Basofil aktiveringstest BAT

Transkript

1 Basofil aktiveringstest BAT Livia Bajelan Tromsø BAT Basofile celler: struktur, funksjon Definisjoner: atopi, sensibilisering, allergi BAT: prinsipp, metode Klinisk bruk Oppsummering 2 1

2 Basofile celler Subgruppe granulocytter, µ Mørke granula: histamin, cysteinyl lektoriene LTC4, cytokiner (IL 4, IL 13) Farges med basiske farger Cytoliseresistent membran Sirkulerende celler, lavt tall <0,1x10 9 celler L Sterkt uttrykk av Fcε RI 3 Basofil celle 4 2

3 Atopi definisjon Genetisk predisposisjon til å danne IgE mot vanlige miljøallergener Ca. 40 % av befolkningen i vestlige land Eksponering til mikrober i barndommen immunresponsen mot TH1 responser og nonatopi. Barn med genetisk predisposisjon til atopi, lav eksponering til mikrober Th2 responser 5 Allergi sensibilisering Nature Rev Immunology 2008; Galli et al. 3

4 Allergi degranulering Nature Rev Immunology 2008; Gould et al. Degranulering dose sted 8 4

5 Allergi sensibilisering + symptomer sensibilisering allergi 9 Diagnose Sensibilisering (IgE) + symptomer = allergi Relevant klinikk/anamnese Konfirmerende tester: IgE, SPT, tryptase, ECP, BHR, BAT, provokasjon Industrialiserte land, sykefravær fra skole, jobb, kostbar sykdom. Riktig diagnose og behandling. 10 5

6 Inhalasjonsallergener Allergisk rhinitt, konjunktivitt Allergisk astma Aktivering av mastceller og basofile under epitel Rennende nese, øye, kløe, lokal hevelse Sesongallergener (bjørk timotei) Helårsallergener (katt, hund, husstøvmidd) Aktivering av mastceller og basofile i nedre luftveier Bronkokonstriksjonsekunder Økt mucus produksjon Pustevansker 11 Mat/medisiner po Matallergener: Fordøyelsesstabile (pepsin) Diaré, oppkast (aktivering av mastceller og basofile under epitel) Urticaria (rask absorbsjon av allergen fra tarmen inn i blodbanen f. eks. penicillin) Anafylaksi (aktivering av mastceller og basofile i bindevev : lavt BT, puls, bronkokonstriksjon peanøtter, fisk) 12 6

7 BAT prinsipp og metoder stimulering med spesifikk allergen frigjøring av mediatorer (BHR) oppregulering av CD63, CD203c (flowcytometri) 13 Markører karakteristika Julie Leysen, Vito Sabato Expert Rev Clin Immunol.2011;7(3):

8 Degranulering Ebo et al Flow assisted allergy diagnosis. Allergy 2006:61: Aktiveringsmarkører 16 8

9 Flowcytometrisk metode materiale fullblod (mer fysiologisk, mindre sentrifugering, men interferens med serumproteiner anti IgG, anti IgE, medisiner) isolerte basofile (tap av celler gjennom separering) 17 Preaktivering med IL 3 Ikke generell konsensus Kort preaktivering (10 min) 2 ng/ml: primer cellene med økt mediator frigjøring (ikke oppregulering av CD63) Øker sensitiviteten Cozon G, Ferrandiz J, Detection of activated basophils using flowcytometri for diagnosis in atopic patients. Allergol Immunopathol (Madr) 1999;27: Ikke brukt for CD203c 18 9

10 Allergener typer Naturlige allergenekstrakter heterogene, har nonspesifikke inhiberende/stimulerende faktorer som endotoksiner, lektiner Hudtest ekstrakter toksiske, inhiberende konserveringsmidler. Lite brukt, med mindre de er dyalisert Medisiner flytende form 19 Allergenerstimuleringskonsentrasjoner Positive og negative kontroller Histamin og leukotrienefrigjøringstester få Tester for å finne stimuleringskonsentrasjoner Identifisere cytotoksiske doser eller doser som forårsaker uspesifikk stimulering unngå falsk negative/positive resultater Optimal allergenkonsentrasjon (fullt blod/isolerte Bf., priming med IL 3) 20 10

11 Falsk negative resultater Non responders ( 5 10 % oppregulerer ikke CD63 og CD203c påvirker spesifisitet og sensitivitet, mange nevner ikke det i publiserte studier) Nylig eksponering for allergen med midlertidig cellerefraktæritet eller midlertidig reduksjon av allergenspesifikk eller membranbundet IgE Forsinket analysering av prøven ideelt 6 uker 12 mnd etter allergisk episode Medisiner: glukokortikoider, immunmodulerende, immunsupressiva, anti IgE Dårlig lagring av prøvemateriale ideelt maksimum 24 timer i 4 0 Celsius Ikke adekvat stimulering kontaminerte allergener, cytotoksiske allergenkonsentrasjoner Repetisjon av negativ test ( non responders tilstanden midlertidig) Negative kontroll stimulering se på spontan uttrykk av aktiveringsmarkører (innebærer inkubasjon med stimulasjonsbuffer) 21 Valg markører Buhlmann, Switzerland CD63, CD203c Orpegen, Tyskland BD (fullt blod), Belgium CD63: CD123+HLA DR CD203c forekommer kun på basofile ( trenger ikke anti IgE og anti HLA DR for identifisering av celler) Hvilende Bf har av og til lavt spontant uttrykk av CD203c, oppregulering av CD203c<enn oppregulering av CD63. Pas. med spontant økt uttrykk av CD203coppreg. kan være absent eller minimal. Under testing: CRTH2 (DP2) chemoattractant receptor homologous molecule uttrykt på TH2 celler Aktiverings antigener CD13, CD107 a 22 11

12 CD63 CD203c CCR3 Anti CD63 FITC Anti CD203c PE DY647 Anti CCR3 PE Kontroller: anti FcEpsilonRI (monoclonal antibody) tripetide (fmlp) (aktiverer nonimmunologisk) 23 Kliniske applikasjoner Diagnostikk av IgE medierte allergier (luftveisallergener, mat, latex, hymenoptera, medikamenter) Sammenlikning av allergenisitet for naturlige ekstrakter, kjemisk modifiserte, rekombinante allergener Vurdering av passiv IgE sensibilisering via blodtransfusjoner Component resolved diagnosis: pollen og hymenoptera allergi 24 12

13 Sensitivitet og spesifisitet Ebo et al Flow assisted allergy diagnosis. Allergy 2006:61: NMBD Julie Leysen, Vito Sabato Expert Rev Clin Immunol.2011;7(3):

14 Inhalasjonsallergener Sensitivitet og spesifisitet 90 % Cozon G, Ferrandiz J, Detection of activated basophils using flow cytometri for diagnosis in atopic patients. Allergol Immunopathol (Madr) 1999;27: Sanz ML, Sanchez G, Allergen induced basophil activation: CD63 cell expression detected by flow cytometri in patients allergic to Dermatophagoides pteronyssinus and Lolium perenne. Clin Exp Allergy 2001;31: B lactamer Julie Leysen, Vito Sabato Expert Rev Clin Immunol.2011;7(3):

15 NSAIDS Julie Leysen, Vito Sabato Expert Rev Clin Immunol.2011;7(3): Latex Ikke nok sensitiv og spesifikk for å diagnostisere IgE mediert latex allergi, men hjelper til å skille mellom klinisk relevant og irrelevant IgE resultater Ebo DG, Lechkar Validation of a two colour flow cytometric assay detecting in vitro basophil activation for the diagnosis of IgE mediated natural rubber latex allergy. Allergy 2002;57: Flere uavhengige grupper: spesifisitet og sensitivitet >90 % Sanz ML, Gamboa PM et al Flow cytometric cellular allergen stimulation test in latex allergy. Int Arch Allergy Immunol 2003;130: Hemery ML, Arnoux B et al Confirmation of the diagnosis of natural rubber latex allergy by the basotest method, Int Arch Allergy Immunol 2005;136:

16 Basofil histamin frigjøringstest BHR Prøvemateriale: fullblod, isolerte MNC (basofile granulocytter), serum. Metode: direkte provokasjon på pasientens egne celler eller passiv sensibilisering av donorceller med pasientserum. Stimuli: allergenekstrakter, medikamenter, stoffer, anti IgE. Måling: Histamin, tryptase, leukotrien. Målemetode: RIA, ELISA, HPLC. 31 BHR Clin Exp Allergy 2001, Crockard 32 16

17 Basofil leukotriene test Clin Exp Allergy 2001, Editorial; Crockard Oppsummering Allergi = sensibilisering + symptomer Diagnostikk: Relevant klinikk/anamnese, tester: Spesifikk IgE, SPT, provokasjon, BAT : monitorering av anti IgE behandling, ASIT. 17