Konjugeringsenzymer. Glukuronidering Sulfatering Acetylering Metylering Glutationkonjugering Aminosyrekonjugering

Transkript

1 Konjugeringsenzymer Glukuronidering Sulfatering Acetylering Metylering Glutationkonjugering Aminosyrekonjugering

2 Konjugeringsenzymer Konjugat Kosubstrat Enzym Glukosid UDP-G Glukosyltransferase Glukuronid UDP-GA Glukuronosyltransferase Sulfat PAPS Sulfotransferase Acetat AcCoA N-acetyltransferase Glutationkonjugat GSH Glutationtransferase Aminosyrekonjugat CoAderivat Metylering A- adenosylmetionin

3 Typiske substrater PAPS og UDPG: Hydroksylgrupper og aminogrupper som i fenoler, aromatiske aminer og høyere alkoholer GSH: Elektrofiler som i klororganiske forbindelser, epoksider, men også estere og addisjon til enkelte dobbeltbindinger

4 Kosubstratkons i cellene: Fosfoadeninfosfosulfonat 75 µm Uridindifosfatglukuronsyre 350 µm Glutation 10 mm Finn strukturformlene av disse! Glutation reagerer med elektofiler PAPS og UDPG med nukleofiler Gifter 93 og 99

5 H UDP - Glu Glu H PAPS S 3 H UDP C - H H P P CH 2 H - - H (UDP-Glu) uridindifosfat-glukuronsyre HN N H - S P - (PAPS) PAP CH 2 - P - N N H 3'-fosfoadenosin-5'-fosfosulfat NH 2 N N Gifter 99

6 Metabolisme av GSH-konjugater Glutation Gifter 120 NH 2 CHC - RX + GSH CH 2 CH γ Glutamyl- 2 XH C NH Glutationkonjugat R SCH 2 CH cysteinyl- glycin C NH CH 2 C - Glutationkonjugat av R Til Gallen H 2 γ Glutamyltranspeptidase Glutamat R SCH 2 NH 2 CH C NH CH 2 C - H 2 Aminopeptidase Gycin NH 2 R SCH 2 CH _ C Metylering β-lyase R SH Glukuronidering C CoA N-acetyltransferase CoA NHC R SCH 2 CH _ C Merkaptursyre RS Tioeter RSGlu S-Glukuronid Til urin Til urin

7 Typer glukuronosyltransferaser Vi regner med 4 hovedtyper fra to genfamilier Substratspesifisitet og alder avgjør når vi har ekspesjon av dem Glukuronider skilles ut i gallen: MV>350 D eller i urinen MV<250 Endogene substrater: bilirubin, steroide hormoner, tyroksin

8 Egenskaper og betydning Glukuronosyltransferase: Høy Km høy kapasitet (UDPGlu-kons ~ 75 µm) Sulfotransferase: Lav Km aktiv ved lav konsentrasjon (PAPS-kons ~ 350 µm)

9 METABLISME AV FENL I FRSKJELLIGE DYREARTER: Glu DYR I III II IV H I RTTE MENNESK E II S 3 - KATT MARSVIN GRIS H H III IV Glukuronider Sulfater

10 Glutationtransferase (GST) To hovedformer: Cytosolisk og microsomal Typiske substrater: Epoksider Umettede aldehyder rganiske peroksider Aromatiske og alifatiske stoffer substituert med elektrontiltrekkende grupper Alle substrater reagerer også med GSH uten enzym

11 Klassifikasjon Cytosoliske enzymer er løst sammensatte dipeptider med molvekt ca Forekommer sannsynligvis i alle aerobe celler i konsentrasjoner på 0,5% til 10% av løselig protein Så godt som alle former (ikke klasse T) er aktive mot CDNB: N 2 2 N

12 Klassifikasjon for GST i pattedyr: NB: Dette systemet er tilpasset pattedyrtoksikologi ettersom f. eks. insekter og planters enzymer gis et liknende, men ikke likt system Grunnlagt i aminosyresekvensen. 5 eller flere klasser (A, M, P, T pluss mikrosomale) > 50 % sekvenslikhet for enzymer av samme klasse (oftest > 70 %) Hver subenhet har et nummer som av historiske grunner er:

13 Fortsettelse A: 1, 2, 8, 10 M: 3, 4, 6, 8, 10 P: 7 T: 5 En liten bokstav foran, f. eks. h eller r antyder hvilke dyr de stammer fra. (Eks. hgsta1-2 for human GST med peptidene 1 og 2. (Heteromer)

14 Induksjon I dyr 2 til 3 ganger ved Metylkolantren, Fenobarital Kortikosteroider Antioksidanter RS (H 2 2 ) Mange typiske substrater NB! Broccoli har et stoff (sulforafan) som er en sterk induktor mrna øker. Dvs. Induksjonen er på transkripsjonsnivå. Flere enhancer-regioner er involvert, XRE, ARE, GRE etc. I planter: Safeners

15 Funksjoner Uskadeliggjøring av elektrofiler som ellers kunne gi celleskader eller somatiske mutasjoner Innfanging av bilirubin, sterolmetabolitter etc. Dette er spesielt viktig i lever. Mange alleliske varianter som kan gi opphav til f. eks. insektmiddelresistens for insekter og herbicidresistens hos planter

16 Typesubstrater ofte brukt i biokjemiske studier N 2 2 N N 2 C H CDNB DCNB kumenperoksid HCCH 2 I metyliodid etakrynsyre CH 2 CC 2 H 5 CH 2

17 Gifter N Noen typiske elektrofiler som reagerer med GSH δ+ N 2 δ+ I CH 2 δ+ CHCH δ+ C H δ+ CH CH NC δ+

18 Eksempel på naturlig substrat kolesterol-5,6-oksid H GSH H H SG

19 Resistensmekanismer hos insekter: Anrikning i populasjonen av sjeldne alleler av GST som kan katalysere konjugering av insektmidlet til GSH: H C GSH C DDT S P C 3 N 2 GSH DDE H S P C 2 N 2 parathion-methyl lindane SG GSH H SG

20 Få tilfeller der konjugering fører til Gifter 118 bioaktivering: CH 2 CH 2 Etylenklorid GSH G S CH 2 CH 2 SG H 2 C CH 2

21 Artsforskjeller Alle dyr har GST og GSH Dyr som lever på knapp vannbalanse, og giftholdig mat har mer spesielt av former som kan konjugere mindre reaktive elektrofiler som f. eks. DCNB Kålfluelarver og rottelever er meget rike på GST, (flere prosent av totalprotein), mens f. eks. vannkalver har lite.

22 Fra Stenersen et al Mengde GST som prosent av totalprotein i postmikrosomal supernatant fra hele dyr: Art GST-protein (%) Hydra attenuata 0,7 Eisenia andrei 0.58 Tipula paludosa larvae 0.5 Callophora vomiaria larvae 0.47 Delia floralis pupae 0.61 Delia floralis larvae 1.37 Phylopertha horticola 0.26 Tenebrio molitor 0.97 Alces alces liver 3.1 Tetrahymena thermophila 0.7 Rottelever 10 Humanlever 3

23 Måle- og rensemetoder Glutation bindes kovalent til en gelmatriks (agarose el. Sephadex) Proteinblandingen eks et bufferekstrakt av et vev el. l. føres gjennom en kolonne med gelen GST vil bindes helt spesifikt til GSH i matriksen Alle andre proteiner skylles ut med buffer GST elueres deretter spesifikt med en alkalisk, GSH-holdig buffer og vil være nesten helt rent! De ulike formene kan deretter separeres fra hverandre ved hjelp av ionekromatografi, etc.

24 Måling ftest enklest med CDNB som gir høy aktivitet (unntatt for T-familien) CDNB + GST + GSH har lav lysabsorbans ved λ = 340nm, mens GS-DNB har mye høyere Reaksjonen kan derfor lett følges i et vanlig spektrofotometer og enzymaktiviteten kan bestemmes

25 Eksempler på biotransformasjon av enkele stoffer Paracetamol Diklorvos Karbaryl Malation For disse stoffene er mange av de nevnte biotransformaswjonene inolvert

26 PARACETAML Metabolisme av enkelte stoffer - eksempler GSSG HNC sulfotransferase HNC GST1-1 GST2-2 2GSH H NADPH 2 CYP2E1 CYP1A2 CYP3A4 UDP-glukuronosyltransferase konjugat NC HNC GSH Nukleofilt makromolekyl δ+ GST7-7 H SG HNC Merkaptursyre Makromolekyl H

27 Diklorvos menneske rotte gris P CH CCL 2 menneske rotte gris CH 2 CH diklorvos mus P H H P CH CCL 2 CH CH C 2 H P H CH 2 NH 2 CH glycin 39 % 14 C-vinylmerket diklorvos Rotte: 39 % i utåndingslufta 31 % inkorporeres i organismen proteiner etc. 31 %

28 CNH rotte sulfat Karbaryl CNH H menneske rotte sau ikke hund CNH menneske rotte glukuronid H glukuronid H menneske rotte diverse dyr Karbaryl CNH diverse dyr sulfat CNHCH 2 H diverse dyr H glukuronid sulfat H H

29 S P S CHCC 2 H 5 CH 2 CC 2 H 5 Glutationtransferaser GSH, 2, H 2 CYP-enzymer S P S CHCC 2 H 5 CH 2 CC 2 H 5 Karboksylesteraser