Rømming 1-2015 Sporing av rømt oppdrettslaks fanget i Ørstaelva høsten 2015 Wennevik, V., Quintela, M., Sørvik, A.G.E., Skaala, Ø., Glover, K.A. Havforskningsinstituttet, Postboks 1870, Nordnes, 5817 Bergen 2. november 2015. Innledning Denne rapporten beskriver genetiske og statistiske analyser av prøver fra rømt oppdrettslaks innsamlet fra Ørstaelva (vassdragsnummer 095.Z) i Møre og Romsdal i perioden 02.09-24.09.2015, samt analyse av prøver fra oppdrettslokaliteter i regionen. Rapporten gir en vurdering av muligheten for at den rømte laksen stammer fra disse anleggene, basert på DNA-analysene. Undersøkelsen ble initiert av Fiskeridirektoratet på bakgrunn av opplysninger om fangst av rømt laks i Ørstaelva. Materiale og metode Materiale Rømt oppdrettslaks: Prøver av rømt fisk ble samlet inn av lokale fiskere. Den rømte laksen var relativt homogen i størrelse (med enkelte unntak) og ble samlet inn i et begrenset tidsrom, noe som indikerer at individene kunne ha opphav i en større rømmingsepisode. Prøvene ble analysert av Havforskningsinstituttet i Bergen i oktober 2015. Totalt ble det fra ulike lokaliteter i Ørstaelva samlet inn prøver fra 88 laks som var antatt å være rømt oppdrettslaks basert på ytre kjennetegn (Figur 1 og Vedlegg 1). For alle innsamlede individ foreligger det registreringer av lengde og vekt (Vedlegg 1). Gjennomsnittsvekt for de rømte laksene var 2850 g, varierende fra 700 g til 6100 g. Skjellprøver ble også tatt av de fleste individene. Prøvene fikk samlenavn: RF, med individ nr: 1-15RF1 til 1-15RF88. Referanseprøvene (baseline) fra anleggene: Prøver av oppdrettslaks ble samlet inn av Fiskeridirektoratet fra de av anleggene i området som hadde fisk av tilsvarende størrelse som de rømte fiskene (Tabell 1). Det ble til sammen tatt 282 prøver av laks fra 6 merder på 3 anlegg, og alle disse prøvene ble gitt en entydig nummerering (Tabell 1). Hver av disse prøvene bestod av ca. 47 fisk. Disse prøvene refereres til som baselineprøvene og representerer mulige opphav til de rømte fiskene.
Figur 1 Kart som viser Ørstaelva, og plassering av oppdrettsanlegg hvor det er tatt prøver til analyse Genotyping (analyse av DNA-markører) DNA analyser ble utført i Molekylærbiologisk laboratorium ved Havforskningsinstituttet i Bergen i tidsrommet 19.10.15 3-23.10.15. DNA ble isolert fra skjellprøver eller fettfinner med Qiagen DNeasy isoleringskit, og 17 DNA markører ble analysert for alle individ. Analysene ble utført i henhold til protokollen for sporing av rømt oppdrettslaks ved Havforskningsinstituttet (Glover et al., 2008). Etter DNA-ekstraksjon og analyse av genetiske markører, ble prøver med dårlige/svake resultater kjørt om igjen opptil 3 ganger slik at brukbare data kunne hentes ut av flest mulig prøver. Etter omkjøringer ble alle prøver med akseptable resultater for mindre enn 11 av de 17 markørene forkastet før videre analyse. Noen få prøver ble også forkastet fordi de var forurenset, dvs. det var spor i prøven av DNA fra mer enn ett individ. Analyser viste også at enkelte av de rømte fiskene (RF) var representert med mer enn én prøve. Totalt ble 20 av de 88 rømte fiskene utelukket fra datasettet av ulike årsaker (forurenset prøve, duplisert prøve, dårlig DNA kvalitet, tom skjellkonvolutt) før videre analyser (Vedlegg 1). En rekke statistiske analyser ble gjennomført på datasettet. Disse analysene er forklart i resultatkapittelet. Disse testene kan ikke utelukke at noen eller alle de undersøkte rømlingene i området teoretisk sett kan ha opphav i ett eller flere anlegg utenfor det
undersøkte området, eller i de merdene som det ikke ble tatt prøver fra i forbindelse med denne episoden, og som derfor ikke inngår i baseline-materialet. Resultater og diskusjon Genetisk differensiering mellom prøvene (både baselineprøver og RF) Genetisk forskjell mellom individer, og mellom samleprøver av individ, kan undersøkes ved hjelp av flere ulike statistiske teknikker. Et mye benyttet mål på genetisk differensiering mellom samleprøver av individ (for eksempel mellom populasjoner, eller mellom grupper) er FST. FST er et mål for genetisk distanse, jo høyere verdi, jo større distanse og jo større genetisk forskjell mellom prøvene. I dette prøvematerialet var forskjellene mellom merder innenfor anlegg generelt små. De største forskjellene fant vi mellom prøvene fra anlegg 3 (3A og 3 B) og prøvene fra anlegg 1 (1A) og anlegg 2 (2A, 2B og 2C) (Tabell 2). Dette korresponderer godt med at det er oppgitt at fisken i anlegg 1 og 2 er av Mowi-stamme, men fisken i anlegg 3 er av Aquagen-stamme (Tabell 1). Det er likevel en genetisk forskjell mellom fisken i 1A og 2A-2C selv om alle stammer fra samme genetisk linje (Tabell 2). De minste forskjellene ble observert mellom de to prøvene fra anlegg 3, og mellom prøvene fra anlegg 2 (2A-C). Forskjellen mellom den samlede prøven av rømt fisk (RF) og prøven fra anlegg 1 (1A) var den laveste av alle observerte verdier i denne analysen, og også lavere enn verdiene mellom ulike prøver fra merder innen anlegg 2 og 3 (men marginalt lavere enn verdien observert for 3A vs 3B). Analysen av genetisk diversitet i prøvene (Tabell 3) viste at antall alleler (varianter i de genetiske markørene) var noe lavere i anlegg 1 og 2 sammenliknet med anlegg 3. Den genetiske diversiteten i den samlede prøven av rømt fisk var høyere enn i noen av prøvene fra anleggene. Dette indikerer at prøven av rømt fisk kan være sammensatt av individer fra flere rømmingsepisoder. Et strukturdiagram (Figur 2) viser genetisk likhet mellom prøvene basert på individuelle data (i motsetning til gjennomsnitt mellom prøvene som er illustrert ved FST). Hver genetisk gruppe blir angitt med en farge, og tar høyde for at en samlet prøve evt. kan bestå av fisk av forskjellige opphav (både genetisk blanding dvs. krysninger mellom grupper og fysisk blanding).
Figur 2 Strukturdiagram som viser hvordan laks fra anlegg, og rømt laks, fordeler seg i tre ulike genetiske grupper. Resultatene fra strukturanalysen støtter i hovedtrekk resultatene fra FST estimatene som er beskrevet over, men gir samtidig mer detaljert informasjon. Prøvene fra anleggene deler seg i tre grupper og i Figur 2 er disse markert med fargene blått, gult og rødt, som representerer tre ulike genetiske grupperinger. Hvert av de tre anleggene framstår som dominert av en av de tre fargene. Vi ser også at ulike prøver fra samme anlegg har samme farge. Gruppen av rømt fisk framkommer i denne analysen som en blanding av flere farger, men er imidlertid sterkt dominert av blått, med enkelte gule individer og noen få røde. Dette er en klar indikasjon på at hovedmengden av den rømte fisken er av samme genetiske gruppe som fisken i anlegg 1, selv om enkelte individer ser ut til å ha en annen genetisk bakgrunn. Simulering av genetisk tilordning (assignment) mellom prøvene Muligheten for å kunne bruke genetiske metoder for å identifisere opphavet til rømt fisk øker med den genetiske forskjellen mellom baselineprøvene. Genetisk tilordning ble simulert mellom de ulike baselineprøvene fra oppdrettsanleggene, for å teste om det var tilstrekkelig genetisk forskjell mellom baselineprøvene til å kunne identifisere de rømte fiskene. Graden av genetisk differensiering mellom baseline-prøvene (målt som FST verdi) og potensialet for genetisk tilordning er tett koblet. I gjennomsnitt var graden av selv-tilordning (self-assignment) mellom baselineprøvene 67,4%. Dette betyr at 190 av 280 individer fra disse 6 baseline prøvene ville blitt riktig identifisert tilbake sin opprinnelige kilde (merd) ved bruk av genetisk informasjon. Dette er for upresist til å bestemme opphavet til rømt fisk basert på denne typen analyse alene. Men, dataene viser imidlertid at feil-tilordning i hovedsak forekom mellom prøvene gruppevis, og innenfor prøvene fra det samme
anlegg. Dersom vi ser på tilordning til anlegg oppnådde vi korrekt resultat for 99.6% av fisken. Dette er fordi det er store genetiske forskjeller mellom anleggene (Figur 2 og Tabell 2), og disse forskjellene er store nok til å differensiere rømt fisk fra disse anleggene. Identifisering av den rømte fisken Strukturanalyse er også en form for genetisk tilordning. Strukturanalysene klassifiserer de rømte individene i forhold til et antall valgte kategorier, med en angitt andel av genomet tilhørende hver av kategoriene (Vedlegg 1). I dette tilfellet er det definert tre kategorier. For de fleste fiskene vil en av de tre kategoriene være dominerende, mens enkelte individ framstår som en blanding mellom ulike kategorier. I Figur 2 vil slike individ være karakterisert ved at søylen som representerer individet består av flere farger. Videre identifisering av opphavet til den rømte fisken ble gjennomført ved to metoder. 1) Direkte tilordning til baselineprøvene, og 2) Ekskludering fra baselineprøver på signifikansnivå 0,01 og 0,05. Direkte tilordning plasserer et individ i den baselineprøven som er genetisk mest lik (uansett absolutt grad av likhet). Figur 3 Direkte tilordning av rømte individer til anlegg (blå søyler), antall fisk som ikke kan ekskluderes fra det anlegget ved sannsynlighetsnivå 0.05 (røde søyler) og sannsynlighetsnivå 0.01 (grønne søyler). Direkte tilordning tar ikke med i betraktningen at ikke alle kilder som teoretisk sett kan ha gitt opphav til rømlingene er representert i datamaterialet, dvs. alle individer tilordnes en av baselineprøvene som er representert i datamaterialet selv om de kan ha sitt opphav i en rømming som har skjedd langt unna. Følgelig er det viktig å få et mål for genetisk likhet mellom den rømte fisken og baselineprøvene. Dette oppnår man
ved Eksklusjons basert simulering kalkulert for ulike grader av sannsynlighet. Denne metoden ekskluderer hvert individ i tur og orden fra hver av baselineprøvene ut fra sannsynligheten for at et gitt individ tilhører baselineprøven. Som det framgår av Figur 3, ble den rømte fisken i hovedsak tilordnet anlegg 1 (dvs 48 av de 68 rømte individene). Det var også dette anlegget hvor vi fant høyest antall individer som ikke kan ekskluderes. Noen individer ble også tilordnet anlegg to, som også hadde fisk av Mowistamme, mens svært få individ ble tilordnet anlegg 3. Alle grunnlagsdata for tilordning finnes i Vedlegg 1. Analysen i programmet Structure (Figur 2, Vedlegg 1) tilordner også individene til genetiske grupper, som i dette tilfellet samsvarer godt med de tre ulike anleggene. De statistiske metodene og prinsippene bak tilordning i GeneClass og Structure er forskjellige. I Figur 4 har vi sammenstilt tilordningsresultatene fra de to metodene, med tilordning til anlegg. Som det framgår av figuren er det godt samsvar mellom resultatene fra de to metodene: de fleste rømte individene tilordnes anlegg 1, og det er også indikert at relativt få individer stammer fra anlegg som ikke er representert i analysen. Individer som i strukturanalysen har en tilhørighet på mindre enn 0,75 til noen av anleggene (verdien kan variere mellom 0 og 1) er her definert som til å være av ukjent opphav ( unknown ). Tilsvarende er direkte tilordning og individer som ikke kan utelukkes ved signifikansnivå 0,05 benyttet for å beregne antall individer i de ulike kategoriene utfra Genclass-analysen. Figur 4 Direkte* tilordning av individer til de tre anleggene med to ulike metoder, og individer klassifisert til å være av ukjent opphav. Det er godt samsvar mellom metodene. *= Det er viktig å merke seg at resultatene for Geneclass i denne figuren samsvarer ikke med eksklusjon på P=0,05 i Figur 3 fordi i denne figuren er det også tatt høyde for direkte tilordning.
Konklusjoner En kombinasjon av DNA analyser og statistiske metoder demonstrerer stor grad av genetisk likhet mellom 48 (71%) av de rømte fiskene og fisken i anlegg 1. De rømte fiskene ble fanget i begrenset tid og rom, var relativt like i størrelse og relativt homogene genetisk. Selv om en del individer var avvikende og nok har sitt opphav i andre kilder (se punktene under), konkluderes det med at merd 1A er det mest sannsynlige opphavet til de fleste rømte fiskene som er analysert her. Det har likevel skjedd en mindre tilleggsrømming fra minst en annen kilde. 48 av 68 analyserte rømt fisk ble direkte tilordnet prøve 1A (Figur 3). Samtidig kunne ikke 47 av disse fiskene utelukkes fra dette anlegget ved signifikansnivå 0,05. Dette gir et tydelig signal på at 1A er den mest sannsynelige kilden til disse fiskene, og er kilden til de fleste rømlingene i denne saken. Av de 20 rømlingene som ikke ble tilordnet 1A, var de fleste (16) tilordnet anlegg 2 (antallet reduseres til 14 ved signifikans 0,05). Dette indikerer en tilleggsrømming fra dette anlegget, evt. et annet anlegg med fisk fra samme stamme (Mowi). Kun 3 av de rømte fiskene ble direkte tilordnet anlegg 3 ved signifikans 0,05 (Figur 4). Dette anlegget har fisk av Aquagen- stamme som er genetisk svært ulik Mowi-stammen. Anlegg 3 kan dermed utelukkes som kilde til nesten samtlige av de rømte fiskene med høy sannsynelighet.
Tabell 1. Oversikt over prøvene samlet inn fra anlegg i området i forbindelse med rømmingsepisode 1 2015. Hver prøve består av ca. 47 fisk fra 1 3 merder HI Nummer Prøve Selskap Lokalitet Merd Innsamlet Vekt Smoltleverandør 1 151A 1A Marine Harvest Dato utsatt/levert brønnbåt Rogninnlegg dato Genetisk linje Rognlevarndør Voldnes 13246 3 08.10.2015 4 MHN Ytre Stadal 04.09.2014 MHN Tveitevåg 24.04.2013 Mowi 1 152A 2A Marine Harvest Sandvika 2 08.10.2015 3.3 MHN Dalsfjorden 07.09.2014 MHN Tveitevåg 28.01.2014 Mowi 1 152B 2B Marine Harvest Sandvika 6 08.10.2015 2.8 MHN Rovde 17.09.2014 MHN Tveitevåg 14.11.2014 Mowi 1 152C 2C Marine Harvest Sandvika 7 08.10.2015 2.5 MHN Dalsfjorden 04.11.2014 MHN Tveitevåg 28.01.2014 Mowi 1 153A 3A Aqua Farms Vartdal AS Bjørndal 12308 11 12.10.2015 4.5 Vartdal Fiskeoppdrett 15.05.2014 Aquagen 09.11.2012 Aquagen 1 153B 3B Aqua Farms Vartdal AS Bjørndal 12308 9 12.10.2015 4.6 Vartdal Fiskeoppdrett 15.05.2014 Aquagen 09.11.2012 Aquagen Tabell 2. Genetisk relasjon mellom prøvene. Parvise F ST verdier under diagonalen og P verdier over diagonalen. P verdi <0.05 betyr at prøvene er statistisk signifikant forskjellige til hverandre. 1A 2A 2B 2C 3A 3B RF 1A ***** 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0317 2A 0.0581 ***** 0.0063 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 2B 0.0562 0.0061 ***** 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 2C 0.0587 0.0214 0.0257 ***** 0.0000 0.0000 0.0000 3A 0.0913 0.0993 0.1019 0.0946 ***** 0.0363 0.0000 3B 0.1036 0.1122 0.1198 0.1072 0.0036 ***** 0.0000 RF 0.0035 0.0406 0.0390 0.0417 0.0706 0.0838 *****
Tabell 3. Oppsummeringsstatistikk for baselineprøvene og for de rømte fiskene (RF). Prøve Antall individer Alleler AR Ho Avvik HWE (0.05) Avvik LD (0.05) 1A 47 124 7.29 0.720 ± 0.042 1 25 2A 47 117 6.88 0.745 ± 0.048 1 9 2B 47 119 7.00 0.718 ± 0.047 1 15 2C 47 118 6.93 0.736 ± 0.039 3 24 3A 47 153 8.98 0.780 ± 0.037 1 24 3B 47 144 8.45 0.797 ± 0.036 1 26 RF 68 167 9.14 0.712 ± 0.041 2 19 Vedlegg 1. Dokumenter fra Fiskeridirektoratet: Se vedlagt elektronisk fil.