PyroMark KRAS Kit-håndbok

Transkript

1 Juni 2009 PyroMark KRAS Kit-håndbok 24 Versjon 1 CE-IVD-merkede PyroMark KRAS Kit muliggjør kvantitativ måling av mutasjoner i codoner 12, 13 og 61 i det humane KRAS-genet. Den gir klinikere informasjon som hjelper utvelgingen av pasienter med kolorektal kreft som trolig vil dra fordel av anti- EGFR-terapier. Til in vitro diagnostisk bruk NO QIAGEN GmbH, QIAGEN Strasse 1, D Hilden R NO Sample & Assay Technologies

2 QIAGEN Sample and Assay Technologies QIAGEN er den ledende leverandøren av nyskapende prøver og assayteknologier som gjør det mulig å isolere og detektere innholdet i biologiske prøver. Våre avanserte produkter og tjenester av høy kvalitet sikrer suksess fra prøve til resultat. QIAGEN setter standarder i: Rensing av DNA, RNA og proteiner Nukleinsyre- og proteinassayer mikrorna forskning og RNAi Automatisering av prøve- og assayteknologi Vår visjon er å gi deg muligheten til å oppnå fremragende suksess og gjennombrudd. For mer informasjon, besøk

3 Innhold Kit-innhold 4 Symboler 4 Transport og oppbevaring 5 Tiltenkt bruk 5 Produktets bruksbegrensninger 6 Teknisk assistanse 6 Kvalitetskontroll 7 Sikkerhetsinformasjon 7 Innledning 8 Prinsipp og prosedyre 8 Ytelsesegenskaper 9 Utstyr og reagenser som brukeren må skaffe selv 13 Viktige merknader 14 Allmenne forholdsregler 14 Prøvemateriale 14 DNA-isolasjon 14 Kontroller 15 Protokoller Protokoll 1: Kjøreoppsett for PyroMark Q24 MDx 16 Protokoll 2: PCR ved bruk av HotStarTaq Plus Master Mix Kit og PyroMark KRAS Kit 18 Protokoll 3: Immobilisering av PCR-produkter til Streptavidin Sepharose High Performance-kuler 21 Protokoll 4: Prøvepreparering før Pyrosequencing-analyse utføres på PyroMark Q24 MDx 23 Protokoll 5: Kjøring av PyroMark Q24 MDx 26 Protokoll 6: Analyse av kjøring på PyroMark Q24 MDx 28 Feilsøkingsveiledning 33 Tillegg A: Oppsetting av PyroMark KRAS-assayer 35 Tillegg B: Tømming av avfallsbeholder og trau 37 Referanser 38 Bestillingsinformasjon 39 PyroMark KRAS Kit-håndbok 06/2009 3

4 Kit-innhold PyroMark KRAS Kit (24) Katalognr Antall reaksjoner 24 Seq Primer KRAS 12/13 24 μl Seq Primer KRAS 61 PCR Primer KRAS 12/13 PCR Primer KRAS 61 wt KRAS Control DNA Mutant KRAS Control DNA 24 μl 24 μl 24 μl 100 μl 100 μl Håndbok 1 Symboler <N> Inneholder reagenser for <N> prøver Brukes innen In vitro diagnostisk medisinsk utstyr Katalognummer Parti nummer Materialenummer Komponenter Inneholder Nummer 4 PyroMark KRAS Kit-håndbok 06/2009

5 Temperaturbegrensninger Lovlig produsent Se informasjon i håndboken Viktig merknad Transport og oppbevaring PyroMark KRAS Kit transporteres på tørris og skal oppbevares ved -20 C ved ankomst. Gjentatt tining og frysing (> 5 x) skal unngås. PyroMark KRAS Kit er stabilt til kitets utløpsdato når det oppbevares under disse forhold. Tiltenkt bruk Det er sterk fokusering på KRAS-mutasjonsanalyse i Europa pga. EUkommisjonens autorisasjon til betinget markedsføring av panitumumab og cetuximab for behandling av metastasert kolonkreft hos pasienter med ikkemutert (villtype) KRAS-gen. Dette betyr at panitumumab og cetuximab bare kan gis til pasienter som er screenet for KRAS-mutasjonsstatus. Tiltenkt bruk er å hjelpe leger i å identifisere pasienter med kolorektal kreft som mest sannsynlig vil dra fordel av anti-egfr-terapier, slik som panitumumab og cetuximab. Det er beregnet som et adjuvans for andre prognostiske faktorer i bruk i dag for å velge pasienter som egner seg for behandling med anti-egfrterapier, på grunnlag av pasientens mutasjonsstatus i codoner 12, 13 og 61 i KRAS-genet. Pasientens mutasjonsstatus må vurderes sammen med andre sykdomsfaktorer for at klinikeren kan ta en bestemmelse angående terapien. KRAS-mutasjonsstatus må ikke være det eneste grunnlaget for å bestemme en behandling for kreftpasienter. Produktet brukes til å ta kvantitative målinger av mutasjoner i codoner 12, 13 og 61 i det humane KRAS-genet. Produktet består av to assayer: et som detekterer mutasjoner i codoner 12 og 13 og et annet som detekterer mutasjoner i codon 61. Begge assayer inneholder spesifikke PCR-primere og en sekvenseringsprimer. PyroMark KRAS Kit-håndbok 06/2009 5

6 Produktets bruksbegrensninger Resultater fra produktet må tolkes innenfor rammen av alle relevante kliniske resultater og laboratorieresultater. Produktet skal kun brukes av personale som er spesielt instruert og opplært i in vitro diagnostiske prosedyrer og PyroMark Q24 MDx-systemet. Det ble utført valideringsstudier med humant DNA ekstrahert fra formalinfikserte, parafininnstøpte tumorprøver. Materialene for DNA-rensing, PCR-amplifikasjon og prøvepreparering for Pyrosequencing -analyse er ikke inkludert i produktet. Produktet har blitt validert med DNA-rensingsprodukter og PCR-reagenser fra QIAGEN. Bruk anbefalt PCR-amplifikasjonsprodukter og DNA-rensingsprodukter som angitt på sider 13 og 14. Produktet er utformet kun til bruk på PyroMark Q24 MDx-systemet. Det kreves streng overholdelse av brukerhåndboken for optimale resultater. Fortynning av andre reagenser enn dem som beskrives i denne håndboken kan ikke anbefales og vil resultere i ytelsestap. Det bør utvises påpasselighet mht. utløpsdatoer og oppbevaringsforhold trykt på esken og etikettene til alle komponenter. Ikke bruk utløpte eller ukorrekt oppbevarte komponenter. Teknisk assistanse Vi i QIAGEN er stolte over kvaliteten og tilgjengeligheten til vår tekniske støtte. Vår tekniske serviceavdeling er bemannet med erfarne vitenskapsmenn og -kvinner med bred praktisk og teoretisk ekspertise i prøve- og assayteknologier og bruk av QIAGEN-produkter. Hvis du har spørsmål eller vanskeligheter angående PyroMark KRAS Kit eller QIAGEN-produkter generelt, må du gjerne kontakte oss. QIAGENs kunder er en viktig informasjonskilde når det gjelder avansert eller spesialisert bruk av våre produkter. Denne informasjonen er til hjelp for andre vitenskapsmenn og -kvinner så vel som forskerne hos QIAGEN. Derfor oppmuntrer vi deg til å ta kontakt med oss hvis du har ideer/forslag angående produktets ytelse eller nye anvendelser og teknikker. For teknisk assistanse og mer informasjon, besøk vårt tekniske støtte senter på eller ring en av våre QIAGEN tekniske serviceavdelinger eller lokale forhandlere (se baksiden eller besøk 6 PyroMark KRAS Kit-håndbok 06/2009

7 Kvalitetskontroll I henhold til QIAGENs ISO-sertifiserte kvalitetsstyringssystem, testes hvert parti av PyroMark KRAS Kit mot forhåndsfastsatte spesifikasjoner for å sikre konsistent produktkvalitet. Sikkerhetsinformasjon Når det arbeides med kjemikalier, skal man alltid ha på seg egnet laboratoriefrakk, engangshansker og beskyttelsesbriller. For mer informasjon, vennligst les relevante Material Safety Data Sheets (materialesikkerhetsdatablad, MSDSs). Databladene er tilgjengelige online i praktisk og kompakt PDF format på hvor du kan finne, se og skrive ut MSDSdatabladet for hvert QIAGEN kit og hver kit-komponent. 24-timers nødinformasjon Medisinsk nødinformasjon på engelsk, fransk og tysk er tilgjengelig døgnet rundt fra: Die Beratungsstelle bei Vergiftungen (Giftinformasjonssentral) Mainz, Tyskland Tlf.: PyroMark KRAS Kit-håndbok 06/2009 7

8 Innledning CE-IVD-merket PyroMark KRAS Kit brukes til kvantitative målinger av mutasjoner i det humane KRAS-genets codoner 12, 13 og 61. Produktet består av 2 assayer: et for å detektere mutasjoner i codoner 12 og 13 og et annet for å detektere mutasjoner i codon 61. De to regionene amplifiseres separat via PCR og sekvenseres gjennom den definerte regionen. Sekvenser som omringer de definerte posisjonene tjener som normaliserings- og høydepunktsreferanser for kvantifisering og kvalitetsvurdering av analysen. Codoner 12 og 13 FP Seq FPB RPB Codon 61 Figur 1. Illustrasjon av KRAS-assayet. Den angitte sekvensen er den analyserte sekvensen for en normal prøve. FP og FPB: Forover PCR-primere (B indikerer biotinylasjon); RP og RPB: Revers PCR-primere (B indikerer biotinylasjon); Seq: Sekvenseringsprimere. Codoner 12 og 13 sekvenseres i foroverretning; codon 61 i reversretning. Produktet består av en PCR-primerblanding og en sekvenseringsprimer for hvert assay. Primerne leveres i løsning. Hvert hetteglass rommer 24 μl av hver primer eller primerblanding. Prinsipp og prosedyre Arbeidsflyten på side 9 illustrerer assayprosedyren. Etter PCR ved bruk av primere målrettet for codoner 12/13 og 61, blir amplikonene immobilisert på Streptavidin Sepharose High Performance-kuler. Enkeltrådet DNA prepareres og tilsvarende sekvenseringsprimere anneal-bindes til DNA. Prøvene analyseres deretter på PyroMark Q24 MDx ved hjelp av en kjøreoppsettfil og en kjørefil. Sequence to Analyze (sekvensanalysen) kan justeres for deteksjon av uvanlige mutasjoner etter kjøringen (se Protokoll 6: Analyse av PyroMark Q24 MDx, side 28, og Tillegg A, side 35). Seq RP 8 PyroMark KRAS Kit-håndbok 06/2009

9 Arbeidsflyt for PyroMark KRAS-prosedyren Assay og kjøreoppsett Prøvepreparering Assay-filoppsett (Tillegg A) PCR (Protokoll 2) Immobilisering (Protokoll 3) Kjørefiloppsett (Protokoll 1) Preparering av prøver (Protokoll 4) Ytelsesegenskaper PyroMark Q24 MDx-kjøring (Protokoll 5) Analyse av PyroMark Q24 MDx-kjøring (Protokoll 6) Rapport Blankbegrensning og deteksjonsbegrensning Blankbegrensning (LOB) og deteksjonsbegrensning (LOD) ble fastslått for en rekke mutasjoner ved bruk av blandinger av plasmider lik de som følger med kitet. To metoder ble brukt, avhengig av mutasjonstypen. Mutasjoner som resulterer ved tilsynekomst av et høydepunkt i en ellers blank posisjon: LOB og LOD ble bestemt i henhold til anbefalingene i NCCLS s retningslinje EP17-A Protokoll for å fastslå deteksjonsbegrensninger og kvantiteringsbegrensninger; godkjent retningslinje. α- og β-feil (henholdsvis falsk positiv og falsk negativ) ble satt til 5 %. Mutasjonen GGT GTT i codon 12: Denne mutasjonen resulterer i endringer som omfatter enkle og doble høydepunkter og gir ingen lineær respons ved lave mutasjonsnivåer. Denne posisjonen ga en LOB som konsekvent var 0 % enheter (n = 72). Det laveste signalet som angir tilstedeværelse av en mutasjon i denne posisjonen var satt til 1 % enhet som tydeligvis er over det konsekvente baselinenivået på 0 % enhet. Ved analysering av en prøve inneholdende 7 % enheter mutasjon, ga 95 % av resultatene (n = 89) et signal som kunne oppfattes som positiv ( 1 % enhet). Derfor ble LOD satt til 7 % enheter for denne mutasjonen, og alle prøver som ga signaler over 1 % enhet ble betraktet som positive for denne mutasjonen. PyroMark KRAS Kit-håndbok 06/2009 9

10 Tabell 1. LOB og LOD fastslått for spesifikke mutasjoner Mutasjon LOB (%) LOD (%) COSMIC ID* (V42) Codon 12 (GGT) GAT 0,6 2,2 521 GTT i.a. 7,0 520 TGT 0,5 2,1 516 AGT 0,4 1,9 517 GCT 0,7 2,3 522 CGT 0,3 1,8 518 Codon 13 (GGC) GAC 0,3 1,9 532 Codon 61 (CAA), analysert i revers orientering (TTG) GTG 0,8 2,8 554 TAG 1,2 3,1 553 TCG 1,6 3,5 552 ATG 0,7 2,6 555 TTC 1,2 3,1 550 * Fra Catalogue of Somatic Mutations in Cancer, tilgjengelig online fra Sanger Institute på i.a.: ikke aktuelt. Disse verdiene ble basert på kjøringer der signalet var over 60 RLU oppnådd rutinemessig fra 10 ng med DNA isolert fra formalinfiksert, parafininnstøpt vev. Det anbefales å bekrefte metodens utførelse i laboratoriet. Linearitet Linearitet ble målt i henhold til dokument EP6-A Evaluering av kvantitative målingsprosedyrers linearitet: en statistisk betraktningsmåte; godkjent retningslinje fra Clinical and Laboratory Standards Institute. Normale og mutante sekvenser ble proporsjonelt blandet for å oppnå følgende mutasjonsnivåer: 0, 12,5, 25, 37,5 og 50 %. Fire replikater av blandingene ble plassert i randomisert mønster på en plate og analysert. Resultatene for 10 PyroMark KRAS Kit-håndbok 06/2009

11 mutasjonen GGT TGT i codon 12 ble analysert med Analyse-it Software v2.04 (Analyse-it Software, Ltd., Storbritannia) og vises i figur Reell (%) Actual (%) Forventet (%) Expected (%) Figur 2. Linearitet av mutasjon GGT TGT i codon 12. Den generelle repeterbarheten var 1,64 % enheter og resultatene var lineære innenfor en tillatt ikke-linearitet på 3 %. Lignende resultater ble oppnådd for mutasjonen GGC GAC i codon 13. Middelverdien for unøyaktighet Fastslått linearitet for mutasjonen GGT TGT i codon 12 ble gjentatt av 3 operatører på 3 forskjellige dager ved bruk av forskjellige kombinasjoner av PyroMark Q24 MDx-instrument og PyroMark Gold Q24 Reagents. Resultatene av de 3 kjøringene vises i tabell 2. Tabell 2. Middelverdien for unøyaktighet Kjøring 1 Kjøring 2 Kjøring 3 Referat Forventet Gjennomsnitt SD Gjennomsnitt SD Gjennomsnitt SD Gjennomsnitt SD 0,0 0,6 0,2 1,7 0,7 0,7 0,2 1,0 0,6 12,5 13,3 1,5 16,2 1,9 14,6 3,0 14,7 1,4 25,0 23,8 1,4 26,8 2,4 26,9 2,9 25,8 1,8 37,5 42,0 1,9 41,7 0,5 38,5 2,6 40,7 2,0 50,0 49,7 2,4 50,5 1,8 49,1 4,8 49,8 0,7 Alle verdier angis som % enheter. SD: standardavvik. PyroMark KRAS Kit-håndbok 06/

12 Middelverdiene for unøyaktighet (SD) var derfor 0,6 2,0 % enheter i det målte verdiområde på 0 50 %. Diagnostisk sensibilitet og spesifisitet PyroMark KRAS Kit ble evaluert i en studie. Til sammenligning med DxS Therascreen : K-RAS Mutation Kit, ble 100 prospektive prøver av kolorektale krefttumorer analysert for mutasjoner i codoner 12 og 13. DNA for testing ble isolert ved bruk av EZ1 DNA Tissue Kit, og analysen ble utført med PyroMark KRAS Kit på PyroMark Q24 MDx og med Therascreen: K-RAS Mutation Kit på ABI PRISM 7900HT SDS. Av de 100 prøvene som ble analysert, kunne det fastslås mutasjonsstatus i 91 prøver med DxS-analysen. Pyrosequencing-analysen gjorde det mulig å fastslå mutasjonsstatus i 94 prøver for codoner 12 og 13. Bortsett fra prøvene som mislyktes fra ett eller begge kitene, var det 100 % korrelasjon på PyroMark KRAS Kit sammenlignet med Therascreen: K-RAS Mutation Kit. Den diagnostiske sensibiliteten til PyroMark KRAS Kit var 100 %, og den diagnostiske spesifisiteten var 100 % (tabell 3). Tabell 3. Resultater av analyserte prospektive prøver fra kolorektal krefttumor for codoner 12 og 13 Therascreen: K-RAS Mutation Kit Mutant wt Total PyroMark KRAS Kit Mutant wt Analyse av codon 61 De samme 100 prøvene ble analysert for mutasjoner i codon 61 med PyroMark KRAS Kit. Bare én prøve ga en mislykket kvalitetsvurdering for codon 61 assayet. Denne prøven mislyktes også både i PyroMark- og Therascreenassayene for codon 12 og 13, noe som indikerer at DNA var av alt for lav kvalitet. Den høyere suksesskvoten for codon 61 assayet indikerer at det er mindre avhengig av DNA-kvaliteten enn både PyroMark- og Therascreenassayene for codon 12 og 13. Siden Therascreen-assayet ikke tester for mutasjoner i codon 61, er en direkte sammenligning av assayene ikke mulig. Mutasjoner i codon 61 ble detektert i 4 av de 99 prøvene. Tre inneholdt frekvente mutasjoner (CAC, CAT, CTA) i codon 61 mens den fjerde prøven inneholdt mutasjoner i både codon 60 (GGT GGA) og codon 61 (CAA AAA). 12 PyroMark KRAS Kit-håndbok 06/2009

13 Utstyr og reagenser som brukeren må skaffe selv Når det arbeides med kjemikalier, skal man alltid ha på seg egnet laboratoriefrakk, engangshansker og beskyttelsesbriller. For mer informasjon se relevante Material Safety Data Sheets (materialesikkerhetsdatablad, MSDSs) tilgjengelige fra produktets leverandør. DNA isolasjonskit (se DNA-isolasjon, side 14) Pipetter (justerbare)* Sterile pipettespisser med filtre Benketopp-mikrosentrifuge* PCR-reagenser (PyroMark KRAS Kit ble validert ved hjelp av HotStarTaq Plus Master Mix Kit, kat.nr , , eller ) Termosykler* og egnete PCR-rør Streptavidin Sepharose High Performance (GE Healthcare, kat.nr ; PyroMark Q24 MDx (kat.nr )* PyroMark Q24 MDx Software (kat.nr ) PyroMark Q24 Plate (kat.nr ) PyroMark Q24 Cartridge (kat.nr ) PyroMark Q24 MDx Vacuum Workstation (kat.nr eller )* PyroMark Gold Reagents (kat.nr ) PyroMark Binding Buffer (kat.nr ) PyroMark Denaturation Solution (kat.nr ) PyroMark Wash Buffer, konsentrat (kat.nr ) PyroMark Annealing Buffer (kat.nr ) Plateblander* for immobilisering til kuler Varmeblokk* i stand til å nå 80 C 24-brønns PCR-plate eller remser Remsehetter Høyrenset vann (Milli-Q 18,2 MΩ x cm eller tilsvarende) Etanol (70 %) * Sørg for at instrumentene er etterprøvd og kalibrert i henhold til produsentens anbefalinger. CE-IVD-merket i henhold til EU-direktiv 98/79/EC. Alle andre oppførte produkter er ikke CE-IVD-merket basert på EU-direktiv 98/79/EC. PyroMark KRAS Kit-håndbok 06/

14 Viktige merknader Allmenne forholdsregler Brukeren skal alltid være oppmerksom på følgende: Bruk sterile pipettespisser med filtre. Oppbevar og ekstraher positive materialer (prøver, positive kontroller og amplikoner) atskilt fra alle andre reagenser og tilsett dem i reaksjonsblandingen i et separat anlegg. Alle komponentene må være fullstendig tinet ved romtemperatur (15 25 C) før assayet startes. Etter tining bland komponentene (ved gjentatt pipettering opp og ned eller ved pulserende virvelblanding) og sentrifuger en kort stund. Prøvemateriale Alle prøvene må behandles som potensielt smittefarlig materiale. Prøvemateriale er humant DNA ekstrahert fra blod eller formalinfikserte parafininnstøpte prøver. Prøver fra mennesker under heparinbehandling må ikke brukes. Blodprøver oppsamlet i rør som inneholder heparin som antikoagulant må ikke brukes. Heparin påvirker PCR. DNA-isolasjon Kitene fra QIAGEN vist i tabell 4 anbefales for DNA-rensing fra de angitte typene av humane prøver som skal brukes med PyroMark KRAS Kit. Utfør DNA-rensing i henhold til anvisningene i kit-håndbøkene. 14 PyroMark KRAS Kit-håndbok 06/2009

15 Tabell 4. DNA-rensingskit anbefalt til bruk med PyroMark KRAS Kit Prøvemateriale Nukleinsyre-isolasjonskit Katalognummer (QIAGEN) Parafininnstøpt QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (50) vev EZ1 DNA Tissue Kit (48)* Blod QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit * Følger protokollen til bruk med parafininnstøpt vev. EZ1 DNA Tissue Kit skal brukes i kombinasjon med EZ1 Advanced (kat.nr eller ) og EZ1 Advanced DNA Paraffin Section Card (kat.nr ) med EZ1 Advanced XL (kat.nr eller ) og EZ1 Advanced XL DNA Paraffin Section Card (kat.nr ), eller med BioRobot EZ1 (kat.nr ; ikke lenger tilgjengelig) og EZ1 DNA Paraffin Section Card (kat.nr ). CE-IVD-merket i henhold til EU-direktiv 98/79/EC. Kontroller Produktet inkluderer to positive kontroller. Disse tjener som kontroller for PCR- og sekvenseringsreaksjoner. wt KRAS Control DNA inneholder normal KRAS-sekvens, og Mutant KRAS Control DNA inneholder mutasjoner i alle 3 codoner. Begge kontroller har en baseutveksling i codon 15 og codon 59 for å atskille dem fra genomisk DNA. Kontrollene kan enten inkluderes separat i analysen eller blandes til foretrukne forhold. Sekvensene for kontrollene vises i tabell 5. For å analysere Mutant KRAS Control DNA, sett Sequence to Analyze (sekvensanalysen) til NGTGRCGTAGGYA, som målretter første base av codon 12 (se Tillegg A, side 35). Tabell 5. Kontrollenes sekvenser Kontroll Codon 12 Codon 13 Codon 15 Codon 59 Codon 61 Normal GGT GGC GGT GTA CAA Mutert TGT GAC GGT GTA CAC I tillegg skal en negativ kontroll (uten templat-dna) alltid inkluderes. PyroMark KRAS Kit-håndbok 06/

16 Protokoll 1: Kjøreoppsett for PyroMark Q24 MDx Viktig punkt før start Hvis påkrevd, kan LOB bekreftes ved hjelp av en normal prøve eller inkludert wt KRAS Control DNA for å generere en full plate med resultater. Se NCCLS s retningslinje EP17-A Protokoll for å fastslå deteksjonsbegrensninger og kvantiteringsbegrensninger; godkjent retningslinje. Ting som må utføres før start Opprett et assay-oppsett som beskrevet i Tillegg A. Dette gjøres bare én gang, før PyroMark KRAS-assayet kjøres for første gang (se Tillegg A, side 35). Prosedyre 1. Klikk i verktøylinjen. En ny kjørefil opprettes. 2. Legg inn kjøreparametrene (se kjøreparametrer nedenfor). 3. Sett opp platen ved å tilføre assayer for både codoner 12/13 og codon 61 i brønner som tilsvarer prøvene som skal analyseres. En negativ prøve (uten DNA) samt inkludert wt KRAS Control DNA og Mutant KRAS Control DNA anbefales som kontroller. 4. Når kjøringen er satt opp og klar til kjøring på PyroMark Q24 MDx: Skriv ut en liste med påkrevde volumer med enzymblanding, substratblanding og nukleotider, samt plateoppsettet. Marker Pre Run Information (førkjøringsinformasjon) fra Tools (verktøy)- menyen, og når rapporten vises, klikk. Lukk kjørefilen og kopier det til en USB-pinne (følger med systemet) ved hjelp av Windows Explorer. Den utskrevne førkjøringsinformasjonen kan brukes som mal for prøveoppsetting (se Protokoll 3: Immobilisering av PCR-produkter til Streptavidin Sepharose High Performance-kuler, side 21). For å kjøre platen på PyroMark Q24 MDx, se Protokoll 5: Kjøring av PyroMark Q24 MDx, side PyroMark KRAS Kit-håndbok 06/2009

17 Kjøreparametre Run name (kjøringens navn): Instrument method (instrumentmetode): Plate ID (plateidentifikasjon): Bar code (strekkode): Reagent ID (reagensidentifikasjon): Run note (kjøringsnotat): Kjøringens navn gis når filen lagres. Hvis filnavnet endres, endres også kjøringens navn. Marker instrument method (instrumentmetoden) i henhold til reagenser og patroner som skal brukes i kjøringen; se anvisningene som følger med produktet. Valgfritt: Legg inn ID-en til PyroMark Q24 Plate. Valgfritt: Legg inn et bar code (strekkode)-nummer for platen, eller hvis du har en strekkode-avleser tilkoblet til datamaskinen, plasser musemarkøren i Barcode (strekkode)-tekstboksen (ved å klikke på boksen) og skann strekkoden. Valgfritt: Legg inn et partinummer for PyroMark Gold Q24 Reagents som skal brukes. Partinummeret finnes på produktets etikett. Vi anbefales å legge inn reagent ID (reagensidentifikasjonen) slik at evt. problemer med reagensene kan spores. Valgfritt: Legg inn et notat om innholdet eller kjøringens formål. Tilføy assayfiler For å tilføye en assay til en brønn, kan du enten: Høyreklikke brønnen og markere Load Assay (last assay) fra kontekstmenyen. Marker assayet i snarvei-browseren og klikk og dra assayet til brønnen. En brønn er fargekodet i henhold til assayet lastet til brønnen. Legg inn prøve-ider og notater For å legge inn en prøve-id eller notat, marker cellen og legg inn teksten. For å redigere en prøve-id eller notat, marker enten cellen (aktuelt innhold markeres) eller dobbeltklikk på cellen. PyroMark KRAS Kit-håndbok 06/

18 Protokoll 2: PCR ved bruk av HotStarTaq Plus Master Mix Kit og PyroMark KRAS Kit Denne protokollen er for PCR-amplifikasjoner av en region som inneholder codon 12 og codon 13 og en separat PCR-amplifikasjon av en region som inneholder codon 61 ved hjelp av PyroMark KRAS Kit. Viktige punkter før start HotStarTaq Plus DNA Polymerase trenger et aktiveringstrinn på 5 min. ved 95 C (se HotStarTaq Plus PCR-håndboken). Sett opp alle reaksjonsblandingene i et område atskilt fra det som brukes for DNA-rensing, og tilføy templat-dna til PCR, PCR-produktanalyse eller prøveprepareringen før Pyrosequencing-analyse. Bruk engangsspisser med hydrofobe filtre for å minimere krysskontaminering. Ting som må utføres før start Før rørene med PCR-primere åpnes, sentrifuger dem en kort stund for å samle opp innholdet på bunnen av rørene. Juster konsentrasjonen av prøve-dna til 0,4 2 ng/μl, hvis nødvendig. Prosedyre 1. Tin primerløsninger og templat-nukleinsyre. Bland godt før bruk. 2. Preparer en reaksjonsblanding for hver PCR-primer satt i henhold til tabell 6. Typisk reaksjonsblanding inneholder alle komponentene påkrevd for PCR unntatt prøven. Preparer et volum med reaksjonsblanding større enn det som trengs for totalantallet av PCR-assayene som skal utføres. 18 PyroMark KRAS Kit-håndbok 06/2009

19 Tabell 6. Preparering av reaksjonsblanding for hver PCR-primerblanding Komponent HotStarTaq Plus Master Mix, 2x PCR Primer KRAS 12/13 eller PCR Primer KRAS 61 Høyrenset vann Totalvolum Volum/reaksjon 12,5 μl 1 μl 6,5 μl 20 μl 3. Bland reaksjonsblandingen grundig og hell 20 μl i hvert PCR-rør. Det er ikke nødvendig å holde PCR-rørene på is da HotStarTaq Plus DNA Polymerase er inaktiv ved romtemperatur. 4. Tilsett 5 μl templat-dna (2 10 ng med genomisk DNA) til hvert PCR-rør (se tabell 7), og bland grundig. En negativ kontroll (uten templat-dna) skal alltid være inkludert. Inkluder reaksjoner med wt KRAS Control DNA og Mutant KRAS Control DNA som positive kontroller (se Kontroller, side 15). Tabell 7. Preparering av PCR Komponent Reaksjonsblanding DNA-prøve Totalvolum Volum/reaksjon 20 μl 5 μl 25 μl PyroMark KRAS Kit-håndbok 06/

20 5. Programmer termosykleren i henhold til produsentens anvisninger og bruk forholdene beskrevet i tabell 8. Tabell 8. Optimalisert sykliseringsprotokoll Kommentarer Initiell aktiveringstrinn: 5 min. 95 C HotStarTaq Plus DNA Polymerase aktiveres ved dette oppvarmingstrinnet. 3-trinns syklisering: Denaturering 20 sek. 95 C Annealing 30 sek. 53 C Forlengelse 20 sek. 72 C Antall sykluser 40 Endelig forlengelse: 5 min. 72 C 6. Plasser PCR-rørene i termosykleren og start sykliseringsprogrammet. 7. Etter amplifikasjon, fortsett med Protokoll 3: Immobilisering av PCR-produkter til Streptavidin Sepharose High Performance-kuler. 20 PyroMark KRAS Kit-håndbok 06/2009

21 Protokoll 3: Immobilisering av PCR-produkter til Streptavidin Sepharose High Performance-kuler Denne protokollen er for å immobilisere templat-dna til Streptavidin Sepharose High Performance (GE Healthcare) før analysering på PyroMark Q24 MDx. Ting som må utføres før start La alle påkrevde reagenser og løsninger nå romtemperatur (15 25 C) før start. Prosedyre 1. Rist flasken som inneholder Streptavidin Sepharose High Performance varsomt til det oppnås en homogen løsning. 2. Preparer en hovedblanding for DNA-immobilisering i henhold til tabell 9. Preparer et volum 10 % større enn det som trengs for totalantallet med reaksjoner som skal utføres. Tabell 9. Hovedblanding for DNA-immobilisering Komponent Streptavidin Sepharose High Performance PyroMark Binding Buffer Høyrenset vann Totalvolum Volum/prøve 2 μl 40 μl 28 μl 70 μl 3. Tilsett 70 μl hovedblanding i brønnene til en 24-brønns PCR-plate eller remser som forhåndsdefinert i kjøreoppsettingen (se Protokoll 1: Kjøreoppsett for PyroMark Q24 MDx, side 16). 4. Tilsett 10 μl med biotinylert PCR-produkt fra protokoll 2 til hver brønn inneholdende hovedblandingen som forhåndsdefinert i kjøreoppsettingen (se Protokoll 1: Kjøreoppsett for Pyromark Q24 MDx, side 16). Totalvolum pr. brønn skal være 80 μl etter tilsetning av hovedblandingen og PCR-produktet. 5. Forsegl PCR-platen (eller remsene) med remsehetter. Sørg for at det ikke finnes mulighet for lekkasje mellom brønnene. PyroMark KRAS Kit-håndbok 06/

22 6. Rist PCR-platen ved romtemperatur (15 25 C) i 5 10 min ved 1400 o/m. Mens dette trinnet pågår klargjøres PyroMark Q24 MDx Vacuum Workstation for prøvepreparering som beskrevet i PyroMark Q24- brukerhåndbok. 7. Fortsett omgående med Protokoll 4: Prøvepreparering før Pyrosequencing-analyse utføres på PyroMark Q24 MDx. Sepharose-kuler sedimenterer raskt. Innfanging av kulene må utføres øyeblikkelig etter ristingen. 22 PyroMark KRAS Kit-håndbok 06/2009

23 Protokoll 4: Prøvepreparering før Pyrosequencinganalyse utføres på PyroMark Q24 MDx Denne protokollen utføres for å preparere enkeltrådet DNA og annealing av sekvenseringsprimeren til templatet før Pyrosequencing-analysen utføres på PyroMark Q24 MDx. Viktige punkter før start Før rørene åpnes med sekvenseringsprimere, sentrifugeres de en kort stund for å samle opp innholdet på bunnen av rørene. Tilsett de 2 forskjellige sekvenseringsprimere i samme mønster som forhåndsdefinert for platen i kjøreoppsettingen (se Protokoll 1: Kjøreoppsett for PyroMark Q24 MDx, side 16), avhengig av analyseregionen (codoner 12 og 13 eller codon 61). Ting som må utføres før start Plasser PyroMark Q24 Plate Holder på en varmeblokk ved 80 C til bruk i trinn 17. Prosedyre 1. Fortynn en tilstrekkelig mengde med hver sekvenseringsprimer, Seq Primer KRAS 12/13 og Seq Primer KRAS 61 i PyroMark Annealing Buffer som vist i tabell 10. Preparer et volum med fortynnet sekvenseringsprimer større enn det som er nødvendig for totalantallet med prøver som skal sekvenseres (antall prøver + én ekstra). Tabell 10. Fortynningseksempel for sekvenseringsprimere Komponent Seq Primer KRAS 12/13 eller Seq Primer KRAS 61 Volum/prøve Volum for reaksjoner 0,8 μl 8 μl PyroMark Annealing Buffer 24,2 μl 242 μl Totalvolum 25 μl 250 μl PyroMark KRAS Kit-håndbok 06/

24 2. Tilsett 25 μl med fortynnet sekvenseringsprimer i hver brønn på PyroMark Q24 Plate i henhold til kjøreoppsettingen (se Protokoll 1: Kjøreoppsett for PyroMark Q24 MDx, side 16). Hold en av PyroMark Q24 Plate Holders (som følger med PyroMark Q24 MDx Vacuum Workstation) ved romtemperatur (15 25 C) og bruk den som støtte ved preparering og forflytting av platen. 3. Plasser PCR-platen (eller remsene) fra protokoll 3 og PyroMark Q24 Plate på arbeidsbenken (se figur 3). satt inn. Pass på at platen plasseres i samme retning som når prøvene ble Figur 3. Plassering av PCR-plater (eller remser) og PyroMark Q24 Plate på vakuum-arbeidsstasjonen. 4. Appliser vakuum på verktøyet ved å åpne vakuumsbryteren. 5. Senk filtersondene forsiktig ned på PCR-platen (eller remsene) for å innfange kulene som inneholder immobilisert templat. Hold sondene på plass i 15 sek. Var forsiktig når du tar opp verktøyet. Sepharose-kuler sedimenterer raskt. Hvis det er gått mer enn 1 min. siden platen (eller remsene) ble ristet, rist igjen i et minutt før kulene innfanges. 6. Overfør verktøyet til trauet som inneholder 70 % etanol (trau 1). Skyll filtersondene i 5 sek. 7. Overfør verktøyet til trauet som inneholder denatureringsløsning (trau 2). Skyll filtersondene i 5 sek. 8. Overfør verktøyet til trauet som inneholder vaskebuffer (trau 3). Skyll filtersondene i 10 sek. 9. Løft verktøyet opp og bakover, utover 90 vertikalt, i 5 sek. for å drenere væsken fra filtersondene (se figur 4). 24 PyroMark KRAS Kit-håndbok 06/2009

25 Figur 4. Illustrasjon av vakuumverktøyet reist over 90 vertikalt. 10. Mens verktøyet holdes over PyroMark Q24 Plate, lukk vakuumsbryteren på verktøyet (Off) (av). 11. Frigjør kulene i platen som inneholder Seq-primere ved å riste varsomt på verktøyet fra side til side. La filtersondene hvile på bunnen av brønnene. 12. Overfør verktøyet til trauet som inneholder nukleasefritt vann (trau 4) og rist verktøyet i 10 sek. 13. Vask filtersondene ved å senke dem i nukleasefritt vann (trau 5) og appliser vakuum. Skyll sondene med 70 ml nukleasefritt vann. 14. Løft verktøyet opp og bakover, utover 90 vertikalt, i 5 sek. for å drenere væsken fra filtersondene (se figur 4). 15. Lukk vakuumsbryteren på verktøyet (Off) (av) og plasser verktøyet i parkerings (P)-posisjon. 16. Slå av vakuumpumpen. Etter avsluttet arbeidsdag skal væskeavfall og resterende oppløsninger kastes og PyroMark Q24 MDx Vacuum Workstation undersøkes for støv og søl, se Tillegg B, side Varm PyroMark Q24 Plate med prøvene ved 80 C i 2 min. ved hjelp av den forhåndsvarmede PyroMark Q24 Plate Holder. 18. Fjern PyroMark Q24 Plate fra plateholderen og la prøvene avkjøle til romtemperatur (15 25 C) i minst 5 min. 19. Fortsett videre med Protokoll 5: Kjøring av PyroMark Q24 MDx. PyroMark KRAS Kit-håndbok 06/

26 Protokoll 5: Kjøring av PyroMark Q24 MDx Denne protokollen beskriver lasting av PyroMark Gold Q24 Reagents inn i PyroMark Q24 Cartridge og start og avslutning av en kjøring på PyroMark Q24 MDx. For detaljert beskrivelse om hvordan en kjøring opprettes, se PyroMark Q24-brukerhåndbok. Viktig punkt før start Førkjørings-informasjonsrapporten som finnes i Tools (verktøy)-menyen ved kjøreoppsetting (se Protokoll 1: Kjøreoppsett for PyroMark Q24 MDx, side 16), gir informasjon om nukleotider-volum, enzym og substratbuffer som trengs for en spesifikk assay. Prosedyre 1. Last PyroMark Q24 Cartridge med egnede volumer av nukleotider, enzym og substratbuffere. 2. Åpne patronporten og sett inn den fylte reagenspatronen med etiketten vendt utad. Skyv patronen helt inn og skyv den deretter nedover. 3. Sørg for at linjen er synlig foran patronen og lukk porten. 4. Åpne plateholderrammen og plasser platen på varmeblokken. 5. Lukk plateholderrammen og instrumentlokket. 6. Sett inn USB-pinnen (som inneholder kjøringsfilen) inn i USB-porten på forsiden av instrumentet. Ikke fjern USB-pinnen før kjøringen er endt. 7. Marker Run (kjøring) i hovedmenyen (med og skjermknappene) og trykk OK. 8. Marker kjørefilen med og skjermknappene. For å se innholdet til en mappe, marker mappen og trykk Select (velg). For å gå tilbake til forrige visning, trykk Back (tilbake). 9. Når kjøringen er markert, trykk Select (velg) for å starte kjøringen. 10. Når kjøringen er avsluttet og instrumentet bekrefter at kjørefilen er lagret til USB-pinnen, trykk Close (lukk). 11. Fjern USB-pinnen. 12. Åpne instrumentlokket. 13. Åpne patronporten og fjern reagenspatronen ved å løfte den opp og trekke den ut. 14. Lukk porten. 26 PyroMark KRAS Kit-håndbok 06/2009

27 15. Åpne plateholderrammen og fjern platen fra varmeblokken. 16. Lukk plateholderrammen og instrumentlokket. 17. Kasser platen og rens patronen. 18. Analyser kjøringen i henhold til Protokoll 6: Analyse av kjøring på PyroMark Q24 MDx. PyroMark KRAS Kit-håndbok 06/

28 Protokoll 6: Analyse av kjøring på PyroMark Q24 MDx Denne protokollen beskriver mutasjonsanalysen til en avsluttet KRAS-kjøring ved hjelp av PyroMark Q24 MDx Software. Prosedyre 1. Sett USB-pinnen (som inneholder den prosesserte kjørefilen) inn i datamaskinens USB-port. 2. Flytt kjørefilen fra USB-pinnen til ønsket sted på datamaskinen med hjelp av Windows Explorer. 3. Åpne kjørefilen i AQ-modus i PyroMark Q24 MDx Software enten ved å markere Open (åpne) fra File (fil)-menyen eller ved å dobbeltklikke på filen ( ) i snarvei-browseren. 4. For å analysere kjøringen og oppnå et overblikk av resultatene, klikk på en av analyseknappene. Analyser alle brønnene. Analyser valgt brønn. Analyseresultatene (allelfrekvenser) og kvalitetsvurdering vises over variabelposisjonen i Pyrogram-kurven. Før ytterligere detaljer om hvordan en kjøring analyseres, se PyroMark Q24-brukerhåndbok. 5. For å generere en rapport, marker Full Report (full rapport) fra Reports for AQ runs (rapporter for AQ-kjøringer) i menyen. De hyppigste mutasjonene i KRAS finnes ved nukleotid 35 (annen base av codon 12). Det er derfor at standard Sequence to Analyze (sekvensanalysen) definert i Analysis Setup (analyseoppsettingen) behandler mutasjoner ved denne posisjonen (se Tillegg A, side 35). Hvis en prøve inneholder en mutasjon ved nukleotid 34 (første base av codon 12) kan Sequence to Analyze (sekvensanalysen) endres til også å analysere mutasjonsstatusen ved denne posisjonen, som beskrevet i Tillegg A. Oppdaterte frekvenser av mutasjoner i humant KRAS-gen i codon 12/13 og codon 61 er tilgjengelig online fra Sanger Institute på For pålitelige resultater anbefales det enkelt-høydepunkter over 30 RLU. 30 RLU skal settes som required peak height for passed quality (påkrevd høyde på høydepunktet for bestått kvalitet) i assay-oppsetting (Se Tillegg A og PyroMark Q24-brukerhåndbok). 28 PyroMark KRAS Kit-håndbok 06/2009

29 AQ-analysens resultatrapport skal brukes til å dokumentere allelkvantifisering. Tallene som vises i Pyrogrammet er avrundet og viser ikke nøyaktig kvantifisering. Repetert analyse av prøver uten detektert mutasjon i nukleotid 35 eller med Check (kontrollér)- eller Failed (mislykket)- kvalitetsvurdering. Vi anbefaler meget sterkt å repetere alle prøver som ikke detekterte mutasjoner i nukleotid 35 så vel som prøver som fikk Check (kontrollér)- eller Failed (mislykket)-kvalitetsvurdering med Sequence to Analyze (sekvensanalysen) målrettet til mutasjoner ved nukleotid 34. Check (kontrollér)- eller Failed (mislykket)-kvalitetsvurdering kan indikere et referanse-høydepunkt ved en posisjon som ikke forventes av en nukleotid 35-mutasjon. Et høydepunkt i hvilken som helst av de 3 første utdelingene viser at en mutasjon er til stede ved nukleotid 34. For å gjenta analysen og målrette den til mutasjoner ved nukleotid 34, gå til Analysis Setup (analyseoppsett) og endre Sequence to Analyze (sekvensanalysen) fra GNTGRCGTAGGYA til NGTGRCGTAGGYA. Trykk på Apply (appliser)-knappen, og klikk på To All (på alle) når Apply Analysis Setup (appliser analyseoppsett)-vinduet vises. Gjenkjøring av prøver for deteksjon av lavnivå-mutasjoner Det anbefales meget sterkt å inkludere en normal prøve i hver kjøring for sammenligning. Enhver prøve som viser en høyere mutasjonsfrekvens enn dens tilsvarende posisjon i den normale prøven skal undersøkes i forhold til tabellen som viser deteksjonsbegrensningen (se tabell 11, side 30). Prøvene kan også sammenlignes med hverandre for å avsløre uvanlig høye mutasjonsfrekvenser. Som veiledning skal prøver som har mistenkt mutasjon i verdiområdet fra LOD (tabell 11) til LOD + 3 % enheter, analyseres på nytt i duplikat sammen med en normal prøve i duplikat. Hvis begge duplikater gir samme resultat som den opprinnelige analysen og er åpenlyst forskjellige fra den normale kontrollen, skal prøven betraktes som positiv for mutasjonen. Vær oppmerksom på at en behandlingsbeslutning for kreftpasienter ikke utelukkende må baseres på KRAS-mutasjonsstatus. I tilfelle av en mistenkt GGT GTT-mutasjon kan et resultat større enn 1 % vurderes som positivt. Dette nivået kan variere betraktelig mellom replikater (se Blankbegrensning og deteksjonsbegrensning, side 9). PyroMark KRAS Kit-håndbok 06/

30 Tabell 11. LOB og LOD fastslått for spesifikke mutasjoner Mutasjon LOB (%) LOD (%) COSMIC ID* (V42) Codon 12 (GGT) GAT 0,6 2,2 521 GTT i.a. 7,0 520 TGT 0,5 2,1 516 AGT 0,4 1,9 517 GCT 0,7 2,3 522 CGT 0,3 1,8 518 Codon 13 (GGC) GAC 0,3 1,9 532 Codon 61 (CAA), analysert i revers orientering (TTG) GTG 0,8 2,8 554 TAG 1,2 3,1 553 TCG 1,6 3,5 552 ATG 0,7 2,6 555 TTC 1,2 3,1 550 * Fra Catalogue of Somatic Mutations in Cancer, tilgjengelig online fra Sanger Institute på i.a.: ikke aktuelt. 30 PyroMark KRAS Kit-håndbok 06/2009

31 Representative resultater Representative Pyrogram-resultater vises i figurene Figur 5. Pyrogram-kurve fremkommet etter analyse av en prøve med normal genotype in codoner 12 og 13. Figur 6. Pyrogram-kurve fremkommet etter analyse av en prøve med normal genotype in codon 61. Figur 7. Pyrogram-kurve fremkommet etter analyse av prøver med en GGT GATmutasjon i base 2 av codon 12 (nukleotid 35, angitt med en pil). PyroMark KRAS Kit-håndbok 06/

32 Figur 8. Pyrogram-kurve fremkommet etter analyse av prøver med en GGT AGTmutasjon i base 1 av codon 12 (nukleotid 34, angitt med en pil), med Sequence to Analyze (sekvensanalysen) GNTGRCGTAGGYA målrettet til base 2 i codon 12 (nukleotid 35). En gul farge angir at denne sekvensen er uventet og trenger å bli undersøkt. Figur 9. Pyrogram-kurve og resultat fremkommet etter ny analyse av prøven i figur 8. Mutasjonen GGT AGT ble analysert på nytt med Sequence to Analyze (sekvensanalysen) NGTGRCGTAGGYA målrettet til base 1 i codon 12 (nukleotid 34). Figur 10. Pyrogram-kurve etter analyse av Mutant KRAS Control DNA med Sequence to Analyze (sekvensanalysen) NGTGRCGTAGGYA målrettet til første base av codon PyroMark KRAS Kit-håndbok 06/2009

33 Feilsøkingsveiledning Feilsøkingsveiledningen kan være til hjelp i å løse evt. problemer som kan oppstå. For mer informasjon, se også Ofte stilte spørsmål (Frequently Asked Questions)- siden ved vårt Teknisk støttesenter: Vitenskapsmennene og -kvinnene ved QIAGENs tekniske service er alltid beredt til å svare alle de spørsmål du måtte ha om informasjonen eller protokollene i denne håndboken eller om prøve- og assayteknologier (for kontaktinformasjon, se baksiden eller besøk Se PyroMark Q24-brukerhåndbok for generell feilsøking av instrumentet. Kommentarer og forslag Signaler i kontrollen uten templat (negativ kontroll) a) Kryss-samtale mellom brønner Signal fra en brønn detekteres i en tilgrensende brønn. Unngå å plassere prøver med høy signalintensitet ved siden av kontrollbrønner uten templat. b) PCR-kontaminasjon Bruk sterile pipettespisser med filtre. Oppbevar og ekstraher materialer slik som prøver, plasmidkontroller og amplikoner atskilt fra PCR-reagenser. Dårlig eller uventet sekvens Lav kvalitet av genomisk DNA Lav kvalitet av genomisk DNA kan forårsake at PCR mislykkes. Analyser PCR-prøver med elektroforetisk teknikk (for eksempel, bruk QIAxcel -systemet eller agarose-gelelektroforese). Check (kontrollér) eller Failed (mislykket) resultat Sjelden mutasjon ikke definert i assayoppsettingen Juster sekvensanalysen i assayoppsettingen (se Tillegg A, side 35) og analyser kjøringen på nytt. Høy bakgrunn Uriktig oppbevaring av nukleotider Oppbevar nukleotider ved 2 8 C. Oppbevaring ved -20 C kan forårsake en økning i bakgrunnen. PyroMark KRAS Kit-håndbok 06/

34 Kommentarer og forslag Ingen signaler i positive kontroller (wt KRAS Control DNA og Mutant KRAS Control DNA) a) Utilstrekkelig enzym eller substratblanding for alle brønner b) Reagenser ukorrekt oppbevart eller fortynnet Pass på å fylle PyroMark Q24 Cartridge i henhold til Pre Run Information (førkjøringsinformasjon) i Tools (verktøy)- menyen. Preparer PyroMark Gold Q24 Reagents i henhold til anvisningene som følger med reagensene. Uventet høydepunkt-avtegning i siste variabel posisjon Kontaminasjon med kontroll plasmid-dna Kontrollplasmidene, wt KRAS Control DNA og Mutant KRAS Control DNA inneholder en unik sekvensforskjell som kan brukes til å identifisere signaler fra kontrollene (se Kontroller, side 15) og Tillegg A: Oppsetting av PyroMark KRAS-assayer, side 35). Bruk sterile pipettespisser med filtre. Oppbevar og ekstraher materialer slik som prøver, plasmidkontroller og amplikoner atskilt fra PCR-reagenser. 34 PyroMark KRAS Kit-håndbok 06/2009

35 Tillegg A: Oppsetting av PyroMark KRAS-assayer Før PyroMark KRAS kjøres for første gang, må assayfilen opprettes som beskrevet nedenfor. Prosedyre KRAS codoner 12 og Sett opp assayet for KRAS-codoner 12 (posisjon 2) og 13 (posisjon 2) ved bruk av PyroMark Q24 MDx Software. 2. Klikk på verktøylinjen og marker New AQ Assay (nytt AQassay). 3. Tast inn følgende sekvens i Sequence to Analyze (sekvensanalysen). GNTGRCGTAGGYA De mest frekvente mutasjonene i codon 12 vil bli detektert i nukleotid 35 (annen posisjon). Hvis mutasjoner er til stede i nukleotid 34 (første posisjon) endres Sequence to Analyze (sekvensanalysen) til følgende sekvens. NGTGRCGTAGGYA Variabelposisjonen 3 (Y) tillater diskriminering mellom signaler som stemmer fra plasmidkontroller (wt KRAS Control DNA og Mutant KRAS Control DNA) og signaler fra genomisk DNA. Mens genomisk DNA vil resultere i en C, vil plasmidkontrollene resultere i en T ved variabel posisjon Legg inn følgende Dispensation Order (utdelingsordre) manuelt. TACGACTCAGATCGTAGTC T A C G A 5 C T C A G 10 A T C G T 15 A G T C Figur 11. Histogram for codoner 12 (nukleotid 35) og 13 (nukleotid 38) med Sequence to Analyze (sekvensanalysen) GNTGRCGTAGGYA. PyroMark KRAS Kit-håndbok 06/

36 2 1 0 T A C G A 5 C T C A G 10 A T C G T 15 A G T C Figur 12. Histogram for codoner 12 (nukleotid 34) og 13 (nukleotid 38) med Sequence to Analyze (sekvensanalysen) NGTGRCGTAGGYA. 5. Klikk fanen Analysis Parameters (analyseparametrer) og øk Peak Height Threshold - Required peak height for Passed quality: (Høydepunkt-terskel - påkrevd høyde på høydepunktet for bestått kvalitet:) til Klikk på verktøylinjen og lagre assayet som KRAScodon KRAS-codon Klikk på verktøylinjen og marker New AQ Assay (nytt AQassay). 8. Tast inn følgende sekvens i Sequence to Analyze (sekvensanalysen). CTCDTGACCTRC Variabel posisjon 2 (R) tillater diskriminering mellom signaler som stemmer fra plasmidkontroller (wt KRAS Control DNA og Mutant KRAS Control DNA) og signaler fra genomisk DNA. Mens genomisk DNA vil resultere i en G, vil plasmidkontrollene resultere i en A ved variabel posisjon Legg inn følgende Dispensation Order (utdelingsordre) manuelt. GCTCAGTCAGACTAG G C T C A G T C A G 5 10 Figur 13. Histogram for codon 61 (nukleotid 183). A C T A G Klikk fanen Analysis Parameters (analyseparametrer) og øk Peak Height Threshold - Required peak height for Passed quality: (Høydepunkt-terskel - påkrevd høyde på høydepunktet for bestått kvalitet:) til Klikk på verktøylinjen og lagre assayet som KRAScodon PyroMark KRAS Kit-håndbok 06/2009

37 Tillegg B: Tømming av avfallsbeholder og trau ADVARSEL Farlige kjemikalier Denatureringsløsningen som brukes med vakuumarbeidsstasjonen inneholder natriumhydroksid, noe som irriterer øyne og huden. Ha alltid på vernebriller, vernehansker og beskyttende laboratoriefrakk. Den ansvarlige (f.eks. laboratoriesjefen) må ta nødvendige forholdsregler som sikrer at omgivelsen rundt arbeidsstedet er trygt og at instrumentoperatørene ikke er utsatt for farlige nivåer av toksiske stoffer (kjemiske eller biologiske) som definert i gjeldende Material Safety Data Sheets (materialesikkerhetsdatablad, MSDSs) eller OSHA,* ACGIH, eller COSHH dokumenter. Ventilering av røykgasser og avhending av avfall må utføres i henhold til alle nasjonale, delstats- og lokale helse- og sikkerhetsforskrifter og lover. * OSHA: Occupational Safety and Health Administration (USA) ACGIH: American Conference of Government Industrial Hygienists (USA) COSHH: Control of Substances Hazardous to Health (Storbritannia) Sørg for å etterfølge alle føderale, delstats- og lokale miljømessige forskrifter for avhending av laboratorieavfall. Viktig punkt før start Denne protokollen krever høy-renset vann (Milli-Q 18,2 MΩ x cm, eller tilsvarende). Prosedyre 1. Sørg for at vakuum ikke appliseres på vakuumverktøyet. Sørg for at vakuumet er lukket (Off) [av] og at vakuumpumpen er slått av. 2. Kast alle løsninger etterlatt i trauene. 3. Skyll trauene med høyrenset vann eller skift dem ut hvis nødvendig. 4. Tøm avfallsbeholderen. Hetten kan fjernes uten slangens frakobling. 5. Hvis vakuum-arbeidsstasjonen må rengjøres (for eksempel pga. støv eller søl) følg anvisningene i PyroMark Q24-brukerhåndbok. PyroMark KRAS Kit-håndbok 06/

38 Referanser QIAGEN vedlikeholder en stor, oppdatert online database med vitenskapelige publikasjoner som bruker QIAGEN-produkter. Omfattende søkealternativer lar deg finne artiklene du trenger, enten med et vanlig nøkkelordsøk eller ved å spesifisere anvendelsen, forskningsområdet, tittel, osv. For en komplett liste med referanser, besøk QIAGENs referansedatabase online på eller ta kontakt med QIAGEN teknisk service eller din lokale forhandler. 38 PyroMark KRAS Kit-håndbok 06/2009

39 Bestillingsinformasjon Produkt Innhold Kat.nr. PyroMark KRAS Kit (24) PyroMark Q24 MDx PyroMark Q24 MDx Vacuum Workstation For 24 reaksjoner på PyroMark Q24 MDx: Seq-primere, PCR-primere, wt KRAS Control DNA, Mutant KRAS Control DNA Sekvensbasert deteksjonsplatform for Pyrosequencing av 24 prøver parallelt Vakuum-arbeidsstasjon (220 V) for preparering av 24 prøver parallelt, fra PCR-produkt til enkeltrådet templat * PyroMark Q24 MDx Software Applikasjonsoftware Tilbehør PyroMark Q24 Plate (100) PyroMark Q24 Cartridge (3) PyroMark Gold Q24 Reagents (5 x 24) PyroMark Binding Buffer (200 ml) PyroMark Denaturation Solution (500 ml) 24-brønns sekvenseringsreaksjonsplate Patroner til utdeling av nukleotider og reagenser For 5 x 24 prøver: Enzymblanding, substratblanding og nukleotid For binding av biotinylert PCR-produkt til sepharose-kuler Til denaturering av dobbeltrådet PCRprodukt til enkeltrådet templat-dna PyroMark Wash Buffer, konsentrat (200 ml) Til vasking av enkeltrådet DNA PyroMark Annealing Buffer (250 ml) PyroMark Vacuum Prep Filter Probe (100) For annealing av sekvenseringsprimer til enkeltrådet PCR-produkt og for Pyrosequencing-reaksjon Gjenbrukbare filtersonder for PyroMark Vacuum Workstation Q96 og Q PyroMark Control Oligo For installasjonskontroll av systemet * For alle andre land (ikke Storbritannia). For Storbritannia. PyroMark KRAS Kit-håndbok 06/

40 Produkt Innhold Kat.nr. PyroMark Q24 Validation Oligo For ytelsesbekreftelse av systemet Relaterte produkter HotStarTaq Plus Master Mix Kit (250) HotStarTaq Plus Master Mix Kit (1000) HotStarTaq Plus Master Mix Kit (2500) QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (50) EZ1 DNA Tissue Kit (48) For 250 x 20 μl reaksjoner: 3 x 0,85 ml HotStarTaq Plus Master Mix, inneholdende 250 enheter HotStarTaq Plus DNA Polymerase total, 1 x 0,55 ml CoralLoad konsentrat, 2 x 1,9 ml RNase-fritt vann For 1000 x 20 μl reaksjoner: 12 x 0,85 ml HotStarTaq Plus Master Mix, inneholdende 1000 enheter HotStarTaq Plus DNA Polymerase total, 4 x 0,55 ml CoralLoad konsentrat, 8 x 1,9 ml RNase-fritt vann For 2500 x 20 μl reaksjoner: 25 ml HotStarTaq Plus Master Mix, inneholdende 2500 enheter HotStarTaq Plus DNA Polymerase total, 5,5 ml CoralLoad konsentrat, 2 x 20 ml RNase-fritt vann For 50 DNA prepareringer: 50 QIAamp MinElute kolonner, proteinase K, buffere, oppsamlingsrør (2 ml) For 48 prepareringer: reagenspatroner (vev), engangs-filterspisser, engangsspissholdere, prøverør (2 ml), elusjonsrør (1,5 ml), buffer G2, proteinase K QIAamp DSP DNA Blood Mini Kit For 50 prepareringer: QIAamp minispinn-kolonner, buffere, reagenser, rør, vakuumkoblinger For oppdatert lisensieringsinformasjon og produkt-spesifikke fraskrivelser, se det respektive QIAGEN kitets håndbok eller brukerhåndbok. QIAGEN kithåndbøker og -brukerhåndbøker er tilgjengelige på eller kan fås fra QIAGEN teknisk service eller din lokale forhandler. 40 PyroMark KRAS Kit-håndbok 06/2009