Autoantistoffer innen immunhematologi

Transkript

1 Autoantistoffer innen immunhematologi Unni Bergerud Seksjon for immunhematologi med kompetansetjeneste i blodtypeserologi Blodbanken i Oslo Avdeling for immunologi og transfusjonsmedisin Oslo universitetssykehus, HF Bioingeniørkongressen 2016, Sesjon Blodbank Hva vil foredraget belyse: * Noen definisjoner og forklaringer * De vanligste autoimmune hemolytiske anemier (klassifikasjoner) * Kjennetegn for antistoffene som er involvert * Prinsipper for hemolyse in vivo * Flere detaljer om sykdommene 1

2 * Pretransfusjonsprøver og transfusjon akt. prøver utredning av autoantistoffet identifikasjon auto/alloadsorbsjon eluering fortynning fenotyping valg av blod / forlik Autoantistoff er en betegnelse på antistoff som reagerer med kroppsegne antigen. Antistoffene kan reagere in vivo og in vitro Autoantistoff kan være rettet mot forskjellige celler og vev i kroppen. 2

3 De autoimmune sykdommene som hovedsakelig berører blodtypeserologien er de som produserer : Autoantistoff mot antigen som finnes på de røde blodlegemene (RBC ) Det finnes også autoantistoffer mot andre blodceller, f. eks. trombocytter: Idiopatisk trombocyttopenisk purpura Hvorfor dannes autoantistoff?? Mangelfull T-celle regulering av B-lymfocyttene er en hovedårsak Vi får svikt i den immune toleransen Det utvikles antistoff mot kroppseget vev, og immunsystemet går til angrep mot seg selv B-cellene vil få utviklet forbudte kloner av antistoffproduserende celler og: Autoantistoffene er et faktum. 3

4 Autoimmune hemolytiske anemier De tre mest kjente er: 1) Autoimmun hemolytisk anemi av varmetypen (AIHA) (87%) (Engelsk: WAIHA: Warm Antibody Induced Hemolytic Anemia) 2)Autoimmun hemolytisk anemi av kuldetypen/kuldeagglutininsyndrom (Engelsk: CHD = Cold Hemagglutinin Disease) (12%) 3) Paroksystisk kuldehemoglobinuri (1%) (Engelsk: PCH: Paroxymal Cold Hemoglobinuria) Sykdommene, spesielt de to første, inndeles igjen i to: Idiopatiske eller primære (= grunnsykdom, eneste kjente sykdom) Sekundære (= ses som en tilleggsykdom) WAIHA: Idiopatiske: Sekundære: Eneste sykdom Kronisk lymfatisk leukemi, lymfomer, SLE m.flere 4

5 CHD: Idiopatiske: Dannelse av IgM antistoffer, ofte monoklonale komponenter Waldenstrøms makroglobinemi (kronisk karakter) Sekundære: PCH: Idiopatiske: Sekundære: Kroniske eller akutte: Mycoplasma pneumonier, mononucleose, andre virusinfeksjoner (forbigående karakter) Ses svært sjelden Ses særlig hos barn etter virusinfeksjoner, gir akutt hemolyse. Ved alvorlig grad av syphilis I tillegg til de nevnte grupper, finnes de: Medikamentbetingede* immunhemolytiske anemiene (* autoantistoff *adsorbsjon *immunkomplekser *membranmodifisering) Symptomene kan arte seg som WAIHA, forsvinner når medikamentet seponeres 5

6 Hva kjennetegner autoantistoffene fra de tre autoimmunhemolytiske anemiene: WAIHA CHD PCH Antistoffets imm. globulinklasse IgG IgM IgG Antistoffets Inkomplett Saltvanns- Bifasisk hemolysin karakter agglutinerende Optimal in-vitro 37 o 0-4 o 0-4 o reaksjonstemperatur Komplementaktivering Både Ja og Nei Ja Ja Hva finner vi på cellene (DAT) Antistoffpåvisning i eluat Vanlige antistoffspesifisiteter IgG eller IgG og C3d IgG antistoff Rh, Kell, LW, Ena, Wrb, U, Jka C3d Ingen (negativ) Vanligst er I systemet C3d Ingen (negativ) P Hemolyse (destruksjon) av røde blodlegemer: Destruksjon av celler oppstår i mange ulike situasjoner og kan arte seg bl.a som følger Akutt eller forsinket hemolytisk transfusjonsreaksjon (uforlikelig blod) Varme og kalde antistoff induserte hemolytiske anemier PCH Hemolytisk sykdom hos nyfødte Medikament betinget hemolytisk anemi Transplantasjonsrelatert allo-immun hemolytisk anemi 6

7 Selv om mange ulike årsaker og forhold nevnes, finnes kun 2 mekanismer for nedbryting: INTRAVASAL HEMOLYSE & EKSTRAVASAL HEMOLYSE ( Mekanisk nedbrytning av cellene, kan også forekomme) INTRAVASAL HEMOLYSE: Oppstår når antistoff som bindes til RBC er i stand til å aktivere komplement: 1) 2 Fc deler fra et antistoff må gå i kompleks med komplementfaktor C1q for å aktivere komplement Ett IgM molekyl har 5 Fc deler og kan lett gå i kompleks med C1q Et IgG molekyl har bare 1 Fc del og for å inngå i et kompleks kreves at to IgG molekyler er bundet til nærliggende antigen på RBC. (Dette er hovedforklaringen på at IgM aktiverer komplement i langt større grad enn IgG) 7

8 2) For at komplementaktiveringen skal gå sin gang gjennom hele kaskaden, må bindingen til komplement skje raskt og i en viss mengde for at nok C3 skal bli aktivert. En rekke komplementregulerende faktorer i blodet går også normalt inn og reduserer / regulerer mengden aktivert komplement på forskjellige steder i komplementkaskaden. En annen ting å huske på : Det er først og fremst antistoff av IgM type som aktiverer komplement Pga temperatur optimum ved lave temperaturer, bindes de sjelden til celler in vivo Komplementaktiveringen fra mange IgM antistoffer er således mer et vitro fenomen og oppstår relativt sjelden in vivo. 8

9 I praksis: Hovedsakelig antistoffene i ABO systemet, som aktiverer komplement så raskt og i så stor mengde, at den terminale delen av komplementaktiveringen går sin gang og gir lyse av cellene 9

10 Den intravasale hemolysen er den mest livstruende: Det utvikles raskt sjokk, DIC, nyresvikt og i verste fall død. Issit: 10 % av de pasienter som får ml ABO uforlikelig blod, dør!!!!!!!!! I tillegg til antistoffene i ABO systemet, kan enkelte medikamentbetingetde antistoffer og antistoffene ved PCH gi intavasal hemolyse, men det er relativt sjelden. EKSTRAVASAL HEMOLYSE: Ekstravasal hemolyse oppstår når RBC som er dekket med IgG eller IgG og C3, blir nedbrutt i store mengder av makrofager i milten og/eller i leveren. Makrofagene har Fc reseptorer for IgG og /eller reseptor for C3c (aktivert C3) 10

11 Makrofagene fjerner IgG og/eller C3 fra cellemembranen og dette resulterer i fagocytose av RBC eller at RBC konverterer til sfærocytter som da pga sin stive form dør (de fleste cellene dør på denne måten) Makrofagene binder IgG 3 sensibiliserte celler mer effektivt enn IgG1 sensibiliserte celler. RBC som er sensibilisert både med IgG og C3 fjernes raskere fra sirkulasjonen enn de RBC som kun har IgG. Dette skyldes bl.a at Fc reseptoren for IgG kan bli blokkert av fritt IgG fra plasma. Tilsvarende nøytralisering kan ikke skje for C3c reseptoren. Celler som bare er sensibilisert med C3c fjernes ikke permanent fra sirkulasjonen. 11

12 Ekstravasal hemolyse av RBC, er den vanligste form for hemolyse ved : Transfusjon av uforlikelig blod pga klinisk signifikante antistoffer (anti-d, K, Jka, Fya osv) og på restene av ABO antistoffene. WAIHA HDN Medikamentindusert hemolytisk anemi Den er mindre akutt og alvorlig enn den intravasale, men også denne kan være fatal!! Flere detaljer om de autoimmune hemolytiske anemiene: For å skille varme og kalde autoimmune hemolytiske anemier, er det viktig å se om vi påviser: Kuldeantistoff (IgM) eller Varmt antistoff (IgG) i serum og om DAT er sensibilisert med C3d alene eller med IgG (evt. IgG + C3d) Behandlinsopplegget for den ene sykdommen vil være ineffektiv for den andre og vise versa 12

13 WAIHA: I en tidlig fase hos pasienter med WAIHA, vil transfusjon være kontraindisert fordi: En transfusjon vil tilføre nye antigen som trigger autoantistoff produksjonen. Dette gir igjen økt nedbrytning og man kommer inn i en ond sirkel hvor prognosen på sikt forverres (økt hemolyse, hemoglobinuri,nyresvikt) Det er fare for alloimmunisering Transfunderte celler har redusert levetid Man bør unngå transfusjon så langt man kan!!! WAIHA forts.: Behandling: Man vil som oftest forsøke å behandle pasientene med steroider for å unngå celledestruksjon. Steroidene virker ved å: Hemme makrofagene/fagocytosen (reduserer antall Fc reseptorer) Redusere antall Ag/Ab komplekser Redusere antistoffproduksjonen (Annen behandling kan være splenektomi, immunsuppresiv terapi, behandling med anti CD20 (Retuximab), plasmaferese, IVIG) 13

14 WAIHA forts.: Mengde av autoantistoff er av stor betydning: Hvis mengden autoantistoff er så liten at: DAT: positiv SCR: negativ Antagelig god og rask respons på steroidene. Kan ofte se effekt i løpet av 1-2 døgn Hvis mengden med autoantistoff er større: DAT: positiv SCR: positiv Behandling vil ta lengre tid, kanskje 5-7 dager WAIHA forts.: Hvis RBC er sensibilisert med komplement (vi påviser C3d i tillegg til IgG), er dette viktig informasjon: Involvering av komplement, medfører: større nedbrytning av celler doser av steroider må økes responsen på steroider ofte dårligere NB: Det er viktig å finne ut hvor pasienten befinner seg OG helst før pasienten transfunderes 14

15 WAIHA forts.: Vi ser av dette at forholdsvis enkle og raske lab.undersøkelser, gir viktig informasjon til klinikerne Bruker klinikerne det bevist nok????? Gradert DAT kan gi informasjon!!!!!!! Subklasse bestemmelser kan være aktuelt, særlig IgG3 eller IgG1, men pasienter med autoantistoff har veldig ofte begge subklassene og da er man ikke så mye klokere. Hvis DAT er negativ, hva da?????? (ses hos opptil 10%) Hvis klinisk tegn til hemolyse: mistenk WAIHA pga IgA!!! CHD: Transfusjon er ikke kontraindisert her fordi autoantistoffene normalt ikke reagerer in-vivo Antistoffproduksjonen hos disse pasientene er ofte på topp, og vil heller ikke bli trigget Ofte vil behandling av pasientens grunnsykdom, bedre tilstanden. Man må unngå kuldeeksponering, gir transfusjon hvis nødvendig (særlig ved operasjoner e.l) PCH: Går fort over etter kritisk fase, behandling steroider og transfusjon. Hvis transfusjon, ofte pp blod (pga anti-p) 15

16 Pretransfusjonsprøver og transfusjon En del pasienter MÅ til slutt transfunderes: Når anemien er så uttalt at den påvirker hjertefunksjon og blodstrøm/oksygentilførsel, MÅ pasienten få blod. Ofte opplever Blodbankfolkene situasjonen verre enn klinikken tilsier Verdt å huske på : Hvis det kun er autoantistoffet som er årsak til uforlik, vil det transfunderte blodet normalt destrueres med tilsvarende hastighet som pasientens eget blod og man vil sjelden se noen tr.rx. Ved utredning, forhør deg om pasientens sykdomsanamnese: Diagnose Medikamenter Tidligere transfusjoner, hvis ja, når sist?? Tidligere komplikasjoner?? Graviditeter Det viktigste ved transfusjon til pasienter med autoantistoff, er å finne ut om det kan foreligge maskerte allo-antistoffer under. 16

17 Litteraturen varierer mht om pasienter med autoantistoffer har alloantistoffer i tillegg. Noen av de senere tall sier mellom 30-40%. Data fra egen blodbank viser at dette er tilfelle hos ca. 20 % av pasientene. Blant alloantistoffene har flertallet spesifisitet Hos de fleste av pasientene, har ikke pasientene hatt kjente påviste alloantistoffer før vi påviser autoantisoffet Utredning av autoantistoffer: Pretransfusjonsundersøkelser utføres som vanlig: ABO, RhD og screening 1) Antistoffscreening: Vil oftest bli positiv med samtlige celler. Kan på dette tidspunkt ikke si om det er allo- eller auto, kaldt eller varmt antistoff. 17

18 2) Antistoffidentifisering med cellepanel og egne celler: Viktig å gradere reaksjonene så godt man kan Det første tegn på at vi har et autoantistoff, er at antistoffet reagerer med egne celler ved id. Funnet bekreftes ved at også DAT blir positiv. 3) DAT: m / bredspektret reagens m / spesifikke reagenser (IgG og C3d) evt. m/spesifikke reagenser (IgG,IgA,IgM,C3c og C3d) Vær obs på evt. partielle reaksjoner!! Hvis DAT i glass: kan være aktuelt å vaske kaldt hvis tradisjonelt oppsett blir negativt, men pas. hemolyserer 18

19 Før konklusjon autoantistoff gis, må en huske at også andre situasjoner kan gi et bilde med egne celler positive: Hemolytisk transfusjonsreaksjon Alloantistoff mot transfunderte celler, gir reaksjon med de transfunderte celler / DAT positiv /Ofte partiell Spesifikt alloantistoff og et svakt autoantistoff i tillegg Overførsel av Allo-antistoff i forbindelse med organtransplantasjon. Reaksjon med egne celler / DAT positiv / Ofte partiell ( Medikamentbetinget antistoff ) 4) Prøv å finn ut om det dreier seg om autoantistoff av varme- eller kuldetypen? DAT reaksjon med IgG (og evt. C3d), positiv screening ved 37 grader, ingen problemer ved ABO og RhD typing Trolig autoantistoff av varmetypen DAT reaksjon bare med C3d, evt. problemer med ABO og RhD typing, negativ / positiv screening ved 37 grader Trolig autoantistoff av kuldetypen 19

20 I begge tilfeller bør man ved identifikasjon ( IAT), se etter om det finnes: negative reaksjoner er det forskjeller i reaksjonsstyrke med de ulike cellene i panelet?? mellom panelcellene og egne?? Bruk av enzympanel eller PEG-IAT vil ofte forsterke rx. Autoantistoff kan vise spesifisitet, f. eks. auto-anti-e, men veldig ofte reagerer autoantistoffet med samtlige celler i panelet Når alt er positivt, og særlig med reaksjonstyrker , er det umulig å vite om alloantistoffer kan ligge skjult. Dette BØR utredes, men det KREVER TID!!!! Nr ID C w C c D E e K k Le a Le b M N S s Fy a Fy b P1 Lu a Lu b Kp a Kp b Xg a Jk a Jk b Co a Co b Nr IAT-gel +37 o C 1 FM RzR Bg a 4+ 2 JO r`r sv PGS R2R EFS R1R KHT R2R RA r`wr JS rr st RJ r r BV rr R1wR1 SAG Bga KS R1wR TB R2R sv Bg a PÅL rr st JR R1R Egne celler 4+ 20

21 Nr ID C w C c D E e K k Le a Le b M N S s Fy a Fy b P1 Lu a Lu b Kp a Kp b Xg a Jk a Jk b Co a Co b Nr IAT-gel +37 o C 1 FM RzR Bg a 1+ 2 JO r`r sv PGS R2R EFS R1R KHT R2R (+) 6 RA r`wr (+) 7 JS rr st (+) 8 RJ r r BV rr R1wR1 SAG Bga (+) (+) sv Bg a st (+) Egne celler KS R1wR2 12 TB R2R2 13 PÅL rr 14 JR R1R1 Ved utredning av autoantistoffer for å se etter evt. alloantistoffer, er det viktig å vite om pasienten er transfundert i løpet av de siste 3 måneder. Er pasienten ikke transfundert utfører man ofte en AUTOADSORBSJON (dvs. bruke EGNE celler) Er pasienten nylig transfundert bør man utføre en ALLOADSORBSJON (dvs. bruke ANDRE celler) 21

22 5a) Autoadsorbsjon: Prinsipp: La pasientens serum/plasma reagere med egne celler for å få vekk/trekke ut autoantistoffet Celler som er sensiblilisert (DAT pos.) må strippes først Kan gjøres med 20% klorokinfosfat eller med varme. Når antistoffene har løsnet fra cellene, kan cellene brukes til autoabsorbsjon. Cellene kan brukes ubehandlet eller enzymbehandlet (sistnevnte har ofte en enda bedre evne til å trekke ut antistoff) Ved noen metoder skjer stripping /autoadsorbsjon i ett : ZZAP/WARM PEG (Poly Ethylen Glykol) Fordelen med PEG er at det er en veldig rask metode, ulempen er at det foreligger en fortynningseffekt. Etter autoadsorbsjon, settes det adsorberte serum/plasma opp på panelet. 22

23 Cellepanel før og etter autoasorbsjon Nr C w C c D E e K k Le a Le b M N S s Fy a Fy b P1 Lu a Lu b Kp a Kp b Xg a Jk a Jk b Co a Co b Nr IAT-gel +37 o C 1 R zr 1 2 r`r 3 R 2R 2 4 R 1R 1 5 R 2R 2 6 r`wr 7 rr 8 r r 9 rr 10 R 1wR 1 11 R 1wR 2 12 R 2R 2 13 rr 14 R 1R 1 Egne celler sv st sv st Plasma IAT-gel IgG +37 o C PEG Adsorbat b) Alloadsorbsjon Benyttes hvis: pasienten er nylig transfundert vi ikke klarer å trekke ut autoantistoffet ved autoadsorbsjon vi har for lite celler til autoadsorbsjon 23

24 ID SNE IS TB DS R1R1 R1r R2R2 rr Panel til alloadsorbsjon av autoantistoff C w C c D E e K k Le (a) Le (b) M N S s Fy (a) Fy (b) P1 Lu (a) Lu (b) Kp (a) Kp (b) Xg Jk (a) (a) sv Jk (b) Co (a) Co (b) Cellepanel- differensialadsorbsjon Nr Rh fenotype Le a Le b M N S s Fy a Fy b P1 Jk a Jk b IAT IAT IAT A B C 1 R z R r'r R 2 R R 1 R R o r r'r rr r''r rr R 1 wr R 1 wr R 2 R sv rr R 1 R Egne celler Kun vist deler av panelet. IAT D 24

25 6) Eluering: Hvis man vil undersøke autoantistoffet nærmere for å forsøke å finne spesifisiteten, er det vanlig å utføre en eluering. Prinsipp: Ved eluering løsnes antistoffene fra cellene og løsningen med antistoff = ELUAT, settes opp til identifikasjon Ulike former for eluering kan benyttes, eluering med syre er vanlig (for eksempel Elukit) 7) Fortynning: Kan fortynne plasma/serum 1:3 eller 1:5 for å se om autoantistoffet blir borte. Men stor usikkerhet: hva med evt. alloantistoff? Brukes kun i nød situasjoner 25

26 8) Fenotyping Rh fenotyping (evt.mer i spesielle situasjoner, feks, K, Kidd) Påvises alloantistoff, må pasienten types for tilsvarende antigen Dersom pasientens ubehandlede celler benyttes: IAT teknikk kan IKKE benyttes fordi DAT er positiv Saltvannsagglutinerende sera er OK Dersom de strippete cellene benyttes: IAT teknikk kan benyttes, må bruke rent anti-igg som Coombs serum (komplement kan fremdeles sitte på cellene og gi falske positive reaksjoner) Vær obs på hvilken teknikk stripping har forgått med: ZZAP ødelegger Duffy, MNS og Kell ag. ************************************************************* Hvis pasienten er transfundert: Se etter partielle reaksjoner Er typing umulig, kan evt. molekylærbiologisk typing (PCR teknikk) benyttes 26

27 For de kalde autoantistoffene må man: Sette opp screening / panel varmt (strikt 37 o C) for å se om man da får negative reaksjoner. Er kuldeantistoffet sterkt nok, er det ikke sikkert dette lykkes (må ofte bruke glassteknikk). I tilfeller der screeningen ikke blir negativ ved 37 o C må man vurdere autoabsorbsjon for å kunne se etter evt. alloantistoff. Celler fra EDTA prøve som er tatt varmt og skilt umiddelbart, kan brukes til å adsorbere (må minimum vaskes varmt). Serumet som skal adsorberes med, kan med fordel være fra fullblodglass uten tilsetning. Hvis ikke panelet viser noen spesifisitet, må kuldescreening (hurtigkulde) og eventuell full kuldetitrering utføres. Kuldeantistoffene viser ofte spesifisitet mot høyfrekvente antigen, mest vanlig er anti-i. 27

28 Hvis pasienter M Å ha blod og det HASTER, har man ikke tid til alt dette. Da er hovedregel: Gi blod med samme Rh-fenotype som pasienten selv fenotype forlikelig. 9) Valg av blod til transfusjon: Autoantistoff av varmetypen, ingen alloantistoff påvist: 1) ABO/RhD typelikt (forlikelig) blod velges 2) Velg fortrinnsvis blod av samme Rh-fenotype/ Rh-fenotype forlikelig (da unngår man alloimmunisering mot Rh-ag), som oftest også K-neg 3) Hvis autoantistoffet viser spesifisitet, f.eks. auto-anti-e, gis ofte e-negativt blod. Særlig hvis pasienten er inne i en aktiv hemolyserende fase Unntak: Kvinner i /under fertil alder: Gir Rh-fenotypelikt/ Rh-fenotype forlikelig, for å unngå evt. alloimmunisering 28

29 6) Det må gis beskjed til rekvirent, at biologisk forlik må utføres. Beskjeden SKAL følge hver enhet. BIOLOGISK FORLIK: * Rask transfusjon av ml av blodet * Deretter redusert dråpetakt i de neste minutter * Observer pasienten og se etter tegn til tr.rx * Hvis ingen reaksjon kan transfusjon fortsette med normal dråpetakt * HUSK: pasienten skal observeres under hele transfusjonen 4) Forlik med egne celler skal alltid settes opp parallelt, slik at enheter som reagerer svakere eller likt som egne, kan velges Dersom autoadsorbsjon er utført, bør også det autoadsorberte serum/plasma benyttes til forlikene (parallelt med uadsorbert serum/plasma) (OBS: PEG adsorbat har ikke lang holdbarhet, 24 timer) 5) Det gjøres enkelt og utvidet forlik (Husk anti-igg i utv.forlik med PEG adsorbat) 29

30 Alloantistoffer påvist i tillegg til autoantistoffet ABO/RhD typelikt (forlikelig) blod velges Normalt velges Rh-fenotypelikt/ Rh fenotypeforlikelig blod, K-neg, som er negativt for det antigen alloantistoffet er rettet mot. Pas. kan ha både auto- og alloantistoff som viser spesifisitet, f. eks. auto-anti-e og allo-anti-e. Hva gjør man da??? Generell regel: 1) Unngå transfusjon 2) Unngå allo antistoff 3) Unngå auto antistoff MEN: Noen ganger må man bl.a se på styrken /titeret. Hvis autoantistoffet har et mye høyere titer enn alloantistoffet, vil man enkelte ganger velge blod der en tar hensyn til autoantistoffet. Videre følges punktene 4 6 som beskrevet over Autoantistoff av kuldetypen For de kalde antistoffene vil man først og fremst forholde seg til blod av samme: 1) ABO /RhD type 2) Noen velger samme Rh-fenotype/fenotypeforlikelig, som oftest K-neg 3) Er alloantistoff påvist, velges antigen negativt blod 4) Selv om spesifisitet er anti-i, gis ofte I + (pos) blod. 5) Det gjøres enkelt og utvidet forlik, utførelse ved 37 o C 6) Det må gis beskjed til rekvirent, at blodet må VARMES OPP til 37 grader før transfusjon (bruk av blodvarmer). Beskjeden SKAL følge hver enhet. 30