Chlamydia pneumoniaeiggselisa medac Norsk 0123 430TMBVPN/010708
FABRIKANT medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbh Fehlandtstraße 3 D20354 Hamburg DISTRIBUSJON medac Gesellschaft für klinische Spezialpräparate mbh Geschäftseinheit Diagnostika Theaterstraße 6 D22880 Wedel Telefon: ++49/ 4103 / 8006 348 Fax: ++49/ 4103 / 8006 359 TINGE ADDRESS Telefon: ++49/ 4103 / 8006 111 Fax: ++49/ 4103 / 8006 113 430TMBVPN/010708
Chlamydia pneumoniaeiggselisa medac Enzyme immunoassay for påvisning av IgG antistoff mot Chlamydia pneumoniae Cat. no.: 430TMB KUN FOR IN VITRO DIAGNOSTISK BRUK INTRODUKSJON Chlamydia er gramnegative bakterier De har en intracellulær livssyklusen i den mucosale overflate, endothelial celler, smooth muscle celler, og i følge nyere oppdagelser i visse vevs strukturer i det sentrale nerve system. Chlamydia er avhengig av energi rike fosfater i sine verts celler og er derfor energi parasitter. Slekten chlamydia omfatter fire arter: C. pneumoniae, C. trachomatis, C. psittaci, og C. pecorum. C. pneumoniae og C. trachomatis er humane patogener. C. psittaci er patogene for mennesker og en del dyre arter. Opptil nå har, C. pecorum bare blitt isolert fra dyr. Infeksjoner med C. pneumoniae forkommer over hele verden. Sykdomsspekteret, i tillegg til influensa lignende sykdom, omfatter også sinusitt, pharyngitt, bronkitt, kronisk obstruktive lunge sykdommer, pneumonia, og reaktiv artritt. Årsakssammenheng mellom C. pneumoniae ved infeksiøs astma, sarcoidosis, lungekreft, atherosclerose, akutt myocardialt infarkt, hjerne slag, multiple sklerose, og sen inntreden av Alzheimer s sykdom er områder som gjenstår å undersøke. I følge Grayston og Saikku (1989), som først beskrev denne Chlamydia arten, blir nesten alle infisert og reinfisert med C. pneumoniae gjennom hele livet. De hovedsakelig svake og/eller diffuse symptomene som C. pneumoniae infeksjoner forårsaker gjør den vanskelig å påvise; ikke påviste infeksjoner kan lede til, kroniske tilstander av sykdommer med alvorlige følger. Diagnosen av C. pneumoniae infeksjoner er basert på isolasjon av organismen fra cellekultur, direkte antigen påvisning, nuklein syre amplifikasjons tester og serologi. Isolasjon av organismen fra 430TMBVPN/010708 1
cellekultur trenger normalt flere påfølgende steg; det er tidkrevende, begrenset bare til spesial laboratorier, og bare noen få tilfeller lykkes. Direkte immunofluorescence tester (IFA) og antigen enzymimmunoassays (EIA) er ikke tatt bredt i bruk; de har blitt rapportert til å ha lav sensitivitet og spesifisitet. For påvisning av arts spesifikt antistoff har mikroimmunofluorescence (MIF) blitt ansett som gull standard MIF er arbeidskrevende, subjektiv, og krever mye erfaring. Testsystemet er ikke standardisert og bruk av forskjellige antigener og cut off grenser for tidligere, ferske eller pågående infeksjoner gir signifikante lab til lab variasjoner. Chlamydia pneumoniaeselisa medac inneholder et høyrenset og spesifikt antigen. Påvisning ev IgM, IgA, og IgG antistoff muliggjør vurdering av infeksjonens status og follow up etter behandling. IgM antistoff indikerer med en høy grad av sikkerhet for tilstedeværelse av akutt infeksjon. Chlamydia pneumoniaeselisa medac tilfredsstiller kravet til standardisering, objektivitet, og automatisering i et rutine laboratorium. 430TMBVPN/010708 2
TESTPRINSIPP Platen er coated med et høy renset C. pneumoniaespesifikt antigen. C. pneumoniaespesifikt antistoff fra prøven bindes til antigenet. Peroxidasekonjugert antihuman IgG antistoff bindes til IgG antistoff (P = peroxidase). Inkubering med TMBsubstrat (*). Reaksjonen stoppes ved tilsettning av svovelsyre. Absorbsjonen leses fotometerisk. TESTENS FORDELER Høy sensitivitet og spesifisitet. Brytbare mikrobrønn strips gir god utnyttelse av kitet. 430TMBVPN/010708 3
KIT INNHOLD Cat. no.: 430TMB 1. MTP Mikroplate: 12 x 8 brønner, rosakodet (med ramme og tørremiddel forseglet i en aluminium pose), brytbare, Uformede, coated med C. pneumoniaespesifikt antigen and FCS, ferdig til bruk. 2. CONTROL Negativ kontroll: 1 flaske med 1,5 ml, humant serum, ferdig til bruk, blåfarget, inneholder NBCS, phenol, ProClin TM 300 og gentamycin sulfat. 3. CONTROL + Positiv kontroll: 1 flaske med 1,5 ml, humant serum, ferdig til bruk, blåfarget, inneholder BSA, phenol, ProClin TM 300 og gentamycin sulfat. 4. WB Vaskebuffer: 1 flaske med 100 ml PBS/Tween (10x), ph 7,2 7,4, inneholder ProClin TM 300. 5. BACDIL Prøve fortynning: 1 flaske med 110 ml PBS/Tween/NBCS, ph 7,0 7,2, ferdig til bruk, blåfarget, inneholder ProClin TM 300. 6. CON Konjugat: 4 flasker med 4,5 ml i hver, geit antihuman IgG, HRPkonjugert, ferdig til bruk, grønnfarget, inneholder BSA, phenol, ProClin TM 300 og gentamycin sulfat. 7. TMB TMBsubstrat: 1 flaske med 10 ml, ferdig til bruk. 8. STOP Stopp løsning: 2 flasker med 11 ml i hver, 0,5 M svovel syre (H 2 SO 4 ), ferdig til bruk. 430TMBVPN/010708 4
1. OPPBEVARING OG HOLDBARHET Materiale/Reagens Status Lagring Holdbarhet Test kit uåpnet 2...8 C inntil utløpsdato Mikroplate åpnet 2...8 C i pose 12 uker med tørremiddel Kontroller åpnet 2...8 C 12 uker Vaskebuffer fortynnet 2...8 C 12 uker Prøve fortynning åpnet 2...8 C 12 uker Konjugat åpnet 2...8 C 12 uker TMBsubstrat åpnet 2...8 C 12 uker Stopp løsning åpnet 2...8 C inntil utløpsdato Ikke bruk reagenser etter utløpsdato. 2. REAGENSER OG MATERIALER SOM ER NØDVENDIGE, MEN SOM IKKE FØLGER MED I KITET 2.1. Destillert vann (H 2 O redist.). Bruk av deionisert vann kan forstyrre test prosedyren. 2.2. Justerbare mikro pipetter. 2.3. Rene glass eller plastikk beholdere til fortynning av vaskebuffer og prøver. 2.4. Passende utstyr for vasking av mikroplater (eks multistepper eller ELISA vasker). 2.5. Inkubator for 37 C. 2.6. Mikroplate avleser med filtre for 450 nm og 620 650 nm. 3. TILLAGING AV REAGENSER Alle kit komponenter må få romtemperatur før bruk. Beregn det nødvendige antall brønner som trengs. 3.1. Mikroplate Aluminium posen må forsegles helt tett igjen etter hver gang det taes ut brønner. Oppbevaring og stabilitet til brønnene er nevnt i avsnitt 1. 430TMBVPN/010708 5
3.2. Vaskebuffer Bland en del vaskebuffer (10x) med ni deler destillert vann (eks 50 ml vaskebuffer (10x) med 450 ml vann). 10 ml fortynnet vaskebuffer trenges til 8 brønner. Krystaller i vaskebufferen (10x) må løses opp ved oppvarming (maks. 37 C) og/eller risting ved romtemperatur. Ikke bland test spesifikke reagenser (mikroplate, kontroller, konjugat) fra ulike kit lot nr. Prøve fortynning, vaskebuffer, TMBsubstrat og stopp løsning kan innbyrdes byttes i alle Chlamydiaog MycoplasmaELISA medac. Reagenser fra andre produsenter kan ikke brukes. Gyldige og reproduserbare resultater kan bare oppnåes hvis prosedyre er fulgt nøyaktig. 4. PRØVER 4.1. Testen er for serum prøver, men ikke for plasma. 4.2. Forbehandling av sera, eks. inaktivering er ikke nødvendig. Men de må ikke være kontaminert med mikroorganismer eller inneholde røde blodlegemer. 4.3. Seraene må fortynnes 1:50 med prøve fortynning. 5.A. TEST PROSEDYRE 5.1. Klipp opp aluminium posen ovenfor zip låsen og ta ut det nødvendige antall mikroplate brønner (se 3.1.). Mikroplate brønnene er ferdig til bruk og trenger ikke å prevaskes. 5.2. Pipetter 50 µl prøve fortynning til brønn A1 som blank (se 6.A.), og 50 µl negative kontroll (i duplikat), samt 50 µl positiv kontroll og fortynnede pasientprøver (singletter). Hvis nødvendig kan mikroplate brønnene oppbevares i et fuktighets kammer i maksimum 30 minutter ved romtemperatur før videre prosedyre. 430TMBVPN/010708 6
5.3. Inkuber mikroplate brønnene i 60 min (± 5 min)ved 37 (± 1 C) I et fuktighetskammer, eller forseglet dekkfolie over brønnene. 5.4. Etter inkubasjonen vaskes mikroplate brønnene tre ganger med 200 µl vaskebuffer pr. brønn. Pass på at alle brønnene fylles. Etter vaskingen bankes mikroplate brønnene mot et filter papir. Brønnene må ikke få tørke ut! Fortsett umiddelbart! 5.5. Tilsett konjugat (grønn farget) til hver brønn. 50 µl konjugat må pipetteres til brønnene hvis testen gjøres manuelt. NB!: Hvis det brukes automatisk utstyr må 60 µl konjugat tilsettes hver brønn grunnet høyere fordamping i utstyrets inkuberings kammer. Egnetheten til testen for automatisering er bekreftet under evaluering av testen. Men vi anbefaler å kontrollere forenligheten med det utstyret som laboratoriet bruker. 5.6. Inkuber mikroplate brønnene igjen i 60 min (± 5 min) ved 37 o C (± 1 C) i et fuktighetskammer, eller forseglet med dekkfolie over brønnene. 5.7. Etter inkubasjonen vaskes mikroplate brønnene igjen(se 5.4.). 5.8 Tilsett 50 µl TMBsubstrat til hver brønn og inkuber mikroplate brønnene mørkt i 30 min (± 2 min) ved 37 o C (± 1 C) i et fuktighetskammer, eller forseglet med dekkfolie over brønnene. Positive prøver blir blå. 5.9. Stopp reaksjonen ved å tilsette 100 µl stopp løsning. Positive prøver blir gule. Vask/tørk undersiden av mikroplatebrønnene før de leses av i fotometeret og pass på at det ikke er luftbobler I brønnene. Avlesningen må gjøres innen 15 minutter etter tilsetting av stopp løsningen! o C 430TMBVPN/010708 7
5.B. TABELL FOR TESTPROSEDYRE Prøve fortynning Negativ kontroll Positiv kontroll Prøve Blank (A1) 50 µl Negativ kontroll 50 µl Positiv kontroll 50 µl Prøve 50 µl Inkuber i 60 min ved 37 C, vask 3 x med 200 µl vaskebuffer Konjugat 50/60 µl*) 50/60 µl*) 50/60 µl*) 50/60 µl*) Inkuber i 60 min ved 37 C, vask 3 x med 200 µl vaskebuffer TMBsubstrat 50 µl 50 µl 50 µl 50 µl Inkuber mørkt i 30 min ved 37 o C Stopp løsning 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Fotometerisk avlesning ved 450 nm (ref. 620 650 nm) *) manuell/automatisk prosedyre (se 5.5.) 6.A. BEREGNING AV RESULTATER (VALIDERING) Avles OD verdiene ved 450 nm (referanse bølgelengde 620 650 nm). Trekk OD verdien til blank(brønn A1) fra alle de andre OD verdiene. Blank OD verdien må være < 0,100. Gjennomsnitts OD verdien til de negative kontrollene må være < 0,100. OD verdien til den positive kontrollen må være > 0,800. Cutoff = gjennomsnitts OD verdien til de negative kontrollene + 0,380 Grå sone = Cutoff ± 10 % Repeter kjøringen hvis resultatene ikke møter spesifikasjonen. 430TMBVPN/010708 8
6.B. EVALUERING AV RESULTATENE 6.B.1. KVALITATIV Resultat OD < Grå sone OD av Cutoff ± 10 % OD > Grå sone Validering negativ usikker positive 6.B.2. SEMIKVANTITATIV : CutoffIndex: OD Prøve OD Cutoff Validering < 0,9 negativ 0,9 1,1 usikker > 1,1 positiv Prøver med OD verdier innen grå sonen skal retestes sammen med ferske prøver som er tatt 14 dager senere for å se om det er titer endring. Resultatene skal alltid tolkes i samband med IgM og IgA, og med kliniske data og andre diagnostiske parametre. Høye konsentrasjoner av hemoglobin, bilirubin og lipider i serum har ingen innvirkning på resultatene. Kryss reaksjoner med antinuklære antistoffer, heterofile antistoffer og antistoff mot to C. psittaci så vel som mot C. trachomatis kan ikke sees bort fra i enkelt tilfeller. 430TMBVPN/010708 9
6.C. SPESIFIKK IgG/IgA TOLKNING Mulige Resultater IgG IgA + + + + +/ +/ + +/ +/ + Tolkning 1. IgG og IgA positive; indikasjon på infeksjon. Ytterligere vurdering er avhengig av symptomer og titer utvikling. 2. Bare IgG positiv; indikasjon på en tidligere infeksjon. I tilfelle klinisk mistanke fastslå om det er fire fold IgG økning i titer mellom to serumprøver og retest for IgA. 3. IgG positiv, IgA grå sone; mulighet for en begynnende eller en avtagende infeksjon; retest IgA etter 10 14 dager. 4. Bare IgG i grå sonen; tidligere infeksjon kan ikke utelukkes. I tilfelle av klinisk mistanke, retest for IgG og og IgA etter 10 14 dager. 5. Bare IgA positiv; muligens et tidlig stadium av infeksjon eller isolert vedvarende,pågående IgA; retest IgA og IgG etter 10 14 dager. 6. Bare IgA i grå sonen; mulighet for et tidlig stadium av infeksjon; retest IgA og IgG etter 10 14 dager. 7. IgG i gråsonen, IgA positiv; mulighet for et tidlig stadium av infeksjon; retest IgA og IgG etter 10 14 dager. 8. IgG og IgA negative; ingen indikasjon på infeksjon. I tilfelle av klinisk mistanke gjør en direkte antigen test og retest IgA og IgG etter 10 14 dager. KOMMENTARER: I tilfeller ved ny akutt Chlamydia infeksjon kan de serologiske antistoff resultatene være negative til tross for kliniske symptomer og positive antigen påvisning. Ved serologisk påvisning av antigen eller hvis en oppfølgings test ønskes, anbefales det å vente ca 1014 dager på serokonversjon. 430TMBVPN/010708 10
7. KARRAKTERISTISKE EGENSKAPER Følgende egenskalper er blitt fastsatt under den diagnostiske evalueringen. 7.A. SPESIFISITET OG SENSITIVITET Sera fra pasienter uten symptomer på respiratorisk infeksjon ble undersøkt for å fastsettte spesifisitet. Ved MIF ble ikke antistoff mot C. pneumoniae påvist. Sera fra pasienter med mistenkt respiratorisk infeksjon ble undersøkt for å fastsette sensitivitet. Ved MIF ble antistoff mot C. pneumoniae påvist i alle seraene Pasient Gruppe Spesifisitet IgA IgG Pasienter uten respiratorisk infeksjon; ikke antistoff mot C. Pneumoniae med MIF. 93 % (n=86) 95 % (n=42) Pasient Gruppe Sensitivitet IgA IgG Pasienter med respiratorisk infeksjon; alle seraene hadde antistoff mot C. pneumoniae med MIF. 95 % (n=74) 99 % (n=117) 430TMBVPN/010708 11
7.B. PRESISJON Prøve Intraassay variasjon Prøve Interassay variasjon (n = 11) OD gj. SD CV (%) n OD gj. SD CV (%) sn. sn. NC 0,032 0,009 28 21 NC 0,035 0,004 11 BC 0,772 0,038 5 21 BC 0,824 0,073 9 PC 1,990 0,062 3 21 PC 2,133 0,149 7 N 1 1,951 0,098 5 21 N 3 1,655 0,140 8 N 2 0,731 0,030 4 21 N 4 1,027 0,087 8 NC = negativ kontroll; BC = svak positiv kontroll. (er ikke inkludert i kitet); PC = positiv kontroll GENERELLE RÅD For å unngå kryss kontaminasjon, ikke bland flaskene og de tilhørende korkene. Reagensene må forsegles umiddelbart etter bruk for å forhindre fordampning og mikrobiell kontaminasjon. Etter bruk må reagensene oppbevares som anbefalt for å garantere holdbarheten. Etter bruk må alle komponenter i kitet oppbevares i deres originale forpakning for å unngå blanding med andre reagenser eller lot nr. (se også 3.). HELSE OG SIKKERHETS INFORMASJON De lokale helsemyndigheters reguleringer må følges. Reagenser av human opprinnelse er testet negativt på HBsAg og på antistoff mot HIV1/2 og HCV. Men det anbefales på det sterkeste at dette materialet så vel som det som er av animalsk opprinnelse (se kit innhold) behandles som potensielt smittefarlig. KASSERING Rester av kjemikalier og reagenser er å anse som risikoavfall. Kassering skal skje i henhold til lokale eller nasjonale regler. Ta kontakt med lokal myndighet som vil gi råd om hvordan risikoavfall skal håndteres. Dato utgave: 01.07.2008 430TMBVPN/010708 12
LITTERATUR Balin, B.J., Gérard, H.C., Arking, E.J., Appelt, D.M., Branigan, P.J., Abrams, J.T., WhittumHudson, J.A., Hudson, A.P.: Identification and localization of Chlamydia pneumoniae in the Alzheimer s brain. Med. Microbiol. Immunol. 187, 2342 (1998). Christiansen, G., Boesen, T., Hjerno, K., Daugaard, L., Mygind, P., Madsen, A.S., Knudsen, K., Falk, E., Birkelund, S.: Molecular biology of Chlamydia pneumoniae surface proteins and their role in immunopathogenicity. Am. Heart J. 138, 491495 (1999). Danesh, J., Collins, R., Peto, R.: Chronic infections and coronary heart disease: is there a link? Lancet 350, 430436 (1997). Elkind, M.S., Lin, I.F., Grayston, J.T., Sacco, R.L.: Chlamydia pneumoniae and the risk of first ischemic stroke. The Northern Manhattan stroke study. Stroke 31, 15211525 (2000). Gérard, H.C., Schumacher, H.R., ElGabalawy, H., GoldbachManksy, R., Hudson, A.P.: Chlamydia pneumoniae present in the human synovium are viable and metabolically active. Microb. Pathog. 29, 1724 (2000). Grayston, J.T.: Epidemiology of Chlamydia pneumoniae (TWAR). In: Chlamydia Research. Angelika Stary (ed.). Proceedings of the Third Meeting of the European Society for Chlamydia Research, Vienna, Austria, 11.14. September, 211214 (1996). Grayston, J.T., Aldous, M.B., Easton, A., Wang, S.P., Kuo C.C., Campbell, L.A., Altman, J.: Evidence that Chlamydia pneumoniae causes pneumonia and bronchitis. J. Infect. Dis. 168, 12311235 (1993). Gupta, S., Leatham, E.W., Carrington, D., Mendall, M.A., Kaski, J.C., Camm, A.J.: Elevated Chlamydia pneumoniae antibodies, cardiovascular events, and azithromycin in male survivors of myocardial infarction. Circulation 96, 404407 (1997). Gurfinkel, E., Bozovich, G., Daroca, A., Beck, E., Mautner, B.: Randomised trial of roxithromycin in nonqwave coronary syndromes: ROXIS pilot study. Lancet 350, 404407 (1997). Hahn, D.L., Peeling, R.W., Dillon, E., McDonald, R., Saikku, P.: Serologic markers for C. pneumoniae in asthma. Ann. Allergy Asthma Immunol. 84, 227233 (2000). Hunter, S.F., Hafler, D.A.: Ubiquitous pathogens: Links between infection and autoimmunity in MS? Neurology 55, 164165 (2000). Kuo, C. C., Jackson, L.A., Campbell, L.A., Grayston, J.T.: Chlamydia pneumoniae(twar). Clin. Microbiol. Rev. 8, 451461 (1995). LayhSchmitt, G., Bendl, C., Hildt, U., DongSi, T., Jüttler, E., Schnitzler, P., GrondGinsbach, C., Grau, A.J.: Evidence for infection 430TMBVPN/010708 13
with Chlamydia pneumoniae in a subgroup of patients with multiple sclerosis. Ann. Neurol. 47, 652655 (2000). Maass, M., Bartels, C., Engel, P.M., Mamat, U., Sievers, H.H.: Endovascular presence of viable Chlamydia pneumoniae is a common phenomenon in coronary artery disease. J. Am. Coll. Cardiol. 31, 827 832 (1998). Muhlestein, J.B.: The link between Chlamydia pneumoniae and atherosclerosis. Infect. Med. 14, 380382, 392, 426 (1997). Saikku, P.: Chronic Chlamydia pneumoniae infections. In: Chlamydia Research. Angelika Stary (ed.). Proceedings of the Third Meeting of the European Society for Chlamydia Research, Vienna, Austria, 11.14. September. 215218 (1996). Saikku, P., Leinonen, M., Mattila, K., Ekman, M.R., Nieminen, M.S., Mäkela, P.H., Huttunen, J.K., Valtonen, V.: Serological evidence of an association of a novel Chlamydia, TWAR, with chronic coronary heart disease and acute myocardial infarction. Lancet 2, 983986 (1988). Saikku, P., Leinonen, M., Tenkanen, L., Linnanmäki, E., Ekman, M.R., Manninen, V., Manttari, M., Frick, M.H., Huttunen, J.K.: Chronic Chlamydia pneumoniae infection as a risk factor for coronary heart disease in the Helsinki Heart Study. Ann. Intern. Med. 116, 272278 (1992). Samra, Z., Soffer, Y.: IgA antichlamydial antibodies as a diagnostic tool for monitoring of active chlamydial infection. Eur. J. Epidemiol. 8, 882884 (1992). Schumacher, H.R.: Chlamydial Arthritis. In: Chlamydia Research. Pekka Saikku (ed.). Proceedings of the 4 th Meeting of the European Society for Chlamydia Research, Helsinki, Finland, 20.23. August. 229 (2000). Sriram, S., Stratton, C.W., Yao, S.: Chlamydia pneumoniae infection in the central nervous system in multiple sclerosis. Ann. Neurol. 46, 6 14 (1999). Stille, W., JustNübling, G.: Argumente für eine AntibiotikaTherapie der Arteriosklerose. Chemotherapie Journal 6, 15 (1997). 430TMBVPN/010708 14