1 HPLC. Hvorfor separeres komplekse blandinger? Man er interessert i å analysere noen få stoffer i blandingen. Prøveinnføring: i løsning Temperatur: Rom temp. (evt opp til 60 C) Trykk: 30 300 bar Væskehastighet: 1-2 ml/min (analytisk) Minste detekterbare mengde: 1 pg 1 µg Maksimal prøvepåsetning: µg, mg, g (avhengig av kolonne.) Deteksjon: UV, fluorescens, brytningsindeks, elektrokjemisk. Separasjonsprinsipp: Adsorpsjon, normalfase, omvent fase, ionebytting, ionpar, gelfiltrering. I omvent fase kromatografi. Stasjonærfasen ikke polar eller svakt polar. Mobilfasen er polar. Løsningsmidler er metanol, acetonitril eller tetrahydrofuran. Disse kan blandes med vann, en vandig buffer eller med hverandre. I normalfase kromatografi Stasjonærfasen polar. Mobilfasen er mindre polar enn stasjonærfasen. Elueringsstyrken øker når løsningsmiddelet blir mindre polart i omvent fase kromatografi. Elueringsstyrken øker når løsningsmiddelet blir mer polart i normalfase kromatografi.
2 SCF. En superkritisk væske er en substans over dets kritiske temperatur og kritiske trykk. SCF Økt hastighet og oppløsing relativt til HPLC p.g.a. økt diffusjonshastighet. Kan benyttes til å analysere ikke-flyktig forbindelser (som ikke ville kunne analyseres med GC). Kan bruke detektorer utviklet for GC (f. eks. FID) og for HPLC (f. eks. UV). Kolonnen er en kapillærkolonne, utstyret ellers er som til HPLC. I superkritisk fluid kromatografi økes elueringsstyrken ved å øke tettheten av løsningsmiddelet (ved å øke trykket). Når trykket øker, øker løseligheten av analytter.
3 Den kromatografiske prosessen. Pakkede kolonner. Kolonner Kolonnene lages av rustfritt kromstål. I hver ende er det metallfiltre som holder pakkematerialet på plass. Disse har porestørrelse som er halvparten av pakkematerialets diameter. For å unngå at urenheter i prøven forurenser kolonnen er det vanlig å bruke en forkolonne før analysekolonnen Vanlig analytisk kolonne Indre diameter 2-5 mm 4,6 mm Vanlig platetall for 10 cm kolonne 5 µm 8000, 3 µm 13000 Minste kolonnedimensjoner 3 cm lange med 3 µm partikler. Mest vanlig 10 25 cm med 5 µm partikler. Effektiviteten av en pakket kolonne øker når størrelsen på partiklene i stasjonærfasen avtar. Små partikler gi bedre oppløsning fordi de gir mer uniform hastighet av mobilfasen gjennom kolonnen. A leddet i van Deemter likningen reduseres. Tiden et løst stoff bruker på å komme i likevekt mellom stasjonærfasen og mobilfasen er kortere dersom tykkelsen av begge faser er mindre. H = A + B/u x + C u x Men med liten partikkelstørrelse øker motstanden mot gjennomstrømning av løsningsmiddel. Høyoppløselig analytiske kolonner krever trykk i området 7-40
4 MPa (70-400 bar) dersom man ønsker mobilfasehastighet i området 0,5-5 ml/min. Ren silika kan benyttes som stasjonærfase i adsorpsjonskromatografi. Mer vanlig er det imidlertid at væske-væske fordelingskromatografi utføres på en bundet stasjonærfase kovalent festet til silika. Den vanligste metode til å binde en stasjonærfase kovalent til en bæresubstans er å benytte klorerte silaner. Ved å reagere silika med et alkylklorsilan vil det avhengig av substitusjonsgraden på silanet og vann i løsningsmiddelet dannes monomere og polymere overflatelag. Med vannfrie løsninger dannes monomere. Dersom en løsning av diklorsilaner inneholder små vannmengder finner det sted en polymerisasjon i sideretning i tillegg til substitusjon. Avhengig av silanets substituenter kan man lage kolonnematerialer med forskjellig polaritet og forskjellige egenskaper. Disse anvendes hovedsakelig til omvendt fase kromatografi, men noen brukes til ionebytterkromatografi, noen til adsorpsjonskromatografi, noen til eksklusjonskromatografi og andre til spesielle anvendelser som f. eks. kirale kolonner. CH 3 CH 3 Si OH + Cl Si R Si O Si R CH 3 CH 3 Si Si OH OH + Cl 2 SiR 2 Si Si O O SiR 2 Vanlige polare faser R=(CH 2 ) 3 NH 2 amino R=(CH 2 ) 3 C N cyano R=(CH 2 ) 2 OCH 2 CH(OH)CH 2 OH diol Vanlige ikke-polare faser R=(CH 2 ) 17 CH 3 oktadekyl R=(CH 2 ) 7 CH 3 oktyl R=(CH 2 ) 3 C 6 H 5 fenyl I omvent fase kromatografi er C 18 mest brukt som stasjonærfase. Som mobilfase benyttes vann og en organisk komponent som er fullstendig blandbar med vann, f. eks. metanol, acetonitril eller tetrahydrofuran. Vanlig løsning er vanligvis en buffer med definer ph
5 Retensjonsmekanismer Viktigste interaksjon mellom stoff og stasjonær fase: van der Waals krefter d.v.s relativt svake krefter som øker med molekylstørrelsen Polare interaksjoner normalt liten betydning, unntak er syrer og baser. I en blanding av stoff vil de minst hydrofobe stoffene eluerer ut først I en blanding av homologer vil økende hydrofob kjedelengde gi økende retensjon. Umettede forbindelser gir vanligvis mindre retensjon enn mettede forbindelser. Ioniserbare stoffers retensjon er avhengig av om disse er ionisert eller ikke. Retensjonen av et stoff påvirkes av Mobilfasens sammensetning Økende innhold av organisk modifikator gir mindre retensjon ph. Syrer blir minst retardert ved høy ph Baser blir minst retardert ved lav ph Tilsetning av salter. Salter kan minske løseligheten i mobilfase. Ionepardannerer øker stoffets lipofile karakter. Tilsetningsstoffer som absorberes til kolonnen (f. eks. aminer) gir mindre retensjon, bedre symmetri og mindre båndspredning ved analyse av baser. Stasjonær fase Omvent fase materialer med lange hydrokarbonkjeder som C18 gir større retensjon enn materialer med kortere hydrokarbonkjeder. Materialer med polare overflategrupper gi mindre retensjon Forskjellige typer C18 materialer kan gi forskjellig retensjon. Temperatur Økende temperatur gir mindre retensjon Vanlig å jobbe ved romtemperatur.
6 Mobilfasen. Partikkelfri o Filtrering 0,2 0,5 µm filter. Fri for luft o Degassing, ultralys, vakuum, gjennombobling med helium. Transparent med hensyn på detektoren Ren, HPLC kvalitet. Lav viskositet gir lavt trykk og høy effektivitet. Lav toksitet Lite brennbar Ikke reaktiv ph i mobilfasen. Silika løses i vann ved ph over 8 og bør ikke brukes over denne ph. Spesielle typer silika er stabile opptil ph 9 eller 10. I ph området 8-12 benyttes polymert materiale som polystyren. Det er ca 4 µmol R grupper per kvadratmeter støttemateriale og veldig liten blødning fra kolonnen under kromatografering. Polystyren er mindre mekanisk stabil enn silikamaterialer. Gi normal ikke like høy effektivitet som silikamaterialer. Siloksan, Si-O-SiR, bindingen hydrolyserer under ph 2 HPLC med en bundet stasjonærfase på silika som bæremateriale generelt er begrenset til ph området 2-8. Dersom voluminøse isobutylgrupper er bundet til silisiumatomene i den bundne fase er det vanskeligere for H 3 O + å angripe Si-O-Si bindingen. En
7 stasjonærfasen med isobutylgrupper bundet til silisiumatomene vil være stabil for en lengre periode ved lave ph verdier selv ved høy temperatur. (f. eks. ph 0,9 ved 90 C) Asymmetriske topper. Asymmetrifaktoren, A/B, bør ikke være utenfor området 0,9-1,5. Haledannelse med aminer kan elimineres ved at man tilsetter 30 mm trietylamin til mobilfasen. Den høye konsentrasjonen av tilsetningsstoff bindes til aktive seter på silika som ellers ville bundet analytten. Haledannelse av sure forbindelser kan elimineres ved å tilsette 30 mm ammoniumacetat. For ukjente blandinger er 30 mm trietylammoniumacetat brukbar. Dersom man fremdeles har haledannelse kan 10 mm dimetyloktylamin eller dimetyloktylammonium acetat være brukbare. Et problem med tilsetningsstoffer er at de øker tiden nødvendig for å oppnå likevekt når man forandrer løsningsmiddel. Kolonnen bør periodevis vaskes for å hindre at sterkt absorberende stoffer bygges opp og kolonnens yteevne reduseres. Haledannelse kan skje dersom metallfilteret ved inngangen til kolonnen tettes med forurensninger fra mange prøver. Man kan da erstatte metallfilteret eller tilbakespyle (=back flushing) kolonnen med et sterk løsningsmiddelet over i et begerglass. Avsetninger fra metallfilteret må ikke vaskes inn i stasjonærfasen. Overloading kan forårsake fronting. Dette kan korrigeres ved å injisere et mindre prøvevolum Elueringssprosessen Isokratisk eluering: et løsningsmiddel. Gradient eluering: kontinuering forandring av løsningsmiddelets sammensetning.
8 Valg av separasjonsmetode. Oppgave 25-10. Bruk figur 25-12 og forslå hvilken type kromatografi du ville bruke for å separere forbindelser i hver av følgende kategorier. (a) MW < 2000, løselig i oktan (b) MW < 2000, løselig i dioksan (c) MW < 2000, ionisk (d) MW > 2000, løselig i vann, ikke ionisk, størrelse 50 nm (e) MW > 2000, løselig i vann, ionisk (f) MW > 2000, løselig i tetrahydrofuran, størrelse 50 nm (a) Bundet omvendt fase kromatografi, C18, C9, C4, C2, C1, fenyl, cyano. (b) Bundet normalfase kromatografi. (Dioksan har elueringsstyrke som ligger nærmere etylacetat enn kloroform se tabell) (c ) ionebytterkromatografi eller ionekromatografi. (d) Gelfiltrering. (e) Ionebytterkromatografi. (f) gelfiltrering.
9 Pumper og injeksjonsventiler. Høytrykks stempelpumpe for HPLC. Injeksjonsventil for HPLC. Injeksjonsloopen kan skiftes med en annen injeksjonsloop med en annen størrelse.
10 Spektrofotometriske detektorer. UV-detektor Analyttene må absorberer i UV-området og siden mange stoffer absorberer her er UV detektoren er meget anvendbar. Man velger en optimal bølgelengde i UVområdet eller i det synlige området. UV-detektorer kan benyttes med gradient eluering. Med en fotodiodearray tar man opp hele spekteret av analytten når den elueres. Fluorescensdetektor. Disse detektorene er meget sensitive. Men det er få analytter som fluorescerer. For å øke anvendbarheten av en fluorescensdetektor kan analyttene derivatiseres før man utfører kromatografi (pre-kolonne derivatisering), eller man kan tilsette reagens etter kolonnen, men før detektorene (post-kolonnne derivatisering)
11 Brytningsindeksdetektor universell deteksjonsgrensen bestemmes av forskjell i brytningsindeks mellom mobilfase og analytt kan benyttes når analyttene ikke absorberer UV-lys (sukker, alkoholer, fettsyrer, estere, aminosyrer) eller sammen med et løsningsmiddel som absorberer UV-lys (f. eks toluen) sensitiv for temperaturforandringer sensitivt til trykkforandringer kan ikke benyttes ved gradient eluering (husk at referansecellen alltid må inneholde det samme som prøvecellen med unntak av analytt.) Lysspredningsdetektor. gir respons for analytter som er signifikant mindre flyktige enn mobilfasen Virkemåte Kolonnen er forbundet med en forstøver. Eluatet fra kolonne I forstøveren blandes eluatet med N 2 (g) og det dannes en aerosol. Løsningsmiddelet fordamper fra dråpene i et oppvarmet rør. o Jo mindre mobilfasehastighet jo mindre gass og varme er nødvendig for forstøving og fordamping. o Lav gasshastighet gir større dråper og kan gi større sensitivitet da man får mer spredning. Det tar imidlertid lengre tid å fordampe
12 løsningsmiddel når dråpene er for stor. Ikke fordampet mobilfase vil øke bakgrunnsstøyen. Optimal gasshastighet må justeres. Eluatet fra kolonnen går så inn i lysspredningscellen. Her vil partikler i prøven spre laserlyset. Spedt lys detekteres av en diode 90º på laserlyset. Det dannes et signal som gir et analogt output. Dersom en buffer benyttes i eluenten må den lett kunne fordampe. Kalibreringskurven er ikke lineær og må tilpasses med et polynom. Elektrokjemisk detektor Gir respons for analytter som kan oksideres eller reduseres. Detektoren er basert på måling av strøm som er et resultat av oksidasjon/reduksjon av analytter på en passende elektrode. Da strømnivået er direkte proporsjonalt med analytt konsentrasjonen kan detektoren benyttes i kvantitative målinger.
13 Metodeutvikling. En separasjonsprosedyre bør være robust. Den bør ikke bør ikke påvirkes vesentlig av gradvis forringelse av kolonnen små variasjoner i sammensetning av løsningsmiddelet ph temperatur bruk av forskjellige batcher av samme stasjonærfase (fra forskjellige produsenter) Retensjonsfaktoren, k, er et mål på retensjonstiden, t r, i enheter av mobilfasens retensjonstid, t m. Ved separasjon som regnes som god nok er retensjonsfaktoren i området 0,5-20. Dersom k er for liten vil den første toppen påvirkes av løsningsmiddelfronten. I figur 25-10 ses små positive og negative utslag etter 3-4 min. Disse signalene skyldes forandringer i mobilfasens brytningsindeks forårsaket av løsningsmiddelet prøven var løst i. Disse forandringene forstyrrer UV-signalet ved tiden t m. Dersom en topp elueres nær t m kan toppens utseende påvirkes av løsningsmiddelfronten. Dersom retensjonsfaktoren er for stor vil kromatograferingen ta for lang tid. 25-29 (a) Når du forsøker å separere en ukjent blanding ved omventfase kromatografi med 50 % acetonitril/50 % vann er toppene tett sammen og eluert i området k' = 2-6. Bør du benytte en høyere eller lavere konsentrasjon av acetonitril i neste forsøk? (b) Når du forsøker å separere en ukjent blanding ved normalfase kromatografi og 50 % heksan/50 % metyl t-butyleter er toppene tett sammen og i området k' = 2-6. Bør du benytte en høyere eller lavere konsentrasjon av heksan i neste forsøk? (a) Et lavere innhold av acetonitril øker retensjonstiden og vil sannsynligvis øke oppløsningsevnen. (b) I normalfase kromatografi vil løsningsmiddelstyrken øke når løsningsmiddelet blir mer polart, hvilket korresponderer til økt konsentrasjon av metyl t- butyleter. Vi trenger en høyere konsentrasjon av heksan for å senke løsningsmiddelstyrken, øke retensjonstiden og sannsynligvis øke oppløsningen.
14 I fig 25.10 ses t m som et negativt utslag på basislinjen. Dersom man ikke har et slik utslag kan t m estimeres: t m Ld 2 c 2F L er lengden av kolonne (cm) d c er kolonnes diameter (cm) F mobilfasehastigheten (ml/min). O NH NH O I omventfase kan t m kan estimeres ved å la urasil som ikke retarderes gå gjennom kolonnen. Urasil detekteres ved 260 nm. t m kan også estimeres ved å la NaNO 3 som ikke retarderes gå gjennom kolonnen. NaNO 3 detekteres ved 210 nm. For kvantisering må oppløsningsevnen være minst 1,5 mellom de to nærmeste toppene. I en robust metode er oppløsningsevnen 2,0 eller bedre. Oppløsningsevnen vil da fremdeles være bra ved små forandringer i betingelsene eller en langsom kvalitetsforringelse av kolonnen som fører til dårligere oppløsningsevne. Et annet kriterium for en god kromatografisk metode er å ikke gå over det øverste trykket i instrumentets "hardware". Ved å holde trykket under 15 MPa (150 bar) forlenges levetiden for pumpe, ventiler, pakninger og autosampler. Trykket kan øke med en faktor 2 under kolonnens levetid på grunn av avleiringer. Dersom man benytter et trykk på < 15 MPa ved metodeutvikling tillater man at kolonnen forringes pga avleiringer. Alle topper (spesielt alle topper som man skal måle på) bør være symmetriske med en asymmetrifaktor A/B i området 0,9-1,5. Asymmetriske topper bør korrigeres når man optimaliserer en separasjon. Den raskeste måten å få en oversikt over en ny blanding er å avgjøre som man skal benytte isokratisk eller gradient eluering er å benytte en bred gradient som vist i figur 25-28a. Figuren viser hvordan prøveblandingen fra 25-10 separeres ved en lineær gradient fra 10 til 90 % acetonitril i løpet av 40 min. Gradienttiden, t g, er tiden der sammensetningen av løsningsmiddelet forandres. La t være forskjellen mellom retensjonstiden for første og siste topp i kromatogrammet. I figur 25-
15 28a er t = 35,5-14,0 = 21,5 min. Dette kriteriet benyttes for å bestemme om man skal benytte gradient eller ikke. Bruk gradient dersom t/t g > 0,25. Bruk isokratisk eluering dersom t/t g < 0,25. Dersom alle toppene elueres over et smalt område kan isokratisk benyttes. Dersom et bredt løsningsmiddelområde kreves er gradient eluering mer praktisk. Dersom isokratisk eluering er indikert fordi t/t g < 0,25 vil et godt utgangspunkt være sammensetning midt i intervallet t. Dersom først topp elueres etter 10 minutter og siste topp etter 20 min vil en brukbart isokratisk løsningsmiddel ha den sammensetningen gradienten har etter 15 minutter. 25-25 En blanding av 14 komponenter ble separert ved omventfase med en gradient fra 5 til 100 % acetonitril i løpet av 60 minutter. Prøven ble injisert ved t D = dwell time. Alle toppene ble eluert mellom 22 og 41 min. a. Er det best å benytte isokratisk eller gradient eluering for denne blandingen? b. Dersom neste run er en gradient, velg start og sluttverdier for % acetonitril og gradient tid. a. t/t g = 19/60 = 0,32. Siden t/t g > 0,25 foreslås gradient eluering. b. Ved t = 22 min kan sammensetningen av løsningsmiddel som går inn i kolonnen beregnes ved lineær ekstrapolering. 5 + (22/60)(100-5) = 39,8%. En fornuftig gradient for det andre eksperimentet er fra 40 % til 5 + (41/60)(100-5) = 70 % acetonitril i løpet av 60 minutter. Kombinasjoner av acetonitril, metanol og tetrahydrofuran med vann eller en vandig buffer gir et tilstrekkelig område av dipolare og hydrogenbindingsinteraksjoner med løste stoff for å separere en stort antall forbindelser med omvent fase kromatografi. CH 3 CN og H 2 O. CH 3 CN har lav viskositet og tillater bruk av relativt lavt trykk. Man kan benytte UV deteksjon ned til 190 nm. Ved denne bølgelengden har mange potensielle analytter en viss absorbans. CH 3 OH og H 2 O. CH 3 OH har høyere viskositet og høyere UV-cutoff. 205 nm.
16 Tetrahydrofuran og H 2 O kan benyttes i et mindre UV område, 212 nm. degraderes ved oksidasjon. det tar lengre tid før likevekt med stasjonærfasen oppnås. Initiale eksperiment gjøres med høy konsentrasjon av organisk løsningsmiddel for å forsikre seg om at alle analytter elueres. Mengde av organisk løsningsmiddel senkes deretter suksessivt for å separere alle komponentene. Dersom alle toppene kan separeres med 20 k 0,5 er isokratisk separasjon vellykket. Nomografen i fig 25-25 viser sammensetninger av organisk løsningsmiddel og vann med omtrent samme løsningsmiddelstyrke. En publisert prosedyre for omventfase separasjon av en spesiell reaksjonsblanding benyttes 48 % metanol/52 % vann. Du ønsker å forandre prosedyren for benytte acetonitril og vann. Hvor stor prosent acetonitril vil du da først prøve ut? I nomografen i figur 25-25 vil en vertikal linje ved 48% metanol skjære acetonitril ved 38%. Isokratisk separasjon for omvendt fase kromatografi ved bruk av to eller tre organiske løsningsmidler. (figur 25-23 og 25-24). 1. Optimaliser først med acetonitril og buffer. Optimale betingelser gir kromatogram A. 2. Optimaliser med metanol og buffer. Optimale betingelser gir kromatogram B. 3. Optimaliser med tetrahydrofuran og buffer. Optimale betingelser gir kromatogram C. 4. Bland løsningsmiddel benyttet i A og B og C. Et par omgangen i 1:1 forhold for å generere kromatogrammene D, E og F. 5. Konstruer en 1:1:1 blanding av løsningsmiddel D, E og F for å generere kromatogram G. Dersom noen av resultatene A til G er nesten gode nok. Velg de to beste punktene og bland disse slik at punkter mellom de to fås Oppgave 25-27. Anta at i figur 25-24 er den optimale konsentrasjon av løsningsmidler ved punktene A, B og C h. h. v. 50 % acetonitril, 60% metanol og 40 % tetrahydrofuran. Hva er sammensetning av løsningsmidlene ved punktene D, E, F og G? D: 25 % acetonitril/30 % metanol/45 % buffer E: 25 % acetonitril/20 % tetrahydrofuran/55 % buffer
17 F: 30 % metanol/20 %tetrahydrofuran/50 % buffer G: 16,7 % acetonitril/20% metanol/13,3 % tetrahydrofuran/50 % buffer. Figur 25-26 viser generell trinn i utvikling av en isokratisk separasjon for omvent fase kromatografi ved bruk av et organisk løsningsmiddel og temperaturen som variable. Ved høye temperaturer bør ph være under 6 slik at stasjonærfasen av silika ikke går i oppløsning. Høyt %B Lav T Lav %B Lav T Høyt %B Høy T Lav %B Høy T Ved å forandre kolonnetemperaturen kan den relative retensjon til forskjellige komponenter i blandingen forandres. Temperaturen har spesielt innflytelse på ioniske forbindelser, f. eks. ammoniumkationer og karboksylat anioner, og forbindelser med flere polare substituenter. Etter optimalisering av en isokratisk eluering med flere løsningsmidler er oppløsningsevnen for systemet 1,2 mellom de to nærmeste toppene. Hvordan kan du forbedre oppløsningsevnen uten å forandre løsningsmidler? Se 631 i margen senke mobilfasehastigheten øke kolonnelengden benytte mindre partikler i kolonnen (a) Ikke-polare aromatiske forbindelser ble separert på HPLC på en oktadekyl (C18) bundet fase. Eluenten var 65 vol% metanol i vann. Hvordan vil retensjonstiden påvirkes dersom man i stedet benyttet 90% metanol? (b) Oktansyre og 1-aminooktan gikk gjennom kolonnen beskrevet i (a) og eluenten var 20 % metanol/80 % buffer (ph = 3,0). Hvilken av forbindelsen forventer du at elueres først og hvorfor? (a) Da ikke-polare forbindelser blir mer løselige i mobilfasen vil retensjonstiden bli kortere i 90% metanol. (b) Ved ph = 3 vil de dominerende formene være nøytralt RCO 2 H og kationet RNH 3 +. Aminet vil elueres først siden kationet RNH 3 + er uløselige i den ikkepolare stasjonærfasen.