(12) PATENT (19) NO (11) (13) B1. NORGE (51) Int Cl. Patentstyret

Transkript

1 (12) PATENT (19) NO (11) (13) B1 NORGE (1) Int Cl. A61K 31/4164 (06.01) A61K 31/4184 (06.01) A61K 31/0 (06.01) A61P 9/ (06.01) Patentstyret (21) Søknadsnr (86) Int.inng.dag og søknadsnr PCT/GB04/041 (22) Inng.dag (8) Videreføringsdag (24) Løpedag () Prioritet , GB, (41) Alm.tilgj (4) Meddelt (73) Innehaver AstraZeneca UK Ltd, 1 Stanhope Gate, GB-W1K1LN LONDON, Storbritannia (72) Oppfinner Jay Lal Mehta, c/o University of Arkansas for Medical Sciences, 41 W Markham, Slot 32, US-AR72 LITTLE ROCK, USA (74) Fullmektig Bryn Aarflot AS, Postboks 449 Sentrum, 04 OSLO, Norge (4) Benevnelse Kombinasjon omfattende kandesartan eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav og rosuvastatin eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav for forebygging eller behandling av sykdom (6) Anførte publikasjoner (7) Sammendrag WO A1 EP A1 WO A1 Det beskrives en kombinasjon som omfatter kandesartan og rosuvastatin for forebyggelse eller behandling av aterosklerose og for forebyggelse av kardiovaskulære hendelser.

2

3 1 1 2 Foreliggende oppfinnelse vedrører en kombinasjon omfattende kandesartan eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav og rosuvastatin eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav for forebygging eller behandling av sykdom. Foreliggende oppfinnelse vedrører videre farmasøytiske blandinger som omfatter ovennevnte kombinasjon for forebygging eller behandling av sykdom. Foreliggende oppfinnelse vedrører videre anvendelsen av ovennevnte kombinasjon til forebyggelse eller behandling av aterosklerose. Aterosklerose er en tilstand som medieres av komplekse patologiske prosessser, som resulterer i uregelmessig fordelte lipidavsetninger i arteriene og er en vesentlig bidragsfaktor til koronar hjertesykdom. En reduksjon i aterosklerose er derfor et hovedmål for å redusere antallet av kardiovaskulære hendelser, for eksempel myokardinfarkt, forverring av angina, hjertestans, slag, kongestiv hjertesvikt og kardiovaskulær død. Dyslipidemi, særlig økt plasmanivå av LDL (low density lipoprotein) er en av hovedrisikofaktorene ved aterosklerose. Kliniske studier har vist at redusering av LDL-nivå i plasma med 3-hydroksy-3- metyl-glutaryl-koenzym A (HMG CoA) reduktaseinhibitorer, vanlig kjent som statiner, resulterer i lavere risiko for kardiovaskulære hendelser. Aktivering av renin-angiotensin-systemet (RAS) kan anses som en annen viktig risikofaktor ved aterosklerose. Aktivering av RAS med dannelsen av angiotensin(ii) (A(II)), og aktiveringen av A(II)-reseptorer har vært ansett implisert i aterogenese, plakkruptur, myokardial iskemisk dysfunksjon og kongestiv hjertesvikt (Singh & Mehta, Arch Intern Med, 03, Bd. 163, ). Internasjonal patentsøknad WO 9/26188 beskriver behandling av aterosklerose med A(II)-reseptorblokkere, eventuelt i kombinasjon med HMGCoA reduktaseinhibitorer. Internasjonal patentsøknad WO 01/7673 omtaler anvendelsen av en kombinasjon av minst to av en A(II)-antagonist, en ACE- (angiotensin-konverterende enzym) inhibitor og en HMGCoA reduktaseinhibitor for forhindring eller forsinkelse av progresjonen i en rekke tilstander, inklusivt aterosklerose. Vi har overraskende funnet at kombinasjonen av A(II)-antagonisten kandesartan og HMG CoA reduktaseinhibitoren rosuvastatin har en synergistisk effekt ved reduksjonen av aterosklerose. Denne synergistiske effekt synes å skrive seg fra synergistisk inhibering av ekspresjon av en rekke inflammatoriske

4 2 1 2 mediatorer involvert i RAS (for eksempel CD40, metalloproteinaser (MMP)) og/eller inhibering av ekspresjonen av reseptoren LOX-1 (som er en reseptor for oksydert LDL på endoteliale celler). Den synergistiske effekt gir en sterk indikasjon på cross-talk mellom RAS og dyslipidemi ved aterogenese. Det skal bemerkes at aktiviteten av MMP kan reguleres in vivo av deres vevsinhibitorer (TIMP). Vi har også vist at ekspresjonen av TIMP-1 og TIMP-2 oppreguleres av kolesterolrik diett og svekkes markert med kombinasjonen av kandesartan og rosuvastatin. Disse data sannsynliggjør konseptet at balansen mellom MMP og TIMP endres av kolesterolrik diett og at denne ubalanse kan normaliseres ved kombinasjonen av en A(II)-antagonist og et lipidsenkende middel. I henhold til ett aspekt ved oppfinnelsen tilveiebringes en kombinasjon omfattende kandesartan eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, og rosuvastatin eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, for forebyggelse eller behandling av aterosklerose. I henhold til ett aspekt ved oppfinnelsen tilveiebringes en kombinasjon omfattende kandesartan eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, og rosuvastatin eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, for forhindring av kardiovaskulære hendelser. En slik kombinasjon kan også være anvendelig ved behandlingen eller forebyggelsen av andre sykdommer forbundet med disse mediatorer, for eksempel ved inflammatoriske sykdommer eller lidelser, så som iskemi-reperfusjonsskade (til hjerte, hjerne, nyrer, lunger og lever), strålings-fremkalt skade, brannskade og perifer vaskulær sykdom. Kandesartan kan hensiktsmessig være i form av kandesartan eller i prodrug-formen kandesartan-cilexetil. Disse formene kan formuleres med et ytterligere middel, så som et diuretikum som hydroklortiazid (for eksempel som markedsført som Atacand Plus ). Hvor det her er referert til kandesartan, omfatter dette både kandesartan og kandesartan-cilexetil. Fortrinnsvis blir kalsiumsaltet av rosuvastatin, som kan refereres til som rosuvastatin-kalsium, anvendt i de forskjellige aspekter ved foreliggende oppfinnelse.

5 3 1 2 Generelt omfatter farmasøytisk akseptable salter syreaddisjonssalter, så som metansulfonat, tosylat, -glycerofosfat, fumarat, hydroklorid, citrat, maleat, tartrat og (mindre foretrukket) hydrobromid. Farmasøytisk akseptable salter omfatter generelt også salter dannet med fosforsyre og svovelsyre. Farmasøytisk akseptable salter omfatter generelt basesalter, så som et alkalimetallsalt, for eksempel natrium, et jordalkalimetallsalt, for eksempel kalsium eller magnesium, et organisk aminsalt, for eksempel trietylamin, morfolin, N-metylpiperidin, N-etylpiperidin, prokain, dibenzylamin, N,N-dibenzyletylamin, tris-(2-hydroksyetyl)amin, tris(hydroksymetyl)metylammonium, N-metyl-d-glukamin og aminosyrer så som lysin. Det kan være mer enn ett kation eller anion avhengig av antallet ladede funksjoner og valensen av kationene eller anionene. Når betegnelsen kombinasjon her benyttes skal det forstås at dette samtidig angir separat eller sekvensiell administrering. I ett aspekt ifølge oppfinnelsen angir kombinasjon samtidig administrering. I et annet aspekt ved oppfinnelsen angir kombinasjon separat administrering. I et ytterligere aspekt ifølge oppfinnelsen angir kombinasjon suksessiv administrering. Når administreringen er suksessiv eller separat, må forsinkelsen i administrering av den andre komponent være slik at begge midler er tilstede i kroppen for å produsere den synergistiske effekten av kombinasjonen. I henhold til et ytterligere aspekt ved oppfinnelsen tilveiebringes et farmasøytisk preparat som omfatter kandesartan eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, og rosuvastatin eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, sammen med et farmasøytisk akseptabelt fortynnings- eller bæremiddel for anvendelse ved forebyggelsen eller behandlingen av aterosklerose. I henhold til et ytterligere aspekt ved oppfinnelsen tilveiebringes et farmasøytisk preparat som omfatter kandesartan eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, og rosuvastatin eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, sammen med et farmasøytisk akseptabelt fortynnings- eller bæremiddel for anvendelse ved forebyggelsen eller reduksjonen av risiko for kardiovaskulære hendelser. Preparatene beskrevet her kan være i en form egnet for peroral administrering, for eksempel som en tablett eller kapsel, for parenteral injeksjon (omfattende intravenøs, subkutan, intramuskulær, intravaskulær eller infusjon) for eksempel som en steril løsning, suspensjon eller emulsjon, for topisk

6 4 1 2 administrering, for eksempel som en salve eller krem, for rektal administrering, for eksempel som et suppositorium, eller administreringsmåten kan være ved direkte injeksjon inn i tumoren eller ved regional avlevering eller ved lokal avlevering. I andre utførelsesformer av foreliggende oppfinnelse kan forbindelsene i kombinasjonsbehandlingen avleveres endoskopisk, intratrakealt, intralesjonalt, perkutant, intravenøst, subkutant, intraperitonealt eller intratumoralt. Generelt kan preparatene beskrevet her fremstilles på konvensjonell måte ved anvendelse av konvensjonelle hjelpestoffer eller bærere som er velkjent på området. Egnede farmasøytisk akseptable hjelpestoffer eller bærere for en tablettformulering omfatter for eksempel inerte hjelpestoffer så som laktose, natriumkarbonat, kalsiumfosfat eller kalsiumkarbonat, granulerings- og sprengemidler, så som maisstivelse eller alginsyre; bindemidler så som gelatin eller stivelse; smøremidler så som magnesiumstearat, stearinsyre eller talk; konserveringsmidler, så som etyl- eller propyl-4-hydroksybenzoat, og antioksydanter, så som askorbinsyre. Tablettformuleringer kan være ubelagt eller belagt enten for å modifisere deres desintegrering og den påfølgende absorpsjon av virkestoffet i den gastrointestinale trakt, eller for å forbedre deres stabilitet og/eller utseende, i ethvert tilfelle ved anvendelse av konvensjonelle beleggingsmidler og prosedyrer velkjent på området. Preparater for peroral anvendelse kan være i form av harde gelatinkapsler, hvor virkestoffet er blandet med et inert fast hjelpestoff, for eksempel kalsiumkarbonat, kalsiumfosfat eller kaolin, eller som myke gelatinkapsler hvor virkestoffet er blandet med vann eller en olje, så som jordnøttolje, flytende parafin eller olivenolje. Kandesartan er kommersielt tilgjengelig som Atacand og Atacand Plus. Rosuvastatin-kalsium er kommersielt tilgjengelig som Crestor. Egnede formuleringer for foreliggende oppfinnelse omfatter de som er kommersielt tilgjengelige. Egnede doseringer av hver komponent av kombinasjonen er de samme som for markedsførte kommersielle produkter. Alternativt kan synergien mellom komponentene tillate en lavere dose av én eller begge komponenter som skal anvendes. For eksempel kan en dose på 4 mg, 8 mg, 16 mg, 32 mg eller opptil 160 mg kandesartan i kombinasjon med en dose på 80 mg, 40 mg, mg, mg,

7 1 2 mg eller 2, mg rosuvastatin benyttes. Det skal bemerkes at hvilken som helst av kandesartan-dosene kan kombineres med hvilken som helst egnet dose av rosuvastatin. I henhold til ett aspekt anvendes 80 mg rosuvastatin. I henhold til et annet aspekt anvendes 40 mg rosuvastatin. I henhold til et ytterligere aspekt anvendes mg rosuvastatin. I henhold til et ytterligere aspekt anvendes mg rosuvastatin. I henhold til et ytterligere aspekt anvendes mg rosuvastatin. I henhold til et ytterligere aspekt anvendes 2, mg rosuvastatin. I henhold til ett aspekt anvendes mellom 32 og 160 mg, så som ca. 64 til 128 mg, for eksempel 64 til 112 mg, så som ca mg kandesartan. Hensiktsmessig benyttes ca. 72 mg kandesartan. I henhold til et annet aspekt anvendes 32 mg kandesartan. I henhold til et ytterligere aspekt anvendes 16 mg kandesartan. I henhold til et ytterligere aspekt anvendes 8 mg kandesartan. I henhold til et ytterligere aspekt anvendes 4 mg kandesartan. Det skal bemerkes at det farmasøytiske preparatet ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderer et preparat omfattende kandesartan eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, og rosuvastatin eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, og et farmasøytisk akseptabelt hjelpestoff eller bærer. Et slikt preparat, for eksempel i en enkel peroral formulering, tilveiebringer hensiktsmessig det terapeutiske kombinasjonsprodukt ifølge oppfinnelsen for samtidig administrering ved forebyggelsen eller behandlingen av aterosklerose. Fortrinnsvis administreres de to komponenter av kombinasjonen begge peroralt. Fortrinnsvis administreres de to komponenter av kombinasjonen som en enkel peroral formulering. Fortrinnsvis formuleres kombinasjonen som en daglig dosering. Hensiktsmessig formuleres kombinasjonen som en enkelt tablett eller kapsel. De doseringer og planer som er beskrevet ovenfor kan varieres i henhold til den spesielle sykdomstilstand og pasientens generelle tilstand. For eksempel kan det være nødvendig eller ønskelig å redusere ovennevnte doser av komponentene av kombinasjonsbehandlingen for å redusere toksisitet. Doseringer og planer kan også variere, dersom det i tillegg til en kombinasjonsbehandling ifølge fore-

8 6 1 2 liggende oppfinnelse, benyttes ett eller flere ytterligere kjemoterapeutiske midler. Doseringsplanen kan bestemmes av behandlende lege som behandler enhver pasient ved å benytte sin profesjonelle fagkunnskap. Et farmasøytisk preparat ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter også separate preparater som omfatter et første preparat omfattende kandesartan eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, og et farmasøytisk akseptabelt hjelpestoff eller bærer, og et andre preparat omfattende rosuvastatin eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, og et farmasøytisk akseptabelt hjelpestoff eller bærer. Et slikt preparat tilveiebringer hensiktsmessig den terapeutiske kombinasjon ifølge oppfinnelsen for suksessiv eller separat administrering for den synergistiske forebyggelse eller behandling av aterosklerose, men separate preparater kan også administreres samtidig. I henhold til et annet aspekt ved oppfinnelsen tilveiebringes en kombinasjon som omfatter kandesartan eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, og rosuvastatin eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, for anvendelse som et medikament til forebyggelsen eller behandlingen av aterosklerose. I henhold til et annet aspekt ved oppfinnelsen tilveiebringes en kombinasjon som omfatter kandesartan eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, og rosuvastatin eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, for anvendelse som et medikament til forhindringen av kardiovaskulære hendelser. I henhold til et annet aspekt ved oppfinnelsen tilveiebringes en kombinasjon som omfatter kandesartan eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, og rosuvastatin eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, for anvendelse ved fremstillingen av et medikament. I henhold til et annet aspekt ved oppfinnelsen tilveiebringes en kombinasjon som omfatter kandesartan eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, og rosuvastatin eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, for anvendelse ved fremstillingen av et medikament til forebyggelse eller behandling av aterosklerose. I henhold til et annet aspekt ved oppfinnelsen tilveiebringes en kombinasjon som omfatter kandesartan eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, og rosuvastatin eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, for anvendelse ved fremstilling av et medikament til forebyggelse av kardiovaskulære hendelser.

9 7 I henhold til et ytterligere aspekt ved foreliggende oppfinnelse tilveiebringes et sett omfattende en kombinasjon av kandesartan eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, og rosuvastatin; eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, eventuelt med bruksanvisninger for anvendelse ved forebyggelse eller behandling av aterosklerose. 1 Materialer og Metoder Dyremodell Fem par av C7BL/6J mus og tre par av homozygote apo-e knockout-mus (på C7BL/6J bakgrunn) ble oppnådd fra Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME). De ble formert ved bror-søster parring og holdt i et rom opplyst fra klokken 0600 til 1800 og holdt ved 21 C. C7BL/6J mus (n=) ble holdt på regulær diett under hele studieperioden. apo-e knockout-musene ble delt i fire grupper. Gruppe 1 (n=) dyr ble gitt kolesterolrik diett (1% kolesterol) alene i 12 uker fra 6 ukers alder; Gruppe 2 (n=) dyr ble gitt kolesterolrik diett med kandesartan (1 mg/kg/d) i 12 uker fra 6 ukers alder; Gruppe 3 (n=) dyr ble gitt kolesterolrik diett med rosuvastatin (1 mg/kg/d) i 12 uker fra 6 ukers alder; Gruppe 4 (n=) dyr ble gitt kolesterolrik diett med kandesartan (1 mg/kg/d) og rosuvastatin (1 mg/kg/d) i 12 uker fra 6 ukers alder. Ved slutten av 12-ukers behandlingen ble musene avlivet og underkastet nedenfor beskrevne studier. Alle forsøksprosedyrer ble utført i henhold til protokoller godkjent av the Institutional Animal Care and Usage Committee of University of Arkansas for Medical Sciences. 2 Kvantitativ analyse av aterosklerotiske plakk Ved slutten av 12 ukers behandlingen ble mus fra hver gruppe avlivet og aorta separert fra omgivende vev. Etter fjerning av adventitia-fettvevet, ble aorta åpnet på langs fra aortabuen til arteria iliacae bifurkasjonen og fiksert i % formalin i 24 timer. Deretter ble aorta gitt en kort rensing i 70% alkohol, farget med Sudan IV løsning i 1 minutter, differensiert i 80% alkohol i minutter og vasket i rennende vann i 1 time (Russell L. Techniques for studying atherosclerotic lesion, Lab Invest. 198; 7:42-47). Aorta ble montert og bilder tatt med et kamera

10 8 forbundet med et disseksjonsmikroskop. Bildene ble analysert med programvare (Image Pro Plus, Media Cybernetics). 1 2 RNA-fremstilling og analyse ved RT-PCR Ved slutten av 12-ukers behandlingen, ble mus fra hver gruppe avlivet og aorta (fra aortabuen til aorta-bifurkasjonen) skilt fra omgivende vev og oppbevart på tørris. Hver aorta ble kuttet i fire segmenter, to som ble benyttet til å ekstrahere total RNA med enkelt-trinns syre-guanidinium tiocyanat-fenol-kloroform metoden som beskrevet tidligere (27). Ett mikrogram total RNA ble revers transkribert inn i cdna med oligo-dt (Promega, Madison, WI, U.S.A.) og M-MLV (Maloney Murine Leukemia Virus) revers transkripsjon (Promega) ved 42 C i 1 time. To mikroliter revers transkripsjons- (RT) materiale ble amplifisert med Taq DNA-polymerase (Promega) og et primerpar spesifikt for mus LOX-1, CD40 eller MMP (MMP-1, -2, -9). For mus LOX-1, ble forover primer: -TTACTCTCCATGGTGGTGCC-3, revers primer: -AGCTTCTTCTGCTTGTTGCC-3 benyttet. sykluser polymerasekjedereaksjon (PCR) ble utført ved 94 C i 40 sekunder (denaturering), C i 1 minutt (renaturering) og 72 C i 1 minutt (ekstensjon). Lengden av polymerasekjedereaksjons- (PCR) produkt var 193 basepar. For mus CD40, ble forover primer -GTTTAAAGTCCCGGATGCGA-3 og revers primer - CTCAAGGCTATGCTGTCTGT-3 benyttet. 3 sykluser polymerasekjedereaksjon (PCR) ble foretatt ved 94 C i 1 minutt (denaturering), C i 1 minutt (renaturering) og 72 C i 1 minutt (ekstensjon). Lengden av PCR-produkt var 408 basepar. For mus MMP-1, ble forover primer -GGACTCTCCCATTCTTAATGA T-3 og revers primer -CCTCTTTCTGGATAACATCATCA AC-3 benyttet. For mus MMP-2, ble forover primer -ATCAAGGGGATCCAGGAGC-3 og revers primer - GCAGCGATGAAG ATGATAG-3 benyttet. For mus MMP-9, ble forover primer - AGTTTGGTGTCGCGGAGCAC-3 og revers primer - TACATGAGCGCTTCCGGCAC-3 benyttet. For alle MMP, ble 3 sykluser PCR foretatt ved 94 C i 1 minutt (denaturering), 8 C i 1 minutt (renaturering) og 7 C i 1 minutt (ekstensjon). Lengden av PCR-produkt var henholdsvis 627, 718 og 73 basepar. Et primerpar spesifikt for mus -actin ble anvendt som husholdningsgen (forover-primer: -TTCTACAATGAGCTGCGTTG-3, revers primer: -

11 9 CACTGTGTTGGCATAGAGGTC-3 ). sykluser ble anvendt ved 94 C i sekunder (denaturering), C i 1 minutt (renaturering) og 72 C i 1 minutt (ekstensjon). PCR-produktet var 60 basepar. Den reverse transkripsjons-pcr (RT-PCR) amplifiserte prøve ble visualisert på 1,% agarosegel ved anvendelse av etidiumbromid. Proteinfremstilling og analyse ved western blotting 1 2 Hver museaorta ble kuttet i fire segmenter. To av disse ble benyttet til å ekstrahere RNA og de gjenværende to ble benyttet til å ekstrahere protein, som beskrevet tidligere (14). I korthet ble vev fra aorta homogenisert og lysert i lyserings-buffer, deretter sentrifugert ved 4000 rpm i minutter ved 4 C. Lysatproteinene fra aorta ( g/bane) ble separert ved % SDS-PAGE og overført til nitrocellulosemembraner. Etter inkubering i blokkeringsløsning (% non-fat milk, Sigma), ble membraner inkubert med 1:70 fortynning monoklonalt antistoff mot mus LOX-1, 1:00 fortynning polyklonalt antistoff mot mus CD40 (Santa Cruz), 1 g/ml fortynning monoklonalt antistoff mot mus MMP-1 (Oncogene), 1 g/ml fortynning monoklonalt antistoff mot mus MMP-2 (Oncogene), 1 g/ml fortynning monoklonalt antistoff mot mus MMP-9 (Oncogene), 1:00 fortynning polyklonalt antistoff mot mus TIMP-1 (Santa Cruz), 1:00 fortynning polyklonalt antistoff mot mus TIMP-2 (Santa Cruz) eller 1:000 fortynning monoklonalt antistoff mot mus -actin (Sigma) over natten ved 4 C. Membraner ble vasket og deretter inkubert med 1:000 fortynning spesifikt sekundært antistoff (Amersham Life Science) i 2 timer ved romtemperatur, og membranene ble vasket og påvist med ECL-systemet (Amersham Life Science). De relative intensiteter av proteinbånd ble analysert ved Scan-gel-it programvare (Li DY, Zhang YC, Sawamura T, Mehta JL. Circ. Res. 1999; 84:43-49). Dataanalyse Alle data representerer gjennomsnitt av dobbeltprøver. Data er angitt som gjennomsnitt ± SD. Statistisk signifikans ble bestemt i gjentatte sammenligninger blant uavhengige grupper av data, hvor ANOVA og F-testen indikerte forekomsten av signifikante forskjeller. En P-verdi <0,0 ble ansett signifikant.

12 Resultater Den synergistiske anti-aterosklerotisk effekt av kandesartan og rosuvastatin Sammenlignet med kontrollmus (C7BL/6J mus gitt vanlig fôr), utviklet apo- E knockout-mus gitt en kolesterolrik diett, omfattende aterosklerose (P<0,01 vs. kontrollmus). Selv om både kandesartan og rosuvastatin hver for seg reduserte graden av aterosklerose (p<0,0 vs. kolesterolrik diett alene), reduserte kombinasjonen aterosklerose i meget høyere grad (P<0,0 vs. kandesartan eller rosuvastatin alene pluss kolesterolrik diett). Figur 1 viser resultater av representative forsøk og graden av aterosklerose (gjennomsnitt ± SD) i ulike dyregrupper. Kandesartan og rosuvastatin alene reduserte aterosklerose med henholdsvis ca. 3% og 2%. Kombinasjonen reduserte aterosklerose med 70%, hvilket viser en synergistisk effekt. Denne effekten er illustrert grafisk i Figur 2. 1 Den synergistiske effekten av kandesartan og rosuvastatin på LOX-1 ekspresjon Hos kontrollen C7BL/6J mus, var ekspresjon av LOX-1 (mrna og protein) lav. Derimot ble LOX-1 ekspresjon (mrna og protein) markert økt med kolesterolrik diett i apo-e knockout-mus (P<0,01 vs. kontrollmus). Både kandesartan og rosuvastatin alene reduserte LOX-1 ekspresjonen (mrna og protein), om enn moderat (P<0,0 vs. kolesterolrik diett alene). Kombinasjonen av kandesartan og rosuvastatin hadde en dramatisk inhiberende effekt på oppreguleringen av LOX-1 (mrna og protein) i apo-e knockout-mus (P<0,01 vs. kolesterolrik diett alene). 2 Den synergistiske effekt av kandesartan og rosuvastatin på CD40 ekspresjon Sammenlignet med ekspresjonen i kontroll C7BL/6J mus, ble CD40 ekspresjon (mrna og protein) markert økt i apo-e knockout-mus fôret med en kolesterolrik diett (P<0,01 vs. kontrollmus). Selv om kandesartan og rosuvastatin behandling alene svakt reduserte CD40 ekspresjon (P<0,0 vs. kolesterolrik diett alene), hadde kombinasjonen av kandesartan og rosuvastatin hadde en dramatisk

13 11 inhiberende effekt på oppreguleringen av CD40 (mrna og protein) i apo-e knockout-mus (P<0,01 vs. kolesterolrik diett alene). Den synergistiske effekt av kandesartan og rosuvastatin på MMP-ekspresjon Sammenlignet med ekspresjonen i kontroll C7BL/6J mus, ble MMP-1, -2 og -9 ekspresjon (mrna og protein) markert økt i kolesterolrik diett fôrede apo-e knockout-mus (P<0,01 vs. kontrollmus). Både kandesartan og rosuvastatin alene reduserte MMP-1, -2 og -9 ekspresjon (mrna og protein), om enn moderat (P<0,0 vs. kolesterolrik diett alene). Kombinasjonen av kandesartan og rosuvastatin hadde en dramatisk inhiberende effekt på deres ekspresjon (P<0,01 vs. kolesterolrik diett alene). 1 Effekten av kandesartan og rosuvastatin på TIMP-ekspresjon TIMP-1 og TIMP-2 proteinekspresjon ble også økt i apo-e knockoutmus med kolesterolrik diett (P<0,01 vs. kontrollmus), men økningen var mindre enn den for MMP. Både kandesartan og rosuvastatin alene reduserte TIMP-1- og TIMP-2-ekspresjon i liten grad (P<0,0 vs. kolesterolrik diett alene), men kombinasjonen av kandesartan og rosuvastatin hadde en større inhiberende effekt på deres ekspresjon (P<0,01 vs. kolesterolrik diett alene, P<0,0 vs. kolesterolrik diett med kandesartan eller rosuvastatin).

14 12 Patentkrav 1. Kombinasjon omfattende kandesartan eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav og rosuvastatin eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav for anvendelse ved forebygging eller behandling av aterosklerose eller forebygging av kardiovaskulære hendelser, hvor de kardiovaskulære hendelser er valgt fra angina, hjertestans, slag, kongestiv hjertesvikt og kardiovaskulær død. 2. Kombinasjon ifølge krav 1, hvor kandesartan er i form av kandesartan cilexetil Farmasøytisk preparat omfattende en kombinasjon ifølge krav 1 sammen med en farmasøytisk akseptabelt fortynningsmiddel eller bærer, for anvendelse ved forebygging eller behandling av aterosklerose eller forebygging av kardiovaskulære hendelser, hvor de kardiovaskulære hendelser er valgt fra angina, hjertestans, slag, kongestiv hjertesvikt og kardiovaskulær død. 4. Kombinasjon ifølge krav 1 som et medikament for forebygging eller behandling av aterosklerose eller kardiovaskulære hendelser, hvor de kardiovaskulære hendelser er valgt fra angina, hjertestans, slag, kongestiv hjertesvikt og kardiovaskulær død. 2. Sett omfattende en kombinasjon ifølge krav 1, for anvendelse i forebygging eller behandling av aterosklerose eller forebygging av kardiovaskulære hendelser, hvor de kardiovaskulære hendelser er valgt fra angina, hjertestans, slag, kongestiv hjertesvikt og kardiovaskulær død.

15