Sammendrag SAMMENDRAG

Transkript

1 Plantebaserte polysakkarider i et in vitro fordøyelsessystem Polysacchardies from plants in a in vitro digestive system Marikken Dølven Institutt for kjemi, bioteknoligi og matvitenskap (IKBM) Masteroppgave 60 stp. 2011

2 FORORD Forord Denne masteroppgaven ble utført på Nofima AS, på Ås, i perioden januar til desember Oppgaven utgjør 60 studiepoeng av totalt 120 studiepoeng i studieprogrammet Master i matvitenskap (retning mat og helse), Instituttet for kjemi, bioteknologi og matvitenskap (IKBM) på Universitetet for miljø- og biovitenskap (UMB). Først og fremst vil jeg takke mine to gode veiledere på Nofima; hovedveileder Svein Halvor Knutsen og tilleggsveileder Simon Ballance for veiledning og støtte gjennom hele perioden. Jeg er utrolig takknemlig for all den tid og energi dere har satt av til meg, og ikke minst for at dørene deres alltid har vært åpne når jeg har hatt spørsmål. Dere har gitt meg et svært lærerikt år! Videre så ønsker jeg å rette en stor takk til Trygve Helgerud på Nofima, som har bidratt med sin kunnskap og erfaring med HPLC gjennom hele perioden. Tusen takk for at du har vært så hjelpsom! Og hjertelig takk til Nils Kristian Afseth for hjelp til FT-IR spektrofotometer. Lene Ruud Lima og Anne Helene Bjerke har også vært til umåtelig stor hjelp. Tusen takk for praktisk hjelp og tips til utfordringer jeg har møtt på laboratoriet! Og sist, men ikke minst; tusen takk til internveileder på IKBM, Gerd Vegarud! Ås, 14. desember Marikken Dølven I

3 II FORORD

4 SAMMENDRAG Sammendrag Fokuset i denne oppgaven har vært rettet mot kostfiber i bygg (byggris) og brokkoli, og det har blitt utført eksperimenter for å framstille og å kvantifisere disse. Det har blitt brukt fire ulike in vitro fordøyelsesmodeller som delvis har blitt sammenlignet opp mot hverandre: NSP (ikke-stivelses polysakkarider/non-starch polysaccharides)-analyse basert på Englyst et al. 1994, enzymatisk-gravimetrisk metode (McCleary et al. 2010), in vitro enzymatisk fordøyelse for hydrolyse av stivelse og protein (Aura et al. 1999), og en metode som er basert på sistnevnte, men hvor de standardiserte og kommersielt tilgjengelige enzymene er byttet ut med humane fordøyelsesenzymer donert av frivillige menn og kvinner (Almaas et al. 2006; Ulleberg et al. 2011). Mengdene kostfiber funnet i byggris og brokkoli varierte med hensyn til metode; enzymatisk-gravimetrisk metode og Aura-metoden ga en noe høyere mengde kostfiber enn summert karbohydratinnhold funnet i henhold til NSP-metoden. Da metodene baserer seg på mye av den samme metodikken er det derimot ingenting som tilsier at resultatene skal bli forskjellige. Det ble funnet følgende mengder kostfiber per 100 gram tørrstoff: 9-14 gram i ubehandlet byggris, gram i kokt byggris, gram i rå brokkoli og gram i blansjert brokkoli. Av dette utgjorde vannuløselig kostfiber mest i samtlige prøver, men mengde vannløselig kostfiber utgjorde en større andel i prøvene som på forhånd var varmebehandlet. Ut i fra størrelsesfraksjonering med eksklusjonskromatografi (HPLC, SEC- GPC) på prøver av vannløselig kostfiber, ble det funnet at byggris hadde en større gjennomsnittlig molekylstørrelse enn brokkoli, samt at ubehandlede prøver hadde en lavere gjennomsnittlig molekylstørrelse enn varmebehandlede. Mengden fritt sukker (glukose, fruktose og sukrose) samt glukose og maltose fra nedbrutt stivelse gjort tilgjengelig i løsning etter endt fordøyelse i henhold til enzymatisk-gravimetrisk metode, ble undersøkt ved hjelp av HPAEC-PAD. Det ble fra kokt byggris funnet 81 gram, fra ubehandlet byggris 69 gram, fra rå brokkoli 20 gram og fra blansjert brokkoli 13 gram. Disse verdiene er basert på pr 100 gram tørrstoff. In vitro fordøyelse med humane enzymer var den metoden som ga mest avvikende resultat i forhold til de øvrige metodene benyttet i denne undersøkelsen. III

5 SAMMENDRAG Videre så ble effekten av større partikkelstørrelser og økte prøvemengder undersøkt i forhold til mengde grovisolert kostfiber og tilgjengeliggjort sukker i simulert fordøyelse. Økt prøvemengde og økt partikkelstørrelser ga en høyere mengde vektbasert kostfiber, samtidig som mengden sukker gjort tilgjengelig i fordøyelsen ble redusert. Dette antas å skyldes ufullstendig hydrolyse av stivelse under simulert fordøyelse, som følge av for store partikkelstørrelser og/eller for stor prøvemengde. Hvorvidt de ulike råvarene i Det sunne måltidet ; laks, byggris og brokkoli, påvirket hverandre under fordøyelse, ble undersøkt ved å fordøye to og to av råvarene eller alle tre sammen, i henhold til enzymatisk-gravimetrisk metode. Resultatene viste at den benyttede metoden ikke klarte å fordøye laksen, samt at laksen ikke påvirket stivelsesomsetningen. Blansjert brokkoli ble undersøkt nærmere med hensyn på grovkarakterisering av pektin. Et høyt innhold av uronsyre indikerte et betydelig innhold av pektin. Forestringsgraden viste seg å ligge på mellom 40 og 50 %, akkurat på grensen mellom høy-metoksyl (HM; >50 %) pektin og lav-metoksyl (LM; <50 %) pektin i kommersielle pektinpreparat IV

6 ABSTRACT Abstract The focus in this paper has been on dietary fibre in barley rice and broccoli, and experiments have been carried out to produce and quantify them. Four different methods of in vitro digestion have been used and compared against each other: NSP (non-starch polysaccharides)-method based on Englyst et al. 1994, enzymatic-gravimetric method (McCleary et al. 2010), in vitro enzymatic digestion for hydrolysis of starch and protein (Aura et al. 1999), and a method based on the last one, but where the commercial enzymes are replaced by human digestive enzymes aspirated from the gastric compartment and duodenal lumen from men and women volunteers (Almaas et al. 2006; Ulleberg et al. 2011). The quantities of dietary fibre found in barley rice and broccoli varied with respect to the method; the enzymatic-gravimetric method and the Aura-method gave higher amounts compared to the NSP-method. Since the methods are based on almost the same methodology, there are no reasons why the results are different from each other. The following amounts of dietary fibre per 100 grams dry weight was found: 9-14 grams in untreated barley rice, grams in cooked barley rice, grams in raw broccoli and grams in blanched broccoli. The water-insoluble fibre accounted for most of the dietary fibre in all of the samples, but the water-soluble fibre accounted for a bigger part in the samples that were heat-treated. With size exclusion chromatography (HPLC, GPC-SEC) it was found that the water-soluble fibre form barley rice had a greater average molecular weight, compared to the water-soluble fibre from broccoli. It was also found that the untreated samples had a lower average molecular weight than the samples that were heat-treated. The free sugars (glucose, fructose and sucrose) and glucose and maltose from hydrolyzed starch made available in solution after digestion, were examined by chromatography. It was found 81 grams form cooked barley rice, 69 grams from untreated barley rice, 20 grams from raw broccoli and 13 grams from blanched broccoli. These values are based on per 100 grams dry weight. The results from the in vitro digestion with human enzymes differed most compared to the results from the other methods used in this examination. V

7 ABSTRACT Furthermore, the effect of larger particle sizes and increased sample volumes was investigated relative to the amount of crude dietary fibre and sugar released in simulated digestion. Increased sample amounts and larger particle sizes resulted in a higher amount of crude dietary fibre, based on weight, simultaneously as the amount of released sugars during digestion decreased. This is probably due to incomplete starch hydrolysis during digestion, as a consequence to large particle sizes and/or large sample amounts. Whether the different components in Healthy meals ; salmon, barley rice and broccoli had an effect on each other during digestion, was investigated by digestion of two and two or all three of them together, according to the enzymatic-gravimetric method. The results reviled that the method was unable to digest the salmon, and that the salmon had no impact on the starch digestion. Blanched broccoli was investigated further with respect to rough characterization of the pectin. A high content of uronic acid indicate a significant content of pectin. The degree of esterification was found to be between 40 and 50 %, right on the threshold between highmethoxyl (HM; > 50 %) and low-methoxyl (LM; <50 %) in commercial pectin. VI

8 INNHOLDSFORTEGNELSE Innholdsfortegnelse Forord... I Sammendrag... III Abstract... V Innholdsfortegnelse... VII 1 Hensikt med oppgaven Introduksjon Innledning Kostfiber Helsepåstander Fordøyelse Fordøyelse av karbohydrater In vitro fordøyelsesmodeller for å simulere human fordøyelse Prosessering påvirker fordøyelighet av stivelse Bygg (Hordeum vulgare) Kornet Stivelse i bygg Fritt sukker; glukose, fruktose og sukrose Kostfiber Prosessering av bygg Brokkoli (Brassica oleracea L. var. italica Plenck) Fritt sukker; glukose, fruktose og sukrose Kostfiber Varmebehandling av brokkoli Kromatografi High-performance anion-exchange chromatography med pulsed amperometric detection (HPAEC-PAD) Gass-væske kromatografi med flammeionisasjonsdetektor (GLC-FID) Materialer og metoder Prøveopparbeidelse Boil-in-bag byggris fra Møllerens VII

9 INNHOLDSFORTEGNELSE Byggris fra Sjåk Brokkoli Laks In vitro fordøyelsesmetoder Metode for måling av total NSP (non-starch polysaccharides) Bestemmelse av totalt kostfiber ved enzymatisk-gravimetrisk metode In vitro enzymatisk fordøyelse med kommersielle enzymer for hydrolyse av stivelse og protein (Aura et al. 1999) In vitro fordøyelse med humane enzymer (Almaas et al. 2006) Øvrige analysemetoder Bestemmelse av totalt karbohydrat som alditolacetater med gass-væske kromatografi Måling av uronsyre vha spektrofotometri (Englyst et al. 1994) Undersøkelse av fritt sukker - ekstraksjon i vandig metanol Separering av fiber inn i vannløselig- og uløselig del og molekylstørrelsesjekk vha. HPLC, GPC-SEC (Gel Permeation/Size Exclusion chromatography) Måling av total stivelse Kvantitativ og kvalitativ analyse av pektin fra brokkoli Resultater Rådata Kromatogram fra HPAEC-PAD Kromatogram fra GLC Bygg og brokkoli før fordøyelse Total stivelse og fritt sukker Karbohydratsammensetning Byggris og brokkoli etter in vitro fordøyelse Grovisolerte kostfiberfraksjoner i byggris og brokkoli Sukkersammensetning i kostfiber Undersøkelse av om byggsort, mengde startmateriale og prøvepreparering gir ulikt utbytte i mengde grovioslert kostfiber Undersøkelse av om ulike komponenter påvirker hverandre i mengde grovisolert kostfiber VIII

10 INNHOLDSFORTEGNELSE Tilgjengelig sukker etter fordøyelse Vannløselig- og uløselig kostfiber Molekylstørrelsesjekk Pektin i blansjert brokkoli FT-IR spekter av fraksjoner fra pektinisoleringen Diskusjon Bygg og brokkoli Produkter etter fordøyelse sammenligning av fordøyelsesmodeller Kostfiber ufordøyelig materiale Mortet byggris og økt mengde prøvemateriale Grovisolert kostfiber fra prøver bestående av flere komponenter Sukker gjort tilgjengelig under in vitro fordøyelse Vannløselig- og uløselig kostfiber Kvantitativ og kvalitativ analyse av pektin i blansjert brokkoli Videre arbeid Konklusjon Litteraturliste Vedlegg 1: Utregning av en spesifikk komponent i en ukjent prøve fra HPAEC-PAD og GLC 103 Vedlegg 2: ERM-referansetabell Vedlegg 3: Oversikt over mengde frigjort sukker og standardavvik tilhørende figur Vedlegg 4: Standardkurve fra molekylstørrelsesjekk med HPLC-SEC IX

11 X INNHOLDSFORTEGNELSE

12 1 HENSIKT 1 Hensikt med oppgaven - Å analysere fiberinnhold i byggris og brokkoli i henhold til konvensjonell anerkjent metodikk (Englyst et al. 1994). - Å utvikle en metode som, i tillegg til data for kvantitativt og kvalitativt kostfiberinnhold, også gir mulighet til å isolere fraksjoner som tilfredsstiller kravene til fiber for bruk i videre forsøk. - Å sammenligne følgende in vitro fordøyelsesmodeller opp mot hverandre: a) NSP-analyse basert på Englyst et al b) Enzymatisk-gravimetrisk metode (McCleary et al. 2010) c) In vitro enzymatisk fordøyelse for hydrolyse av stivelse og protein (Aura et al. 1999) d) Og en metode som er basert på sistnevnte, men hvor de kommersielle enzymene er byttet ut med humane fordøyelsesenzymer (Almaas et al. 2006; Ulleberg et al. 2011). - Å gå nærmer inn på kostfiberstrukturen i brokkoli, spesielt med tanke på pektin, da det var gjort svært lite på dette området da arbeidet med oppgaven startet. 1

13 2 1 HENSIKT

14 2 INTRODUKSJON 2 Introduksjon 2.1 Innledning Fokuset i denne oppgaven har vært rettet mot kostfiber i rike karbohydratkilder som et helkornprodukt av bygg (byggris) og brokkoli. Det er utført eksperimenter for å framstille og å kvantifisere disse. Et hovedpoeng i forbindelse med dette har vært å bryte ned stivelse, for så å fjerne dette sammen med lavmolekylært sukker (glukose, fruktose, sukrose). I de ulike eksperimentelle oppsettene har det derfor vært benyttet amylaser for å hydrolysere stivelse, sammen med proteaser for å bryte ned protein. Metodikken for å fjerne lavmolekylære degraderingsprodukter av karbohydrat og protein (fordøyd materiale) har vært basert på enten utfelling av alkoholuløselig polymert materiale, oppsamling av uløselig restmateriale ved sentrifugering, fjerning av lavmolekylære forbindelser med dialyse, eller kombinasjoner av disse. Dette uløselige, eller ikke dialyserbare materialet, avhengig av metode, er å betrakte som ufordøyd materiale eller kostfiber. Avhengig av innfallsvinkel, kan alle disse eksperimentelle oppsettene betraktes som modeller for in vitro fordøyelse, samtidig som det isolerte eller detekterte materialet er å betrakte som kostfiber etter gjeldene definisjoner og standard metodikk for bestemmelse av kostfiber i næringsmidler. Det har blitt brukt fire ulike in vitro metoder for enzymatisk degradering og fjerning av komponenter som representerer fordøyd materiale, med påfølgende analyse/oppsamling av kostfiber (= ufordøyd materiale). Disse har vært a) en metode hvor enzymatisk behandling er kombinert med syrehydrolyse og en kromatografibasert metode for deteksjon av de enkelte monosakkaridene (NSP-analyse basert på Englyst et al. 1994), b) en modifikasjon av en enzymatisk-gravimetrisk metode hvor det isolerte kostfibret kun er renset og registrert med vekt (McCleary et al. 2010), c) en enzymatisk metode utviklet for fordøyelse av stivelse og protein (Aura et al. 1999), og d) en variant av den siste hvor de definerte, standardiserte og kommersielt tilgjengelige enzymene er byttet ut med humane gastrointestinale (GI) enzymer som inneholder en naturlig blanding av ulike fordøyelsesenzymer (Almaas et al. 2006). Disse fire metodene er delvis blitt sammenliknet opp mot hverandre, men hovedarbeidet har bestått i å analysere fiberinnholdet i henhold til konvensjonell anerkjent metodikk (Englyst et al. 1994) og å utvikle en metode som, i tillegg til data for kvantitativt og kvalitativt 3

15 2 INTRODUKSJON kostfiberinnhold, også gir mulighet til å isolere fraksjoner som tilfredsstiller kravene til fiber for bruk i videre forsøk (metode b over). For å kunne gjøre disse kvantitative sammenligningene er også fiberpreparatene fra metodene b) og c) undersøkt for sukkersammensetning. De utvalgte råvarene er, sammen med laks, hovedbestanddelene i Det sunne måltidet, som er et samarbeidsprosjekt mellom Nasjonalt institutt for ernærings- og sjømatforskning (Nifes), Nofima AS og Universitetet for miljø- og biovitenskap. Prosjektets mål er å studere hvorvidt måltider basert på tradisjonelle norske råvarer kan forbygge og behandle livsstilssykdommer, med hovedfokus på overvekt og metabolsk syndrom, som har hatt en betydelig økning i antall forekomster de siste årene (Helsedirektoratet 2011). For å klare opp i en potensiell forvirrende faktor bør det nevnes at karbohydrater kan deles inn i to hovedgrupper: sukker og lett fordøyelige karbohydrater samt komplekse og vanskelig fordøyelige karbohydrater. Den første gruppen er det man finner mye av i blant annet brus, godteri, hvitt mel, pasta, polert ris og poteter. Disse matvarene inneholder fritt sukker (glukose, fruktose, sukrose) og stivelse som hydrolyseres og tas raskt opp i kroppen, og som dermed gir en stigning i blodsukkeret. Den andre gruppen finner man i blant annet produkter som inneholder en vesentlig mengde av de ytre lagene av kornet, og i grønnsaker. Disse består av komplekse polysakkarider og er ufordøyelige (per definisjon: kostfiber), slik at de fortsetter til tykktarmen hvor de fungerer som mat for de gode tarmbakteriene. Dette gås nærmere inn på senere. I en mellomstilling her finnes enkelte stivelsesformer som, enten på grunn av deres krystallinske struktur eller er pakket inn fysisk, eventuelt inkorporert i råvaren/ferdig produkt, er lite tilgjengelige for fordøyelsesenzymene våre. Dette gjør dem langsomme eller resistente, hvorav de siste er å betrakte som kostfiber og substrat for tarmfloraen. Et høyt innhold av fiberkomponenter, men også fett er et vesentlig bidrag til denne reduserte tilgjengeligheten (dette utdypes i 2.3.3). 4

16 2 INTRODUKSJON 2.2 Kostfiber Definisjonen av kostfiber har variert over tid, og i 2009 kom Codex Alimentarius Commission med en ny definisjon: Kostfiber betyr karbohydratpolymerer, inkludert lignin, med ti eller flere monomere enheter som ikke hydrolyseres av endogene enzymer i tynntarmen hos mennesker og tilhører følgende kategorier: a) spiselige karbohydratpolymerer naturlig til stede i matvaren; b) karbohydratpolymerer som har blitt utvunnet fra råmateriale ved hjelp av fysiske, enzymatiske eller kjemiske hjelpemidler, og som har blitt vist å gi en fysiologisk gevinst i forhold til helse, demonstrert av generelt godkjente vitenskapelige bevis til kompetente myndigheter; c) syntetiske karbohydratpolymerer som har blitt vist å gi en fysiologisk gevinst i forhold til helse, vist av generelt godkjente vitenskapelige bevis til kompetente myndigheter. (Codex Alimentarius Commission 2009; Helsedirektoratet 2011) Kostfiber kan deles inn i to grupper; vannløselig- og uløselig kostfiber. Eksempler på vannløselig kostfiber er β-glukan (kan også være vannuløselig) og pektin, mens cellulose, hemicellulose, lignin er vannuløselige (Saladin 2010). I kontrast til stivelse og sukker fordøyes ikke kostfiber i mennesker, og gir dermed lite energi, men den er likevel en viktig komponent i kostholdet av andre grunner. Selv om disse polysakkaridene ikke brytes ned av kroppens egne enzymer vil bakteriene i tykktarmen fermentere dem og danne flere nedbrytningsprodukter, deriblant kortkjedede fettsyrer: eddiksyre, propionsyre og smørsyre (Newman & Newman 2008) som bidrer med energi til verten (mennesket). Et annet og nyere begrep på denne gruppen ufordøyelige karbohydrater som fungerer som mat for de gode bakteriene (probiotika) i tykktarmen er prebiotika. 5

17 2 INTRODUKSJON Helsepåstander Kostfiber antas å forbygge opp til flere lidelser som forbindes med metabolsk syndrom, og det jobbes i dag med å få flere til å spise mer kostfiber, da de fleste ligger under det anbefalte inntaket som er gram per dag (Helsedirektoratet 2011). Hovedrollen i forebyggingen av hjerte- og karsykdom blant kostfibrene går til det vannløselige kostfibret β-glukan som finnes i havre og bygg. Dette skyldes mest sannsynlig β- glukan sin effekt på viskositeten i tarminnholdet, som antas å redusere og hemme absorpsjonen av lipider og kolesterol (Wang et al. 1992), og dermed gi et lavere nivå av triglyserider i blodet (Slavin 2001). Også arabinoxylan har vist seg å danne viskøse løsninger og dermed bidra til den kolesterolreduserende effekten. Ved å gi økt viskositet i mageinnholdet får man i tillegg en forlenget fordøyelse og lengre metthet, slik at et kosthold rikt på fiber vil redusere det totale inntaket av mat og følgelig gi en lavere kroppsmasseindeks (KMI) på sikt (Helsedirektoratet 2011). Videre så antas det at løselig kostfiber (spesielt β-glukan) binder gallen i tarmen slik at de skilles ut med avføringen, noe som resulterer i at LDL (low-density lipoprotein)-kolesterolet i kroppen brytes ned for å bidra i dannelse av ny galle (Van Horn et al. 2008). På den måten har endringer i gallesyremetabolismen i respons til β-glukan også blitt sett i sammenheng med den kolesterolreduserende effekten, og dermed også effekten av redusert risiko for hjerte- og karsykdom (Helsedirektoratet 2011; Kahlon et al. 1993). Høyt blodsukker etter et måltid (postprandial hyperglykemi) kan bidra til økt risiko for diabetes (Helsedirektoratet 2011). Løselig kostfiber har vist seg å redusere det postprandiale blodsukkeret (Slavin 2001; Symons & Brennan 2004) slik at mengden insulin som skilles ut etter et måltid også er lavere. Dette skyldes kostfibrets lave glykemiske indeks, som vil si at det gir en svak stigning i blodsukkeret over tid, i stedet for den raske økningen som skjer ved inntak av raskt fordøyelige karbohydrater. Disse påstandene, som både er dokumenterte og foreløpig usikre, viser at ting henger sammen i utviklingen av diverse lidelser, som til sammen kan resultere i tilstanden metabolsk syndrom. 6

18 2 INTRODUKSJON 2.3 Fordøyelse I den humane fordøyelsesprosessen går maten gjennom en mekanisk og kjemisk oppdeling og størrelsesreduksjon, slik at kroppen lettere skal kunne absorbere og omsette næringsstoffer som er pakket inn i celler og cellevegger i maten. Munnen og magen og deres fordøyelsesvæsker har hovedansvaret for at denne oppdelingen skjer, mens tynntarmen står for det meste av absorpsjonen (Kong & Singh 2008). Figur 2.1: Oversiktsbilde over fordøyelsessystemet. Det nederste bildet viser hvordan lever og galleblære er i kontakt med duodenum (ADAM). Gallen skilles ut av leveren og oppbevares i galleblæren. 7

19 2 INTRODUKSJON Figur 2.2: Oversiktsbilde av tynntarm og tykktarm. Den første delen av tynntarmen kalles doudenum, andre og midterste del er jejunum, mens den siste delen kalles ileum. Fra ileum beveger kymus seg over i tykktarmen (ADAM). Munn Fordøyelsen starter i det man inntar maten, med mekanisk og kjemisk oppdeling ved hjelp av henholdsvis tygging og utskillelse av spytt. Spytt inneholder slim og enzymene α-amylase og lingual lipase. Amylasen starter nedbrytningen av stivelse allerede i denne prosessen (Hoebler et al. 2002), mens den linguale lipasen ikke aktiveres før den når magens sure miljø (ph > 2), samtidig som amylasen inaktiveres (Saladin 2010). Når maten forlater munnen fraktes den ned i magen via spiserøret ved hjelp av peristaltiske sammentrekninger som dytter maten nedover (Siddiqui et al. 1991). Mage Magen er delt inn i fire regioner; fundus, korpus (kropp), antrum og pylorus, og hovedfunksjonene er oppbevaring, miksing og tømming av mat, samt noe fordøyelse. De fire områdene i magen har hver sine ansvarsområder, med korpus og fundus som reservoar for ufordøyd mat og ansvarlig for tømming av væske, mens antrum tar seg av blanding og siling av mat, og fungerer som en pumpe for magetømming av fast materiale (Urbain et al. 1989). 8

20 2 INTRODUKSJON Figur 2.3: Magesekkens fire regioner (Kong & Singh 2008) Lagringskapasiteten til magen oppnås ved at den kan utvide seg, slik at den maksimalt kan romme et innhold på rundt fire liter hos en voksen person (Kong & Singh 2008; Saladin 2010), mens utskillelse av magesaft og peristatiske sammentrekninger gjør at innholdet kan blandes og homogeniseres. Magesaften som skilles ut fra kjertler i magen inneholder i hovedsak saltsyre (HCl), gallesalter og fordøyelsesenzymer, i hovedsak gastrisk lipase og pepsin (Kong & Singh 2008; Saladin 2010). ph i tom mage varierer fra 1,3 til 2,25 i friske mennesker, mens inntak av mat vil øke ph til mellom 4,5 og 5,8 grunnet bufferkapasitet i matvarene, men dette avhenger av komponentene i måltidet (Dressman et al. 2007). Saltsyren aktiverer enzymene pepsin og lingual lipase, bryter opp bindevev og cellevegger fra plantemateriale, dreper patogene bakterier og konverterer treverdig jern (Fe 3+ ) til toverdig jern (Fe 2+ ), som absorberes i tynntarmen og brukes i syntesen av hemoglobin (Saladin 2010). Pepsinets hovedoppgave er å bryte ned proteiner fra maten til kortere peptidkjeder, som så sendes videre til tynntarmen hvor fordøyelsen fullføres. I tillegg til disse enzymene skilles det også ut gastrisk lipase, som sammen lingual lipase fra spyttet, fordøyer % av fettet i maten. Resten av fettfordøyelsen skjer i tynntarmen (Saladin 2010). Når magen, ved hjelp av peristaltiske bevegelser, presser maten mot pylorus som er lukkemuskelen mellom mage og tarm, vil den trekke seg sammen for å redusere magetømmingen slik at mageinnholdet bearbeides ytterligere. Magen vil etter hvert gjøre om innholdet til en delvis fordøyd flerfaset blanding kalt kymus, som er en kombinasjon av separate faser av fett, vandige løsninger og fast materiale. Kymus som får passere fra magen og over i tynntarmen (duodenum) har en partikkelstørrelse på maksimalt én til to millimeter 9

21 2 INTRODUKSJON (Thomas 2006), og rundt tre milliliter overføres av gangen (Saladin 2010). På den måten rekker tarmen å nøytralisere magesyren og fordøye litt og litt. Hvor lenge maten oppholder seg i magen avhenger av energiinnholdet i måltidet: kymus med en kaloritetthet på 1 kilokalori (kcal) per milliliter (ml) tømmes fra magen med en hastighet på cirka 2 til 2,5 ml per minutt, mens kymus på 0,2 kcal/ml tømmes med en hastighet på cirka 10 ml per minutt (Dressman et al. 1998). Tarm De videre trinnene i fordøyelsen og absorpsjon av næringsstoffer skjer i tynntarmen, hovedsakelig i duodenum og jejunum (figur 2.2), hvor kymus blandes med gallesalter og saft fra bykspyttkjertel og lever. Bukspyttkjertelen skiller ut bukspytt som er en basisk blanding av enzymer, zymogener (inaktive forløpere til fordøyelsesenzymer), enzyminhibitorer, natrium bikarbonat, etc. Natrium bikarbonat er en svak base som nøytraliserer magesyren (Saladin 2010). Enzymene fra bukspyttkjertelen er blant annet pankreatisk α-amylase som fordøyer stivelse; trypsin og chymotrypsin som fordøyer protein; pankreatisk lipase som fordøyer fett; karboksypeptidase som hydrolyserer aminosyren på karboksylenden (-COOH) i små peptider; og ribonuklease og deoksyribonuklease som fordøyer henholdsvis RNA og DNA (Saladin 2010). For at lipase skal aktiveres er den avhengig av kalsium og gallesalter (Boisen & Eggum 1991). Det finnes også enzymer som er spesifikke for fordøyelse av oligosakkarider og disakkarider i tynntarmes børstesøm, disse gås nærmere inn på i Når næringsstoffene har blitt absorbert gjennom veggene i tynntarmen sendes kymus videre til tykktarmen (Kong & Singh 2008) hvor blant annet ufordøyelige karbohydrater fermenteres av tarmbakteriene Fordøyelse av karbohydrater Stivelse brytes først ned til oligosakkarider som er opp til åtte glukoseenheter lange, deretter til disakkaridet maltose og trisakkaridet maltotriose (Gray 1992), og til slutt til monosakkaridet glukose som absorberes i tynntarmen. Prosessen starter, som nevnt tidligere, allerede i munnen hvor α-amylase fra spyttet hydrolyserer stivelse til oligosakkarider. Amylasen har en optimal virkning ved ph 6,8 til 7, slik det er i munnen 10

22 2 INTRODUKSJON (Saladin 2010). Enzymet inaktiveres raskt av syren i magen, men kan fortsette fordøyelsen i én til to timer etter den har ankommet magesekken, avhengig av sammensetningen av måltidet. Dette skjer fordi den gjemmer seg inne i maten og på den måten unnslipper syren (Saladin 2010). Amylasen virker derfor lengre dersom måltidet er større eller fetere, spesielt i fundus hvor magebevegelsene er svakest og maten brytes ned sakte. Når ph i vellingen nærmer seg 4,5 vil amylasen inaktiveres og brytes ned av pepsin, sammen med proteiner fra maten. (Saladin 2010) Fordøyelse av stivelse fortsetter i duodenum, når kymus blandes med amylase fra bukspyttkjertelen. Stivelsen blir da brutt ned til oligosakkarider og maltose innen kort tid (Saladin 2010). Fordøyelsen er komplett når kymus kommer i kontakt med børstesømmen på epitelcellene. To av enzymene som befinner seg i børstesømmen; dekstrinase og glukoamylase, hydrolyserer oligosakkarider som er tre eller flere residuer lange. Det tredje enzymet, maltase, hydrolyserer maltose til glukose (Saladin 2010). Maltose er til stede i noe mat, men disakkaridene det finnes mest av er sukrose (rørsukker) og laktose (melkesukker), som fordøyes av henholdsvis sukrase og laktase i børstesømmen. Resultatet er monosakkaridene glukose og fruktose fra sukrose, og glukose og galaktose fra laktose, som absorberes raskt (Saladin 2010). Personer som lider av laktoseintoleranse mangler helt eller delvis enzymet laktase slik at de har problemer med å fordøye laktose In vitro fordøyelsesmodeller for å simulere human fordøyelse For å forstå hva som skjer under fordøyelse av karbohydrater har det blitt utviklet en rekke in vitro fordøyelsesmodeller. Generelt utgjør simulering av fordøyelsen tre trinn: munn, mage og tarm, under tilnærmede fysiologiske forhold. Men hvordan de fysiologiske forholdene oppnås varierer mellom de ulike modellene. Eksempler på slike variasjoner er hvor finmalt det som skal fordøyes er ved start, hvor lenge de ulike prosessene varer (for eksempel tid i magen), valg av stivelsesspaltende enzym, temperaturer, ph, og andre faktorer. Slike forskjeller, spesielt trinnene som etterligner tygging, kan ha signifikant påvirkning på den relative beregningen av glykemisk potensial for en gitt matvare rik på karbohydrater (Woolnough et al. 2008). Men uansett hvor mye forskning som gjøres på området vil en in vitro modell sannsynligvis aldri kunne måle seg med det som faktisk skjer in 11

23 2 INTRODUKSJON vivo, til det er det for store fysiologiske utfordringer, og for store ulikheter mellom hvert individ. På grunn av dette bør man ha et kritisk syn på refererte in vitro fordøyelsesmodeller i litteraturen, med hensyn på sammenligning av resultater fra de ulike modeller. Av de metodene som benyttes i denne oppgaven er NSP-metoden (Englyst et al. 1994) og enzymatisk-gravimetrisk metode (McCleary et al. 2010) standardisert i forhold til analyse av kostfiber; det er ikke modellen til Aura (Aura et al. 1999), verken med kommersielle eller humane enzymer fra mennesker. Selv om de to førstnevnte er standardisert for kvantifisering av kostfiber, er det vesentlige ulikheter mellom dem; enzymatisk gravimetrisk metode inkluderer både NSP, lignin og noe resistent stivelse i det grovisolerte kostfibret, mens NSP-metoden kun detekterer NSP (Anderson 1990), som kvantifiseres indirekte via mengde monosakkarider i prøvematerialet Prosessering påvirker fordøyelighet av stivelse Først er det viktig å påpeke at ikke all stivelse nødvendigvis er fordøyelig stivelse, og man kan dele stivelsen inn i tre grupper; raskt fordøyelig stivelse, sent fordøyelig stivelse og resistent stivelse. Resistent stivelse fordøyes ikke i tynntarmen hos friske mennesker, og den gir derfor heller ingen økning i blodsukkeret. Den fortsetter til tykktarmen hvor den fermenteres av mikroorganismene og fungerer derfor som kostfiber (BeMiller 2007). Faktorer som påvirker fordøyeligheten av stivelse er blant annet grad av gelatinisering, størrelse på granulene, amyloseinnhold, stivelse-protein interaksjoner, stivelse-lipid komplekser, og grad av krystallisering, inkludert det som dannes av retrogradring under prosessering (BeMiller 2007). Varme øker biotilgjengeligheten av stivelse ved å splitte stivelsesgranulene og gjøre stivelsen mer tilgjengelig for amylasen, slik at nylig varmebehandlet stivelse vil være lett fordøyelig (Brand et al. 1985). Men dersom en matvare inneholdende stivelse varmebehandles for så å bli avkjølt, vil stivelsen omdannes til resistent stivelse som et resultat av krystallisering og retrogradering av amylose og amylopektin, og dermed ikke være mulig å fordøye (BeMiller 2007). Dette er årsaken til at tilhengere av den såkalte lavkarbo-dietten kan spise kokt og avkjølt potet med god samvittighet. 12

24 2 INTRODUKSJON 2.4 Bygg (Hordeum vulgare) Foredlet bygg (Hordeum vulgare) tilhører familien Poaceae (gressfamilien), stammen Triticeae og slekten Hordeum. Det er uklarheter angående hvor planten stammer fra, men flere mener at H. vulgare har blitt utviklet gjennom mutasjoner av Hordeum spontaneum, som fortsatt er å finne i deler av Asia og nordlige deler i Afrika (Harlan & Zohary 1966; Zohary & Hopf 1988) Kornet Byggkornet (figur 2.4) består av inneragne, forblad, selve kornet og hovedakset. Inneragne og forblad utgjør skallet i et modent byggkorn. Cellulose, lignin og silisium (silica) er hovedkomponentene i cellene i inneragne og forbladene, som dør når kornet er modent. Skallet omslutter kornet slik at de adherer til overflaten hos genotyper med skall, mens hos avskallede genotyper vil ikke dette skje. (Harlan 1920). Endospermen utgjør den største delen av kornet, og består av aleuronen, subaleuronen og den stivelsesrike endospermen. Aleuronlaget er et proteinrikt lag av celler som ligger rett under nucellus og frøskallet, og strukturen i de tykke celleveggene i aleuronen holdes oppe av polysakkaridene arabinoxylan og β-glukan. Skallet utgjør om lag 13 % av kornet, mens den stivelsesrike endospermen utgjør klart mest; cirka 76 % (Kent & Evers 1994). Det er i de ytre lagene man finner det som kalles kli og kim, og det er her det meste av kostfibret, vitaminer og mineraler befinner seg. 13

25 2 INTRODUKSJON Figur 2.4: Tverrsnittet av et byggkorn (Newman & Newman 2008) Stivelse i bygg Den største komponenten i gruppen karbohydrater er stivelse, som anses å være et løselig polysakkarid og hovedkilden til energi i bygg, både til en konsument og til vekst av en ny plante etter spiring. Stivelse er også den komponenten i bygg som varierer mest i mengdeinnhold; 45 % i korn med lite innhold og opp til 65 % i dem med mye, anhengig av miljømessige vekstbetingelser og fyllingsgraden av endospermen. Stivelsen lagres kun i endospermen i et modent korn, men fordeles ujevnt. Sentralt lokaliserte endospermceller inneholder høyere nivåer stivelse enn celler i subaleuronen, som ofte inneholder mer protein (Newman & Newman 2008). Stivelse i bygg er satt sammen av to polymerer; amylopektin og amylose. Amylopektin er et forgrenet polysakkarid hvor -(1,4)-D-glukose enheter er forgrenet via -(1,6)-D-glukose bindinger, mens amylose er hovedsakelig en rett kjede av -(1,4)-D-glukose enheter. Selv om amylose anses som en lineær komponent i stivelse, finnes det forgreninger også i dette molekylet (MacGregor & Fincher 1993). Sidekjedene i amylosen fra bygg har ikke blitt fullstendig karakterisert, men de kan variere i størrelse; alt fra fire til hundre glukoseenheter 14

26 2 INTRODUKSJON (Takeda et al. 1984). Amylopektinet i bygg er et stort molekyl (Banks et al. 1972), men til tross for dette har den en relativt lav viskositet i løsninger sammenlignet med amylose, dette skyldes blant annet forgreningene som øker løseligheten. Amylosemolekylene er mindre enn amylopektinmolekylene, og befinner seg i en heliksstruktur. (MacGregor & Fincher 1993). I de fleste byggtyper utgjør amylopektin 72 til 78 % av stivelsen, mens amylose utgjør de resterende 22 til 28 %. Selv om bygg ofte inneholder amylopektin og amylose i en ratio på 3:1, inneholder visse varieteter stivelse som består av 95 til 100 % amylopektin, og det finnes minst tre sorter som inneholder 40 til 70 % amylose av det totale stivelsesinnholdet. Betegnelsen waxy gis til byggsorter som inneholder mye amylopektin, og ikke-waxy bygg vil si dem med en normal ratio på 3:1 av amylopektin og amylose. Waxy bygg inneholder 5 til 8 % mindre total stivelse enn normal ikke-waxy bygg (Ullrich et al. 1986; Xue et al. 1997). Men reduserte nivå av stivlese er ofte forbundet med små økninger i enkle sukker som fruktose, glukose og sukrose, samt fiberkomponenten -glukan (Xue et al. 1997). Bygg som inneholder mer amylose enn normalt (40 til 70 % av totalt) i stivelsen klassifiseres som høy-amylose sorter Fritt sukker; glukose, fruktose og sukrose Lave nivåer av enkle sukker og oligosakkarider (små polymerer) er funnet i byggkornet i tillegg til stivelseskomponenter (Henry 1988). Dette er sukker som absorberes direkte av kroppen under fordøyelse. Monosakkaridene glukose og fruktose er de enkleste karbohydratene, og forekommer i veldig små mengder (<0,2 %), i hovedsak i den modne endospermen. Små mengder av disakkaridet maltose (0,1 til 0,2 %) kan noen ganger finnes i endospermvev nær embryo, mens disakkaridet sukrose, som er en komponent i syntesen av stivelse, representerer 50 % av enkle sukker funnet i byggkorn (Newman & Newman 2008). Nivåene av sukrose varierer fra 0,74 til 0,84 %, med 80 % av dette lokalisert i embryo (MacGregor & Fincher 1993). Videre så har det blitt funnet nivåer av trisakkaridet raffinose på mellom 0,3 og 0,8 %, også dette er hovedsakelig lokalisert i embryo (Mac Leod 1957). 15

27 2 INTRODUKSJON Kostfiber Ikke-stivelses polysakkarider, eller non-starch polysaccharides (NSP), i byggkornet er strukturelle komponenter i celleveggene i skall-, aleuron- og endospermvev. NSP utgjør en stor del av kostfibret, men ikke alt. For eksempel så inkluderes ikke det vannuløselige kostfibret lignin og resistent stivelse i NSP (Anderson 1990). Den største andelen ikke-stivelses polysakkarider i bygg utgjøres av -glukaner, arabinoxylaner og cellulose (Newman & Newman 2008). Cellulose er en langkjedet polymer av -(1,4) bundet glukoseenheter hovedsakelig funnet i skallet, nært relatert til lignin (Mac Leod 1959), men små mengder er også lokalisert i aleuron og stivelsesrik endosperm (Fincher & Stone 1986). Cellulosen utgjør omtrent 40 % av skallets tørrvekt. I tillegg til å være uløselig i vandige løsninger er cellulosemolekyler relativt lite fleksible på grunn av hydrogenbindinger til nærliggende glukosylenheter (Gardner & Blackwel.J 1974). Cellulosenivåene varierer fra 4,1 til 4,8 % i skallet bygg og 2,0 til 2,9 % i avskallet bygg (Xue et al. 1997). Arabinoxylan og -glukaner er komponenter i celleveggstrukturen i både aleuron- og stivelsesrikt endospermvev, men varierer omvendt i deres ratio i disse to vevene. Arabinoxylan utgjør % av celleveggene i aleuronen, mens -glukan utgjør rundt 26 %. I de stivelsesrike celleveggene i endospermen utgjør derimot arabinoxylan % og - glukan rundt 70 % (Duffus & Cochrane 1993). Arabinoxylan i bygg er fra en polysakkaridfamilie hvor det finnes variasjoner i molekylstørrelse, sammensetning, struktur og løselighet (Vietor et al. 1992), følgelig er arabinoxylan både vannløselig- og uløselig (Virkki et al. 2005). Disse polysakkaridene, som prinsipielt sett er satt sammen av arabinose og xylose, har hovedsakelig blitt funnet i aleuron- og endospermcellevegger, men forkommer også i skallet (Aspinall & Ross 1963). Arabinoxylanene varierer svært mye i deres forhold mellom xylose og arabinose. I skallet har raten vist seg å være rundt 1:9 (Aspinall & Ferrier 1957), men det har også blitt rapportert om en rate på 1:3 i stivelsesrik endosperm- eller aleuronvev (MacGregor & Fincher 1993). Raten varierer med hensyn på genotype og miljømessige årsaker (Henry 1986). 16

28 2 INTRODUKSJON Av alle komponentene som utgjør det totale kostfibret i bygg, er β-glukanenen antakeligvis den viktigste med tanke på helseeffekter. β-glukan består av tunge lineære kjeder av β- glukosylenheter polymerisert både via β-(1,3)- og β-(1,4)-bindingene. β-glukaner i bygg tilhører en familie polysakkarider som er heterogene i forhold til molekylstørrelse, løselighet og molekylstruktur (MacGregor & Fincher 1993). I motsetning til cellulose, er β-glukanene delvis vannløselige, en egenskap som har sammenheng med de spredte β-(1,3)-bindingene, som gir et molekyl med ganske ulik romlig arrangering sammenlignet med kun β-(1,4)- bindinger. β-glukannivåene i bygg modifiseres ofte av miljøet, spesielt varme og tørke under modningen av frøet gir som regel økte nivåer β-glukan (Anderson et al. 1978; Bendelow 1975). Men den genetiske bakgrunnen er den viktigste faktoren for det endelige β- glukaninnholdet i kornet. Nivåene av β-glukan varierer fra 2,0 til 11 %, men at det ligger vanligvis mellom 4,0 og 7,0 % (MacGregor & Fincher 1993) Prosessering av bygg Avskalling og sliping er prosesser hvor det ytre laget av kornet gradvis fjernes for å lage et spiselig produkt. Skallet representerer 10 til 13 % av tørrvekten til et korn, men under noen forhold kan avskalling i en kommersiell avskallings- eller slipemaskin fjerne så mye som 20 % av kornets tørrvekt (Newman & Newman 2008). Sliping, som vanligvis skjer etter avskalling, utføres oftest i tre eller flere trinn. Det siste trinnet kalles ofte for polering. Graden av sliping, oftest med prosentbenevning, refererer til mengden av kornet som fjernes under prosessen. Det har blitt funnet at nivåene av løselig kostfiber øker i fraksjonene opp til rundt 30 % sliping, mens over dette stabiliserer verdiene seg. Stivelsesnivåene vil derimot fortsette å stige opp mot 80 % sliping (Knudsen & Eggum 1984), ettersom stivelsen i hovedsak befinner seg i aleuronen. Sammenligning av sliping av non-waxy og waxy avskallet bygg viser at β- glukannivåene i slipte korn av non-waxy bygg øker opp til rundt 25 % sliping, etterfulgt av gradvis reduksjon desto mer som slipes av kornet. Disse observasjonene kan antyde at 17

29 2 INTRODUKSJON konsentrasjonene av β-glukan er høyest i aleuron, subaleuron og i ytre deler av stivelsesrik endosperm i non-waxy bygg. I motsetning til dette, indikerte en gradvis økning av β-glukan i de slipte kornene i waxy bygg en positiv konsentrasjonsgradient av disse komponentene mot midten av kornet. 2.5 Brokkoli (Brassica oleracea L. var. italica Plenck) Brokkoli er en svært gammel kulturplante som ble dyrket av grekerne og romerne allerede for over 2000 år siden. Den tilhører korsblomstfamilien og slekten Brassica, sammen med blant annet blomkål, som den er en nær slektning av. Brokkolien har lenge vært en viktig matplante, og rundt år 1925 kom den til Amerika med italienske emigranter. Det skulle derimot ta nesten 20 år før den kom til Norge; rett før andre verdenskrig brøt ut i landet begynte de første forsøkene med grønnsaken (Balvoll 1976). I dag spiser nordmenn norsk brokkoli store deler av sommeren, mens i vintermånedene er det for kaldt for vellykkede avlinger slik at mesteparten da importeres. Brokkolien er som sagt en nær slektning av blomkålen, og likhetstrekkene mellom dem utseendemessig er derfor også relativt store. Det som ved første øyekast skiller de to grønnsakene fra hverandre er fargeforskjellene. Dette skyldes brokkoliens grønne klorofyllrike hode, som har blomsterknopper på alle forgreninger. Forgreiningene er tykke og sprø blomsterstilker som strekker seg oppover slik at hodet løser seg opp, det er dette som er det matnyttige produktet. Brokkolien som dyrkes i Norge er en ettårig plante (Balvoll 1976) slik at opplagsnæring i form av stivelse ikke er nødvendig for den Fritt sukker; glukose, fruktose og sukrose Type og konsentrasjon av fritt sukker påvirker smaken i ulike sorter fra slekten Brassica (Rosa et al. 2001). Av løselige sukker er fruktose, glukose og sukrose de det finnes mest av i Brassica (King & Morris 1994), hvorav fruktose utgjør mellom 48,8 % og 56,9 % av det totale sukkerinnholdet i brokkoli. Glukose kommer på andre plass (29,6 35,5 %), mens sukrose utgjør et maksimum på 20,5 % (Rosa et al. 2001). 18

30 2 INTRODUKSJON Det har blitt vist at disse nivåene varierer i forhold til når på året brokkolien er dyrket; det generelle innholdet av frie sukker har vist seg å være høyere i brokkoli som er dyrket vår/sommer (mars-juli), som er det som er aktuelt her i Norge, enn sommer/vinter (augustjanuar). Om det er første- eller annengangsblomstring har også betydning, da den første blomsten har vist seg å ha et lavere innhold av fritt sukker enn den andre, med unntak av sukrose Kostfiber Ettersom det ikke er gjort like mye forskning på brokkoli i forhold til dens karbohydratinnhold som det er gjort på korn, vil det i dette avsnittet tas utgangspunkt i hvit kål (Brassica oleracea var. capitata), hvor det derimot finnes en del data. Hvit kål er et medlem i slekten Brassica som det er gjort mange studier på i forhold til karbohydrater og kostfiber. Karbohydratene utgjør hovedkomponenten i hvit kål, og utgjør hele 90 % av tørrvekten, hvorav cirka én tredjedel er kostfiber og to tredjedeler er lavmolekylære karbohydrater (Wennberg et al. 2006). Det gjennomsnittlige nivået totalt kostfiber ligger på 241 gram per kilogram tørrstoff, hvorav 26 % av dette er løselig. Hovedkomponentene i det løselige kostfibret er uronsyre (56-65 %), arabinose (15-25 %) og galaktose (12 %). Hovedkomponentene i det uløselige kostfibret er derimot glukose (45-56 %), men også her finnes det vesentlige mengder uronsyre (17-26 %), arabinose (6-11 %) og galaktose (6-8 %) (Wennberg et al. 2002). Store deler av celleveggene i frukt og grønnsaker består av de vannuløselige kostfiberkomponentene cellulose og hemicellulose, det løselig kostfibret pektin, samt vann, små mengder strukturelle glykoproteiner, fenolestere, mineraler og enzymer. Generelt sett så består den polymere sammensetningen av primærcellevegger i tofrøbladede planter av om lag 35 % pektin, 30 % cellulose, 30 % hemicellulose og 5 % protein, men dette varierer. Under modning, prosessering og lagring skjer det strukturelle endringer i polysakkaridene i celleveggene, mest i pektinene, men også til en viss grad i hemicellulose og materiale bygd 19

31 2 INTRODUKSJON opp av cellulose. Disse endringene er relatert til modifikasjoner i funksjonelle egenskaper (tekstur, reologi) (Sila et al. 2009) Pektin Pektinet spiller en viktig rolle i dannelsen av høyere plantecellevegger, som gir styrke og støtte til planten, men som samtidig er svært dynamiske strukturer. Pektin påvirker også ulike celleveggstrukturer, som blant annet porøsitet, overflateladning, ph, og ionebalanse, og er derfor viktig for ionetransporten i celleveggene (Voragen et al. 2009). Den tredje store rollen til pektin i planten er at de bidrar i aktiveringen av plantens forsvarsrespons (Nothnagel et al. 1983). Pektin er en familie av kovalent bundet svært komplekse polysakkarider i plantecellevegger (Albersheim et al. 1996). Galakturonsyre (GalA) er det sukkeret det finnes mest av, og det utgjør cirka 70 % av pektinet (Mohnen 2008). Gruppen inkluderer blant annet homogalakturonan (HG), rhamnogalakturonanene I (RG-I) og II (RG-II), galaktaner, arabinaner og andre polysakkarider (Cosgrove 2005). Det vanligste pektin polysakkaridet er HG. Det er en lineær homopolymer bestående av α- (1,4)-koblede GalA-enheter, og det utgjør cirka 60 % av den totale pektinmengden (Mohnen 2008). Det har blitt observert at HG ofte er satt sammen av rundt 100 GalA-enheter (Thibault et al. 1993), men også kortere områder har blitt detektert mellom andre pektinpolysakkarider (Nakamura et al. 2002). Karboksylgruppene på karbon fem (Gnanasambandam & Proctor 2000) eller seks (Voragen et al. 2009) i GalA, kan til en viss grad metylesterifiseres med metanol, som vil si dannelse av metylestere (-COOCH 3 ). I forhold til grad av metylering (også kalt esterifisering), kan pektin deles inn i to undergrupper: pektin med over 50 % esterifiseing kalles høy-metoksyl pektiner (HM pektiner), mens de med mindre enn 50 % esterifisering kalles lav-metoksyl pektiner (LM pektiner). De gjenværende karboksylgruppene som ikke er esterifisert, er til stede i form av frie syrer (-COOH) eller som salt (-COO - Na + ) (BeMiller 2007). Graden og mønsteret av metyleringen av karboksylgruppene er sterkt relatert til pektinets funksjonalitet (Gnanasambandam & Proctor 2000; Houben et al. 2011). 20

32 2 INTRODUKSJON Hovedkjeden til RG-I er satt sammen av repeterte enheter av galakturonsyre og rhamnose: [α-d-(1,4)-galpa-α-l-(1,2)-rhap]. Rha-enhetene i RG-I kan få galaktosyl- og/eller arabinosylinneholdende sidekjeder av nøytrale sukker på det fjerde oksygenet (Cosgrove 2005; Westereng et al. 2008). RG-II er det mest strukturelt komplekse pektinet, og har lik hovedkjede som HG; α-d-(1,4)- bundede GalA-enheter som inneholder samlinger av fire ulike hetero-oligomere sidekjeder (Voragen et al. 2009). RG-II utgjør omtrent 10 % av det totale pektinet (O'Neill et al. 2004). Til slutt er det xylogalakturonan (XGA) som er et pektin polysakkarid bestående av en hovedkjede av GalA, lik som HG, med monomere og korte oligomere β-d-xyl sidekjeder på det tredje oksygenet (Ralet et al. 2009). Cellulose og hemicellulose Hemicellulose er en gruppe komplekse polysakkarider med enheter satt sammen av β-d-(1-4)-glykaner som ligner cellulose. De binder seg til overflaten på cellulose slik at de kun kan ekstraheres fra plantecellevegger ved bruk av en strek alkali (Cosgrove 2005). Hemicellulosene består av xyloglukan, xylaner (inkludert glukuronoxylan, arabinoxylan og glukuronoarabinoxylan), og mannaner (inkludert glukomannan, galaktomannan og galaktoglukomannan) (Cosgrove 2005). I kontrast til pektin skjer det minimale strukturelle endringer i cellulose og hemicellulose ved oppvarming av plantebaserte matvarer (Sila et al. 2008) Varmebehandling av brokkoli Varmebehandling av frukt og grønnsaker er kjent for å øke vannbindingsevnen og gjøre dem mykere. En viktig årsak til økt mykhet er delvis som følge av løseliggjøring og depolymerisering av pektinpolymerer som er involvert i adhesjonen mellom cellene (Greve et al. 1994; Vanburen 1979; Waldron et al. 1997). Kjemisk depolymerisering av pektinet under varmebehandlingen skjer på grunn av - eleminering og/eller syrehydrolyse, avhengig av graden av metylering og ph; pektin med en 21

33 2 INTRODUKSJON høy grad av metylering er mer utsatt for -eliminering enn pektin med lav grad av metylering (Fraeye et al. 2007; Krall & McFeeters 1998; Sajjaanantakul et al. 1989). Blansjering kan påvirke den fysiokjemiske strukturen til kostfibret, for eksempel slik at forholdet mellom løselig og uløselig fiber endres, eller viskositeten og den molekylære vekten. Varmebehandling har vist seg å kunne løse opp og degradere uløselig fiber til mindre fragmenter slik at de kan forsvinne ut i kokevannet (Nilsson et al. 2006; Svanberg et al. 1997). Disse endringene kan være et resultat av hydrolyse av glykosidbindinger inne i polysakkaridene eller brudd i hydrogenbindinger mellom polymerene i kostfibret (Krall & McFeeters 1998; Selvendran & Robertson 1994). Varmebehandling i vann vil også gi tap av lavmolekylære komponenter som mineraler, vitaminer og sukker fra plantecellene og ut i vannet, slik at det blir en relativ økning av andre substanser i brokkolien, som for eksempel kostfiber (Wennberg et al. 2006). 2.6 Kromatografi Separering og kvantifisering av monosakkarider har i denne oppgaven vært et svært viktig verktøy. For å kunne gjøre det har det i hovedsak blitt brukt to ulike metoder; høytrykks væskekromatografi med puls-amperometrisk deteksjon (HPAEC-PAD) og gass-væske kromatografi med flammeionisasjonsdetektor (GLC-FID). Begge metodene gir kvalitative og kvantitative analyser av karbohydratsammensetningen i en løsning, men HPAEC-PAD fortekkes i hovedsak ved analyse av enkle monosakkaridsammensetninger og ved analyse av oligosakkarider. GLC-FID brukes derimot til analyse av komplekse løsninger av monosakkarider. Det vil her bli gitt en overfladisk innføring i begge instrumentene, men det gås ikke i detalj High-performance anion-exchange chromatography med pulsed amperometric detection (HPAEC-PAD) På norsk kan dette oversettes til høytrykks ionebytterkromatografi med puls-amperometrisk deteksjon. Instrument egner seg godt til bestemmelse av polymeriseringsgrad og kvantifisering av mono- og disakkarider. Det er en kromatografisk metode som brukes for 22

34 2 INTRODUKSJON separering av komponenter i løsning, og som blir hyppig brukt i biokjemi og analytisk kjemi for identifisering, rensing og kvantifisering av et stort antall komponenter, som for eksempel sukkerarter næringsmidler. Puls-amperometrisk deteksjon (PAD) brukes sammen med anionbytter-kromatografi, da kombinasjonen av disse gir en sensitiv og selektiv deteksjon av komplekse karbohydratløsninger (Poole 2003). Det finnes to ulike typer ionebyttere; anionbytter og kationbytter. Anionbytter, som har blitt benyttet her, har et kovalent bundet kation og vice versa (Greibrokk et al. 1994). Analytten i en anionbytter er et anion med forskjellig affinitet til kationet, som dermed påvirker retensjonstiden, som er tiden det tar før molekylene har passert kolonnen. Anionbytteren er følgelig ansvarlig for separasjonen av molekylene. Retensjonstiden avhenger av størrelsen på molekylene samt av hvor sterk tiltrekningskraften er mellom kolonnen og molekylene, og den er svært sentral i identifiseringen av de ulike molekylene (Greibrokk et al. 1994). Det er på forhånd laget en standardkurve for mono- og disakkarid som ønskes å detekteres, hvor retensjonstiden til hvert sukker er bestemt. Når det kjøres prøver med et ukjent innhold av sukker identifiseres de i forhold til retensjonstiden, som er karakteristisk hvert sukker. Bestemmelse av konsentrasjonen av hvert mono- og disakkarid gjøres ved å sammenligne topparealene i prøven, mot topparelene i standardkurven. En vanlig internstandard er trehalose, som ikke forekommer naturlig i verken bygg eller brokkoli. Trehalosen kommer ut tidlig i kromatogrammet, og interfererer ikke med noen av analyttene. Ved hjelp av forholdet mellom arealet til internstandardtoppen i prøven og arealet av internstandardtoppen standardkurven, vil man kunne regne ut den nøyaktige konsentrasjonen til det ukjente sukkeret (Greibrokk et al. 1994). Konsentrasjonen av internstandard og prøve må også være kjent. Hovedårsaken til at den benyttes internstandard er for å korrigere for varierende detektorrespons. Andre viktige årsaker er for å korrigere for tap av prøvemateriale (dette er spesielt viktig i GLC, hvor prøvene er svært flyktige), for å korrigere for endringer i injisert volum, og for at det ikke skal være nødvendig å kjøre eksterne standarder for kalibrering før hver analyse (Greibrokk et al. 1994). 23

35 2 INTRODUKSJON Gass-væske kromatografi med flammeionisasjonsdetektor (GLC-FID) Analyse ved hjelp av gass-væske kromatografi gjøres for å undersøke monosakkarider i et prøvematerialet. I denne oppgaven ble metoden brukt i forbindelse med NSP-analyse og analyse av alditolacetater. Ettersom de karbonbaserte alditolacetatene er svært flyktige er GLC en egnet metode, sammen med FID, som detekterer organiske materialer. Gass-væske kromatografi vil si at den mobile fasen i systemet består av en gass, mens den stasjonære fasen er en ikke-flyktig væske (Greibrokk et al. 1994). Ved denne typen analyse vil stoffene i analysematerialet vandre gjennom kolonnen med en hastighet som bestemmes av løselighet i stasjonære fase, flyktighet og temperatur. Desto høyere temperaturen er, desto kortere er retensjonstiden gjennom kolonnen, men samtidig kan separasjonen av stoffene bli dårlig dersom temperaturen er for høy (Greibrokk et al. 1994). Også her brukes det en internstandard og standardkurve for å beregne ukjente mengder av ukjente komponenter i prøvene. Standardkurven settes opp etter analyse av løsninger med kjent vektforhold mellom prøve og internstandard, hvor forholdet mellom topparealene plottes mot vektforholdet (Greibrokk et al. 1994) på samme måte som beskrevet i avsnittet om HPAEC-PAD. 24

36 3 MATERIALER OG METODER 3 Materialer og metoder I denne oppgaven har fokusert vært rettet mot fordøyelse av blansjert og rå brokkoli, samt kokt og ubehandlet Møllerens boil-in-bag byggris. Laks ble kun brukt i interaksjonsforsøkene og Sjåk byggris ble brukt for å undersøke eventuelle ulikheter mellom mortet og malt byggris i forhold til isolering av kostfiber og tilgjengeliggjort sukker etter simulert fordøyelse. 3.1 Prøveopparbeidelse Boil-in-bag byggris fra Møllerens Norgesmøllene har behandlet byggrisen med damp for å få en snarkokt variant, og slipt den. Opprinnelsen er ukjent, men den er ikke norsk og den er ikke standardisert. Norgesmøllene er sparsomme med detaljerte opplysninger her og deler av prosessen er patentert og utført av bedriftens samarbeidspartnere. I. Ubehandlet byggris: Ubehandlede prøver ble kun malt på Retsch mølle på 0,5 millimeter. De ble så oppbevart ved 20 ºC gjennom hele perioden. Tørrstoff i ubehandlet hel byggris: 89 % II. Varmebehandlet byggris: Prøver som skulle varmebehandles ble kokt etter anvisning på pakken; i 13 minutter med én teskje salt. Vaskevannet, som ved normal bearbeiding blir helt av, ble ikke analysert. Innholdet i pakkene ble så avkjølt, fryst og frysetørket. Etter dette ble også disse malt på Retsch mølle på 0,5 millimeter og oppbevart ved 20 ºC hele perioden. Tørrstoff i fersk kokt byggris (før frysetørking): 35,6 % 25

37 3 MATERIALER OG METODER Byggris fra Sjåk Byggrisen var på forhånd blitt avskallet. Den ble kokt i et overskudd av vann (100 ml vann per 15 g. byggris) i 45 minutter, avkjølt og oppbevart ved 20 ºC. Byggrisen ble kun mortet, ikke frysetørket og malt. Tørrstoff i kokt hel byggris: 29,4 % Figur 3.1: Til venstre vises Sjåk byggris, til høyre vises Møllerens boil-in-bag snarkokte byggris. Som bildet viser er Møllerens byggris delt opp i mindre biter og det kan se ut til at denne typen er noe mer slipt enn byggrisen fra Sjåk Brokkoli Brokkolien som ble brukt i Det sunne måltidet er dyrket på Skallerød gård på Jeløy i Moss, og er av sorten Ironman. Brokkolien ble høstet 107 dager etter såing. Den ble lagret ved 2 ºC i ett døgn, før den ble delt i buketter med cirka 2 cm stilk fra sekundær gren på buketten. Midtbuketter på over 36 gram ble delt i to. I. Rå brokkolibuketter: Rå brokkolibuketter ble fryst ved hjelp av flytende nitrogen, vakuumpakket og oppbevart ved 40 ºC før de ble finmalt i kjøkkenmaskin. Deretter ble de oppbevart ved 20 ºC. 26

38 3 MATERIALER OG METODER II. Blansjerte brokkolibuketter: Hele brokkolibuketter ble blansjert ved 97 ºC i fem minutter, avkjølt i isvann, og vakuumpakket. Oppbevart ved 70 ºC. Deretter ble de frysetørket, finmalt i kjøkkenmaskin og oppbevart ved 20 ºC resten av forsøksperioden. Tørrstoff i fersk ubehandlet brokkoli og i blansjert brokkoli (før frysetørking): 10 % Laks Grovmalt Salma-laks fra Bremnes Seashore AS ble tint og trykket sammen slik at tykkelsen var rundt 5 millimeter før den ble vakuumpakket. Den ble så varmebehandlet i to minutter ved 70 ºC, etterfulgt av rask avkjøling i isvann. Tørrstoff i kokt laks: 33,3 % 3.2 In vitro fordøyelsesmetoder Det er brukt fire ulike in vitro modeller for fordøyelse; NSP-analyse (Englyst et al. 1994), enzymatisk-gravimetrisk metode (McCleary et al. 2010), in vitro enzymatisk fordøyelse for hydrolyse av stivelse og protein (Aura et al. 1999), og en metode som er basert på Aura sin, men hvor de kommersielle enzymene er byttet ut med humane fordøyelsesenzymer (Ulleberg et al. 2011) Metode for måling av total NSP (non-starch polysaccharides) Dette er en metode for kvantitativ og kvalitativ bestemmelse av kostfiber som ikke-stivelses polysakkarider, i henhold til Englyst sin metode (Englyst et al. 1994). Metoden baseres på enzymatisk hydrolyse og fjerning av stivelse, etterfulgt av syrehydrolyse av NSP til deres respektive nøytrale monosakkarider (rhamnose, fukose, mannose, galaktose, glukose, xylose og arabinose). Disse identifiseres og kvantifiseres ved gass-væske kromatografi (GLC). Metoden ble utført på ubehandlet og kokt byggris fra Møllerens samt rå og blansjert brokkoli (fra avsnitt og 3.1.3), to paralleller av hver. Det ble i tillegg brukt to referanser; 27

39 3 MATERIALER OG METODER pulverpreparat fra eple (ERM-BC 516) og gulrot (ERM-BC 515), med et kjent innhold av ikkestivelses polysakkarider som kontroll (Vedlegg 2) (Institute for Reference Materials and Measurements (IRMM) & European Reference Materials (ERM) 1996). Fremgangsmåte Det ble første laget en standardløsning bestående av 520 milligram (mg.) rhamnose, 480 mg. fukose, 4750 mg. arabinose, 4450 mg. xylose, 2300 mg. mannose, 2820 mg. galaktose, 9400 mg. glukose og 2790 mg. galakturonsyre som ble fortynnet til én liter med 50 % benzosyre. 300 mg finmalt prøve ble fordelt i hver sine 50 ml Kimaxrør. Til hvert rør ble det tilsatt 250 mg. syrevasket sjøsand og ca 15 glassperler slik at pelleten skulle være mulig å knuse i punkt III. I. Dispersjon og enzymatisk nedbrytning av stivelse simulert fordøyelse Prøvene ble tilsatt 2 ml dimetylsulfoksid (DMSO) for å svelle stivelsen (slik at den var tilgjengelig for α-amylase fra Termamyl), og mikset ved hjelp av vorteksmikser slik at alt ble vætet. I løpet av fem minutter ble prøvene vorteksmikset tre til fire ganger. Rørene ble så plassert i kokende vannbad i 20 sekunder før de ble mikset igjen. Etter dette stod de i 30 minutter i det kokende vannbadet. Rørene ble mikset igjen og tilsatt 8 ml av enzymløsning 1. Enzymløsning 1 bestod av 2,5 ml Termamyl 120 L (Novozymes, U/g) fortynnet til 200 ml med varm natriumacetatbuffer (ph 5,2) som på forhånd var varmet til 50 ºC. Enzymløsningen ble blandet godt inn i prøven før rørene ble satt tilbake i det kokende vannbadet i 10 minutter. Deretter ble de overført til et vannbad som holdt 50 ºC. Der stod de i tre minutter før de ble tilsatt enzymløsning 2. Enzymløsning 2 ble laget ved å løse 1,2 gram Pancreatin (Sigma- Aldrich, P-7545, 8 x USP Unit; 8 x 25 USP units/mg amylase, 8 x 25 USP units/mg protease og 8 x 2 USP units/mg lipase) i 12 ml destillert vann, for så at løsningen ble sentrifugert ved 1500 g i 10 minutter (Heraeus, Multifuge 4KR). 10 ml av supernatanten ble pipettert ut og tilsatt 2,5 ml Promozyme 400 L (Novozymes). Promozyme inneholder pullanase som er et enzym laget spesifikt for å katalysere hydrolysen av (1,6)-bindinger i amylopektin. Det produserer flere lineære, men lavmolekylære molekyler fra forgreningene (BeMiller 2007). 28

40 3 MATERIALER OG METODER Rørene ble grundig vorteksmikset før de ble innkubert ved 50 ºC i 30 minutter. Vorteksmiksingen ble gjentatt etter 10, 20 og 30 minutter i vannbadet. For å stoppe enzymaktiviteten ble prøvene overført til et kokende vannbad i 10 minutter. II. Felling og vask av residuet totalt NSP Etter 10 minutter i kokende vannbad ble rørene avkjølt i isvann, før de ble tilsatt 0,15 ml 5 M saltsyre. I løpet av de neste fem minuttene ble samtlige rør vorteksmikset tre ganger mens de fortsatte å stå i isvannet. 40 ml surgjort absolutt etanol ble tilsatt og mikset godt inn i prøvene. Inkubasjon i 30 minutter på is. Deretter ble prøvene sentrifugert (Heraeus, Multifuge 4KR) ved 1500 g i 10 minutter. Supernatanten ble fjernet og pelleten løst ved hjelp av miksing i 10 ml 85 % surgjort etanol. Ytterligere 40 ml surgjort 85 % etanol ble tilsatt og prøvene ble mikset godt. Denne vaskeprosedyren ble gjentatt to ganger. 30 ml aceton ble tilsatt og prøvene ble vorteksmikset. De ble så sentrifugert ved 1500 g i 10 minutter før supernatanten ble fjernet og pelleten fikk lufttørke over natta. Da pelletene ikke var helt tørre dagen etter ble de satt i vannbad ved 50 ºC til all acetonen var dampet av. III. Syrehydrolyse av residuet Pelleten ble knust ved hjelp av en morter og tilsatt 5 ml 12 M svovelsyre som ble mikset godt inn i prøven. Cellulosen i prøvene ble svellet ved å innkubere ved 35 ºC i 30 minutter, med vorteksmiksing etter 5, 10 og 20 minutter. 25 ml destillert vann ble tilsatt, og prøvene ble hydrolysert videre i kokende vannbad i en time. I løpet av denne tiden ble prøvene mikset én gang etter ti minutter. Hydrolysen skjer ved at et vannmolekyl bryter glykosidbindingene som holder molekylene sammen, ved hjelp av syre og varme som katalysatorer (BeMiller 2007). Prøvene ble avkjølt og satt i kjøleskap. 29

41 3 MATERIALER OG METODER IV. Behandling videre og opparbeidelse av kalibreringsløsning 1 ml av standard sukkerløsning ble tilsatt 5 ml 2,4 M svovelsyre. 1 ml av denne og 1 ml av hver av de hydrolyserte prøvene (to paralleller) ble fordelt i hver sine rør, før 0,5 ml internstandard (1 mg/ml allose) ble tilsatt. Prøvene ble deretter satt i isvann og tilsatt 0,4 ml 12 M ammoniakk. Det ble kontrollert at prøvene var basiske med phpapir. Ytterligere 0,1 ml 12 M ammoniakk ble tilsatt. Deretter ble det tilsatt 0,1 ml ammoniakk/natrium-borhydrid og rørene ble innkubert uten kork ved 40 ºC i 30 minutter. Det var i denne prosessen det ble dannet alditoler ved reduksjon av karbonylgruppene. 0,2 ml iseddik ble så tilsatt og mikset godt inn i prøven, før 0,5 ml av hver prøve ble overført til nye 30 ml Kimax-rør. Prøvene ble tilsatt 0,5 ml methyl-imidazol og 5 ml eddiksyreanhydrid som ble mikset godt inn. De ble stående i 10 minutter før 0,9 ml absolutt etanol ble tilsatt. 10 ml destillert vann ble så tilsatt etter ytterligere fem minutter. Etter enda ytterligere fem minutter ble 0,5 ml bromfenolblått tilsatt, prøvene ble mikset for så å bli satt i isvann. 5 ml 7,5 M kaliumhydroksid ble tilsatt og korken ble skrudd på med en gang for å unngå avdamping. Etter to minutter ble enda 5 ml 7,5 M kaliumhydroksid tilsatt og fordelt i prøvene ved å vende rørene opp-ned et par ganger. Prøvene stod i isvannet til det ble dannet to faser. Den øverste gule fasen, inneholdende svært flyktige alditolacetater, ble overført til GC-rør. Analyse med hensyn på nøytrale sukker ble gjort ved hjelp av gass-væske kromatografi (GLC). 30

42 3 MATERIALER OG METODER 31

43 3 MATERIALER OG METODER Figur 3.2: Flytskjema for analyse av kostfiber som total NSP (Englyst et al. 1994). Det første trinnet; Dispersjon og enzymatisk nedbrytning av stivelse, simulerer fordøyelse av stivelse. 32

44 3 MATERIALER OG METODER Bestemmelse av totalt kostfiber ved enzymatisk-gravimetrisk metode Denne metoden er en bearbeidet versjon av enzymatisk-gravimetrisk metode (AOAC offisiell metode 2009.xx) (McCleary et al. 2010), som er laget på grunnlag av tidligere offisielle AOAC metoder; , , , og , for bestemmelse av kostfiber definert av Codex Alimentarius. Prinsippet for metoden går ut på enzymatisk hydrolyse av stivelse, og utfelling av kostfiberfraksjoner ved hjelp av varm etanol. Forsøket ble i hovedsak utført på 1 gram frysetørket og finmalt materiale av Møllerens byggris (3.1.1) og brokkoli (3.1.3). Men for å se hvor mye prøvemateriale som kunne fordøyes uten å øke enzymaktivitet, ble metoden også utført på ulike mengder mellom 0,25 gram og 2 gram frysetørket og finmalt materiale. I tillegg ble metoden brukt i to øvrige analyser: a) Undersøkelse av eventuelle interaksjoner mellom komponentene i Det sunne måltidet ; byggris, brokkoli og laks når de fordøyes sammen. Det ble da veid inn 0,5 gram tørrstoff av hver komponent i prøver bestående av to komponenter, mens i prøver bestående av tre komponenter ble det veid inn 0,35 gram tørrstoff av hver. Byggris og brokkoli var frysetørket og finmalt, mens laksen ble kokt og delt opp i små biter. b) Undersøkelse av forskjeller mellom Sjåk- og Møllerens byggris, og hvorvidt prøvepreparering påvirker resultatene. To ulike metoder for preparering ble sammenlignet; 1) kokt, frysetørket og malt; 2) kokt og mortet. Sjåk byggris ble kun kokt og mortet, mens Møllerens byggris ble preparert i henhold til begge metodene. Det ble veid inn 1 0,02 gram tørrstoff og 0,3 0,09 gram tørrstoff av begge sortene. Det ble hele tiden benyttet tre paralleller av hver prøve. 33

45 3 MATERIALER OG METODER Fremgangsmåte En bestemt mengde materiale ble veid inn i 250 ml Duran flasker og vætet med 1 ml 95 % etanol. Det ble så tilsatt 8 U/mL pankreatisk α-amylase (Sigma-Aldrich A-3176, 25 U/mg) og 3,4 U/mL amyloglukosidase (Sigma-Aldrich A-9228, U/g) som på forhånd var løst i 40 ml 50 mm natriummalat-buffer tilsatt 2 mm kasliumklorid, ph 6. α-amylase er et endoenzym som spalter både amylose og amylopektin. Kombinasjonen av α- amylase og amyloglukosidase utøver hydrolyse ved å frigjøre enkle enheter av D-glukosyl fra de ikke-reduserende endene på amylose- og amylopektinmolekylene, selv også dem som er koblet via (1,6)-bindinger. (1,6)-bindingene er dem som blir tilgjengelige når molekyler av amylopektin brytes ned og forgreningspunktene blottgjøres. Dermed kan enzymene utføre en fullstendig hydrolyse av ikke-resistent stivelse til D-glukose (BeMiller 2007). Deretter fulgte en 16 timers lang innkubering ved 37 ºC med orbitale bevegelser på 150 OPM (Innova 40 Benchtop Incubator Shaker, New Brunswick Scientific). Etter 16 timer ble det tilsatt 3 ml Trizmabase for å avslutte reaksjonen, og ph ble justert til cirka 8. Flaskene ble så plassert i kokende vannbad med noe løsnet kork i 20 minutter. I løpet av denne tiden ble de ristet for hånd tre til fire ganger. Dette ble gjort for å inaktivere α- amylasen og amyloglukosidasen, samt for proteindenaturering. Da temperaturen i løsningen var over 90 ºC ble flaskene tatt ut og avkjølt til 60 ºC g protease (Sigma-Aldrich P-4755, 0,13 U/mg) ble løst i 4 ml 50 % glycerol og 0,2 ml ble tilsatt. Prøvene ble innkubert ved 60 ºC i 30 minutter. Flaskene ble deretter tilsatt 4 ml 2 M eddiksyre slik at ph lå på rundt 4,5, før 180 ml forvarmet (60 ºC) 95 % etanol ble tilsatt. Innholdet i flaskene ble godt mikset slik at det ble dannet bunnfall* av løselig polymert kostfiber, inkludert resistent stivelse. Tre prøver á 1 ml ble tatt ut av hver flaske for å senere kunne bestemme mengde mono- og disakkarider i fordøyd materiale. Innholdet i flaskene ble så filtrert på Whatman filtre (589 3, ca µm, 55 mm), og residuene ble vasket med to ganger 15 ml av følgende: a) 76 % etanol, b) 95 % etanol, og c) aceton. Filtrene med det grovisolerte kostfibret ble til slutt tørket før de ble veid for å finne mengden ufordøyd materiale, altså andelen kostfiber. 34

46 3 MATERIALER OG METODER Metoden ble også utført uten filtrering, men med sentrifugering i stedet. Innholdet i flaskene ble da overført til 50 ml Falconrør etter at den forvarmede etanolen var tilsatt. Den påfølgende vaskeprosedyren med etanol og aceton var lik, med unntak av sentrifugering mellom hver vask i stedet for filtrering. Prøvene som ble tatt ut til glukosedeterminering underveis i metoden ble tørket i en vakuumsentrifuge (ISS110 SpeedVac System, ThermoSavant) og deretter tilsatt 1 ml destillert vann for å reløse blant annet sukker pelleten. 100 µl internstandard (Trehalose 10 mg/ml) ble tilsatt, og 200 µl av prøven ble overført til en 20 ml målekolbe. Den ble så fortynnet med destillert vann til det totale volumet i kolben var 20 ml, og innholdet ble blandet. Cirka 1 ml av løsningen ble tatt ut ved hjelp av 1 ml engangssprøyte, og overført til HPLC-glass. Løsningen ble filtrert ved å sette et 0,22 µm engangsfilter (Millex-GV PVDF) på sprøytens tupp under overføringen. Bestemmelse av glukose, fruktose, sukrose og maltose ble gjort ved hjelp av HPAEC-PAD. Prosedyren med fortynningen er tilpasset PADdetektorens høye følsomhet, og konsentrasjonen av sukker i løsningen som ble injisert er i størrelsesområdet 0,006 mg/ml 0,1 mg/ml. For å bestemme innholdet av totalt karbohydrat i det grovisolerte kostfibret, ble dette analysert i henhold til metoden beskrevet i punkt Bestemmelse av totalt karbohydrat som alditolacetater med gass-væske kromatografi. * Løseligheten i alkohol (60-75 %) blir brukt for å skille høymolekylært (uløselig) kostfiber fra lavmolekylært (enkle sukker og korte oligosakkarider). Ved høy konsentrasjon av alkohol vil generelt alle polysakkarider være uløselige. Under slike betingelser vil en løsning eller suspensjon være i stand til å felle ut vannløselig fiber over en viss størrelse, mens vannuløselig fiber vil forbli uløselige. Alkoholuløselige komponenter (kostfiber) kan dermed separeres fra løselig kostfiber ved å filtrere eller sentrifugere etter tilsats av alkohol som beskrevet over. Alkoholfelling fungerte godt til å isolere kostfiber i dette tilfellet, siden alkoholløselig fiber som for eksempel inulin, eller spesielle oligosakkarider som raffinose og stachyose forekommer i betydelige mengder i verken bygg eller brokkoli. 35

47 3 MATERIALER OG METODER Figur 3.3: Flytskjema for enzymatisk-gravimetrisk metode for bestemmelse av vektbasert kostfiber og tilgjengeliggjort sukker (glukose, fruktose, sukrose og maltose) under simulert fordøyelse. 36

48 3 MATERIALER OG METODER In vitro enzymatisk fordøyelse med kommersielle enzymer for hydrolyse av stivelse og protein (Aura et al. 1999) Prinsippet med denne metoden er basert på enzymatisk hydrolyse av fordøyelig stivelse og protein (Aura et al. 1999). Modellen er forsøkt å gjøres så reell som mulig i forhold til hva som skjer in vivo, med tanke på enzymer, temperatur, tid og ph. Ved hjelp av denne metoden bestemmes mengde totalt kostfiber. Den vil ved senere behov bli kalt Aurametoden. Fremgangsmåte 1,5 ± 0,02 gram oppmalt prøve av Møllerens byggris (ubehandlet og kokt) og brokkoli (rå og blansjert) ble veid inn i 50 ml Falconrør. Det ble som blank brukt to prøver bestående av ubehandlet byggris som ikke ble tilsatt enzym underveis. Samtlige prøver ble tilsatt 15 ml destillert vann samt 10 ml 0,85 % natriumklorid. α-amylase (Sigma-Aldrich A-3176, 25 U/mg) ble løst i 20 mm natriumfosfat tilsatt 1 mm kalsiumklorid. 2 U/mL α-amylaseløsning ble tilsatt hvert rør, med unntak av blank. Prøvene ble innkubert ved 37 C i fem minutter med 250 OPM (Innova 40 Benchtop Incubator Shaker, New Brunswick Scientific). Alle inkubasjoner etter dette ble utført på samme måte. 4,5 ml 150 mm saltsyre ble tilsatt og ph ble holdt under 2,5 for å simulere forholdene i magen. Hver prøve ble så tilsatt 20 mg pepsin (Merck, , 0,7 FIP-U/mg) løst i 1 ml 20 mm saltsyre. Blank fikk kun 1 ml 20 mm saltsyre. Inkubasjon ble foretatt i to timer. Deretter ble 0,6 g gallesyre (Sigma-Aldrich, B-8631) løst i 4 ml 150 mm natrium bikarbonatløsning per prøve, og 75 mg pancreatin (Sigma-Aldrich, P-7545, 8 x USP Unit; 8 x 25 USP units/mg amylase, 8 x 25 USP units/mg protease og 8 x 2 USP units/mg lipase) ble løst i 4 ml 150 mm natrium bikarbonatløsning per prøve, og tilsatt. Blank fikk kun 8 ml 150 mm natrium bikarbonatløsning. Mucin (Sigma-Aldrich M-2378) ble løst i 1 ml destillert vann per prøve, og tilsatt samtlige prøver. Inkubasjon ble så foretatt i tre timer. 37

49 3 MATERIALER OG METODER Volumet i hvert rør ble justert til 45 ml med destillert vann, og fordelt i to 40 ml sentrifugerør. Prøvene ble så sentrifugert (Beckman Coulter, Avanti J-26XP) ved 7700 OPM i fem minutter. Supernatantene ble fjernet, men tatt vare på, og pelletene vasket med 25 ml destillert vann, etterfulgt av sentrifugering (Beckman Coulter, Avanti J-26XP) ved 9400 OPM i 10 minutter. Disse supernatantene ble nå kastet, mens pelleten ble fryst og frysetørket. Supernatanten som ble tatt vare på ble dialysert mot springvann (første døgn), destillert vann (andre døgn) og MilliQ-vann (tredje døgn), med påfølgende frysetørking. Prinsippet med dialyse går ut på fjerning av lavmolekylære forbindelser, som salter og proteiner, fra en løsning ved hjelp av diffusjon. De lavmolekylære forbindelsene som er små nok vil bevege seg ut gjennom porer i membranen så lenge membranpotensialet opprettholdes, samtidig som vann går inn. For opprettholdelse av membranpotensialet slik at så mye som mulig av lavmolekylære forbindelsene fjernes, ble vannet byttet ut med jevne mellomrom. Karbohydratanalyse som alditolacetater og måling av uronsyre (metode og 3.3.2) ble utført på frysetørket materiale fra både pellet og supernatant In vitro fordøyelse med humane enzymer (Almaas et al. 2006) Prinsippet med denne metoden er hydrolyse av fordøyelig stivelse og protein ved hjelp av humane fordøyelsesenzymer fra mage og tarm. Metoden er laget med utgangspunkt i Aurametoden, men med bruk av humane gastrointestinale (GI) enzymer. De humane enzymene er aspirert fra mage (human gastric juice/hgj) og tarm (human doudenal juice/hdj) hos friske frivillige menn og kvinner mellom 20 og 42 år (gjennomsnittsalder: 25 ± 5 år). Uttakene ble utført på Moss sykehus (Ulleberg et al. 2011). Den simulerte fordøyelsen ble utført på i alt åtte prøver; ett sett bestående av to med kokt byggris fra Møllerens og to med blansjert brokkoli som alle ble tilsatt -amylase. Det siste settet, igjen 2+2 prøver, var de samme prøvene, med unntak av at de ikke ble tilsatt - amylase ved start. Det ble veid inn 1,5 ± 0,02 gram oppmalt prøve. 38

50 3 MATERIALER OG METODER Samtlige prøver ble tilsatt 15 ml destillert vann samt 10 ml 0,85 % natriumklorid. α-amylase (Sigma-Aldrich A-3176, 25 U/mg) ble løst i 20 mm natriumfosfat tilsatt 1 mm kalsiumklorid. 2 U/mL α-amylaseløsning ble tilsatt fire av rørene (se over). Prøvene ble innkubert ved 37 C i fem minutter med 250 OPM (Innova 40 Benchtop Incubator Shaker, New Brunswick Scientific). Alle inkubasjoner etter dette ble utført på samme måte. 4,5 ml 150 mm saltsyre ble tilsatt og ph ble holdt under 2,5 for å simulere forholdene i magen. Hver prøve ble så tilsatt 100 L HGJ (26,7 U/mL pepsinaktivitet). Inkubasjon ble foretatt i to timer. Deretter ble det tilsatt 2 ml HDJ (26,8 U/mL) til hver prøve, samt 8 ml 150 mm natrium bikarbonatløsning. Inkubasjon ble så foretatt i tre timer. Volumet i hvert rør ble justert til 45 ml med destillert vann, og fordelt i to 40 ml sentrifugerør. Prøvene ble så sentrifugert (Beckman Coulter, Avanti J-26XP) ved 7700 OPM i fem minutter. 1 ml av hver supernatant ble tatt ut for undersøkelse av mengde tilgjengeliggjort sukker (glukose, fruktose, sukrose og maltose). Supernatantene ble fjernet, men tatt vare på, og pelletene vasket med 25 ml destillert vann, etterfulgt av sentrifugering (Beckman Coulter, Avanti J-26XP) ved 9400 OPM i 10 minutter. Disse supernatantene ble nå kastet, mens pelleten ble fryst og frysetørket. Supernatanten som ble tatt vare på ble dialysert (Thomas Scientific, 3787-D42, cut-off på D) mot springvann (første døgn), destillert vann (andre døgn) og MilliQ-vann (tredje døgn), for så å bli frysetørket. Frysetørkede prøver av supernatant og pellet ble veid for å bestemme mengde vektbasert kostfiber. Prøven som ble tatt ut av supernatanten før dialyse ble tilsatt 100 µl intern standard (Trehalose, 10 mg/ml) før den ble fortynnet 100 ganger med 50 % vandig metanol. Overføring til HPLC-glass ble gjort ved hjelp av 1 ml-engangssprøyte med 0,22 µm Millex-GV filter (PVDF). Prøvene ble analysert på HPAEC-PAD (Dionex) med hensyn på glukose, fruktose, sukrose og maltose. 39

51 3 MATERIALER OG METODER Figur 3.4: Flytskjema for fordøyelse med kommersielle enzymer (Aura et al. 1999) og humane enzymer (Almaas et al. 2006). 40

52 3 MATERIALER OG METODER 3.3 Øvrige analysemetoder Bestemmelse av totalt karbohydrat som alditolacetater med gass-væske kromatografi Prinsippet med denne metoden er syrehydrolyse og derivatisering for dannelse av alditolacetater, som kan identifiseres og kvantifiseres ved hjelp av gass-væske kromatografi. Denne metoden baserer seg på mye av den samme metodikken som NSP-analysen, med unntak av at stivelsen hydrolyseres og fjernes fra prøven i NSP-analysen, noe den ikke gjør her. Metoden kan brukes til å analysere karbohydratsammensetningen i et bredt spekter av prøver, inkludert glukose fra stivelse. Analysen ble utført på følgende prøver: ubehandlede og varmebehandlede bygg- og brokkoliprøver (fra punkt og 3.1.3), preparerte fiberfraksjoner av Møllerens byggris og brokkoli (fra punkt 3.2.2), fordøyd materiale i henhold til Aura (fra punkt 3.2.3), vannløseligog uløselig kostfiberfraksjon (fra punkt 3.3.4) og fraksjoner fra pektinekstraksjon (fra punkt 3.3.6). Fremgangsmåte I. Syrehydrolyse av residuet Dette foregikk på samme måte som beskrevet i punkt 3.2.1, trinn III. Forskjellen var at pelleten ble byttet ut med 10 mg av prøven som var ønsket analysert (to paralleller). I tillegg ble det kun tilsatt 0,5 ml 12 M svovelsyre og 2,5 ml destillert vann. Utenom dette foregikk resten av trinnet på samme måte som forklart i punkt 3.2.1, trinn III. II. Behandling videre og opparbeidelse av kalibreringsløsning Henviser til punkt 3.2.1, trinn IV. 41

53 3 MATERIALER OG METODER Måling av uronsyre vha spektrofotometri (Englyst et al. 1994) Denne metoden ble utført i sammenheng med metodene beskrevet i punkt og for å få en komplett karbohydratsammensetning, da uronsyren ikke detekteres i analysen med gass-væske kromatografi. Dette er fordi uronsyre har en polar karboksylgruppe, som hindrer den i å bli ekstrahert over til organisk (etylacetat) fase etter acetylering. Prinsippet er basert på interaksjoner mellom karbohydrat og dimetylfenol i nærvær av konsentrert svovelsyre som gir gul farge. Intensitet i farge måles ved hjelp av spektrofotometer. Fremgangsmåte Standard sukkerløsning ble laget ved å blande 1 ml av GLC-sukkerløsning (brukt i NSPanalysen, punkt 3.2.1) med 5 ml 2,4 M svovelsyre. Av denne ble det tatt ut volumer på 0,5 ml, 2 ml og 3 ml som ble fordelt i hver sine 10 ml målekolber. Disse ble fortynnet opp til 10 ml med 2 M svovelsyre for å få standarder på henholdsvis 25, 100 og 150 µg/ml av galakturonsyre. Hydrolysatene ble fortynnet med 2 M svovelsyre slik at de ikke inneholdt mer enn 150 µg/ml uronsyre, se tabell 2.1. Tabell 3.1: Tabellen viser fortynningsgraden til de ulike hydrolysatene under opparbeidelsen til måling av uronsyre. Byggris vil si både ubehandlet og kokt byggris, mens brokkoli vil si både rå og blansjert. Prøve Fortynning Byggris fra utgangsmateriale 1:2 Brokkoli fra utgangsmateriale 1:5 Byggris fra grovisolert kostfiber 1:2 Brokkoli fra grovisolert kostfiber 1:5 Byggris fra supernatant og pellet fra Aura-forsøk 1:2 Brokkoli fra supernatant og pellet fra Aura-forsøk 1:5 Byggris fra supernatant og pellet fra blank prøve i Aura-forsøk Ingen Byggris fra vannløselig- og uløselig kostfiber Ingen Brokkoli fra vannløselig- og uløselig kostfiber 1:2 Fraksjoner fra pektinekstraksjon HAc, OX og Soda 1:20 Fraksjoner fra pektinekstraksjon HCl/vann og fiberrest 1:5 42

54 3 MATERIALER OG METODER 0,3 ml 2 M svovelsyre (blank prøve), 0,3 ml av hver uronsyre standardløsning og 0,3 ml av hydrolysatene ble utpipettert i hver sine glass, tilsatt 0,3 ml natriumklorid-borsyreløsning og mikset godt. Deretter ble det tilsatt 5 ml konsentrert svovelsyre og rørene ble umiddelbart vorteksmikset grundig. De ble innkubert ved 70 ºC i 40 minutter, for så at de ble avkjølt til romtemperatur i vann. 0,2 ml 3,5-dimetylfenol ble tilsatt og blandet godt med resten av prøven. Absorbansen ble målt ved hjelp av et spektrofotometer (Agilent 8453) på 400 og 450 nanometer etter 15 minutter mot løsningen brukt som blank. Mengden uronsyre, uttrykt som gram polysakkarider per 100 gram prøve, ble kalkulert ved hjelp av følgende formel (Englyst et al. 1994): A TVTDC 100 Mengde 0,91 A M S T Hvor A T er forskjellen i absorbans ved 400 og 450 nm for hver prøve. V T er det totale volumet av prøven. D vil si fortynningsgraden (se Tabell 3.1) og C er konsentrasjonen av internstandard, som her var 0,1 mg/ml. A S er differansen i absorbans til standarden på 400 og 450 nm. En standardkurve ble laget ved å plotte inn forskjellene i absorbans for standardene mot konsentrasjonene. Og til slutt er det M T som er mengden innveid (i mg) prøve ved start. 0,91 er en konstant som hele stykket multipliseres med for å konvertere verdiene fra monosakkarider til polysakkarider. Dette gjøres for å veie opp for vannmolekylene i glykosidbindingene. 43

55 3 MATERIALER OG METODER Undersøkelse av fritt sukker - ekstraksjon i vandig metanol Denne metoden er en bearbeidet versjon av metoden til (Elmore et al. 2007) som brukes for å se på det totale innholdet av glukose, fruktose og sukrose i en prøve. Den blir ved Nofima benyttet for analyse av fritt sukker i potetmateriale. Prøvene som ble analysert var ubehandlet og kokt byggris fra Møllerens samt rå og blansjert brokkoli, preparert som beskrevet i henholdvis punkt og Det ble også benyttet en kontrollprøve (potetprøve M8 fra Trygve Helgerud) med kjent innhold av glukose, fruktose og sukrose. Fremgangsmåte 0,800 ± 0,05 g oppmalt prøve ble veid inn i 45 ml Falconrør og tilsatt 40 ml 50 % vandig metanol samt 400 µl internstandard (Trehalose, 10 mg/ml). Rørene ble så ristet og satt vertikalt for felling med 250 OPM (Biosan Multi-Shaker PSU 20) ved romtemperatur i 15 minutter. 1,0 ml av løsningen ble så overført til et eppendorfrør og sentrifugert (IEC Centra M2 Centrifuge) i 15 min ved OPM. 100 µl av supernatanten fra eppendorfrøret ble fortynnet med 900 µl destillert vann, før den ble filtrert gjennom et 0,45 µm filter (Millex- GV, PVDF). og ned i et HPLC-glass ved hjelp av en 1 ml engangssprøyte. Prøvene ble til slutt analysert med hensyn på glukose, fruktose og sukrose ved hjelp av HPAEC-PAD (Dionex). 44

56 3 MATERIALER OG METODER Separering av fiber inn i vannløselig- og uløselig del og molekylstørrelsesjekk vha. HPLC, GPC-SEC (Gel Permeation/Size Exclusion chromatography) Prinsippet med denne metoden er basert på bruk av vann, varme og sentrifugering for separering av kostfiber i vannuløselig- og løselig del. Det grovisolerte kostfibret preparert i henhold til enzymatisk-gravimetrisk metode (punkt 3.2.2) fra Møllerens (ubehandledet og kokt) byggris og (rå og blansjert) brokkoli ble undersøkt. Den løselige delen ble preparert for molekylstørrelsesjekk vha eksklusjonskromatografi med HPLC, GPC-SEC (Gel Permeation/Size Exclusion chromatography) med RI-deteksjon. HPLC-SEC separerer molekyler ved hjelp av en kolonne bestående av gelpartikler med en gitt porestørrelse. Separeringen foregår ved at de små molekylene beveger seg gjennom kolonnen via porene i gelpartiklene, mens molekylene som er for store til å komme seg inn i porene vil bevege seg med mobilfasen mellom partiklene. Dermed vil de små molekylene bruke lengre tid enn de store (Greibrokk et al. 1994). Fremgangsmåte 0,1 g av fiberpreparatene ble veid inn i 45 ml Falconrør og vætet med noen få dråper 96 % etanol. Det ble tilsatt 40 ml destillert vann og prøvene ble vorteksmikset før innkubering i kokende vannbad i 50 minutter. Vorteksmiksingen fortsatte hvert femte minutt i løpet av inkubasjonen. Prøvene ble så avkjølt på ristebrett (Biosan, Multi-Shaker PSU 20) ved 200 OPM, til de hadde oppnådd romtemperatur, etterfulgt av sentrifugering (Heraeus, Multifuge 4KR) ved 3500 OPM i 40 minutter. Vannløselig fraksjon (supernatant) og vannuløselig fraksjon (pellet) ble adskilt og frysetørket i hver sine beholdere. Da prøvene var tørre ble utbyttet veid, og 2 mg av den vannløselige delen (supernatant) ble løst i 1 ml (2 mg/ml) 50 mm natriumsulfat ved hjelp av en cellehomogenisator (Precellys 24), to ganger 20 sekunder. De ble så filtrert gjennom et 0,22 µm Millex-GV filter (PVDF) og analysert vha. HPLC-SEC med RI-deteksjon for molekylstørrelsesjekk. Dette ble gjort ved hjelp av en Dionex P680-pumpe med en Spectraphysics AS3500 autoinjektor og en Shimadzu RID6A refraktiv indeksdetektor kontrollert med programvaren Chromeleon, versjon Seriekoblede Shodex OHPack SB-806 HQ og SB-804 HQ kolonner var koblet til en Shodex OHPack SB-LG prekolonne, og ble vasket på 40 ºC med 50 mm natriumsulfat (0,5 ml/min). 45

57 3 MATERIALER OG METODER Prøver (1 mg/ml) ble injisert ved hjelp av en 100 μl loop. Relative molekylvektsgjennomsnitt (M w ) ble estimert ved hjelp av programvaren WINGPC, versjon 6.2, og molekylvektsstandarder fra pullulan på 23,7 kd, 48 kd, 100 kd, 186 kd, 380 kd og 853 kd ble brukt for kalibrering. Programvare og standarder ble levert av PSS (Polymer Standards Service GmbH, Mainz, Tyskland). Pullulan er et nøytralt lineært polysakkarid bygget opp av glukose, som ofte blir brukt som standard i slike typer undersøkelser. Ulempen med å bruke pullulan i dette tilfellet er at pektinet i fraksjonene kan være ladet, noe som dermed blir feil i forhold til pullulanen som er nøytral. Det er her viktigheten av riktig valg av løsningsmiddel kommer inn. Som nevnt ble det bruk 50 mm natriumsulfat, som blant annet maskerer eventuelle ladninger i pektinet, slik at det dermed oppfører seg som at det er nøytralt. Følgelig påvirkes ikke størrelsesfraksjoneringen av eventuelle interaksjoner mellom molekylene og kolonnen. I tillegg til undersøkelse av polydispersiteten, ble det utført en karbohydratanalyse i henhold til punkt av vannuløselig- og løselig fraksjon, for å kontrollere hvor mye av kostfibret som bestod av karbohydrater Måling av total stivelse Konsentrasjonen av total stivelse ble målt ved hjelp av Total Starch assay procedure (Amyloglukosidase/α-amylase method), K-TSTA 04/2009 fra Megazyme International, Irland. Prosedyre e) som er for determinering av stivelse i prøver som også inneholder D- glukose og/eller maltodekstriner ble fulgt fra punkt 1 til 6, for så at analysen fortsatte på prosedyre a) determinering av stivelse i korn og matvarer som inneholder resistent stivelse, D-glukose og/eller maltodekstriner, punkt 4 til 10. Prinsippet med metoden går ut på at stivelsen først blir hydrolysert til D-glukose, for så at det tilsettes glukose oksidase/peroksidase-reagent (GOPOD) som gir en grad av rødfarge til løsningen i henhold til mengden frigjort D-glukose. 46

58 3 MATERIALER OG METODER Kvantitativ og kvalitativ analyse av pektin fra brokkoli Isolering av pektinet (Westereng et al. 2008) Denne metoden er utført med utgangspunkt i tidligere metoder (Westereng et al. 2008) laget for ekstraksjon av pektin fra hvit kål (Brassica oleracea var. Capitata). Fremgangsmåte I. Vask med etanol fjerning av lavmolekylære forbindelser, etanolløselige sukker 23,8 g blansjert brokkoli ble veid inn i en 500 ml Duran flaske og tilsatt 250 ml 80 % etanol. Innholdet ble mikset og flasken ble innkubert i 60 ºC i 30 minutter. Innholdet i flasken ble så filtrert på Whatman foldefilter (113V, 30 µm, 18,5 cm) slik at alkoholen ble fjernet, men tatt vare på, mens brokkolien (AIM alcohol insoluble material) ble overført tilbake i flasken. Dette ble gjentatt fire ganger totalt. Da alle etanolvaskene var gjennomført ble etanolfraksjonene inneholdende etanolløselig sukker slått sammen, og 3 x 1 ml av denne ble fryst ned i eppendorfrør til senere analyse. II. Eddiksyre (HAc) ekstraksjon av nøytrale og lett løselige fiber, samt fjerning av ioniske kryssbindinger og salt Brokkolien ble så overført til en ny 500 ml Duran flaske og tilsatt 250 ml 0,01 M eddiksyre. Løsningen stod med magnetrører over natta i romtemperatur. Innholdet ble sentrifugert i 50 ml Falconrør på 2500 OPM (Heraeus, Multifuge 4KR) i 8 minutter og eddiksyren ble fjernet fra pelleten, men tatt vare på. Denne prosedyren ble gjentatt tre ganger totalt. Eddiksyrefraksjonene som ble tatt vare på underveis ble slått sammen. III. Ammoniumoksalat (OX), Ca 2+ -chelator ekstraksjon av pektin Igjen ble brokkolien overført til en ny 500 ml Duran flaske. Det ble tilsatt 250 ml 0,05 M ammoniumoksalat og flasken ble innkubert ved 80 ºC i en time. Ammoniumoksalat fjernet Ca 2+ fra pektin og gjorde det mer løselig slik at det kunne ekstraheres ut. Løsningen ble filtrert på Whatman foldefilter (113V, 30 µm, 18,5 cm), og brokkolifraksjonen ble overført tilbake til flasken, mens væsken ble tatt vare på. En ny runde med prosedyren over ble gjentatt. Da den tredje runden med ammoniumoksalat ble tilsatt ble flasken innkubert med rørepropell ved 80 ºC i 90 minutter, for så at løsningen ble filtrert. 47

59 3 MATERIALER OG METODER IV. Natriumkarbonat (alkalisk løsning) tilsatt natrium borhydrid (Soda) Brokkolifraksjonen ble overført til en ny 500 ml Duran flaske og tilsatt 200 ml 0,05 M natriumkarbonat og 0,02 M natriumborhydrid. Den høye ph en i løsningen gjorde at hemicellulose, som er sterkt bundet til overflaten av cellulose, kunne ekstraheres ut. Flasken ble innkubert ved 25 ºC i 60 min, og innholdet ble så filtrert (Whatman foldefilter 113V, 30 µm, 18,5 cm). Brokkolifraksjonen ble ført tilbake i flasken, mens væsken ble tatt vare på. Prosedyren over ble gjentatt to ganger til sammen. Væsken som ble tatt vare på underveis ble til slutt slått sammen. V. Svak saltsyre og destillert vann ekstraksjon av restfiber Filterfraksjonen ble overført en siste gang til en ny 500 ml Duran flaske. Det ble tilsatt 200 ml 0,05 M saltsyre og innkubert ved 85 ºC i 60 min. Væsken ble fjernet ved hjelp av et filter (Whatman foldefilter 113V, 30 µm, 18,5 cm). Brokkolifraksjonen ble ført tilbake i flasken og ekstrahert i 200 ml destillert vann i 15 minutter ved romtemperatur før siste filtrering. Væsken som var igjen etter filtreringen av saltsyren og vannet ble slått sammen, mens uløst materiale av brokkolifraksjonen ble fryst ned og frysetørket, før analyse av alditolacetater (punkt 3.3.1). Løsningene fra de ulike filtreringstrinnene (eddiksyre, ammoniumoksalat, natriumkarbonat + natriumborhydrid og saltsyre/vann) ble filtrert på foldefilter (Whatman foldefilter 113V, 30 µm, 18,5 cm), før det ble tilsatt to volum isopropanol for å danne utfellinger. Løsningene ble så filtrert en siste gang. Utfellingene som lå igjen på filteret ble tatt vare på og vasket i 70 % etanol. En Ultra Torax (Polytron, PT 3100 homogenisator) ble brukt for å få jevne fraksjoner før de ble sentrifugert på 2500 OPM i 15 minutter. Etanolen ble dekantert av og 200 ml destillert vann ble tilsatt. Bunnfallet ble løst ved hjelp av en magnetrører på svak varme. Innholdet ble videre overført til dialysemembraner (Thomas Scientific, cut-off Dalton) og dialysert i tre netter, mot springvann (første natt), destillert vann (andre natt) og MilliQvann (tredje natt). Analyse av alditolacetater og uronsyre (henholdsvis punkt og 3.3.2) ble utført på det frysetørkede materialet av dialyseproduktene og brokkolifraksjonen. 48

60 3 MATERIALER OG METODER Tabell 3.2: Oversikt over de ulike trinnene i metoden. Fraksjon Løsning Volum Temp. Tid HAc-1 0,01 M CH 3 COOH 250 ml 25 ºC 16 t HAc-2 0,01 M CH 3 COOH 250 ml 25 ºC 30 min HAc-3 0,01 M CH 3 COOH 250 ml 25 ºC 30 min OX-1 0,05 M (NH 4 ) 2 C 2 O ml 80 ºC 60 min OX-2 0,05 M (NH 4 ) 2 C 2 O ml 80 ºC 60 min OX-3 0,05 M (NH 4 ) 2 C 2 O ml 80 ºC 90 min SODA-1 0,05 M Na 2 CO 3 + 0,02 M NaBH ml 25 ºC 60 min SODA-2 0,05 M Na 2 CO 3 + 0,02 M NaBH ml 25 ºC 60 min HCl 0,05 M HCl 200 ml 85 ºC 60 min Vann Destillert vann 200 ml 25 ºC 15 min 49

61 3 MATERIALER OG METODER Figur 3.5: Flytskjema over pektinisolering 50

62 3 MATERIALER OG METODER Karakterisering av pektinstrukturer ved hjelp av Fourier-transform infrarødt (FT-IR) spektrofotometer Fourier-transform angir analysemetoden for målingen, mens infrarødt er betegnelsen på den delen av det elektromagnetiske spekteret som instrumentet kan analysere. Ettersom hvert materiale har en helt egen kjemisk sammensetning vil en analyse av et materiale gi et unikt IR-spektrum, som kan sammenliknes med et fingeravtrykk ( fingerprinting ). På den måten kan denne typen spektroskopi brukes til å identifisere materialer. I dette tilfellet var hensikten med analysen å se på grad av forestring i de ulike fraksjonene fra pektinisoleringen. Det ble brukt et FT-IR spektrofotometer av typen Equinox 55 fra Bruker med en ATR-faststoffkrystall, Attenuated Total Reflectance (Pike Miracle), og programvaren Opus, versjon 5.5. De frysetørkede fraksjonene ble applisert direkte på krystallen, som er svært velegnet for faste homogene prøver. 51

63 3: Fructose 4: Sucrose 2: Glucose 1: Trehalose 5: Maltose 4 RESULTATER 4 Resultater Først vises eksempler på rådata i form av kromatogram fra HPAEC-PAD og GLC for å gi et inntrykk av hvordan henholdsvis enkle sukker (glukose, fruktose, sukrose og maltose) og nøytrale sukker fra hydrolyserte polysakkarider (glukose, galaktose, mannose, xylose, fukose, rhamnose og arabinose) detekteres og kvantifiseres i prøvemateriale. For å forstå hva som skjer underveis i de ulike fordøyelsesmodellene er det valgt å ta med resultater fra analyser gjort på byggris og brokkoli før in vitro fordøyelse. Deretter følger resultater fra de ulike fordøyelsesmodellene, etterfulgt av videre analyse av isolert kostfiber fra byggris og brokkoli. Da det var gjort svært få undersøkelser på kostfiber i brokkoli da arbeidet med denne oppgaven startet, ble det valgt å gå nærmere inn på dette. 4.1 Rådata Kromatogram fra HPAEC-PAD HPAEC-PAD (Dionex) med programvaren Chromeleon, versjon 6.80 ble brukt for å undersøke mengde enkle sukker i prøvemateriale før fordøyelse og mengde enkle sukker gjort tilgjengelig for absorpsjon i kroppen underveis i fordøyelsen. Et kromatogram fra en tilfeldig valgt prøve er tatt med for å gi et eksempel på hvordan det ser ut. 140 Mar #45 1B2 ECD_1 nc min 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0 12,0 13,0 14,0 15,0 16,0 17,0 18,0 19,0 20,0 Figur 4.1: Eksempel på et kromatogram fra HPAEC-PAD, med programvaren Chromeleon versjon 6.8. Kromatogrammet viser sukkerprofilen i fordøyd materiale av kokt byggris etter fordøyelse i henhold til Aurametoden med humane enzymer. X-aksen angir retensjonstiden i minutter, mens Y-aksen angir signalstyrken som nanocoloumb (nc). Trehalose er benyttet som internstandard. 52

64 Fuc Xyl Man Rha Glc All Ara Gal 4 RESULTATER Prøver med et ukjent innhold av sukker identifiseres i forhold til retensjonstiden som er karakteristisk hvert sukker, beskrevet i avsnitt Som kromatogrammet viser, identifiserer programmet selv de ulike toppene som kommer ut. Et regneeksempel for utregning av mengde sukker i gram per 100 gram tørrstoff er vist i vedlegg Kromatogram fra GLC GLC ble brukt til å identifisere og kvantifisere nøytrale sukker i ulike kostfiberfraksjoner (ufordøyd materiale) etter behandling i henhold til punkt og I denne metoden detekteres ikke fruktose, da fruktosen omdannes til sukkeralkoholene av glukose og mannose under reduksjon. pa 200 FID1 A, Front Signal (2011\190511\ MDO \002F0601.D) min Figur 4.2: Eksempel på et kromatogram fra Agilent 7890A GC-system (Agilent Technologies), med programvaren OpenLAB CDS ChemStation. Kromatogrammet viser nøytrale sukker i en av pektin-fraksjonene (HAc) isolert under analyse av pektin fra brokkoli. X-aksen angir retensjonstiden i minutter, mens y-aksen angir signalstyrken. Som figuren viser, har for eksempel xylose en retensjonstid på nesten 16 minutter. På samme måte som med HPAEC-PAD brukes det en internstandard (allose) og standardkurve for å beregne ukjente mengder av ukjente komponenter i prøvene, som beskrevet i innledningen (2.6.2). Eksempel på utregning av mengde sukker i gram per 100 gram tørrstoff er vist i vedlegg 1. 53

65 g/100 g 4 RESULTATER 4.2 Bygg og brokkoli før fordøyelse Total stivelse og fritt sukker Totalt innhold av fritt sukker betyr i denne sammenheng frie mengder av glukose, fruktose, maltose og sukrose som ikke befinner seg i komplekser av stivelse eller ufordøyelige polysakkarider. Verdiene for mengde fritt sukker er fremstilt sammen med nivåene for total stivelse funnet i byggris og brokkoli før fordøyelse i figur 4.3. Det er her tatt med verdier gjeldene både for tørrvekt og for ferskvekt. Totalt innhold av fritt sukker og stivelse i byggris og brokkoli Tørrvekt og ferskvekt Stivelse Suc Fru Glc 0 VB brokkoli (TV) Ubeh. byggris (TV) VB byggris (TV) Rå brokkoli (TV) VB brokkoli (FV) Ubeh. byggris (FV) VB byggris (FV) Rå brokkoli (FV) Potet ref * Rå brokkoli (TV) ** Byggris (TV) *** Figur 4.3: Fremstilling av mengde fritt sukker (glukose, fruktose og sukrose) og stivelse funnet i byggris og brokkoli (preparert i henhold til punkt og 3.1.3) beregnet ut i fra tørrvekt (TV) og ferskvekt (FV). Verdiene for fritt sukker er basert på gjennomsnittet av to paralleller med svært lave standardavvik (<0,13), mens verdiene for stivelse er basert på gjennomsnittet av fire paralleller med standardavvik. *Potetreferanse med kjent innhold av fritt sukker for kontroll. ** Til sammenligning. Funnet i brokkoli av sorten Marathon (Rosa et al. 2001). *** Til sammenligning (Newman & Newman 2008). VB = varmebehandlet. Resultatene viser at ubehandlet byggris inneholder 69,4 1,15 % stivelse, mens kokt byggris (VB) ligger litt under med 68,9 1,35 %. Brokkoli inneholder derimot så å si ingen stivelse (<0,75 %). 54

66 4 RESULTATER Innholdet av fritt sukker er det svært lavt i byggris, med et totalt innhold på 1 gram per 100 gram tørrvekt (TV) i ubehandlet byggris, mens kokt (VB) byggris ligger enda lavere med 0,8 gram per 100 gram TV. Rå brokkoli har derimot nesten 20 gram fritt sukker per 100 gram TV, og blansjert (VB) brokkoli ligger på 15 gram per 100 gram TV. Av det totale innholdet fritt sukker i byggris, utgjør sukrose mest med 81 % og 79 % i henholdsvis ubehandlet og kokt byggris, mens glukose utgjør minst (5,5 %). I brokkoli er det en noe jevnere fordeling, med 46 %, 39 % og 15 % av henholdsvis glukose, fruktose og sukrose av den totale mengden fritt sukker i rå brokkoli. I blansjert brokkoli finnes det mer fruktose og mindre sukrose, men ellers er fordelingen nokså lik. En svært viktig faktor som bør nevnes i denne sammenheng er at nivåene av fritt sukker i prøvene er, som nevnt over, basert på tørrvekten (TV). Det vil i praksis bety at en fersk brokkolibukett på 100 gram ikke inneholder 20 gram fritt sukker, men omlag 2 gram fritt sukker. Dette er fordi brokkoli består av så mye som 90 % vann, og dermed kun 10 % tørrstoff. For å gi et inntrykk av hvilke mengder som faktisk er å finne i fersk vare (ferskvekt = FV), har vanninnholdet i hver matvare blitt tatt med i betraktningene (midterste del i figur 4.3). For ubehandlet byggris som har et høyt tørrstoffinnhold (89 %) gir ikke det de store utslagene, men for kokt byggris som har tatt til seg mye vann blir stivelses- og sukkernivået mer enn halvert. Også i brokkoli, som har en tørrstoffprosent på kun 10 %, blir de totale mengdene sukker svært lave, som nevnt over. Dataene (**) som er brukt til å sammenligne med verdiene funnet i brokkoli, er hentet fra en stor undersøkelse (Rosa et al. 2001) på mengden fritt sukker i 11 ulike brokkolisorter, dyrket på forskjellig tid av året. Tallene funnet i undersøkelsen var svært variable, og mengden totalt fritt sukker varierte fra 5 gram per 100 gram tørrvekt i de med minst sukker i til 14,3 gram per 100 gram tørrvekt i de med mest i. Når det gjelder sammenligningsgrunnlaget for byggrisen (***) er tallene hentet fra Newman & Newman (2008) hvor det står opplyst at bygg inneholder mindre enn 0,2 % av både 55

67 g/100 g 4 RESULTATER glukose og fruktose, mens sukrosen er funnet å ligge mellom 0,74 og 0,84 %. Det opplyses også om at mengden stivelse kan varierer fra 45 % i bygg med lite stivelse og 65 % i bygg med mye stivelse (Eslick 1981). Ettersom Møllerens byggris viser seg å inneholde mye stivelse, har det blitt valgt å bruke 65 % som sammenligningsgrunnlag Karbohydratsammensetning Totalt karbohydrat skiller seg fra fritt sukker, som er beskrevet over, ved at dette er summen av alt løselig og uløselig karbohydrat, inkludert stivelse og fritt sukker. Disse verdiene er fremstilt som gram per 100 gram i figur 4.4. For å demonstrere hvilke utslag vanninnhold kan ha på resultater som er basert på tørrvekt (TV), er det også her tatt med verdier gjeldende for ferskvekt (FV). I tillegg vises verdier for totalt karbohydrat i byggryn og brokkoli, opplyst om i Matvaretabellen (2001) til sammenligning. Bestemmelse av totalt karbohydrat i byggris og brokkoli Tørrvekt og ferskvekt Ubeh. byggris (TV) VB byggris (TV) Rå brokkoli (TV) VB brokkoli (TV) Ubeh. byggris (FV) VB byggris (FV) Rå brokkoli (FV) VB brokkoli (FV) Byggryn (FV) * Rå brokkoli (FV) * VB brokkoli (FV) * Figur 4.4: Mengde totalt karbohydrat funnet i byggris og brokkoli. De fire første søylene er basert på tørrvekten (TV), mens de fire neste er basert på ferskvekt (FV). Verdiene er basert på gjennomsnittet av to paralleller med standardavvik. *Mengde karbohydrat i byggryn og i rå og kokt brokkoli, opplyst om i Matvaretabellen (2001) til sammenligning. Disse verdiene er basert på gram per 100 gram ferskvekt. Som resultatene viser, ble det funnet 67 gram karbohydrat per 100 gram TV i ubehandlet byggris, mens i kokt (VB) byggris ble det funnet nesten 81 gram per 100 gram TV. Når det gjelder brokkoli, var det totale karbohydratnivået en del lavere med 35 gram og 38 gram 56

68 g/100 g 4 RESULTATER karbohydrat per 100 gram TV i henholdsvis rå og blansjert (VB) brokkoli. Dersom vannet, som vanligvis er til stede i matvarene inkluderes i beregningene, gir det betydelige mindre mengder karbohydrat, spesielt i brokkoli. Figur 4.5 viser hvor mye hver av de nøytrale monosakkarider og uronsyre utgjør i det totale karbohydratinnholdet i byggris og brokkoli. Sukkersammensetning i totalt karbohydrat Ubeh. byggris VB byggris Rå brokkoli VB brokkoli Havre * Uron Glc Gal Man Xyl Ara Fuc Rha Figur 4.5: Totalt karbohydrat fordelt på de ulike monosakkaridene fra byggris og brokkoli. Verdiene er basert på gjennomsnittet av to paralleller. Det totale standardavviket er det samme som vist i figur 4.4. *Havre med kjent innhold av totalt karbohydrat ble brukt som kontroll. VB = varmebehandlet. Den totale karbohydratsammensetningen i byggris utgjøres i hovedsak av glukose. I brokkoli er sukkeret noe jevnere fordelt, men det er glukose og uronsyre som dominerer, samtidig som arabinose og galaktose også utgjør vesentlige mengder av den totale karbohydratsammensetningen. Til nå har det blitt vist verdier gjeldende for både tørrvekt og ferskvekt for å demonstrere hvilke utslag et høyt vanninnhold kan ha på resultatene, og for gjøre leserne bevisste på denne faktoren, men heretter vil det kun vises verdier gjeldene for tørrvekten. 57

69 Ubeh. byggris VB byggris Rå brokkoli VB brokkoli Ubeh. byggris VB byggris Rå brokkoli VB brokkoli Ubeh. byggris VB byggris Rå brokkoli VB brokkoli Blank % TV 4 RESULTATER 4.3 Byggris og brokkoli etter in vitro fordøyelse Grovisolerte kostfiberfraksjoner i byggris og brokkoli Figur 4.6 viser mengde grovisolerte kostfiberfraksjoner isolert etter fordøyelse i henhold til enzymatisk-gravimetrisk metode og Aura-metoden med kommersielle enzymer. Verdiene gjeldende for NSP-metoden er summen av de nøytrale monosakkarider og uronysre som er identifisert etter Grovisolerte undersøkelse kostfiberfraksjoner av totalt NSP. etter fordøyelse i henhold til NSPmetoden, enzymatrisk-gravimetrisk metode og Aura-metoden (m/kommersielle enzymer) NSP Enz.-grav. metode Aura Figur 4.6: Fremstilling av mengde kostfiber funnet i byggris og brokkoli ved hjelp av NSP-metoden (summert sukkersammensetning), enzymatisk-gravimetrisk metode (vektbasert) og Aura-metoden (vektbasert). Verdiene er basert på gjennomsnittet av to til tre paralleller med standardavvik. VB = varmebehandlet. Blank prøve vil si ubehandlet byggris uten tilsatt enzym underveis i Aura-metoden. Resultatene fra metoden for bestemmelse av total NSP i henhold til Englyst et al. (1994) viser at ubehandlet og kokt byggris fra Møllerens inneholder et gjennomsnittlig innhold på henholdsvis 8,8 gram og 10,3 gram stivelsesfritt kostfiber (basert på summert karbohydratinnhold) per 100 gram TV, mens mengdene i brokkoli varierer med hensyn til varmebehandling; rå brokkoli har et gjennomsnittlig innhold på 18,3 gram kostfiber per 100 gram TV, mens blansjert brokkoli ligger på 25 gram per 100 gram TV. 58

70 % kostfiber 4 RESULTATER Mengde grovisolert kostfiber (vektbasert) funnet i henhold til enzymatisk-gravimetrisk metode viser de samme trendene som resultatene fra NSP-analysen, men med noe høyere nivåer; 17,4 % i ubehandlet byggris, 19,4 % i kokt byggris, 39,5 % i rå brokkoli og 49,9 % i blansjert. Som resultatene viser gir de ulike metodene varierende mengder kostfiber, men trendene samsvarer; med minst kostfiber i ubehandlet byggris og mest i blansjert brokkoli. Den metoden som skiller seg mest ut i forhold til mengde grovisolert kostfiber er Aura-metoden. Det som er viktig å presisere i den sammenheng er at mengdene er basert på vekt, både i enzymatisk-gravimetrisk metode og i Aura-metoden, slik at det som ligger igjen etter endt fordøyelse også kan bestå av proteiner, salter og rester etter blant annet enzymer og tilførte buffersalter grunnet ufullstendig dialyse og/eller vask, i tillegg til kostfiber. Vektbasert grovisolert kostfibret funnet i henhold til Aura-metoden med humane enzymer vises i en egen figur (figur 4.7), ettersom det kun var kokt (VB) byggris og blansjert (VB) brokkoli som ble undersøkt Grovisolerte med denne kostfiberfraksjoner metoden. etter fordøyelse med humane enzymer VB byggris m/amylase VB byggris u/amylase VB brokkoli m/amylase VB brokkoli u/amylase Figur 4.7: Grovisolerte kostfiberfraksjoner (vektbasert) isolert i henhold til Aura-metoden med humane enzymer. VB = varmebehandlet. Verdiene er beregnet som et gjennomsnitt av to paralleller med standardavvik. Figuren viser at det grovisolerte kostfibret fra brokkoli ligger på samme nivå, uavhengig av om det ble tilsatt α-amylase ved start eller ikke. Differansen mellom kostfiber isolert fra byggris med og uten α-amylase er derimot på 5 %. 59

71 Byggryn* Rå brokkoli* Kokt brokkoli* Ubeh. byggris VB byggris Rå brokkoli VB brokkoli Ubeh. byggris VB byggris Rå brokkoli VB brokkoli Ubeh. byggris VB byggris Rå brokkoli VB brokkoli Blank Eple** Gulrot** g/100 g TV 4 RESULTATER Sukkersammensetning i kostfiber For å eliminere bidraget fra andre substanser (som nevnt over) og for å undersøke mengdene nøytralt sukker og uronsyre i kostfibret isolert ved hjelp av enzymatiskgravimetrisk metode og Aura-metoden med kommersielle enzymer, ble det utført en analyse av totalt karbohydrat som alditolacetater, i henhold til punkt Sammenligning av figur 4.6 og 4.8 avdekker at fraksjonene isolert ved hjelp av enzymatisk-gravimetrisk metode og Aura-metoden består Sukkersammensetning av en del materiale i som grovisolerte naturlig nok kostfiberfraksjoner ikke utelukkende karbohydrat Rha Fuc Ara Xyl Man Gal Glc Uron Sum KF Matvaretab. NSP Enz.grav.metode Aura NSP Figur 4.8: Kostfiber i byggris og brokkoli hvor vekten er korrigert for faktisk innhold av karbohydrat i fiberfraksjonene isolert i henhold til enzymatrisk-gravimetrisk metode og Aura-metoden. Resultatene fra NSPmetoden viser de samme verdiene som i figur 4.6, men inndelt i de ulike monosakkaridene og uronsyre. Blank prøve vil si ubehandlet byggris som ikke ble tilsatt enzymer i Aura-metoden. Verdiene er beregnet som et gjennomsnitt av to til fire paralleller. VB = varmebehandlet. *Kostfiberverdier for byggryn og brokkoli gjort om til prosentandel i tørrvekt. Opplyst om i Matvaretabellen (2001). **Pulverpreparat fra eple og gulrot ble brukt som kontroller i NSP-metoden (Institute for Reference Materials and Measurements (IRMM) & European Reference Materials (ERM) 1996). Etter korrigering for faktisk innhold av karbohydrat viser resultatene at kostfibernivåene i byggrisprøvene ligger på omtrent samme nivå (9-15 %) etter fordøyelse med de ulike metodene, og at det er glukose som dominerer sammensetningene. Når det gjelder brokkoli er nivåene mer variable, men en gjennomgående trend er at blansjert brokkoli har et høyere innhold av kostfiber enn rå brokkoli. En tydelig forskjell mellom byggris og brokkoli er 60

72 4 RESULTATER mengdene uronsyre, arabinose og galaktose som det finnes relativt mye av i brokkoli. Det bør i tillegg påpekes at verdiene fra NSP-analysen ligger lavere enn de to øvrige metodene. Som figur 4.8 viser, er det tatt med verdier for mengde kostfiber i byggryn og brokkoli opplyst om i Matvaretabellen (2001). Verdiene er gjort om til prosentandel i tørrvekt med grunnlag i de respektive mengdene vann oppgitt i Matvaretabellen: 14 % i byggryn, 89 % i rå brokkoli og 89 % i kokt brokkoli. Ut ifra dette ser man at metodene gir nivåer som stemmer godt med de opplyste verdier for kostfiber i byggryn. Matvaretabellen oppgir derimot at rå og kokt brokkoli inneholder de samme mengdene kostfiber, noe som ikke stemmer med resultatene funnet her Undersøkelse av om byggsort, mengde startmateriale og prøvepreparering gir ulikt utbytte i mengde grovioslert kostfiber For å undersøke hvorvidt sort, startmengde og preparering av prøvene før fordøyelse påvirket mengden grovisolert kostfiber, ble det brukt byggrisprøver fra Sjåk og Møllerens, som verken var frysetørket eller oppmalt. I stedet ble de kun avkjølt etter koking og mortet (simulert tygging) for å knuse kornene til mindre fraksjoner, før fordøyelse i henhold til enzymatisk-gravimetrisk metode. Figur 4.9: Mengde grovisolerte kostfiber (vektbasert) isolert i ulike byggrisprøver, samtlige er kokt på forhånd. De fire første prøvene fra venstre ble kun mortet etter varmebehandling. * 1 gram (TV) ved start. **0,3 gram (TV) ved start. ***Kokt, frysetørket og finmalt (1 g (TV) ved start); tatt med for sammenligning. Verdiene er basert på et gjennomsnitt av tre paralleller med standardavvik. 61

73 4 RESULTATER Som figuren viser, inneholder byggris fra Sjåk en større mengde grovisolert kostfiber enn byggris fra Møllerens. I motsetning til Sjåk byggris, gir Møllerens byggris omtrent lik mengde grovisolert kostfiber ved innveide mengder av mortede prøver mellom 0,3 gram og ett gram. Prøven som er frysetørket og finmalt er den som gir lavest mengde kostfiber. For å undersøke om all stivelsen i byggrisen var hydrolysert, ble det gjort en analyse av total stivelse i det grovisolerte kostfibret fra den høyeste mengden innveid prøve ved start (*) av Sjåk og Møllerens byggris (1 gram TV). Undersøkelsen viste at kostfibret isolert fra Sjåk byggris inneholdt et gjennomsnitt på 12,7 ± 2,25 % total stivelse, mens kostfibret fra Møllerens byggris inneholdt gjennomsnittlig 8,7 ± 0,16 % total stivelse. Dette er stivelse som egentlig skulle vært hydrolysert til glukose. Det betyr at mengden grovisolert kostfiber fra Sjåk byggris skulle ligget om lag 3,5 % lavere, mens det grovisolerte kostfibret fra Møllerens byggris skulle ligget om lag 2 % lavere. Dermed havner den gjennomsnittlige mengden grovisolert kostfiber fra Sjåk byggris på 25,2 0,8 % og fra Møllerens byggris på 20,4 1,2 %. Videre så ble det utført fordøyelse på ulike mengder ubehandlet byggris for å undersøke hvor mye grovisolert kostfiber som kunne isoleres i henhold til enzymatisk-gravimetrisk metode, uten å øke enzymmengden i fordøyelsen. I tillegg ble det undersøkt hvor stor mengden ufordøyd resfibermateriale ble når prøvemengden økte til to gram, uten tilsetning av amyloglukosidase. Resultatene vises i figur

74 % TV Grovisolerte kostfiberfraksjoner fra ulike mengder startmateriale 4 RESULTATER ,75 g 1 g 1,25 g 2 g 1 g 2 g 1 g 2 g 1 g 2 g Ubeh. Byggris VB byggris Rå brokkoli VB brokkoli Figur 4.10: Grovisolerte kostfiberfraksjoner i prøver inneholdende ulike mengder startmateriale. Verdiene er basert på gjennomsnittet av tre paralleller med standardavvik. Mengden startmateriale er markert på x-aksen. Ingen av prøvene med startmengde på to gram ble tilsatt enzymet amyloglukosidase under fordøyelsen. Ulikhetene mellom mengde grovisolert kostfiber fra de forskjellige mengdene ubehandlet byggris (med unntak av to gram), er svært små, mens det grovisolert kostfiber isolert fra to gram innveid prøve ligger noe høyere enn kostfibret isolert fra ett gram. Denne økningen er derimot ikke proporsjonal med økningen i mengde prøvemateriale. Resultatene viser også at kokt byggris er den prøven som gir størst økning (10 %) i mengde grovisolert kostfiber, når prøvemengden økes fra ett gram til to gram, mens ubehandlet byggris kun gir en økning på 5 %. 63

75 4 RESULTATER Undersøkelse av om ulike komponenter påvirker hverandre i mengde grovisolert kostfiber For å undersøke om de ulike komponentene i Det sunne måltidet ; byggris, brokkoli og laks hadde noen påvirkning på hverandre i forhold til mengde grovisolert kostfiber og mengde frigjort/tilgjengeliggjort sukker under simulert fordøyelse, ble komponentene blandet og fordøyd sammen to og to eller alle tre. Forsøkene ble utført i henhold til enzymatiskgravimetrisk metode. Det ble i dette forsøket brukt 0,5 gram (tørrvekt) av hver komponent i prøvene inneholdende to komponenter, og 0,35 gram (tørrvekt) av hver komponent i prøvene inneholdende tre komponenter. Resultatene for mengde grovisolerte kostfiberfraksjoner fra prøver innholdende to og tre Grovisolerte kostfiberfraksjoner i prøver bestående av to eller flere komponenter vises i figur komponenter % VB byggris + rå brokkoli VB byggris + VB brokkoli VB byggris + laks Rå brokkoli + laks VB brokkoli + laks VB byggris + laks + rå brokkoli VB byggris + laks + VB brokkoli Figur 4.11: Oversikt over mengde grovisolerte kostfiberfraksjoner fra de ulike prøvene bestående av to eller tre komponenter. Verdiene er beregnet som et gjennomsnitt av tre paralleller med standardavvik. VB = varmebehandlet. Sammenlignes prøvene som inneholder rå brokkoli med prøvene som inneholder blansjert brokkoli, vises samme trend som tidligere; blansjert brokkoli inneholder mer kostfiber enn rå brokkoli. Ved å sammenligne prøvene som inneholder rå brokkoli med dem som inneholder blansjert brokkoli, ser man i tillegg at forholdet mellom dem er likt, uansett om den andre komponenten er laks eller kokt byggris. Den samme tendensen vises i resultatene fra prøver inneholdende tre komponenter. 64

76 4 RESULTATER Tilgjengelig sukker etter fordøyelse Med tilgjengelig sukker etter fordøyelse, menes summen av glukose, fruktose, sukrose og maltose som gjøres tilgjengelig under fordøyelse. Disse mono- og disakkaridene kan enten befinne seg som fritt sukker i prøvematerialet (som vist i figur 4.3) eller det kan frigjøres under hydrolyse av stivlese i simulert fordøyelse. Glukosen stammer her fra fri glukose (vist i figur 4.3) og fra nedbrutt stivelse, som i et blodsukkerperspektiv vil gi identiske bidrag, uansett opphav. Figur 4.12 viser en samlet oversikt over mengde tilgjengelig sukker etter fordøyelse i henholdt til enzymatisk-gravimetrisk metode og Aura-metoden med humane enzymer, fra punkt 4.3.1, 4.3.3, og Figur 4.12: Samlet oversikt over mengde frigjort sukker etter simulert fordøyelse. Det skilles mellom ubehandlet og kokt byggris kun i den første seksjonen, da det i de tre øvrige bare ble benyttet kokt (VB) byggris. I resultatene fra fordøyelse av mortede prøver ble det brukt Sjåk byggris der det er bemerket, alle øvrige byggrisprøver uten navn er fra Møllerens. 1 1 gram (TV) startmateriale. 2 0,3 gram starmateriale. *Fordøyd i henhold til enzymatisk-gravimetrisk metode. **Frysetørkede og finmalte prøver fordøyd i henhold til Aura-metoden med humane enzymer. Verdiene er basert på gjennomsnittet av seks til åtte paralleller, standardavvik vises i vedlegg 3. VB = varmebehandlet. FT = frysetørket. FV = ferskvekt. m/a = med α-amylase ved start, u/a = uten α-amylase ved start. 65

77 4 RESULTATER Da det ble svært uoversiktlig og vanskelig å se standardavvikene i figuren, er det i stedet valgt å vise disse i en egen tabell, sammen med de respektive sukkerverdier. Tabellen vises i vedlegg 3. Som figuren viser gir de finmalte prøvene de største mengdene tilgjengeliggjort sukker i fordøyelsen. Undersøkelsen av de mortede byggrisprøver fra Sjåk og Møllerens, viser at mortede prøver av Møllerens byggris gir en lavere mengde sukker gjort tilgjengelig i simulert fordøyelse, enn finmalte prøver fra samme produsent. Resultatene viser også at Sjåk byggris gir mindre tilgjenglig sukker enn Møllerens byggris, samt at en høyere prøvemengde gir en lavere mengde tilgjengelig sukker. Ser man tilbake på resultatene fra mengdene grovisolerte kostfiberfraksjoner fra de samme prøvene (figur 4.9), ser man at prøvene som ga mest grovisolert kostfiber gir lavest menge tilgjengeliggjort sukker under fordøyelsen. Tabellen med oversikt over standardavvikene i vedlegg 3, viser at mengden tilgjengelig sukker fra den høyeste mengden Sjåk byggris (3,4 gram FV) har et nokså høyt standardavvik (± 6,95 g/100 g). Det skyldes at disse prøvene ble fordøyd i to ulike omganger, hvor prøvene ble mortet noe bedre den andre gangen enn den første. Gjennomsnittet av mengden tilgjengeliggjort sukker fra den første fordøyelsen ligger på 54,4 gram per 100 gram tørrstoff, mens gjennomsnittet av mengden tilgjengeliggjort sukker fra fordøyelse nummer to ligger på 67,6 gram per 100 gram tørrstoff. Ved å legge sammen de ulike mengdene tilgjengelig sukker etter fordøyelse av individuelle komponenter (de fire første søylene), for å danne de respektive prøvene i interaksjonsforsøket, ser man at sukkermengdene halvert i prøvene inneholdende to komponenter (byggris eller brokkoli). Prøvene inneholdende laks og byggris/brokkoli gir en mengde tilgjengliggjort sukker som er halvert i forhold til da byggris/brokkoli ble fordøyd alene. I prøvene inneholdende tre komponenter utgjør det tilgjengelige sukkeret etter fordøyelse kun én tredjedel, i forhold til summen av tilgjengelig sukker ette fordøyelse av de respektive individuelle prøver. 66

78 % TV 4 RESULTATER De fire siste søylene i figur 4.12, som er fra fordøyelse i henhold til Aura-metoden med humane enzymer, skiller seg vesentlig ut i forhold til de øvrige resultatene. Den første åpenbare ulikheten i forhold til de andre, er hvilke sakkarider som utgjør det tilgjengelige sukkeret i prøvene etter fordøyelse; mens det tilgjengelige sukkeret fra byggris etter fordøyelse i henhold til enzymatisk-gravimetrisk metode i hovedsak består av glukose og noe fruktose, frigjøres mest maltose i byggris-fraksjonene fra Aura-metoden. I tillegg detekteres ikke sukrose i fraksjonene fra enzymatisk-gravimetrisk metode det gjør det derimot i fraksjonene fra Aura-metoden. Den andre store ulikheten er summen av de tilgjengelige sukker fra byggrisen, som er mye lavere enn vist tidligere. Hvorvidt det ble tilsatt α-amylase ved start ser ikke ut til å påvirke sukkermengde- og sammensetning i noen vesentlig grad. Ved å sammenligne mengde tilgjengelig glukose i fordøyd materiale fra enzymatiskgravimetrisk metode, med total stivelse funnet i de samme prøvene før fordøyelse, gir det en indikasjon på hvor mye av glukosen som kommer fra stivelse. Som figur 4.13 viser, er mengden stivelse i ubehandlet byggris høyere enn mengden tilgjengelig glukose fra samme prøve, mens i de øvrige prøvene er mengden stivelse lavere enn mengden tilgjengelig glukose. Forholdet mellom stivelse og glukose Glc Tot. stivelse Ubeh.byggris VB byggris Rå brokkoli VB brokkoli Maisref. * Figur 4.13: Forholdet mellom mengde stivelse funnet i prøvene før fordøyelse, og mengde frigjort glukose i fordøyelsen. *Referanse av maisstivelse som ble brukt som kontroll under analysen av total stivelse. Opplyst mengde stivelse var 96 %. VB = varmebehandlet. 67

79 % TV 4 RESULTATER 4.4 Vannløselig- og uløselig kostfiber For å gi en oppfatning av hvor stor del det vannuløselige- og løselige kostfibret utgjør i hver komponent, vises det i figur 4.14 en oversikt basert på vekten av hver fraksjon etter separering. Figuren viser at det vannuløselige kostfibret dominerer både i brokkoli og byggris, men i begge de varmebehandlede prøvene er det noe mer vannløselig kostfiber enn i de ubehandlede prøvene. Under frysetørkningen ble det mekanisk tapt litt fra det uløselige kostfibret fra ubehandlet byggris. Det er markert som skravert område i figuren under, slik at det skal være letter å sammenligne prøvene. Fordeling av vannløselig- og uløselig kostfiber med utgangspunkt i 100 % Løselig Ubeh. byggris VB byggris Rå brokkoli VB brokkoli Uløselig Tap under frysetørke Figur 4.14: Figuren viser andelen vannuløselig- og løselig kostfiber i byggris og brokkoli. Som kan ses ut i fra figuren så har noe blitt tapt underveis fra ubehandlet byggris (skravert område). Som figuren viser, utgjør det uløselige kostfibret 65,5 %, 56,6 %, 75 % og 59,7 % i henholdsvis ubehandlet byggris, kokt (VB) byggris, rå brokkoli og blansjert (VB) brokkoli. Ved å ta utgangspunkt i figur 4.6, som viser en oversikt over mengde grovisolert kostfiber funnet i de samme prøvene ved hjelp av enzymatisk-gravimetrisk metode, kan de faktiske tall for mengden vannuløselig- og løselig kostfiber regnes ut. Dette vises i figur

80 % % Andel løselig- og uløselig kostfiber i grovisolerte kostfiberfraksjoner Ubeh. byggris VB byggris Rå brokkoli VB brokkoli Løselig 4 RESULTATER Uløselig Figur 4.15: Andel vannuløselig- og løselig kostfiber i grovisolerte kostfiberfraksjoner isolert i henhold til enzymatisk-gravimetrisk metode. VB = varmebehandlet. Men i figur 4.15 vises kun mengdene vannuløselig- og løselig grovisolert kostfiber, og det tas ikke hensyn til hvor mye av det som faktisk er karbohydrater. I figur 4.16 er derimot dette korrigert for, og følgelig vises kun vannuløselig- og løselig kostfiber bestående av karbohydrat Mengde karbohydrat i vannuløselig- og løselig kostfiberfraksjon Ubeh. byggris VB byggris Rå brokkoli VB brokkoli Løselig Uløselig Figur 4.16: Mengde vannuløselig- og løselig kostfiber kvantifisert kun i form av karbohydrat via summen av de enkelte monosakkaridene bestemt med GLC. VB = varmebehandlet. Differansen mellom grafene til de respektive prøvene i figur 4.15 og 4.16 utgjør vannuløselige- og løselige kostfiberfraksjoner som ikke er karbohydrater. Dette kan blant annet være lignin, som inkluderes i definisjonen av kostfiber, men som ikke er et karbohydrat. 69

81 g/100 g TV 4 RESULTATER Som fremstilt over påvirkes det uløselige kostfibret svært lite av hvorvidt prøvene er varmebehandlet eller ikke. Forskjellene mellom prøvene som er ubehandlet og dem som er varmebehandlet utgjøres i hovedsak av det løselig kostfiber, som utgjør en større andel i prøvene som er varmebehandlet. For å få en oppfatning av hva som skiller vannuløselig- og løselig kostfiber, ble mengde nøytrale sukker og uronsyre i fraksjonene bestemt. Det er summen av disse som var basis for kvantifiseringen av fiber i figur 4.16 over. I figur 4.17 er vannløselig- og uløselig fraksjon Sukkersammensetning i vannuløselig- og løselig fraksjon fremstilt separat for å gi en tydelig oversikt Uron Glc Gal Man Xyl Ara Fuc Rha Ubeh. byggris VB byggris Rå brokkoli VB brokkoli Ubeh. byggris VB byggris Rå brokkoli VB brokkoli Fra vannuløselig del Fra vannløselig del Figur 4.17: Individuelle nøytrale monosakkarider og uronsyre i totalt karbohydrat fra vannuløselig- og løselig kostfiber isolert fra byggris og brokkoli. VB = varmebehandlet. Som figuren viser, er det først og fremst mengdene xylose og arabinose som skiller karbohydratene i vannuløselig kostfiber fra karbohydratene i vannløselig kostfiber i byggris. I brokkoliprøvene er det derimot størst forskjeller i mengden glukose mellom de to fraksjonene. Det vannuløselige kostfibret fra brokkoli inneholder store mengder glukose, noe som nesten er fraværende i det vannløselige kostfibret. 70

82 4 RESULTATER Molekylstørrelsesjekk Det ble utført en størrelsesfraksjonering med HPLC (GPC-SEC) på prøver fra vannløselige kostfiberfraksjoner framkommet i avsnitt Figur 4.18: Resultatene etter analyse av løselig kostfiber fra byggris og brokkoli ved hjelp av HPLC-SEC, størrelseseksklusjonskromatografi. Pilene indikerer når de ulike standardene av pullulan kommer ut. X-aksen angir retensjonstiden, hvor de største molekylene vises først. Y-aksen angir signalstyrken. Figuren viser molekylvektsprofilen (M w ) relativt til monodisperse prøver av standardene pullulan. Dette er følgelig ikke absolutte molekylvekter, men relative molekylstørrelser basert på hydrodynamisk volum. Molekylstørrelseprofilen kommer ut med en retensjonstid på mellom 28 minutter til 45 minutter, den lille toppen til høyre er salt, mens nedgangen til høyre for denne igjen er vann. Som antydet ved hjelp av pilene som indikerer størrelsen til pullulanfraksjonene i figuren, kommer de største molekylene ut først, i motsetning til annen kromatografi som HPAEC-PAD. Begge prøvene fra byggris viser en nokså lik trend i molekylstørrelsepopulasjonene, det samme gjør prøvene fra brokkoli. Ved å se nærmere på fordeling relativt til tiden, ser man at ubehandlet byggris har en høyere topp helt i begynnelsen av kromatogrammet, men likevel 71

83 4 RESULTATER en lavere gjennomsnittelig molekylstørrelse enn kokt byggris. Dette skyldes skulderen som kan ses på venstre side i den første toppen fra kokt bygg. Tydelige ulikheter ses også mellom rå og blansjert brokkoli, hvor blansjert brokkoli har en vesentlig større andel høymolekylære polymerer. Som vist i tabellen under har byggrisprøvene nokså like molekylstørrelser, mens forskjellen mellom rå og blansjert brokkoli er stor. Tabell 4.1: Oversikt over gjennomsnittlige molekylstørrelser de ulike fraksjonene relativt til pullulanstandardene. D = Dalton. Beregnet Off-Line med WIN-GPC (se vedlegg 4) Ubeh. byggris Kokt byggris Rå brokkoli Blansjert brokkoli Gjennomsnittlig molekylvekt (M w ) relativt til monodisperse prøver av standardene pullulan D D D D 72

84 % 4 RESULTATER 4.5 Pektin i blansjert brokkoli For å få et nærmere innblikk i kostfibret fra brokkoli, ble det først utført ekstraksjoner med ulike ekstraksjonsmedier, spesifikke for ulike kostfiberkomponenter. Figur 4.19 (mørkeblå søyler) viser mengde kostfiberfraksjon isolert fra hver ekstraksjon, beregnet som prosent i forhold til vekten av startmaterialet. De lyseblå søylene i samme figur, indikerer hvor mye av det isolerte kostfibermaterialet som består av karbohydrater. Karbohydratene utgjør henholdsvis 60 %, 72 %, 72 %, 62,5 % og 50,5 % av vektutbyttet. Ut ifra ekstraksjonsmediet betegnes fraksjonene fortløpende (se figurtekst) som nøytrale og lett løselig fiber (HAc), pektin (Oksalat/OX), hemicellulose (soda), restfiber (HCl+H 2 O) og uløselig materiale. Mengde isolert fraksjon og andel karbohydrat i hver fraksjon Vektutbytte Mengde karbohydrater HAc OX Soda HCl+H2O Uløselig materiale Figur 4.19: Vektbaserte isolerte kostfiberfraksjoner (mørkeblå søyler) og mengde karbohydrater (sum av nøytrale sukker og uronsyre korrigert med vektutbyttet fra hver fraksjon) (lyseblå søyler) i hver fraksjon. Andel karbohydrat er beregnet som et gjennomsnitt av fire paralleller med standardavvik. HAc = mild eddiksyre. OX = ammoniumoksalat. Soda = natriumkarbonat og natrium borhydrid. HCl/H 2 O = fortynnet saltsyre. Ekstraksjon av nøytrale og lett løselige fiber (HAc) gir et svært lavt vektutbytte (0,7 %), mens de tre neste fraksjonene; ekstraksjon av pektin (OX), ekstraksjon av hemicellulose (Soda) og ekstraksjon av restfiber (HCl) gir noe mer (2,1 % - 2,6 %). Uløselig materiale etter alle ekstraksjonene, gir naturligvis størst vektutbytte med 36,4 %. For å gi en oversikt over hvor stor andel karbohydratene fra hver fraksjon utgjør av den totale mengden karbohydrat funnet i pektinisoleringen, er det vist i tabell

85 4 RESULTATER Tabell 4.2: Oversikt over hvor stor prosentandel karbohydratene (summen av nøytrale sukker og uronsyre) fra hver fraksjon utgjør i forhold til total mengde karbohydrat funnet i fraksjonene. % karbohydrat av totalt karbohydrat HAc 1,8 OX 6,5 Soda 6,5 HCl+H2O 6,9 Uløselig materiale 78,3 Sum 100 Tabellen viser at 78,3 % av det totale karbohydratbaserte kostfibret er uløselig/ikke ekstraherbart, mens 21,7 % er løselig/ekstraherbart. I forhold til mengdene karbohydrat funnet i vannuløselig- og løselig kostfiberfraksjon (henholdsvis 65,3 % og 34,7 %) nevnt i kapittel 4.4, utgjør det uløselige karbohydratet omtrent 13 % mer og det løselige omtrent 13 % mindre enn det som tidligere er vist. For å undersøke hva fraksjonene fra de ulike ekstraksjonene faktisk bestod av, ble karbohydratene i hver og én av fraksjonene analysert som alditolacetater etter totalhydrolyse med syre. Resultatene fra dette vises med utgangspunkt i 100 % i figur Det er summen av disse monosakkaridene som ble fremstilt i figur 4.19 (lyseblå søyler). Sukkersammensetning i fraksjoner fra pektinekstraksjon 100 % 90 % 80 % 70 % 60 % 50 % 40 % 30 % 20 % 10 % 0 % HAc OX Soda HCl+H2O Uløselig materiale Uron Glc Gal Man Xyl Ara Fuc Rha Figur 4.20: Nøytrale sukker og uronsyre i de ulike fraksjonene etter ekstraksjon, korrigert med vekten av hver fraksjon. Verdiene er basert på et gjennomsnitt av fire paralleller, og gjort om til andel av 100 %. 74

86 4 RESULTATER Fraksjonen fra ekstraksjon med eddiksyre (HAc) domineres av galaktose (35 %) og uronsyre (25,5 %). Sistnevnte finnes også i vesentlige mengder i fraksjonene fra ammoniumoksalat (OX), natriumkarbonat (soda) og fortynnet saltsyre (HCl/H 2 O), hvor uronsyren utgjør hele 69,4 %, 65,8 % og 57 %, respektivt. I alle fem finnes det i tillegg relativt mye arabinose, men mest i fraksjonen fra fortynnet saltsyre (21,9 %) og minst i ammoniumoksalatfraksjonen (13,8 %). Når det gjelder uløst materiale etter endt ekstraksjon består dette i hovedsak av glukose, som utgjør nesten 50 % av den totale sukkersammensetningen. Ved å bruke formlene opplyst om i tabell 4.3 under, kan ulike karakteristika i pektinet bestemmes. I kilden (Houben et al. 2011) hvor dette oppsettet ble funnet, brukes galakturonsyre i stedet for uronsyre, men ettersom mengden galakturonsyre ikke har blitt bestemt her, antas det at uronsyren gir et relativt uttrykk for mengden galakturonsyre i brokkolifraksjonen. Siden uronsyre er funnet i alle fraksjonene er det antatt at alle disse har bidrag fra pektin og pektinlignende strukturer. Det er likevel valgt å se bort i fra uløst materiale i delen som følger, ettersom dette er en fraksjon som også kan bestå av monosakkarider fra blant annet cellulose og hemicellulose. Tabell 4.3: Forhold mellom monosakkarider fra totalt karbohydrat i de ulike fraksjonene, spesifikke for fraksjoner inneholdende pektin (Houben et al. 2011). Forhold mellom monosakkarider Funksjon 1 Uronsyre Fuc Rha Ara Gal Xyl Linearitet i pektinet 2 Rha Uronsyre Mengde rhamnogalakturonan (RG) i pektin hovedkjeden 3 Ara Gal Rha Grad av forgreninger i pektinet Forhold mellom de ulike monosakkarider beregnet ved hjelp av formlene vist i tabellen over, vises i tabell 4.4 under. 75

87 4 RESULTATER Tabell 4.4: Forhold mellom monosakkarider i de ulike polysakkaridfraksjonene fra pektinisoleringen. Definisjonen av de ulike forholdene er gitt i tabell 4.3. Fraksjon Linearitet i pektin (1) RG i pektin Forgreninger i RG-1 hovedkjede (2) (3) HAc 0,42 0,2 10,56 OX 2,94 0,04 7,33 Soda 2,1 0,06 6,97 HCl+H 2 O 1,44 0,09 6,98 Den første (1) gir et bilde av lineariteten i pektinet, ved at forholdet mellom sukkeret i pektinets antatte hovedkjede bestående av galakturonsyre med innsettelse av rhamnose, og de nøytrale sukker som er å finne i pektin sidekjedene, bestemmes. Som tabell 4.4 viser, er det fraksjonen som hovedsakelig består av pektin (OX) som har høyest linearitet i sitt innhold av pektin, sammen med fraksjonen fra ekstraksjon med natriumkarbonat (soda). Mengden RG i pektinet (2) utgjør størst andel i fraksjonen fra svak eddiksyre (HAc), mens de øvrige fraksjonene har vesentlig mindre mengder. Som tabellen viser, har alle fraksjonene en nokså høy grad av forgreninger i RG-1 (3), men mest finnes i fraksjonen ekstrahert med svak eddiksyre, den samme fraksjonen som også ga høyest andel RG i pektin hovedkjeden. 76

88 4 RESULTATER FT-IR spekter av fraksjoner fra pektinisoleringen Karakteristiske spektrale områder for pektin, og spesielt graden av metylesterifisering og frie karbonylgrupper (uforestret uronsyre) i de ulike fraksjonene, ble sjekket ved hjelp av FT-IR spektrofotometer (Equinox 55, Bruker) med ATR-faststoffkrystall (Pike Miracle). Det ble brukt tre standarder av pektin fra sitrusfrukt med kjent forestringsgrad (Sigma Aldrich), disse vises i figur Støyen i spektrene skyldes vanndamp i prøvene. Prøvene er normaliserte for å redusere fysiske effekter, som blant annet ulike mengder prøve applisert på krystallen og spredning av lys. For en mer nøyaktig kvantifisering burde det blitt beregnet annen deriverte av resultatene, men på grunn av mangel på replikater og støy fra vanndamp i noen av prøvene, ble ikke det gjort. Her kreves mer arbeid, og formålet med disse analysene var ikke en nøyaktig karakterisering, men å detektere tilstedeværelse av pektin i de ulike fraksjonene. (cm-1) Figur 4.21: FT-IR spekter av pektinstandarder fra sitrusfrukt med kjent forestringsgrad (Sigma Aldric). Std 1, 65 % esterifisering (P-9436). Std 2, 34 % esterifisering (P-9311). Std 3, 89 % esterifisering (P-9561). Båndene for forestret karbonyl og fri karbonyl er markert med piler. Forestringsområdet, som er det område som er mest interessant i denne sammenheng, strekker seg fra om lag 2000 til 1500 cm -1. I dette området vises bånd som representerer metylesterifisert karbonyl (hovedsakelig galkaturonsyer i denne sammenheng) i området mellom 1760 og 1745 cm -1 som følge av C=O strekk, mens bånd for frie karbonylgrupper (uronsyre uten forestring) vises i området mellom 1640 og 1620 cm -1. Bånd som 77

89 Absorpsjon 4 RESULTATER representerer frie karbonylgrupper skyldes COO asymmetrisk strekk (Gnanasambandam & Proctor 2000). De to første toppene i spekteret, markert med piler, indikerer områdene for metylesterifisert karbonyl og fri karbonyl (uforestret uronsyre), og som figuren viser inneholder standard 2 lite metylesterifisert karbonyl og mange frie karbonylgrupper. I standard 3 er det omvendt; med mye metylesterifisert karbonyl og få frie karbonylgrupper. Standard 1 ligger omtrent midt i mellom disse to. Disse resultatene stemmer overens med det som var oppgitt på beholderne til de respektive standardene; 1 = 65 % esterifisering, 2 = 34 % esterifisering og 3 = 89 % esterifisering. 0,25 0,2 0,15 HAc HAc OX 0,1 0,05 0 Frekvens/bølgetall (cm-1) Figur 4.22: FT-IR spekter av fraksjonene inneholdende nøytralt og lett løselig fiber (HAc) og pektin (OX). HAc ble undersøkt to ganger, og som spekteret viser er parallellene jevne. Som vist i figuren over, inneholder fraksjonen bestående av pektin (OX) en del metylesterifisert karbonyl, som indikeres av et tydelig bånd rundt 1730 cm -1. Det er derimot ikke like mye her som i standard 1 og 3, men grovt beregnet antas prosentandelen å ligge mellom 40 % og 50 %. Fraksjonen inneholder også frie karbonylgrupper. Når det gjelder fraksjonen bestående av nøytralt og lett løselig fiber inneholder denne lite metylesterifisert karbonyl, men omtrent en like stor andel frie karbonylgrupper som pektin-fraksjonen. 78

90 Absorpsjon 4 RESULTATER 0,25 0,2 0,15 Soda Fortynnet HCl Uløselig materiale 0,1 0,05 0 Frekvens/bølgetall (cm-1) Figur 4.23: FT-IR spekter av fraksjonene inneholdende hemicellulose (Soda), restfiber (HCl+H 2 O) og uløselig materiale. Figur 4.23 viser at ingen av fraksjonene inneholder vesentlige mengder forestret karbonyl, dog inneholder alle en omtrentlig lik mengde fri karbonyl som fraksjonene bestående av nøytralt og lett løselig fiber (HAc) og pektin (OX). Absorbansen som gir utslag på frekvensen mellom 1300 og 800 cm -1 kalles fingeravtrykksområdet og er derfor helt unikt for hver komponent. Inne i dette området vil C-H bøy vises ved rundt 1380 cm -1, mens C-O strekk vises i området mellom 1300 og 1000 cm -1. Området som indikerer C-H bøyning viser ingen spesielle bånd i noen av fraksjonene, da absorbansen ligger på et nokså jevnt nivå i dette området. Når det gjelder området fra 1300 til 1000 cm -1 vises det en sterk økning i absorpsjon fra 1180 til 920 cm -1 i samtlige fraksjoner, som muligens kan være forårsaket av C-O stekk (Gnanasambandam & Proctor 2000). 79

91 5 DISKUSJON 5 Diskusjon 5.1 Bygg og brokkoli Å sette et konkret tall på mengden kostfiber i et plantemateriale kan være utfordrende, da struktur og egenskaper varierer både mellom ulikt plantemateriale og innen det samme plantemateriale (Wennberg et al. 2002). I tillegg er det flere faktorer som påvirker karbohydratnivået i korn/mel, en grønnsak eller en frukt; værforhold under dyrking, når på året høstingen har foregått, hvordan den har blitt lagret, og så videre (Wennberg et al. 2002). En annen kompliserende faktor er at ulike analysemetoder for kostfiber, ikke alltid fanger opp komponenter som kan tilordnes innenfor begrepet kostfiber like godt. Innholdsdata for en gitt råvare eller et ferdig produkt blir ergo påvirket av metodikken som brukes. Dette forklarer forskjellene mellom verdiene funnet i dette arbeidet og verdiene som refereres til i litteraturen, brukt til sammenligning i figur 4.3 og 4.4. Tallene vist i figur 4.3 er den teoretiske mengden stivelse og fritt sukker i byggris og brokkoli som vil gi blodsukkerstigning. Den store mengden stivelse i byggris vil bli hydrolysert til maltose og trisakkaridet maltotriose av α-amylase i munn og tynntarm (duodenum), som videre vil bli hydrolysert til glukose av enzymene i tarmveggen (nevnt i 2.3.1) før absorpsjon. En forutsetning er da at all stivelsen er fordøyelig, noe som for øvrig er tvilsomt ettersom byggrisen er varmebehandlet. For å bestemme mengden fordøyelig stivelse burde mengden resistent stivelse blitt undersøkt, noe som ikke ble gjort i dette arbeidet. Fritt sukker i form av glukose og fruktose vil derimot bli absorbert direkte, mens fritt sukker i form av sukrose først må hydrolyseres til glukose og fruktose. Grunnen til at det er kalt teoretiske mengder, er fordi komponentene var finmalte, noe de sjeldent er som tilbehør i et måltid. Da vil partikkelstørrelse variere med grad av tygging. Og desto større partiklene er, desto vanskeligere er det for enzymene å trenge inn slik at all potensiell energi frigjøres. Dette ble vist av i de mortede byggrisprøvene i figur 4.12, som diskuteres senere. Når det gjelder figur 4.4, ga den et bilde på total mengde karbohydrat funnet byggris og brokkoli. Det vil si summen av total stivelse og fritt sukker (figur 4.3), samt ufordøyelige karbohydrater, altså kostfiber (figur 4.8). Ubehandlet byggris ga en total mengde 80

92 5 DISKUSJON karbohydrat (70 gram per 100 gram tørrstoff) som lå under den sammenlagte summen av total stivelse, fritt sukker og kostfiber, som kan bety at denne mengden muligens var litt for lav. For prøver med mye glukose i form av stivelse, var glukosetoppene i kromatogrammene usymmetriske og vanskelige å integrere korrekt, noe som kan ha gitt unøyaktigheter i kvantifiseringene. Resultatene viste at blansjert brokkoli inneholdt en mindre mengde fritt sukker (figur 4.3), men en større mengde kostfiber (figur 4.8) enn ubehandlet brokkoli. Dette kan tyde på at varmebehandling i vann har ført til at lavmolekylære forbindelser, deriblant fritt sukker, har blitt vasket ut med kokevannet, slik at kostfibret utgjør en større andel av det totale tørrstoffet (Margareta & Nyman 2003). Denne effekten kom ikke like tydelig frem i byggrisprøvene, noe som kan skyldes det lave innholdet av fritt sukker, eller at den såkalt ubehandlede byggrisen fra Møllerens ble varmebehandlet med damp på forhånd, for å få en snarkokt variant (se punkt 3.1.1). Forskjellene i resultatene fra ubehandlet og kokt byggris ble dermed ikke like store som de muligens hadde blitt om ubehandlet byggris ikke var varmebehandlet med damp på forhånd. Totalt karbohydrat fordelt på de ulike nøytrale monosakkarider og uronsyre (figur 4.5) viste tendenser som er typiske for de respektive prøvene. Den store mengden glukose i byggris kommer i hovedsak fra hydrolysert stivelse (se figur 4.3), mens den resterende mengden (som ikke er fra stivelse) kommer antakeligvis fra β-glukan og cellulose. I brokkoli finnes det derimot ikke β-glukan og nesten ingen stivelse, slik at glukosen som finnes der gjenspeiler mengden fri glukose (figur 4.3) og cellulose som finnes i plantens cellevegger. Pektin, som utgjør en vesentlig mengde i brokkoli men ikke i bygg, vises i form av uronsyre, sammen med arabinose, galaktose, fukose, rhamnose og xylose, som ofte er å finne som sidekjeder i pektinets hovedkjedestruktur (Houben et al. 2011; Tungland & Meyer 2002). Disse monosakkaridene kan derimot også komme fra hemicellulose, som både kan inneholde xylose, arabinose, uronsyre og galaktose (Houben et al. 2011). Følgelig er det vanskelig å bestemme mengden pektin i brokkoli ut i fra undersøkelsene utført her, men som en indikasjon kan det sies at pektinmengden antakeligvis er minst like stor som mengden detektert uronsyre. 81

93 5 DISKUSJON 5.2 Produkter etter fordøyelse sammenligning av fordøyelsesmodeller Kostfiber ufordøyelig materiale Som vist i figur 4.6 og 4.7 ga de ulike in vitro fordøyelsesmodellene ulikt utbytte i mengde kostfiber. Mengden kostfiber funnet i henhold til enzymatisk-gravimetrisk metode og Aurametoden var basert på vekt av ufordøyd materiale (grovisolert kostfiber) etter endt fordøyelse. Ulempen med en slik kvantifisering er at materialet kan bestå av mer enn kun kostfiberfraksjoner. Det kan ha vært som følge av utilstrekkelig vask av residuet etter endt fordøyelse eller at selve fordøyelsen har vært ufullstendig. Om vaskeprosedyren ikke var tilstrekkelig kan blant annet buffersalter, proteiner eller rester etter enzymer fortsatt ha vært igjen i det grovisolerte kostfibret. Ved ufullstendig fordøyelse kan det fortsatt ha befunnet seg stivelse i det grovisolerte kostfibret, som følge av for lite tilsatt enzym i forhold til mengde substrat, eller at enzymene ikke har blitt fordelt i hele prøven. En tredje årsak til ulikheter mellom kostfiberverdiene fra NSP-metoden og de øvrige metoder, er at både enzymatisk-gravimetrisk metode og Aura-metoden inkluderer lignin og resistent stivelse i sine fraksjoner, noe NSP-analysen ikke gjør. Ettersom dette er komponenter som er inkludert i definisjonen av kostfiber (avsnitt 2.2), og som kan utgjøre vesentlige mengder i plantematerialer, vil dette fungere som en slags feilkilde ved bestemmelse av totalt kostfiber ved hjelp av Englyst sin NSP-metode. Analysene av individuelle nøytrale monosakkarider og uronsyre i de ulike kostfiberfraksjonene (figur 4.8), viste derimot mer sammenfallende resultater. Disse verdiene ble korrigert for faktiske innhold av karbohydrater i de ulike fiberfraksjonene, slik at nevnte årsaker til forhøyede verdier som følge av utilstrekkelig vasking eller inkludering av lignin, ikke gjelder her. Lignin inkluderes, som nevnt, i definisjonen av kostfiber, men ettersom det ikke er et polysakkarid detekteres det derfor heller i metoden som ble brukt (avsnitt 3.3.1). Sammenligning av figur 4.6 og 4.8 viste at det grovisolerte kostfiberfraksjonene bestod av en del materiale som ikke var karbohydrater. Resultatene fra NSP-analysen ga en mindre mengde kostfiber sammenlignet med summen av de individuelle monosakkarider, funnet i kostfibermaterialet fra enzymatisk-gravimetrisk metode og Aura-metoden med kommersielle enzymer. Siden dette er metoder som baserer 82

94 5 DISKUSJON seg på mye av den samme metodikken, skal det i prinsippet ikke være ulikheter mellom resultatene. Ettersom resultatene fra de ulike metodene viste såpass like trender innad, kan se ut til at det har skjedd en systematisk feil. Blant annet var det flere tørrstoffkorrigeringer i prosessene som ved unøyaktigheter under måling og/eller korrigering kan ha ført til ulikheter. Videre så viste resultatene at uronsyren også var mye av årsaken til ulikhetene mellom NSPmetoden og de øvrige metodene. Uronsyre detekteres ikke i analysen med gass-væske kromatografi, fordi den har en polar karboksylgruppe som hindrer den i å bli ekstrahert over til organisk (etylacetat) fase etter acetylering. Derfor var dette en analyse som ble gjort separat, og som dermed ikke ble påvirket av en eventuell feilkilder nevnt over. Da uronsyre ble målt i sammenheng med NSP-analysen ble det brukt to standarder (tørket pulver av eple og gulrot) med kjent innhold av uronsyre, som bekreftet at metoden var utført riktig (vedlegg 2). Da uronsyren ble bestemt i sammenheng med de to øvrige metodene, ble det derimot ikke brukt kontroll, og som vist i figur 4.8, kan det se ut til at verdiene har blitt overestimert i forhold til verdiene tilhørende NSP-analysen. Selv om det ble funnet variasjoner i resultatene fra de ulike metodene, også etter at vekten var korrigert for faktisk innhold av karbohydrat, var det tydelige trekk å finne. I kostfibret fra byggris utgjorde glukose, xylose og arabinose store deler av den totale mengden karbohydrat. Glukosen kommer i hovedsak fra cellulose og -glukan (MacGregor & Fincher 1993; Xue et al. 1997), mens arabinose og xylose utgjør kostfiberkomponenten arabinoxylan. Det at nettopp disse tre polysakkaridene dominerer kostfibersammensetningen er svært karakteristisk for bygg (Newman & Newman 2008). I brokkolifraksjonene var det i hovedsak uronsyre, galaktose, glukose og arabinose som dominerte. Uronsyre og disse nøytrale monosakkarider representerer, som nevnt over, pektin og hemicellulose i kostfibret, mens glukosen er et produkt av hydrolysert cellulose. Det har blitt gjort observasjoner av at grønnsaker vanligvis inneholder mindre xylose enn arabinose (Englyst & Hudson 1996), noe som stemmer med resultatene vist her. Grunnen til dette er at arabinose ofte er å finne i pektin og som egne polysakkaridkjeder assosiert med pektin, som arabinogalaktan og arabinogalaktanpeptid. 83

95 5 DISKUSJON Blank-prøven (ubehandlet byggris uten tilsetninger av enzymer) som ble brukt under fordøyelsen i henhold til Aura-metoden, bestod etter fordøyelse i hovedsak av glukose. Dette skyldes at stivelsen ikke ble fordøyd som følge av at prøven ikke ble tilsatt enzymer. Dermed har den totale mengden stivelse kun blitt hydrolysert til glukose under undersøkelsen av totalt karbohydrat som alditolacetater. Denne verdien tilsvarer følgelig mengden totalt karbohydrat bestemt direkte på utgangsmaterialet, vist i figur 4.5. Fordøyelsen i henhold til Aura-metoden med humane enzymer (figur 4.7) viste at tilsetning av α-amylase ga en differanse på 5 % mellom de to prøvene av byggris. Dette skyldes byggrisens høye innhold av stivelse. Ved tidlig tilsetting av α-amylase for å simulere stivelsesnedbrytningen som starter allerede i munnen, ble en større mengde av stivelsen hydrolysert i forhold til i prøvene som ikke ble tilsatt α-amylase. I brokkoli, hvor det kun ble påvist minimale mengder stivelse, forble derimot mengden grovisolert kostfiber upåvirket av hvorvidt det ble tilsatt α-amylase eller ikke. Selv om det grovisolerte kostfibret fra Aura-metoden med humane enzymer ikke ble korrigert for faktisk innhold av karbohydrater, er likevel rimelig å anta også dette besto av mye som ikke var karbohydratbaser kostfiber. Resultatene viste at kostfiberverdiene funnet i byggris og brokkoli lå på omtrent samme nivå som er opplyst om i Matvaretabellen (2001). Små differanser har sammenheng med hvilke analysemetoder som er brukt, og hvilke sorter av bygg og brokkoli tallene er basert på. Det at Matvaretabellen (2001) opplyser om at kokt og rå brokkoli inneholder den samme mengden kostfiber, strider derimot i mot det som ble funnet her og i tidligere arbeid, da varmebehandling av grønnsaker i vann har vist seg å redusere mengden lavmolekylære forbindelser, slik at kostfibret utgjør en større andel av det totale tørrstoffet (Margareta & Nyman 2003). 84

96 5 DISKUSJON Mortet byggris og økt mengde prøvemateriale Som vist i figur 4.9, ga byggrisen fra Sjåk en større mengde grovisolerte kostfiberfraksjoner enn Møllerens byggris. Årsaken til det, i tillegg til det faktum at dette er to ulike byggsorter, kan være at byggrisen fra Møllerens var mer slipt og delt opp i mindre biter, slik at noe av kostfibret forsvant i de prosessene. Som nevnt innledningsvis befinner kostfibret seg i de ytre lagene. Videre ble det påvist minst kostfiber i de finmalte byggrisprøvene fra Møllerens. Malingen førte til at enzymene fikk god tilgang til stivelsesgranulene, slik at en større mengde stivelse ble hydrolysert. I de mortede prøvene ble derimot enzymene hindret av de store partikkelstørrelsene, slik at vekten av det grovisolerte kostfibret økte som følge av gjenværende stivelse i det grovisolerte kostfibret. Dette viser hvor mye partikkelstørrelse har å si for resultatene og hvor lite som skal til før ulikheter oppstår. In vitro fordøyelse av ulike mengder startmateriale av ubehandlet byggris, men med konstant enzymmengde, ga svært like mengder grovisolert kostfiber. Det betyr at enzymene klarte å hydrolysere omtrent like mye av stivelsen fra ulike mengder byggris mellom 0,75 gram og 1,25 gram. I tillegg ble det undersøkt hvor stor mengden ufordøyd resfibermateriale ble når prøvemengden økte til to gram, uten tilsetning av amyloglukosidase (figur 4.10). Forskjellene i mengde grovisolert kostfiber fra to gram prøvemateriale og ett gram, var størst i kokt byggris; 10 %, og minst i ubehandlet byggris; 5 %. Årsaken til at det nettopp var kokt byggris som ga størst økning, kan skyldes at det har skjedd en krystallisering etterfulgt av retrogradering under avkjøling av prøvene, slik at det har blitt dannet resistent stivelse. Resistent stivelse oppfører seg som kostfiber under fordøyelse ved at det ikke blir fordøyd, og dermed kan det ha bidratt til at kokt byggris ga mer grovisolert kostfiber enn ubehandlet byggris. 85

97 5 DISKUSJON Grovisolert kostfiber fra prøver bestående av flere komponenter Resultatene fra in vitro fordøyelse av byggris, laks og brokkoli sammen (figur 4.11), viste at laks bidro med omtrent like mye vekt i det grovisolerte kostfibret som kokt byggris. Laks inneholder derimot ikke kostfiber (Matvaretabellen (2001)), ergo klarte ikke enzymatiskgravimetrisk metode å fordøye laksen, slik at ufordøyd protein og/eller fett befant seg i det grovisolerte kostfibret. Karbohydratanalyse sammen med undersøkelse av mengde gjenværende protein i det grovisolerte kostfibret, burde blitt utført for en mer utfyllende analyse. Forsøket kunne også blitt styrket ved tilføring av galle i fordøyelsen, som blant annet deltar i fordøyelsen av fett Sukker gjort tilgjengelig under in vitro fordøyelse Resultatene fra fordøyelsen av finmalte prøver av byggris og brokkoli, viste at mengden tilgjengeliggjort sukker (figur 4.12) tilsvarte omtrentlige mengder fritt sukker og stivelse vist i figur 4.3. Sukrosen som var til stede som fritt sukker (figur 4.3) i brokkoli før fordøyelse, ble hydrolysert til monosakkaridene glukose og fruktose underveis i den simulerte fordøyelsen. Det betyr at enzymatisk-gravimetrisk metode klarte å hydrolysere all fordøyelig stivelse, og at disse verdier dermed kan ses på som maksimale mengder sukker som kan absorberes i kroppen ved inntak av byggris og brokkoli. Enzymatisk-gravimetrisk metode kombinert med HPAEC-PAD gir dermed en god indikasjon på hvor mye sukker som frigjøres fra byggris og brokkoli under fordøyelse. Ettersom stivlese er bygget opp av glukoseenheter, vil sammenligning med mengde glukose gjort tilgjengelig under fordøyelse, gi en indikasjon på hvor mye av glukosen som kommer fra stivelse. Årsaken til at total stivelse oversteg mengden frigjort glukose i ubehandlet byggris, kan ha vært på grunn av resistent stivelse, eller at mengden glukose skulle vært høyere. I fordøyelsesmetodene (ikke NSP) ble fordøyelig stivelse hydrolysert enzymatisk med en konvensjonell α-amylase ved 37 ºC, mens under analysen av total stivelse (Megazyme) ble det tatt i bruk et termostabilt amylasepreparat, som brøyt ned og detekterte alle former for stivelse. Dermed kan mengden total stivelse overgå mengden glukose gjort tilgjengelig i fordøyelse. 86

98 5 DISKUSJON Det har allerede blitt antydet at kokt byggris kan ha inneholdt resistent stivelse, det samme ville dermed skjedd ved sammenligningen av frigjort glukose og stivelse i denne prøven også. Da det ikke var tilfellet, tvert imot, kan det dermed antas at mengden frigjort glukose etter simulert fordøyelse av ubehandlet byggris skulle vært høyere. Som nevnt tidligere i diskusjonen, kan vanskeligheter i forhold til integrasjon ha ført til unøyaktigheter. I brokkoli, hvor det ble påvist minimale mengder stivelse, kommer den tilgjengeliggjorte glukosen kun fra fri glukose og sukrose (vist i figur 4.3). Mengden sukker gjort tilgjengelig etter fordøyelse av byggrisprøvene i henhold til Aurametoden med humane enzymer (figur 4.12), ble vesentlig lavere enn da byggrisen ble fordøyd i henhold til enzymatisk-gravimetrisk metode. Antakeligvis skyldes det underskudd på stivelsesspaltende enzym, slik at store deler potensielt fordøyelig stivelse ikke ble hydrolysert. Ettersom brokkoli ikke inneholdt de samme mengdene stivelse som byggris, ga heller ikke mangel på stivelsesspaltende enzym de samme konsekvensene. Det tilgjengelige sukkeret etter fordøyelse i henhold til Aura-metoden med humane enzymer så også ut til å bestå av noe helt annet enn det tilgjengelige sukkeret etter enzymatiskgravimetrisk fordøyelse. Men sukrose er bygget opp av fruktose og glukose, mens maltose er satt sammen av to glukoseenheter. Årsaken til at de ikke ble brutt ned til sine respektive monosakkarider skyldes antakeligvis at det ikke ble tilsatt amyloglukosidase under fordøyelsen, slik at hydrolysen ble ufullstendig. Amyloglukosidase er et enzym som ikke finnes naturlig til stede i kroppen, men som simulerer aktiviteten til enzymer som er å finne i tynntarmens børstesøm (avsnitt 2.3.1). Ettersom disse enzymene befinner seg nettopp i børstesømmen vil de ikke følge med når tarmsaften aspireres, og dermed vil heller ikke denne typen aktivitet være å finne i de humane fordøyelsesenzymene. Dette gir en ufullstendig in vitro fordøyelse av karbohydrater, og resultatene blir derfor vanskelige å sammenligne med resultatene fra de øvrige fordøyelsesmodellene. Hvorvidt metoden egner seg til kvantifisering av kostfiber er derimot vanskelig å si, ettersom det ikke ble utført en karbohydratanalyse av det grovisolerte kostfibret. Undersøkelsene av mengden tilgjengeliggjort sukker etter simulert fordøyelse, antyder derimot at store deler av stivelsen forblir ufordøyd. Under en analyse av nøytrale monosakkarider i kostfibret vil dette 87

99 5 DISKUSJON gi konsekvenser i form av forhøyede glukosenivåer. Derfor vil metoden antakeligvis heller ikke egne seg til kvantifisering av totalt kostfiber i stivelsesrike matvarer. Videre så kan resultater basert på metoder med humane enzymer kan være vanskelige å reprodusere, ettersom det har blitt vist at det er store individuelle forskjeller i enzymaktivitet, samt at den reduseres over tid etter uttak (Ulleberg et al. 2011). Muligheten til (re)produksjon av store mengder data kan også begrense seg selv med tanke på mengdene som aspireres fra hvert individ av gangen (HGJ; gjennomsnittlig ml, HDJ; gjennomsnittlig ml, begge fra 18 individer) (Ulleberg et al. 2011). En fordel med humane enzymer er derimot at disse, i motsetning til standardiserte kommersielle enzymer, inneholder enzymer og kofaktorer i en fysiologisk sammensetning som kan være fordelaktige i en in vitro fordøyelse. Men dersom målet er å undersøke mengde frigjort sukker i simulert fordøyelse, hjelper ikke dette så lenge sentrale enzymer i karbohydratfordøyelsen mangler. Når det gjelder fordøyelsen av mortede prøver fra Møllerens og Sjåk byggris, ble det vist at en større prøvemengde ved start ga en mindre mengde tilgjengelig sukker etter simulert fordøyelse. Det skyldes at prøvemengden var for stor i forhold til mengden tilgjengelig enzym, slik at enzymene ikke klarte å hydrolysere like mye som de klarte ved en mindre mengde prøve. Dette ble bekreftet av undersøkelsen av stivelsesinnholdet i kostfibret, beskrevet i avsnitt Det ble også sett ulikheter i forhold til hvordan prøvene var preparert. Prøvene som var mortet ga en mindre mengde tilgjengeliggjort sukker etter fordøyelse, enn prøven som var finmalt. Årsaken til det er at større partikkelstørrelser gjorde det vanskeligere for enzymene å trenge inn, slik at de ikke klarte å hydrolysere all stivelsen til mono- og disakkarider. Standardavviket fra den største prøvemengden Sjåk byggris, som ble nevnt i resultatdelen (vedlegg 3), viste hvor mye simulering av tyggeprosessen har å si for resultatene. Som nevnt i introduksjonen er dette en av faktorene som kan gi signifikant påvirkning på den relative beregningen av glykemisk potensial det ble vist tydelig i disse resultatene. I tillegg bør det nevnes at det kan ha blitt dannet resistent stivelse under avkjøling av kokte prøver. Og som nevnt tidligere vil ikke denne typen stivelse være fordøyelig. 88

100 5 DISKUSJON Når det gjelder mengden tilgjengeliggjort sukker etter fordøyelse av prøver bestående av to eller tre komponenter (byggris/brokkoli/laks), viste resultatene at laksen ikke påvirket hydrolysen av stivelse under den simulerte fordøyelsen. Årsaken til at mengdene tilgjengeliggjort sukker var lavere fra prøvene bestående av flere komponenter sammen, i forhold til mengden tilgjengeliggjort sukker som ble funnet etter fordøyelse av de ulike komponentene alene, skyldes at prøvemengdene var redusert. En annen årsak til lavere mengde frigjort sukker kunne vært at fettinnholdet i laksen (cirka 15 % i kokt oppdrettslaks, i følge Matvaretabellen (2001)) gjorde stivelsen utilgjengelig for enzymene, men den tydelige sammenhengen med prøvemengde ved start tilsier at det ikke var tilfellet Vannløselig- og uløselig kostfiber Som vist i resultatene (figur 4.15) utgjorde den vannløselige kostfiberfraksjonen en større andel i prøvene som var varmebehandlet enn prøvene som var ubehandlet, mens andelen uløselig kostfiber holdt seg så og si konstant. Det indikerer at varmebehandling førte til økt mengde totalt kostfiber som et resultat av økt mengde vannløselig kostfiber, den samme effekten ble funnet i bygg av Vasanthan et al. (2002). Ulikhetene mellom sukkersammensetningene vannløselig- og uløselig fraksjon var tydelige (figur 4.17). Den største forskjellen observert mellom fraksjonene fra byggris, var fordelingen av xylose og arabinose. Begge fantes i vesentlig større mengder i vannuløselig fraksjon, noe som tyder på at det meste av arabinoxylanene i Møllerens byggris er uløselig i vann. Forholdet mellom dem (Ara/Xyl) viste seg å ligge på rundt 0,66, som følge av en relativt stor menge arabinose. Ettersom arabinose hovedsakelig utgjør sidekjedene i molekylet tyder dette på et nokså forgrenet molekyl. Dette assosieres vanligvis med et redusert hydrodynamisk volum og økt løselighet (Izydorczyk & Biliaderis 1995), noe som kan bety at løseligheten til arabinoxylan styres av mer enn kun asymmetrisk konformasjon. Den store mengden glukose i vannløselig fraksjon fra byggris, var antakeligvis et resultat av den vannløselige kostfiberkomponenten -glukan, som ble mye omtalt for sine antatte positive helseeffekter i introduksjonen. I forhold til mengden glukose i vannuløselig fraksjon, 89

101 5 DISKUSJON kan det se ut til at -glukan utgjorde en større andel i kostfibret, enn den vannuløselige kostfiberkomponenten cellulose. Også i kostfiberfraksjonene fra brokkoli utgjorde glukosen vesentlige forskjeller mellom vannuløselig- og løselig kostfiber. Glukosen i vannuløselig fraksjon tyder på betydelige mengder cellulose, som er en viktig celleveggskomponent også i brokkoli. Pektinene er, som nevnt i introduksjonen, rike på galakturonsyre (Mohnen 2008; Voragen & Pilnik 1995). En forestilling av mengden pektin i brokkoli kan derfor fås ved å se på mengde uronsyre i det vannløselige kostfibret. I tillegg har det blitt funnet at fukose, rhamnose, arabinose, galaktose og xylose er alle nøytrale monosakkarider som kan befinne seg i galakturonsyrens sidekjeder (Houben et al. 2011). Xylose og mannose i vannuløselig fraksjon antas å komme fra hemicellulose (Cosgrove 2005; Houben et al. 2011). Undersøkelsen av molekylvekstprofilene i det vannløselige kostfibret (figur 4.18), viste at byggrisprøvene hadde en gjennomsnittlig større molekylstørrelse enn brokkoliprøvene. Dette er sannsynligvis grunnet innholdet av blant annet -glukan, som ble antatt å utgjøre en stor andel i den vannløselige fraksjonen. Molekylstørrelser har vist seg å være viktige faktorer i forhold til kostfibrets fysiologiske egenskaper, blant annet i fordøyelsen. Større molekylstørrelse er assosiert med økt viskositet i kymus, som videre gir positive effekter som blant annet forlenget metthetsfølelse, økte peristaltiske bevegelser i tarmen, og flere andre effekter som ble nevnt i avsnitt Undersøkelsen av molekylvektsprofilene viste dermed at byggris antakeligvis vil bidra med en større helsegevinst på dette området, enn brokkoli. Videre så ble det funnet at de ubehandlede prøvene hadde en lavere gjennomsnittlig molekylstørrelse, enn prøvene som var varmebehandlet. Det kan ha vært som følge av endogene enzymer (glykanaser) i materialet, som har brutt ned polysakkaridene under simulert fordøyelse. Det kan derimot se ut til at varmebehandlingen inaktiverte disse enzymene, slik at polysakkaridene ikke ble brutt ned i like stor grad i prøvene som var varmebehandlet. Som resultatene indikerte, kan det se ut til at pektin i brokkoli brytes raskere ned enn -glukan i byggris, ettersom rå brokkoli hadde en vesentlig lavere gjennomsnittlig molekylstørrelse enn blansjert brokkoli, mens differansen mellom 90

102 5 DISKUSJON ubehandlet og kokt byggris ikke var like stor. Årsaken til at ulikhetene var mindre mellom sistnevnte prøver kan også skyldes at, som nevnt tidligere, den såkalt ubehandlede byggrisen ble varmebehandlet med damp av produsenten, slik at de endogene enzymene delvis ble inaktivert i denne prosessen. Det har tidligere blitt vist at varmebehandling av grønnsaker kan føre til ødeleggelse av glykosidbindinger og depolymerisering av polysakkaridene i kostfibret, slik at molekylstørrelsene i løselig kostfiber reduseres (Margareta & Nyman 2003). Men i følge resultatene vist her, var i så fall denne degraderingen mindre enn den som ble skapt av polysakkaridspaltende endogene enzymer. 5.3 Kvantitativ og kvalitativ analyse av pektin i blansjert brokkoli Da arbeidet med denne oppgaven startet var det gjort svært få undersøkelser på kostfiber i brokkoli, men underveis i perioden har det blitt publisert to artikler på akkurat dette området. Begge (Christiaens et al. 2011; Houben et al. 2011) bruker omtrent den samme metodikken for isolering av pektinstrukturer som er beskrevet i punkt 3.3.6, men fokuset i publikasjonen til Houben (2011) samsvarer best med denne oppgaven. Undersøkelsene startet med ekstraksjon av pektin fra Som vist i figur 4.19, utgjorde det karbohydratbaserte kostfibret kun 50 % av vekten til den uløselige fraksjonen, samlet opp som alkoholuløselig materiale på filter. Det indikerer at metodikken som ble brukt ikke klarte å rense ut et rent kostfibret fra brokkoli. Bedre vask sammen med dialyse etter endt ekstraksjon kunne derimot gjort kostfiberfraksjonen renere, ved at lavmolekylært materiale hadde blitt fjernet. Forholdet mellom polysakkarid som ble ekstrahert ut i de ulike løsningene og det som var igjen i uløselig materiale etter endt sekvensiell ekstraksjon, var henholdsvis 22 og 78 %, kvantifisert på basis av reelt karbohydratinnhold. I forhold til det som ble funnet ved separasjonen i vannuløselig- og løselig fraksjon (figur 4.17) var dette en nokså skjev fordeling, men disse analyser kan ikke sammenlignes direkte. Ekstraksjonen ble gjort for å 91

103 5 DISKUSJON identifisere ulike fiberkomponenter kvalitativt, og bestod i en rekke ekstraksjonstrinn, fellinger, vaskinger, dialyseringer og lignende, som alle ga mekaniske tap. Ettersom det uløste materialet inneholdt en stor mengde uronsyre (figur 4.20), er det rimelig å anta at det befant seg pektin igjen i denne fraksjonen, som følge av ufullstendig ekstraksjon. Årsaken til det kan blant annet skyldes at polysakkaridene befinner seg i komplekser med proteiner (Voragen & Pilnik 1995). I separasjonen av det grovisolerte kostfibret i vannuløselig- og løselig del, var materialet behandlet med blant annet protease under den simulerte fordøyelsen, slik at kompleksene ble løst opp og karbohydratene kunne bli hydrolysert til sine respektive monosakkarider. Men i denne metoden, hvor det ikke ble benyttet enzymer, kan det se ut til at deler av karbohydratet forble bundet i komplekser med protein, slik at de ikke ble ekstrahert ut. I stedet havnet de i uløselig materiale, og som vist i tabell 4.2, inneholdt det store deler av det totale karbohydratet. Det har tidligere blitt vist at ekstraksjon med enzymer (protease og cellulase) kan gi ulikt utbytte i forhold til ekstraksjon med syre, noe som kan forklare forskjellene i resultatene fra de to metodene diskutert over (Panouille et al. 2006). Sammenligning av resultatene funnet i dette arbeidet med nylig publiserte data fra undersøkelse av pektin i brokkoli (Houben et al. 2011), viste mange av de samme tendensene som har blitt vist her. Blant annet den dominerende uronsyren (tilsvarende relativ mengde galakturonsyre funnet av Houben (2011)) i fraksjonene bestående av nøytralt og lett løselig fiber (HAc), pektin (OX) og hemicellulose (Soda). I tillegg utgjorde uronsyren store deler av restfiberfraksjonen (fortynnet HCl), men dette er en ekstraksjon som avviker fra metoden benyttet av Houben (2011). Mye uronsyre tyder på, som nevnt tidligere, pektinrike fraksjoner. Etter ekstraksjonen med natriumkarbonat (Soda) har Houben (2011) en ekstraksjon med kaliumhydroksid. Dette for å isolere hemicellulose og pektin sterkt bundet til cellulose eller hemicellulose, da han mener fraksjonene ekstrahert med natriumkarbonat (Soda) består av pektiner som er kovalent esterbundet til andre polysakkarider i celleveggen. Dette tyder på at det finnes uenigheter vedrørende hvilke fraksjoner som ekstraheres med ulike ekstraksjonsmedier. Dermed er det en mulighet for at hele eller deler av hemicellulosen ikke 92

104 5 DISKUSJON ble isolert her og følgelig befant seg i uløst materiale, samt at fraksjonen isolert ved hjelp av natriumkarbonat i hovedsak bestod av pektin eller en blanding av pektin og hemicellulose. Som vist i resultatene (figur 4.20) hadde fraksjonen ekstrahert med soda en svært lik monosakkaridprofil som fraksjonen ekstrahert med ammoniumoksalat, noe som kan tyde på at soda-fraksjonen bestod av en del pektin, som hevdet av Houben (2011). Pektinet i fraksjonen av nøytralt og lett løselig fiber (HAc) hadde lav grad av linearitet, men høy andel RG i hovedkjeden og forgreninger i RG-1. Dette er omvendt av hva som ble funnet i pektinfraksjonen (OX) og i restfiberfraksjonen (fortynnet HCl). Lav grad av linearitet og høy grad av forgreninger antas å hindre pektin polysakkaridet i å binde seg til kalsiumioner, slik at potensialet for geldannelse reduseres (BeMiller 2007; Houben et al. 2011). De vil derimot være mer løselige enn pektinene funnet i pektinfraksjonen (Thebaudin et al. 1997), som har sammenheng med hvorfor pektinet i den første fraksjonen er løst bundet til celleveggene, og dermed kan ekstraheres ut med mild eddiksyre. Også grad av metylesterifisering spiller inn i egenskaper som løselighet og evne til geldannelse. Lav metylesterifisering har vist seg å ha sammenheng med økt geldannelse (Christiaens et al. 2011). På grunn av høy grad av linearitet (tabell 4.4) og lav grad av metylesterifisering (figur 4.23) vil derfor pektin fra ekstraksjonene med soda og fortynnet HCl, antakeligvis ha gode evner til geldannelse i løsning Som vist i resultatene, var det kun pektinfraksjonen ekstrahert med ammoniumoksalat (OX) som inneholdt en viss mengde metylesterifisert karbonyl. I forhold til standardene som er brukt, ligger graden av metylesterifisert karbonyl i pektinfraksjonen på om lag 40 til 50 %, grovt estimert. Dette samsvarer med nylig publiserte data fra Christiaens (2011). Det vil si at 40 til 50 % av karboksylgruppene er i metyl-ester form (-COOCH 3 ), mens resten av gruppene er til stede enten som frie syrer (-COOH) eller som salt (-COO - Na + ) (BeMiller 2007). Dette er ikke en spesielt høy grad av esterifisering; skillet mellom høy-metoksyl pektiner (HM) og lavmetoksyl pektiner (LM) ligger på 50 % esterifisering (BeMiller 2007). Om samme undersøkelse hadde blitt utført på rå brokkoli, hadde antakeligvis esterifiseringsgraden vært høyere i pektinfraksjonen. Dette fordi blansjering øker den katalytiske aktiviteten til enzymet pektin metylesterase (PME), noe som resulterer i deesterifisering av pektin homogalakturonan (Christiaens et al. 2011). 93

105 5 DISKUSJON 5.4 Videre arbeid Da resultatene fra den simulerte fordøyelsen av de tre matvarene i Det sunne måltidet ikke ga så mye informasjon som håpet, er dette noe som bør undersøkes nærmere. Ettersom Det sunne måltidet tar for seg byggris, brokkoli og laks som et helt måltid, vil kartlegging av eventuelle interaksjoner mellom dem under fordøyelse være hensiktsmessig for et helhetlig bilde. Det krever derimot mye mer arbeid enn det som var mulig å utføre i sammenheng med denne oppgaven. Til tross for nylig publiserte data og det som er funnet i arbeidet med denne oppgaven, er det fortsatt mye som gjenstår i kartleggingen av kostfiber i brokkoli, og da spesielt med tanke på pektin. Videre undersøkelse av dette er derfor også noe som vil være hensiktsmessig i prosjektet Det sunne måltidet. 94

106 6 KONKLUSJON 6 Konklusjon I dette arbeidet har det blitt vist at enzymatisk-gravimetrisk metode og Aura-metoden med kommersielle enzymer, alene ikke ga tilfredsstillende kvantifisering av totalt kostfiber i plantemateriale fra byggris og brokkoli. I kombinasjon med bestemmelse av totalt karbohydrat som alditolacetater med GC ga derimot begge metodene gode, både kvantitative og kvalitative bestemmelser av totalt kostfiber. Aura-metoden med humane enzymer, som i utgangspunktet er laget for in vitro fordøyelse av protein, egnet seg ikke til kvantifisering av mengde frigjort sukker fra fordøyd plantemateriale. Enzymatisk-gravimetrisk metode fungerte derimot svært godt. Begge forsøksoppsett ble kontrollert med HPAEC-PAD. I tillegg til dette, kan følgende spesifikke konklusjoner trekkes: - Basert på tørrvekt, inneholdt brokkoli en større mengde fritt sukker (glukose, fruktose og sukrose) og kostfiber enn byggris. - Basert på tørrvekt, inneholdt byggris en større mengde total stivelse og totalt karbohydrat enn brokkoli. - Partikkelstørrelse hadde en signifikant påvirkning på in vitro fordøyelse av byggris. Økt partikkelstørrelse ga redusert stivelseshydrolyse og følgelig redusert mengde frigjort sukker under simulert fordøyelse. - Laks påvirket ikke stivelsesnedbrytningen i bygg under fordøyelse i henhold til enzymatisk-gravimetrisk metode. - Løselig kostfiber utgjorde en større mengde i varmebehandlet bygg og brokkoli, enn i ubehandlede prøver. - Løselig kostfiber fra byggris hadde en høyere gjennomsnittelig molekylstørrelse enn løselig kostfiber fra brokkoli. - Pektin representerte en vesentlig del av kostfibret i brokkoli, og var i middels grad forestret (40 50 %) 95

107 7 LITTERATURLISTE 7 Litteraturliste ADAM. Body guide - Digestive system. Tilgjengelig fra: (lest 2. desember 2011). Albersheim, P., Darvill, A. G., Oneill, M. A., Schols, H. A. & Voragen, A. G. J. (1996). An hypothesis: The same six polysaccharides are components of the primary cell walls of all higher plants. I: Visser, J. & Voragen, A. G. J. (red.) Progress in Biotechnology, b. 14 Pectins and Pectinases, s Amsterdam: Elsevier Science Publ B V. Almaas, H., Cases, A. L., Devold, T. G., Holm, H., Langsrud, T., Aabakken, L., Aadnoey, T. & Vegarud, G. E. (2006). In vitro digestion of bovine and caprine milk by human gastric and duodenal enzymes. International Dairy Journal, 16 (9): Anderson, J. W. (1990). Dietary fiber and human health Hortscience, 25 (12): Anderson, M. A., Cook, J. A. & Stone, B. A. (1978). Enzymatic determination of 1,3-1,4-Betaglucans in barley-grain and other cereals Journal of the Institute of Brewing, 84 (4): Aspinall, G. O. & Ferrier, R. J. (1957). The constitution of barley husk hemicellulose Journal of the Chemical Society (OCT): Aspinall, G. O. & Ross, K. M. (1963). Degradation of 2 periodate-oxidised arabinoxylans Journal of the Chemical Society (MAR): 1681-&. Aura, A. M., Harkonen, H., Fabritius, M. & Poutanen, K. (1999). Development of an in vitro enzymic digestion method for removal of starch and protein and assessment of its performance using rye and wheat breads. Journal of Cereal Science, 29 (2): Balvoll, G. (1976). Krossblomsterfamilien. I: Grønnsaksdyrkning på friland, s Oslo: Landbruksforlaget. Banks, W., Geddes, R., Greenwoo.Ct & Jones, I. G. (1972). Physicochemical studies on starches.63. molecular-size and shape of amylopectin Starke, 24 (8): 245-&. BeMiller, J. N. (2007). Carbohydrate Chemistry for Food Scientists. 2 utg. St. Paul, Minnesota: AACC International, Inc. Bendelow, V. M. (1975). Determination of Non-Starch Polysaccharides in Barley breeding programs. Journal of the Institute of Brewing, 81 (2): Boisen, S. & Eggum, B. O. (1991). Critical Evaluation of in Vitro Methods for Estimating Digestibility in Simple-Stomach Animals. Nutrition Research Reviews, 4 (01): Brand, J. C., Nicholson, P. L., Thorburn, A. W. & Truswell, A. S. (1985). Food-processing and the glycemic index. American Journal of Clinical Nutrition, 42 (6): Christiaens, S., Van Buggenhout, S., Houben, K., Fraeye, I., Van Loey, A. M. & Hendrickx, M. E. (2011). Towards a better understanding of the pectin structure-function relationship in broccoli during processing: Part I-macroscopic and molecular analyses. Food Research International, 44 (6): Codex Alimentarius Commission. (2009). Codex Committee on Nutrition and Foods for Special Dietary Uses I: FAO & WHO (red.). Alinorm 09/32/26. Cosgrove, D. J. (2005). Growth of the plant cell wall. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 6 (11): Dressman, J. B., Amidon, G. L., Reppas, C. & Shah, V. P. (1998). Dissolution testing as a prognostic tool for oral drug absorption: Immediate release dosage forms. Pharmaceutical Research, 15 (1):

108 7 LITTERATURLISTE Dressman, J. B., Vertzoni, M., Goumas, K. & Reppas, C. (2007). Estimating drug solubility in the gastrointestinal tract. Advanced Drug Delivery Reviews, 59 (7): Duffus, C. M. & Cochrane, M. P. (1993). Formation of the barley grain: morphology, physiology, and biochemistry. I: MacGregor, A. W. & Bhatty, R. S. (red.) Barley: Chemistry and Technology, s St. Paul, MN: American Association of Cereal Chemists. Elmore, J. S., Mottram, D. S., Muttucumaru, N., Dodson, A. T., Parry, M. A. J. & Halford, N. G. (2007). Changes in free amino acids and sugars in potatoes due to sulfate fertilization and the effect on acrylamide formation. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 55 (13): Englyst, H. N., Quigley, M. E. & Hudson, G. J. (1994). Determination of dietary fiber as Non- Starch Polysaccharides with Gas-Liquid-Chromatographic, High-Performance Liquid- Chromatographic or Spectrophotometric measurement of constituent sugars Analyst, 119 (7): Englyst, H. N. & Hudson, G. J. (1996). The classification and measurement of dietary carbohydrates. Food Chemistry, 57 (1): Eslick, R. F. (1981). Mutation and characterization of unusual genes associated with the seed. Barley Genetics IV: Proc. 4th International Barley Genetics Symposium. Edinburgh, UK s. Fincher, G. B. & Stone, B. A. (1986). Cell walls and their components in cereal grain technology. I: Pomeranz, Y. (red.) b. 8 Advances in Cereal Science and Technology s St. Paul, Minnesota: American Association of Cereal Chemists. Fraeye, I., De Roeck, A., Duvetter, T., Verlent, I., Hendrickx, M. & Van Loey, A. (2007). Influence of pectin properties and processing conditions on thermal pectin degradation. Food Chemistry, 105 (2): Gardner, K. H. & Blackwel.J. (1974). Structure of native cellulose Biopolymers, 13 (10): Gnanasambandam, R. & Proctor, A. (2000). Determination of pectin degree of esterification by diffuse reflectance Fourier transform infrared spectroscopy. Food Chemistry, 68 (3): Gray, G. M. (1992). Starch digestion and absorption in nonruminants Journal of Nutrition, 122 (1): Greibrokk, T., Lundanes, E. & Rasmussen, K. E. (1994). Kromatografi. 4 utg. Oslo: Universitetsforlaget. Greve, L. C., McArdle, R. N., Gohlke, J. R. & Labavitch, J. M. (1994). Impact of heating on carrot firmness - Changes in cell-wall components Journal of Agricultural and Food Chemistry, 42 (12): Harlan, H. V. (1920). Daily development of kernels of Hannchen barley from flowering to maturity at Aberdeen, Idahio. J. Agric. Res., 19: Harlan, J. R. & Zohary, D. (1966). Distribution of wild wheats and barley Science, 153 (3740): 1074-&. Helsedirektoratet. (2011). Kostråd for å fremme folkehelsen og forebygge kroniske sykdommer, metodologi og vitenskapelig kunnskapsgrunnlag. Nasjonalt råd for ernæring. Oslo: Helse- og omsorgsdepartementet. Henry, R. J. (1986). Genetic and environmental variation in the pentosan and beta-glucan contents of barley, and their relation to malting quality Journal of Cereal Science, 4 (3):

109 7 LITTERATURLISTE Henry, R. J. (1988). The carbohydrates of barley grains - A Review Journal of the Institute of Brewing, 94 (2): Hoebler, C., Lecannu, G., Belleville, C., Devaux, M. F., Popineau, Y. & Barry, J. L. (2002). Development of an in vitro system simulating bucco-gastric digestion to assess the physical and chemical changes of food. International Journal of Food Sciences and Nutrition, 53 (5): Houben, K., Jolie, R. P., Fraeye, I., Van Loey, A. M. & Hendrickx, M. E. (2011). Comparative study of the cell wall composition of broccoli, carrot, and tomato: Structural characterization of the extractable pectins and hemicelluloses. Carbohydrate Research, 346 (9): Institute for Reference Materials and Measurements (IRMM) & European Reference Materials (ERM). (1996). Certification report I: European Commission (red.). The method specific certification of the mass fraction of dietray fibre in lyophilised haricot beans, carrot, apple, full fat soya fluor and bran breakfast cereal reference materials. Luxembourg. Izydorczyk, M. S. & Biliaderis, C. G. (1995). Cereal arabinoxylans: advances in structure and physicochemical properties. Carbohydrate Polymers, 28 (1): Kahlon, T. S., Chow, F. I., Knuckles, B. E. & Chiu, M. M. (1993). Cholesterol-lowering effects in hamsters of beta-glucan-enriched barley fraction, dehulled whole barley, rice bran, and oat bran and their combinations Cereal Chemistry, 70 (4): Kent, N. L. & Evers, A. D. (1994). Technology of Cereals. 4 utg. Oxford, UK: Elsevier Science. King, G. A. & Morris, S. C. (1994). Early compositional changes during postharvest senescence of broccoli Journal of the American Society for Horticultural Science, 119 (5): Knudsen, K. E. B. & Eggum, B. O. (1984). The nutritive-value of botanically defined mill fractions of barley.3. The protein and energy value of pericarp, testa, germ, aleuron, and endosperm rich decortication fractions of the variety bomi Zeitschrift Fur Tierphysiologie Tierernahrung Und Futtermittelkunde-Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition, 51 (3): Kong, F. & Singh, R. P. (2008). Disintegration of solid foods in human stomach. Journal of Food Science, 73 (5): R67-R80. Krall, S. M. & McFeeters, R. F. (1998). Pectin hydrolysis: Effect of temperature, degree of methylation, ph, and calcium on hydrolysis rates. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 46 (4): Mac Leod, A. M. (1957). Raffinose Metabolism in Germinating Barley. New Phytologist, 56 (2): Mac Leod, A. M. (1959). Cellulose distribution in barley. Journal of the Institute of Brewing, 65: MacGregor, A. W. & Fincher, G. F. (1993). Carbohydrates of the barley grain. I: Bhatty, R. S. (red.) Barley: Chemistry and Technology, s St. Paul, MN: American Association of Cereal Chemists. Margareta, E. & Nyman, G. L. (2003). Importance of processing for physico-chemical and physiological properties of dietary fibre. Proceedings of the Nutrition Society, 62 (1): McCleary, B. V., DeVries, J. W., Rader, J. I., Cohen, G., Prosky, L., Mugford, D. C., Champ, M. & Okuma, K. (2010). Determination of Total Dietary Fiber (CODEX Definition) by 98

110 7 LITTERATURLISTE Enzymatic-Gravimetric Method and Liquid Chromatography: Collaborative Study. Journal of Aoac International, 93 (1): Mohnen, D. (2008). Pectin structure and biosynthesis. Current Opinion in Plant Biology, 11 (3): Nakamura, A., Furuta, H., Maeda, H., Takao, T. & Nagamatsu, Y. (2002). Structural studies by stepwise enzymatic degradation of the main backbone of soybean soluble polysaccharides consisting of galacturonan and rhamnogalacturonan. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 66 (6): Newman, R. K. & Newman, C. W. (2008). Barley for food and helath: Science, Technology, and Products. New Jersey: John Wiley & Sons, Inc. Nilsson, J., Olsson, K., Engqvist, G., Ekvall, J., Olsson, M., Nyman, M. & Akesson, B. (2006). Variation in the content of glucosinolates, hydroxycinnamic acids, carotenoids, total antioxidant capacity and low-molecular-weight carbohydrates in Brassica vegetables. Journal of the Science of Food and Agriculture, 86 (4): Nothnagel, E. A., McNeil, M., Albersheim, P. & Dell, A. (1983). Host-pathogen interactions.22. A galacturonic acid oligosaccharide from plant-cell walls elicits phytoalexins Plant Physiology, 71 (4): O'Neill, M. A., Ishii, T., Albersheim, P. & Darvill, A. G. (2004). Rhamnogalacturonan II: Structure and function of a borate cross-linked cell wall pectic polysaccharide. Annual Review of Plant Biology, 55: Panouille, M., Thibault, J. F. & Bonnin, E. (2006). Cellulase and protease preparations can extract Pectins from various plant byproducts. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54 (23): Poole, C. F. (2003). The Essence of Chromatography. Detroit, USA: Elsevier Science Ralet, M.-C., Lerouge, P. & Quéméner, B. (2009). Mass spectrometry for pectin structure analysis. Carbohydrate Research, 344 (14): Rosa, E., David, M. & Gomes, M. H. (2001). Glucose, fructose and sucrose content in broccoli, white cabbage and Portuguese cabbage grown in early and late seasons. Journal of the Science of Food and Agriculture, 81 (12): Sajjaanantakul, T., Vanburen, J. P. & Downing, D. L. (1989). Effect of methyl-ester content on heat degradation of chelator-soluble carrot pectin. Journal of Food Science, 54 (5): Saladin, K. S. (2010). Anatomy and Physiology, The Unity of Form and Function. 5 utg. New York: McGraw-Hill Companies s. Selvendran, R. R. & Robertson, J. A. (1994). Dietary fiber in foods - amount and type. Physico- Chemical Properties of Dietary Fibre and Effect of Processing on Micronutrients Availability: Cost 92 - Metabolic and Physiological Aspects of Dietary Fibre in Food. Luxembourg: Commission European Communities s. Siddiqui, A. M., Provost, A. & Schwarz, W. H. (1991). Peristaltic pumping of a 2nd-order fluid in a planar channel Rheologica Acta, 30 (3): Sila, D. N., Duvetter, T., De Roeck, A., Verlent, I., Smout, C., Moates, G. K., Hills, B. P., Waldron, K. K., Hendrickx, M. & Van Loey, A. (2008). Texture changes of processed fruits and vegetables: potential use of high-pressure processing. Trends in Food Science & Technology, 19 (6): Sila, D. N., Van Buggenhout, S., Duvetter, T., Fraeye, I., De Roeck, A., Van Loey, A. & Hendrickx, M. (2009). Pectins in Processed Fruit and Vegetables: Part II - Structure- 99

111 7 LITTERATURLISTE Function Relationships. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 8 (2): Slavin, J. L. (2001). Dietary fiber and colon cancer. Handbook of Dietary Fiber, 113: Statens råd for ernæring og fysisk aktivitet (SEF), Statens næringsmiddeltilsyn (SNT) & Institutt for ernæringsforskning ved UiO. (2001). Matvaretabellen. Svanberg, S. J. M., Nyman, E., Andersson, R. & Nilsson, T. (1997). Effects of boiling and storage on dietary fibre and digestible carbohydrates in various cultivars of carrots. Journal of the Science of Food and Agriculture, 73 (2): Symons, L. J. & Brennan, C. S. (2004). The influence of (1 -> 3) (1 -> 4)-beta-D-glucan-rich fractions from barley on the physicochemical properties and in vitro reducing sugar release of white wheat breads. Journal of Food Science, 69 (6): C463-C467. Takeda, Y., Shirasaka, K. & Hizukuri, S. (1984). Examination of the purity and structure of amylose by gel-permeation chromatography Carbohydrate Research, 132 (1): Thebaudin, J. Y., Lefebvre, A. C., Harrington, M. & Bourgeois, C. M. (1997). Dietary fibres: Nutritional and technological interest. Trends in Food Science & Technology, 8 (2): Thibault, J.-F., Renard, C. M. G. C., Axelos, M. A. V., Roger, P. & Crépeau, M.-J. (1993). Studies of the length of homogalacturonic regions in pectins by acid hydrolysis. Carbohydrate Research, 238: Thomas, A. (2006). Gut motility, sphincters and reflex control. Anaesthesia & intensive care medicine, 7 (2): Tungland, B. C. & Meyer, D. (2002). Nondigestible Oligo- and Polysaccharides (Dietary Fiber): Their Physiology and Role in Human Health and Food. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 1 (3): Ulleberg, E., Comi, I., Holm, H., Herud, E., Jacobsen, M. & Vegarud, G. (2011). Human Gastrointestinal Juices Intended for Use in In Vitro Digestion Models. Food Digestion: Ullrich, S. E., Clancy, J. A., Eslick, R. F. & Lance, R. C. M. (1986). Beta-glucan content and viscosity of extracts from waxy barley Journal of Cereal Science, 4 (3): Urbain, J. L. C., Siegel, J. A., Charkes, N. D., Maurer, A. H., Malmud, L. S. & Fisher, R. S. (1989). The 2-component stomach - effects of meal particle-size on fundal and antral emptying European Journal of Nuclear Medicine, 15 (5): Van Horn, L., McCoin, M., Kris-Etherton, P. M., Burke, F., Carson, J. A. S., Champagne, C. M., Karmally, W. & Sikand, G. (2008). The evidence for dietary prevention and treatment of cardiovascular disease. Journal of the American Dietetic Association, 108 (2): Vanburen, J. P. (1979). Chemistry of texture in fruits and vegetables Journal of Texture Studies, 10 (1): Vasanthan, T., Jiang, G. S., Yeung, J. & Li, J. H. (2002). Dietary fiber profile of barley flour as affected by extrusion cooking. Food Chemistry, 77 (1): Vietor, R. J., Angelino, S. & Voragen, A. G. J. (1992). Structural features of arabinoxylans from barley and malt cell-wall material. Journal of Cereal Science, 15 (3): Virkki, L., Johansson, L., Ylinen, M., Maunu, S. & Ekholm, P. (2005). Structural characterization of water-insoluble nonstarchy polysaccharides of oats and barley. Carbohydrate Polymers, 59 (3):

112 7 LITTERATURLISTE Voragen, A. G. J. & Pilnik, W. (1995). Pectins. I: Stephen, A. M. (red.) A series of monographs, textbooks, and reference books, Food polysaccharides and their applications, s New York: Marcel Dekker, Inc. Voragen, A. G. J., Coenen, G. J., Verhoef, R. P. & Schols, H. A. (2009). Pectin, a versatile polysaccharide present in plant cell walls. Structural Chemistry, 20 (2): Waldron, K. W., Smith, A. C., Parr, A. J., Ng, A. & Parker, M. L. (1997). New approaches to understanding and controlling cell separation in relation to fruit and vegetable texture. Trends in Food Science & Technology, 8 (7): Wennberg, M., Engqvist, G. & Nyman, M. (2002). Effects of harvest time and storage on dietary fibre components in various cultivars of white cabbage (Brassica oleracea var capitata). Journal of the Science of Food and Agriculture, 82 (12): Wennberg, M., Ekvall, J., Olsson, K. & Nyman, M. (2006). Changes in carbohydrate and glucosinolate composition in white cabbage (Brassica oleracea var. capitata) during blanching and treatment with acetic acid. Food Chemistry, 95 (2): Westereng, B., Michaelsen, T. E., Samuelsen, A. B. & Knutsen, S. H. (2008). Effects of extraction conditions on the chemical structure and biological activity of white cabbage pectin. Carbohydrate Polymers, 72 (1): Woolnough, J. W., Monro, J. A., Brennan, C. S. & Bird, A. R. (2008). Simulating human carbohydrate digestion in vitro: a review of methods and the need for standardisation. International Journal of Food Science and Technology, 43 (12): Xue, Q., Wang, L., Newman, R. K., Newman, C. W. & Graham, H. (1997). Influence of the Hulless, Waxy Starch and Short-awn Genes on the Composition of Barleys. Journal of Cereal Science, 26 (2): Zohary, D. & Hopf, M. (1988). Domestication of plants in the old world: The origin and spread of cultivated plants in west Asia, Europe, and the Nile Valley: Clarendon Press (Oxford, OX and New York) 249 s. 101

113 102 VEDLEGG 1

114 VEDLEGG 1 Vedlegg 1: Utregning av en spesifikk komponent i en ukjent prøve fra HPAEC-PAD og GLC HPAEC-PAD Det første som må gjøres er å regne ut internstandard responsfaktor (IRF) ved hjelp av følgende formel: IRF Areal Is Mengde Sk Mengde Is Areal Sk Is = internstandard (Trehalose) Sk = spesifikk komponent (den komponenten man ønsker å finne) Arealene finner man ved å lage en standardkurve ved hjelp av en standardløsning med kjent innhold av mengde sukker som ønskes kvantifisert. Det er viktig at også denne inneholder internstandard. I dette regneeksempelet brukes det en standard inneholdende 0,0009 mg/ml glukose og 0,0011 mg/ml trehalose som gir arealer på henholdsvis 1,8624 og 0,94: (0,94 0,0009) IRF sk (0,0011 1,8624) 0,413 Denne faktoren brukes for å regne ut mengde spesifikk komponent i ukjent prøve ved hjelp av følgende formel: Mengde is Area sk IRF sk Area is 103

115 VEDLEGG 1 Ut ifra kromatogrammet finner man arealet under trehalose-toppen og under toppen til spesifikk komponent (her: glukose) som ønskes kvantifisert i ukjent prøve. I tillegg må man vite konsentrasjonen av trehalose i den ukjente prøven. I dette eksempelet benyttes en prøve innholdende 37,568 mg/ml tørrstoff i det internstandarden tilsettes. Det tilsettes 100 L 10 mg/ml trehalose i 1 ml prøve, slik at trehalosen fortynnes til 1 mg/ml. Areal trehalose: 5,0595 Areal glukose: 19,7621 Tallene plottes inn i formelen: 1 19,7621 0,413 1,6132 5,0595 1,6132 mg glukose i prøven Relativ mengde glukose (g/100 g): 1, ,568 4,294 Mengden glukose i prøven blir dermed 4,294 g/100 g tørrstoff 104

116 VEDLEGG 1 GLC R F Areal Is Mengde Sk Mengde Is Areal Sk Is = internstandard (Allose) Sk = spesifikk komponent (den komponenten man ønsker å finne) I dette regneeksempelet brukes det en standard inneholdende 3 mg/ml allose og 10 mg/ml glukose som gir arealer på henholdsvis 483 og 1449: (483 10) R F (3 1449) Denne faktoren brukes til å regne ut mengde spesifikk komponent i ukjent prøve ved hjelp av følgende formel: A T M I R F 100 A I M T 0,89 A T og A I er arealene av henholdsvis prøve og internstandard; 226 og 456 M I er massen av internstandard (mg); 1,5 mg M T er massen av prøven (mg); 10,2 mg R F er responsfaktoren (samme som IRF i forrige eksempel); 1, ,89 er faktor for å konvertere verdiene for monosakkarider til polysakkarider, for å veie opp for vannmolekylene som forsvinner ved dannelse av glykosidbindinger. Tallene plottes inn i formelen: 226 1,5 1, ,2 7,207 Mengden glukose i prøven blir dermed 7,207 g/100 g tørrstoff 105

117 VEDLEGG 2 Vedlegg 2: ERM-referansetabell Tabell 8.5 i ERM referansetabell, side 60 (Institute for Reference Materials and Measurements (IRMM) & European Reference Materials (ERM) 1996) med verdier for nøytrale monosakkarider og uronsyre gjeldene for standarder ved analyse i henhold til NSPmetoden (Englyst et al. 1994). Standardene CRM 515 av tørket gulrotpulver og CRM 516 av tørket eplepulver ble brukt. 106