1 Kromatografiteori NITO kurs i kromatografi og massespektrometri Trondheim 23.05.2018 Åse Marit Leere Øiestad 2 Disposisjon Innledning historikk Kromatografiske parametere Analytters egenskaper Kromatografi definisjoner Typer kromatografi prinsipper vs. teknikker Eksempler på kromatografiproblemer og løsninger 1
3 Kromatografi Kromatografi = fargeskriving (Tsvet 1903) chroma farge grafi skrive Separerte klorofyll og karotenoider Samlenavn på separasjonsmetoder 4 Hva brukes kromatografi til? Separere forbindelser De fleste prøver er komplekse blandinger, må skille analytten(e) fra forurensninger/matriks/andre stoffer Prøveopparbeidelse preparativ HPLC Kvalitativ identifikasjon Sammenlikne retensjonstiden, tr (dvs. tiden stoffet vandrer) med standarder UV, IR, MS identifikasjon Kvantitativ bestemmelse Ved hjelp av kalibreringskurver 2
Prinsipp for Kromatografi (separasjon av stoffer) Eksempel: Væskekromatografi (LC) Mobil fase: Væske (ofte blanding av flere) Stasjonær fase: Kolonne pakket med små partikler <2µm Separerer stoffer fra hverandre ved at de vandrer med forskjellig hastighet i et system med en mobil og en stasjonær fase: forskjell i vandringshastighet må være stor nok veien stoffene vandrer må være lang nok 5 Opprenset prøve injiseres med sprøyte i systemet og føres med væskestrømmen gjennom kolonna Kolonne (5 10 cm) Buffer Organisk løsningsmiddel (metanol) A B Ecstasy Amfetamin Morfin 6 Kromatografisk separasjon 1. Stoffene beveger seg med forskjellig hastighet 2. Stoffene spres i lengderetningen når de vandrer 3
Retensjon 7 K = C s C m Fordelingskoeffisienten bestemmer hvor mye av stoffet som vil oppholde seg i stasjonær fase (BESTEMMER RETENSJONEN) 8 Båndspredning Får alltid båndspredning fordi molekyler av samme type har forskjellig (gjennomsnitts) hastighet Skyldes fysiske prosesser 4
9 Van Deemter Figur fra Waters Høyere optimal flowhastighet for små partikler enn store. Høyere flow gir smalere og høyere topper. 10 5 μm partikel 1.7 μm partikler 60 μm menneskehår 5
Kromatogram Resultatet av en kromatografisk separasjon 11 1. Retensjonstiden t R karakteriserer retensjonen interaksjonen med stasjonær fase (brukes til identifikasjon) 2. Bredden av toppene t W (ved grunnlinjen) karakteriserer båndspredningen 3. t 0 er tiden et ikke retardert stoff bruker gjennom kolonnen 12 Kromatografiske parametre Retensjonsfaktor retensjonstid retensjonsvolum Teoretiske plater høydeekvivalenten til en teoretisk plate Oppløsningsevne 6
Retensjonsfaktor 13 to (Vo) t R (V R ) k = tr t0 t0 k: retensjonsfaktor for et stoff med retensjonstid tr k uttrykker : tiden stoffet oppholder seg i stasjonær fase tiden stoffet oppholder seg i mobil fase Effekt av selektivitet, effektivitet og retensjon 14 R s = 1/4 ( 1) N ( k 1 + k ) 7
Analytten(e) 15 Kjemiske egenskaper Sure og basiske grupper pka verdier Lipofilisitet, hydrofilisitet løselighet i vann og organiske løsningsmidler Flyktighet, størrelse, stabilitet Funksjonelle grupper Egenskaper av betydning for deteksjon UV absobans Fluorescens Oksiderbarhet Bestemte grunnstoffer (nitrogen, fosfor, halogener) Konsentrasjon Kjemiske egenskaper: pka 16 Repetisjon av gamle kunnskaper: ph = log[h 3 O + ] Syrekonstanten Ka er definert ved i likevekten K a [ Base][ H 3O [ Syre] ] Syre H O Base H ( aq) 2 ( l) ( aq) 3 ( aq) ph = pka log[syre]/[base] Dvs. når konsentrasjonen av syre = konsentrasjonen av base vil ph = Pka I praksis betyr dette at 50% av molekylene i løsningen er ladet og 50% er nøytrale Ved en ph 2 ph enheter fra pka vil ca. 99% av molekylene være på den ene formen O 8
Eksempel: Ladningen av morfin ved forskjellige ph verdier 17 Morfin: pka1= 8.0 pka2 =9.9 Ladet Ladet CH + 3 NH CH 3 N CH + 3 NH CH 3 N CH 3 N OH O OH OH O OH OH O OH O O OH OH O OH ph = 8 ph ~ 6 Ladet ph = 10 50% av molekylene er ladet på aminet 50% er uladet på aminet ~99% er uladet på oksygenene 99% av molekylene er ladet på aminet 100% er uladet på oksygenene 99% av molekylene er uladet på aminet ~50% er ladet på det ene oksygenet ~50% er uladet på oksygenene Figur av Thomas Berg, RMF, OUS 18 Kjemiske egenskaper: løselighet Like løser like Lipofilisitet = fettløselighet Hydrofilisitet = vannløselighet Polare funksjonelle grupper lokalisert eller spredt ut over molekylet? Størrelsen på upolar del av molekylet 9
Matriks 19 Vanlige komponenter som må vurderes Proteiner Fett Salter Endogene forbindelser Andre stoffer/metabolitter Hvordan foreligger analytten Grad av proteinbinding Konjugert Er det forbindelser som kan interferere eller ødelegge for analysen? Prinsipper NB! Prinsipp er ikke det samme som teknikk (metode) 20 Prinsipper (type stasjonærfase i kolonnen) Adsorpsjon Fordeling/faste kjemisk bundne stasjonærfaser Ionebytte Eksklusjon (gel) Stasjonærfasen i kolonnen holder stoffene tilbake retensjon Stoffene tvinges i gjennom kolonnen med en væske eller gass som presses gjennom med konstant hastighet (gassen/væsken kalles mobilfasen) 10
21 Gasskromatografi (GC) Mobilfasen er en gass Teknikker Væskekromatografi (UHPLC/HPLC el LC) Mobilfasen er en væske Kolonne preparativ eller analytisk Tynnsjikt (TLC) Superkritisk fluid kromatografi Mobilfasen er et superkritisk fluid (vanligvis superkritisk CO 2 ) 22 Kromatografi Likevekten mellom stasjonærfase og mobilfase (og dermed vandringslengden) er avhengig av Sammensetningen av den stasjonære fase Sammensetningen av den mobile fase (LC og SFC) raskere ved sterkere mobilfase Temperaturen (GC og SFC) retensjonen kan styres ved temperaturendring Trykk (LC og SFC) endring i flowhastighet endrer også trykket over kolonnen 11
23 Fordelingskromatografi (GC) Den stasjonære fase er impregnert som en tynn film på en bæresubstans eller på veggen av en kapillærkolonne, vanligvis silikoner evt silikonoljer eller gummier Disse har god termisk stabilitet, og variasjon av kjedegrupper gir ulik grad av polaritet. Upolar stasjonærfase separasjon etter kokepunkt (flyktighet) Polar stasjonærfase separasjon etter polaritet (interaksjon) og kokepunkt (dvs. kan separere forbindelser med samme kokepunkt, men forskjellige funksjonelle grupper) 24 Fordelingskromatografi (HPLC) HPLC (faste kjemisk bundne stasjonærfaser) den stasjonære fase er vanligvis kjemisk bundet til overflaten av en bæresubstans (silika eller polymer) 12
25 Separasjonsprinsipper i LC Omvendt fase kromatografi stasjonærfasen er hydrofob Normal fase kromatografi stasjonærfasen er hydrofil Hydrofob interaksjonskromatografi (HILIC) vannrikt lag på stasjonærfasen Ionebytterkromatografi stasjonærfasen har ladet overflate Gelkromatografi stasjonærfase med gitt porestørrelse 26 Omvendt fase Separasjonsprinsipper i LC Stasjonærfasen er upolar og mobilfasen er polare væsker slik som metanol, acetonitril eller vann. Vanlige stasjonærfaser: C18, C8 Mer upolare forbindelser har større retensjon i systemet. Aller mest brukte system innen LC per i dag! Normalfase Stasjonærfasen er sterkt polar og mobilfasen er hovedsakelig upolar (slik som heksan). 13
I omvendt fase kromatografi retarderes stoffene ved hydrofob interaksjon 27 O Si Si O H 3 C Si O Si O H 3 C Si O Si CH 3 H 3 CO HCH 3 C COOH Hydrofob interaksjon van der Waalske krefter Interaksjon mellom hydrokarbonkjedene på C18 og den hydrofobe delen av naproxen 28 Separasjonsprinsipper i LC HILIC Stasjonærfasen er polar og mobilfasen er upolar ( normalfasesystem ) Mobilfasen inneholder vann Alternativ til omvendt fase kromatografi for polare forbindelser Fordeling mellom mobilfasen og vannlag utenpå stasjonærfasen Begynner å få stor utbredelse. 14
29 Isokratisk eluering vs. gradient eluering Isokratisk eluering (mobilfasen endres ikke) gir best separasjon kan utføres med en enkel pumpe Gradienteluering (mobilfasen endres i løpet av analysen) brukes når stoffene har stor forskjell i hydrofobisitet må utføres med en gradient pumpe eller flere pumper Hovedsakelig bruk av gradienteluering fordi man sparer tid, og i tillegg får man smalere topper på slutten av kromatogrammet. 30 Retensjonsrekkefølge RP C18 Minst hydrofob kommer først ut Lenger hydrofob kjedelengde gir lengre retensjonstid Forgrenet før rettkjedet Umettet før mettet Ionisert form før ikke ionisert 15
31 Retensjonen påvirkes av: Mobilfasens sammensetning Økende innhold av organisk modifikator (ACN, MeOH) gir mindre retensjon ph Syrer blir minst retardert ved høy ph Baser blir minst retardert ved lav ph Tilsetning av salter Salter kan minske løseligheten i mobil fase Ionepardannere øker stoffets lipofile karakter Tilsetningsstoffer som adsorberes til kolonnen (eks. aminer) gir mindre retensjon samt bedre symmetri og mindre båndspredning ved analyse av baser 32 Retensjonen påvirkes av: Stasjonær fase Omvendt fase materialer med lange hydrokarbonkjeder som C18 gir større retensjon enn materialer med kortere hydrokarbonkjeder Materialer med polare overflategrupper gir mindre retensjon Forskjellige typer C18 materialer kan gi forskjellig retensjon Temperatur Økende temperatur gir mindre retensjon Ofte ca. 35 grader HPLC, 60 grader UHPLC 16
33 Kromatografiproblemer og «hacks» 1 Metode for analyse av legemidler med LC MS. Ved utvikling av metoden hadde stoffene som kom først i gradienten veldig brede topper. Injiserte en løsning med høy prosentandel organisk. Løsningen på problemet var å fortynne prøvene mer med vann før injisering på kolonnen. Løsemiddelstyrken ble for stor ift. starten på gradienten og de tidligst eluerende stoffene ble spredt utover på kolonnen. 34 Kromatografiproblemer og «hacks» 2 LC MS metode for analyse av benzodiazepiner. Stoffet som kom først i gradienten hadde stor variasjon i retensjonstid mellom høye og lave konsentrasjoner, hvilket det vanligvis ikke har. De andre stoffene var fine. Har opplevd dette før og løsningen var da som nå å bytte kolonnen. Stasjonærfasen klarte ikke lenger å «holde på» høye konsentrasjoner og stoffet eluerte for tidlig, trolig pga. slitasje på stasjonærfasen. 17
Kromatografiproblemer og «hacks» 3 35 Fikk plutselig veldig stygge og brede topper for de tidligst eluerende stoffene i en LC MS metode. Injeksjonsvolumet hadde blitt endret til et lavere volum. Metoden bruker en injeksjonsteknikk (partial loop with needle overfill) Loopen fylles med prøve, slik at ikke noe vaskeløsning blir med i injeksjonen Når inj. volum + overfillvolum < loop volum ble vaskeløsning med sterkere løsemiddelstyrke også injisert Tilpasset overfillvolumet slik at det ikke ble mindre totalt enn loopen rommer og toppene ble fine igjen. Kromatografiproblemer og «hacks» 4 Ulik reløsning ulik respons 36 1) 10% ACN og 90% 5 mm ammoniumbikarbonatbuffer ph 10,2 2) 30% ACN og 70% 5 mm ammoniumbikarbonatbuffer ph 10,2 3) 25% ACN og 75% 5 mm ammoniumacatatbuffer ph 5. Figur fra Ingeborg Amundsen, Sykehuset i Østfold 18
37 Kromatografiproblemer og «hacks» 5 John W. Dolan, LCGC Europe, 2008 Volume 21, Issue 11 Kromatografiproblemer og «hacks» 5 forts. 38 Viktig å passe på at man ikke får dødvolumer i systemet og at det er god kvalitet på alle løsninger, evt. filtrere løsninger før bruk. 19
Takk til Thomas Berg og Elisabeth Øiestad, RMF, OUS Ingeborg Amundsen, Sykehuset i Østfold Léon Reubsaet, Farmasøytisk institutt, UiO 39 Spørsmål? 20