosedyrer valideres ved bruk av kjente antistoffer. Bio-Rad`s Anti-D Reference Reagent er produsert for regelmessig kontroll av alle metoder for antistoffdeteksjon (se aktuelt pakningsvedlegg). Feilkilder a) ID-Kort med luftbobler eller geldråper i øvre del av mikrobrønnene og/eller under folien, må sentrifugeres før bruk.
8 b) Noen medikamenter kan forårsake positive reaksjoner i antihuman globulin tester. c) Noen patologiske tilstander kan forårsake positive reaksjoner i antihuman globulin tester. d) Celler med aktivert T-antigen enten in vivo eller in vitro, kan reagere med alle humane sera. Ved mistanke om slike reaksjoner, skal ytterligere undersøkelser utføres. e) Bakteriell eller annen kontaminering av anvendt materiale kan forårsake falske positive eller falske negative reaksjoner. f) Fibrinrester i erytrocyttsuspensjonen eller plasmaet/serumet kan fange opp ikke-agglutinerte erytrocytter i toppen av gelen. Dette ses som en rosa linje i toppen av gelen mens de fleste cellene ligger i bunnen av mikrorøret etter sentrifugering. g) Det er viktig å følge anbefalt metodeanvisning. Utstyret skal kontrolleres regelmessig i følge GLP-prosedyrer. h) Bruk av annen suspensjonsløsning enn ID-Diluent 2 kan forårsake avvikende resultater. i) Bruk av andre testcellereagenser enn ID-DiaCell eller ID-DiaPanel kan forårsake avvikende resultater. j) For sterk eller for svak erytrocyttsuspensjon kan forårsake avvikende reaksjoner. N P I P o e Referanser 1. Coombs, R.R.A., Mourant, A.E. and Race, R.R.: Lancet 1945; 2:15 2. Coombs, R.R.A., Mourant, A.E. and Race, R.R.: Brit. J. Exp. Path 1945; 26:255. 3. Lapierre, Y., Rigal, D., Adam, J. et al.; The gel test; A new way to detect red cell antigen-antibody reactions. Transfusion 1990; 30: 109-113. 4. Technical Manual; R.H. Walker (ed.); 11 th ed. 1993; American Association of Blood Banks.
9 0 Produkt ID-Kort LISS/Coombs 4 x 12..... REF 004014 24 x 12..... REF 004017 60 x 12..... REF 004016 112 x 12..... REF 004015 Produsenten garanterer at disse produktene fungerer i følge beskrivelse på etikett og pakningsvedlegg. Produsenten sier fra seg alt ansvar om produktene selges eller brukes på annen måte enn det som er beskrevet her. Bio-Rad GmbH 1785 Cressier FR Switzerland 0123