Eksamen i emnet KJ 2053; KROMATOGRAFI

Kandidat-nr.:... NRGES TEKNISK- NATURVITENSKAPELIGE UNIVERSITET INSTITUTT FR KJEMI Studieprogr.:... (frivillig) Faglig kontakt under eksamen: Institutt for kjemi; F.-Aman. Rudolf Schmid Tel. 735 96203, (evt. M.: 913 75 546) MED LØSNINGSFRSLAG Eksamen i emnet KJ 2053; KRMATGRAFI Mandag 30. mai 2011, kl. 9.00 13.00 (4 timer) Bokmål Med noen mindre rettelser/forbedringsforslag i etterkant (i rød farge) Skriftlig svar på oppgavene 1 7 skal gis på oppgavearkene bak som skal innleveres (med ekstra ark om nødvendig) Hjelpemidler: D Ingen trykte eller håndskrevne hjelpemidler tillatt. Bestemt (godkjent) enkel kalkulator tillatt. Dette oppgavesett består av tolv tretten - 13 - sider : 1 forside (s. 1), 11 sider med 7 oppgaver (s. 2-12) og 1 side med vedlegg (s.13): tabell med 10-er logaritmer. Vektingen av hver (del-)oppgave er oppgitt. Maks. poengtall er 104. Karakterskalaen (100%) tar utgangspunkt i 100 poeng... Rudolf Schmid Eksamensansvarlig faglærer ppgavesettet er kontrollert : Ragnhild B. Strand Sensor Sensurdato : Fredag, 20.06.2011

Side 2 av 14 ppgave 1-7 Besvares på oppgavearket og innleveres ppgave 1. (13 p.) a.) Skriv ned formelen til den forenklede "van Deemter-ligningen", (1+10 p.) h = A + B/u + C u = A + B/u + C MF u + C smf u + C SF u (= H E + H L + H MF + HC smf + H SF ) el. evt. h = B/u + ( 1/A + 1/(C u) ) -1 og benevn og forklar kort leddene i ligningen. (i) A = Eddy Diff. =c A d p d p =Partikkeldiameter (ii) B/u = bidrag fra Longitudinal diffusjon = c B D x,mf D x,mf = Diff konst av analytt X I MF (iii) C = massetransfer-termen (= C t mt(sf-mf-sf ) eller oppdelt : C MF = bidrag fra massetransfer i mobil fase = c MF d 2 p / D MF (iv) C smf = bidrag fra massetransfer i stillestående mobil fase = c smf d p 2 / D MF (v) C SF = bidrag fra massetransfer i stasjonær fase = c SF d 2 p / D SF = Diff.-konst. av analytt X I SF D x,mf 1.b.) (2p) Illustrer v.h.a. en skisse av "van Deemter-kurven" ( bruk som eksempel gasskromatografi. og / eller kombin. med vandeemter-kurve for GC

Side 3 av 14 ppgave 2. (17 p) Innen kromatografisk teori bruker man bl.a. begrepene/forkortelsene: R, α, t R, R S, og N. 2a) Hva kalles hver av disse begrepene/forkortelsene; forklar kort hva de uttrykker (inkluder formler der det er aktuelt). (10p) R = Retarderingsfaktor (rel. elueringshastighet i f.t. MF-hastighet; andel analytt i MF av totalmengden analytt) = u(x) / u(mf) = c(x) MF / (c(x) SF + c(x) MF ) = c(x) MF / c(x) Total ( = t MF / t R,X = V M / V R,X = V M / (V M + KV S ) = 1 / (1+k) or = L X / L MF ) α = α = separasjonsfaktor (selektivitetsfaktor) α = k 2 / k 1 = t R,2 ' / t R,1 ' = K 2 /K 1 t R = t R = retensjonstiden t R = tiden frå appliseringstidspunkt til eluering av maks.-konsentrasjon (toppmaksimum) for en analytt. (forutsatt konst ell. reproduserbare forhold). ) (= t 0 k = t MF k ) R s = R s = (kromatografisk) oppløsning, R s = (t R,2 t R,1 ) / ½(w b,1 + w b,2 ) = Δt R,1,2 / ½(w b,1 + w b,2 ) (Ikke full uttelling for = 1/4 N 1/2 1/2 ( k/1+k) (α-1/α) el. = 1/4 N eff (α-1/α), o.l.) separ.-evne for 2 spesif. topper stort tall - god separasjon (basislinjesep. = 1,5) N = N = Platetall, (Antall teoretiske plater) N = 16(t R / w b ) 2 = 5,545(t R / w h ) 2 = (t R / ) 2 Beskriver effektivitet til kro.-system: stor tall - stor eff. (smale topper, lite spredning) 2b) Hvilke av begrepene over (2.a)) (2p) (i). er avhengig av stoffet (analytten) som kromatograferes? R, α og t R og Rs varierer med analytten. (ii). kan økes for å gi en økning av R S? (1p) jfr. R S = 1/4 N 1/2 ( k/1+k) (α-1/α) el. øk α, k og/el. N. 2.c) Skriv ut fult navn på følgende (engelske) forkortelser (svar på 4 av 7) : (4p) AFID, ESI-MS, FWHM, IEF, PLT, SPME, WCT (i) (ii) (iii) (iv) AFID = Alkali-FID, SI-MS = ElektroSpray-Ioniserings-MS; FWHM = Full Width at Half Maximum, IEF = IsoElektrisk Fokusering, PLT = Porous Layer pen Tubular (column), SPME = Solid Phase Micro-Extraction, WCT = Wall Coated pen Tubular (column).

Side 4 av 14 2.d) Kromatogrammet under i Situasjon 1 ble oppnådd ved normal fase (NP) LSC med en mobil fase med ε 0 1 = 0,25 (eluent(1)). (1+2p) En tommelfinger-regel sier at en økning i løsningsmiddelstyrken, ε 0, på med ca.0,05, gir en reduksjon av retensjonsfaktoren, k; med en faktor på ca. 3,5 gjør retensjonsfaktoren, k, ca. 3,5 ganger mindre. (i) Beregn en ny retensjonstid, t R(2), for en ny eluent(2) med ε 0 2 = 0,30 (Situasjon 2). Vis utregningen. Tegn inn det (hypotetiske) kromatogrammet for Situasjon 2 i figuren ovenfor: k(1) = t R(1) t 0 / t 0 = 4,5 1,5 / 1,5 = 2,0 Økning av ε 0, med 0.05 tilsier en forkortning av k (og dermed t R ) med faktor 3,5 k(2) = k(1) / 3,5 = 0,571 t R = (1+k) t 0 : t tr(2) = (1 + 0,571) * 1,5 = 2,36 min. (t R = k t 0 : t tr(2) = 0,571 * 1,5 = 0,86 min ) (N.B: Fordi k = prop. t regningen kunne også gjøres med t istedenfor k ) for mini-toppen : t R, m = 5,5 min : k R1, m =2,667 ; k R(2)m = 2,667 / 3,5 = 0,762 t R2, m = k R(2)m t 0 = 0,762 * 1,5 min = 1,143 min; t R2, m = 2,643 min (ii) Hva er sammenhengen mellom retensjonsfaktoren, k, og R f -verdien brukt for å uttrykke retensjon ved TLC? Beregn R f -verdiene, R f (1) og R f (2), for eluering på TLC ved bruk av hhv. eluent(1) og eluent(2). Skisser de to situasjonene (1) og (2) på en TLC plate (nedenfor; viktig med flekken av hovedtoppen, mindre nøye med den lille). R er det teoretiske analog til den empiriske R F verdien. R R F R = 1 / (1+k) R F R F (1) = 1 / (1 + k(1) = 1 / (1 + 2) = 0,333 (in cm = 0,333 x 6,6 cm = 2,26 cm) R F (2) = 1 / (1 + k(2) = 1 / (1 + 0,571) = 0,637 (in cm = 0,637 x 6,6 cm = 4,33 cm) R F (1)m = 1 / (1 + k(1,m) = 1 / (1+ 2,667) = 0,273 R F (2)m = 1 / (1 + k(2,m) = 1 / (1+ 0.762) = 0,568

Side 5 av 14 R f (1) = R f (2) = ppgave 3. (8 p) 3.a) Navngi og beskriv kort hovedkomponentene til en ionebytter (generelt). (2p) Matriksen (funksjonalisert materiale som ioner eller inogene grupper/funksjonelle grupper er bundet til, (for kro.: ikke-løselig, partikkelformet) Faste ioner (/ funksjonelle grupper): med ladning, kovalent bundne til matriksen Motioner : ioner av motsatt ladning som kompenserer ladningene til de faste ionene, elektrostatisk bundet, eller oppløst og flyttbar i elektrolytt, innenfor ionebytteren. Evt. elektrolytt : ion-solvatiserende løsningsmiddel med oppløste ioner/salt Alternativt: opplisting av ulike ionebyttertyper med aktuelle faste ioner: teller bare maks. 1 poeng ved alle fire typer (50%)). 3.b) (2p) 3.c) (4p) For enkle uorganiske kationer finnes noen enkle generelle regler for selektivitet (retensjonsstyrke) ved kationbytterkromatografi. Hvilke? Ladning: Økt ladning, gir økt retensjon Størrelse: jo større ionradius (av det nakne ion) desto sterkere retensjon = svakere solvatisering (svakere ved større ionradius) desto sterkere retensjon) (Gjelder for atomare kationer, mindre opplagt for komplekse kationer) Hvilke forandringer av eluenten kan gjøres for å øke elueringsstyrken ved ionebytterkromatografi? Beskriv kort mekanismen og spesifiser om effekten er generell eller spesifikk for ionebyttertype eller analytt-type. Generelt: Øke konsentrasjonen av MF-elektrolytten (øke ionestyrken) Øke selektivitetskonstanten av MF-elektrolyttens konkurrerende motion. (= Øke elektrolyttionenes affinitet til ioenbytteren) spesielt: Tilsette ligander som kan kompleksere med analyttionene på en måte som øker retensjon (el.omvendt ; dersom den svekker retensjon, redusere dens kons.). Deriblant : justere ph i MF på en måte som øker andelen av den ioniske formen når analytten foreligger i et syre/base-likevekt. (øke ph for sure analytter på anionbytter, minske ph ved basiske analytter på kationbytter) (veldig spesielt : for svake ionebyttere når ph er i nøytraliseringsområde, endre ph til mer ionisering) (veldig spesielt : øke temperaturen (i noen grad)).

Side 6 av 14 ppgave 4. (12p) 4a) (i) Beskriv kort nødvendige materialer, og fremgangsmåten din, for å gjennomføre flash-kromatografi på silikagel. (2p) Adsorpsjonsmiddel med noe mindre patikkelstørrelse enn klassisk (ca. 40+ um) glass-kro.-kolonne som kan pålegges, og tåler, noe gass-overtrykk (evt. eksplosjonssikret) Gasskilde for overtrykk av inert gass (N 2, luft), med trykk/flow-regulering, leidning, sliptilkobling til kolonna. Rest som vanlig. 4.a) (ii) Hvordan skiller flash-kromatografi seg fra vanlig åpen-kolonne søylekromatografi? (2p) Mindre partikler, (gir flere plater, lavere platehøyde), mer mottrykk Gass-påtrykk for å øke elueringshastighet til (lik eller) helst mer enn gravitasjonsdrevet LPLC. 4.b) Aktivitet av stasjonærfasen er viktig innen adsorpsjonskromatografi. (i) Hvilket fenomen beskriver begrepet aktivitet, og hva er årsakene og konsekvensene når en stasjonære faser har ulik aktivitet ved adsorpsjons-kromatografi. (2+2+4p) Styrken adsorpsjonmiddelet adsorberer med, f.eks. analyttmolekyler. Variasjon av aktivitet ved avsvekking av adsorpsjonsstyrken til adsorbenten gjennom forhånds-adsorberte ) polare (moderator-)molekyler / typisk vann) i et delvis, monoeller polymolekylært lag. Ulik aktivtet oppstår når ulike mengder moderator er tilstede (Jfr. Brockmann-skala) Høyest aktivitet: (nesten) ikke moderator, sterkest adsorpsjon og sterkest retensjon Lavere aktiviteter ved økende mengde moderator tilstede og tilsv. avtagende adsorpsjonsstyrke / retensjon, ved at de kraftigste adsorbsjonssetene er opptatt med moderatormolekylene ( helt eller delvis ). Styrken på retensjonen ved LSC kan uttrykkes ved formelen: (ii) Hvilke(n) faktor(er) i likningen beskriver/kvantifiserer SF-aktivitet. Hvilke andre paramtere i liningen (gi symbol og navn på parmeter) har (evt.) aktiviteten innflytelse på. Ledd to : primært α=alfa som er selve parameteren som beskriver aktiviteten. Men alfa innviker på (ganges med) analyttens ads-enegi, S 0, elueringsstyrken, ε 0, og løsningsmiddelmolekylens ads.-areal A s. (g til slutt - direkte effekt, selvfølgelig, på K )

Side 7 av 14 (iii) angi hvilken parameter i ligningen ovenfor som beskriver den effekten i hhv. i) v) (4p) Effekt (dersom alle andre forhold er uendret). Svar ja/nei i) Vil mer polare stoffer elueres før mindre polare stoffer? nei S 0 ii) Vil små molekyler elueres ut før større? (for vanskelig) nei/ja A s iii) Vil endring til mer polart løsningsmiddel øke retensjon? nei ε 0 iv) Reduseres retensjonen når stasjonærfasens spesifikke overflateareal (m 2 pr. g) reduseres? ja Hvilken parameter V a ppgave 5. (19p) 5a) Nikotin (s.n.) er en organisk base og kan analyseres ved ulike kromatografiske teknikker (7p) og prinsipper. Anta den skal analyseres i tobakkvarer. (i) Vurder mulighetene for retensjon/separasjon for nikotin for følgende kromatografiske teknikker (kommenter kort) og (ii) Foreslå aktuelle detektorer (ikke spektroskopiske) for nikotin for de ulike metodene som er aktuelle. Teknikk (i) Mulig ja/nei/kanskje (ii) Mulig(e) detektor GLC ja FID AFID (=NPD) (MS) GSC nei s.o. (kanskje) RP-HPLC ja UV (MS) Kommentar (i) og (ii) jfr. labforsøk trolig for lite flyktig polare, basiske aminogrupper (kanskje på rel. svake adsorbenter (org. polymerer) (evt. Fl-D, men trenger da derivatisering) NP-HPLC kanskje s.o. polare, basiske aminogrupper gir vanskelig utgangspunkt (ikke-lin. isotermer m. tailing-fare) IEC ja kanskje s.o. protonert som kation / dikation SEC nei (kanskje) s.o. neppe stor nok separasjonsevne for separasjon i en biologisk prøve CZE ja UV (MS) protonert som kation / dikation (CZE) eller med MEKC (analog RP-LC)

Side 8 av 14 5.b) Vurder n-tetradekan som en intern standard for en nikotin-kvantifisering i snus-prøver. (3+3p) Nikotin (kp.: ca. 250 ºC) n-tetradekan (kp.: 252ºC) Vurder om det er et velegnet stoff som intern standard for nikotin for teknikkene nedenfor (Argumentér for og imot, og ta hensyn til mulige aktuelle eksperimentelle betingelser.): (i) GLC Bra flyktighet, lignende retensjonstider kan forventes. Stor forskjell i kjemiske egenskaper: helt upolar tetradekan (n-c14) mot ganske polar organisk base nikotin. De to opplever analysen kjemisk sett nokså forskjellig, og er derfor dårlige referanser for hverandre. n-c14 ok med FID (men uegnet for evt. N-selektiv AFID/NPD (± ingen respons for n-c14)) Trolig lite n-c14 i prøven (snus) fra før, n-c14 lett tilgjengelig i ren form (ii) Vurder for RP-HLPC HPLC. Rel. stor forskjell i polaritet gir stor forskjell i forventet retensjonstid ugunstig. Stor forskjell i kjemiske egenskaper gjør analysen i (og utenom) kolonna kjemisk sett nokså forskjellig, og er derfor dårlige referanser for hverandre. (iii) Problem med deteksjonsmetoden UV-synlig- (og Fluor.) det. fungerer ikke for n- C14, (RI-det. lite følsom), kanskje MS (men vanskelig for ioniseringsmetode som fungerer for godt for begge samtidig). Trolig lite n-c14 i prøven (snus) fra før, n-c14 lett tilgjengelig i ren form 5.c) Fra en isotermisk GC-analyse av nikotin koinjisert med standardstoffene n-pentadekan og n-heksadekan har vi fått følgende (hypotetiske) data: (2+2+2p) nikotin n-pentadekan n-heksadekan metan (t 0 ) t R [min] 15 13 19 2 w h [min] 0,8 0,62 0,85 -- (i) Regn ut retensjonsindeksen,i, til nikotin fra denne (hypotetiske) analysen. (Vis utregningen/fremgangmåten). I(n) = 15 x 100 + 100 x ((log t R n log t R C15) / (log t R C16 log t R C15)) = 1500 + 100 x ((log (15-2) log (13-2) / (log (19-2) log (13-2))) = 1500 + 100 x ((1,114-1,041)/(1,23 1,041) = 1500 + 100 x (0,073 / 0,189) I(n) = 1500 + 100 x 0,386 = 1538,6 ( = 1540 )

Side 9 av 14 (5.c)) (ii) Regn ut effektiv plattetall, N eff, for nikotin, n-pentadekan og n-heksadekan; kommenter resultatet. (Vis utregningen/fremgangmåten). N eff = 5,545 ( (t R t 0 ) / w h ) 2 =5,545 (t R / w h ) 2 t 0 t R (metan) Nikotin. 5,545 ((15-2)/0,8) 2 = 1465 C15 5,545 ((13-2)/0,62) 2 = 1745 C16 5,545 ((19-2)/0,85) 2 = 2220 Vanligvis økende N med økende t R, noe som ikke stemmer for nikotin kan tyde på at den noe polare og basiske nikotinen har noe asymmetri (trolig tailing). TUNGVINDT ALTERNATIV via N : Neff= N (k/k+1) 2 nikotin C15 C16 N = 1950 2440 2770 k = 6,5 5,5 8,5 neff= 1465 1745 2200 (iii) Bestem separasjonstallet (TZ, el. SN) for kolonnen fra analysedataene ovenfor. (Vis utregningen/fremgangmåten). Korrekt formel : TZ = ((t R (n+1) t R n/ ( w h (n+1) + w h n )) - 1 = ((19-13)/(0,85 + 0,62)) - 1 = (6 / 1,47) - 1 TZ = 4,1-1 = 3,1 n = Antall karbon i n-c n H 2n+2 n+1 = Antall karbon i n-c n+1 H 2n+4 Lærebokens feil formel: gis litt trekk (ca. 0,5?) - ikke helt feil TZ = 1 + ((t R (n+1) t R n/ ( w h (n+1) + w h n )) = ((19-13)/(0,85 + 0,62)) + 1 = (6 / 1,47) + 1 TZ = 4,1 + 1 = 5,1

Side 10 av 14 ppgave 6. (11p + 2p bonus) 6.a) (i) Hva er den mest benyttede stasjonærfasen ved omvendt fase (RP) HPLC, (2+2+1p) angi spesifikt navn og delstruktur. (2p) ktadekyl-silika (monomer ( brush )) H 3 C n-c H 18 37 Si Si CH 3 H Si H 3 C CH 3 Si Si CH 3 Si H Si CH 3 Si n-c 18 H 37 CH 3 Si H (Med én end-capped-gruppe (TMS) i midten (ikke nødvendig for å få 2 p)) (ii) Hva er den mest benyttede stasjonærfasen ved gass-væske-kromatografi, GLC, angi navn og delstruktur. f.eks. H CH 3 C 3 Si Si n Si CH 3 H 3 C CH 3 H 3 C CH CH 3 3 Eksempelet er en metyl-silikon : PDMS = PolyDiMetylSiloksan (også PolyDiMetyl- Silikon ) (alternative produkt-navn : V-1, V-101, SE-30, SP-2100, CP-Sil 5, m.fl.! ). (iii) Hva er forskjellene mellom kromatografiteknikkene gelpermeasjon og gelfiltrering? De er begge SEC-metoder, men Gelfiltrering (GelC) bruker vandige faser med polare geler og som regel polare analytter (ofte biologiske makrokolekyler) (definisjonen ofte også begrenset til lav effektivitet/oppløsning), mens gelpermeasjon (GPC) bruker rel. upolare faser og upolare matriser for rel. upolare analytter (typisk syntetiske polymerer)(brukes ved både lav og høy effektivitet). (iv) Hva gjorde Mikhail Semenovich Tsvett i 1905 (svar kort)? (2p bonus) Publiserte den første publikasjonen i kromatografi. (Separasjon av plantepigmenter med (normalfase) kolonnekromatografi (SF=kalsiumkarbonat, MF=Petroleumseter).) (Ga teknikken navnet Kromatografi ("fargetegning"))

Side 11 av 14 6.b) Svar enten: Hva er hensikten med Snyders selektivitetstrekant for løsningsmidler, (3p) og hva er dens betydning for væskekromatografi? eller: Hva har kromatofokusering (IEC-metode) og isoelektrisk fokusering (elektroforese-metode) felles som separasjonsmetoder? Snyders selektivitetstrekant for løsningsmidler Løsningsmidler brukt i (HP)LC (RP, NP) kan foruten etter generell polaritet karakteriseres etter hvilken natur denne polariteten har. Snyder klassifierte etter 3 molekylære egenskaper/krefter: å være protondonor, protonakseptor eller å kunne inngå dipol-interaksjoner. andel av disse til samlet polaritet av løsningsmidddelet kan tegnes i trekant-graf: ofte kalt Snyders selektivitetstrekant. Til å variere selektivitet ønskes lsm. (3 stk.) med størst mulig ulik sel. d.v.s. størst avstand i trekanten. Ulike blandinger av disse gir da ulik selektivitet, justerbar innenfor den nye indre sel.-trekanten. (Vann- (RP) eller alkan- tilsats (NP) kan så brukes til å regulere elueringsstyrken av blandingen til passe k. Kromatofokusering (IEC-metode) og isoelektrisk fokusering (elektroforese-metode) felles? Begge anvendes på separasjon av amfotere stoffer med separasjon etter isoelektrisk punkt (pi) i en ph gradient (f.eks. proteiner, peptider). I begge tilfeller samler mokelyer av samme pi (bl.a. alle identiske molekyler) seg ved stedet der ph=pi, (det kan skje en sone-fokusering fra en i utgangspunkt vid sone til en smal en). Det må skapes en ph gradient i kolonna (evt. gelen) v.h.a. en elektrolyttblanding som inneholder mange ulike bufferstoffer som dekker jevnt et rel vidt buffrings-ph-område. Ved kormatofokusering kombineres dette med en kolonne av spesiallaget svak ionebytter, inneholdende funksjonelle ioniserbare grupper med tilsvarende matchende vide bufrings-egenskaper. Da titreres kolonna under eluering av MF-elektrolytten, og det oppstår en jevn ph-gradient langs kolonna som sakte forflytter seg i samme retning som den (raskere) MF-væsken. Ved isoelektrisk fokusering lages en statisk ph gradient i elektrolytten mellom elektrodene og analyttene forflyttes elektroforetisk til den plass de har nettoladning null (ved ph = pi) og dermed mobilitet null i feltet. Deretter detekteres fordelingen i gradienten: rett fram ved klassisk el.- forese, eller etter transport forbi detektoren ved Cap-IEF. 6.c) Nevn den viktigste ioniserings-teknikken i GC-MS og skisser ionekilde-prinsippet. (1+1+1p) (i) GC/MS: EI = Elektron Ionisering (Electron (impact) Ionisation) typisk En elektronstråle med høy energi ioniserer analyttmolekyler til radikalkationer, som i mer eller mindre stor grad fragmenterer (fragment-ioner kan gi ekstra struktur-informasjon, utover evt. synlig molekyl-ion).

Side 12 av 14 (ii) I LC/MS brukes i dag atmosfærisk-trykk-ionseringsmetoder (eng. API methods) : nevn en av dem og skisser ionekilde-prinsippet. Aktuelle: Elektrospray (ESI), MF pumpes ut av en kapillær med kvspenning i forh. t. MS: Dannes en spray av ladede dråper, der MF fordamper fra (og skylles/pumpes vekk) og gjenværende ioner overføres til MS ets analysator. Analyttioner er enten forutdannet eller dannes ved assosiasjon av nøytral analytt med MF-ioner, evt. avspaltning av ion fra analytt. se Greibr. s. 270 (fig. 14-11), Ionespray (ofte også tatt med i ESInavnet idag), samme prinsipp som ESI, men dråpedannelse hjelpes ved aktiv spraying (tillater større MF-strøm) se Greibr. s. 271 (fig. 14-12), og ppvarmet forstøver (eng. ofte bare kalt APCI, Atmospheric Pressure Chemical Ionisation), MF pumpes ut av en kapillær med høy temperatur og fordampes. I dampen etter kapillæren ioniseres MF i et sterkt elektrisk felt (høyspennings-elektrode) til mange ioniserte MF-fragmenter (en CI-plasma). Disse ioner ioniserer analytten (mest typisk ved assosiasjon, kjemisk ionisering, CI) som trekkes inn i MS ets-analysator. se Greibr. s. 269 (fig. 14-10), (API gir hovedsakelig kvasi-molekylioner = analytt med addert (el. avspaltet) ion f.eks. H +. Ingen, el. lite fragmentering (må evt. provoseres fram v.h.a. potensialer/kollisjoner, evt. analysert ved MS/MS). (iii) Gir disse to ioniseringsmetodene (for hhv. GC/MS of LC/MS) samme type massespektrum for et stoff, eller ikke? Forklar kort. Nei, ikke like: se forklaringer i (i) og (ii) : EI: fra mye til ingen (ekte) Molekylion og en del mye fragmentering (tolkbar m.h.t. struktur). API: ingen lite fragmentering, mye (evt. bare) kvasi-molkylioner. (ad. fragm.: se (ii)) (evt. premiesvar) :I tillegg for makromolekyler: dannelse av flerladede ioner, flere ladninger jo større molekylet)flere

Side 13 av 14 ppgave 7. (20p) Gi Ja/Nei svar pluss (nødvendig!) kort forklaring ("fordi "): (1 poeng pr. riktig og begrunnet svar : uten forklaring ansees ja/nei som potensielt tipping og telles som følger : riktig svar gir + 0,2 poeng, feil svar gir -0,2 poeng (trekk!). 1. Er kolonneblødning et typisk problem ved SEC? Ja/Nei, fordi. kjemisk SF = MF bløding usynlig /uaktuell, (Bløding et problem ved GLC (eller klass. LLC)) 2. Små molekyler elueres ut før større molekyler i SEC. Store molekyler er ekskludert frå SF, dermed elueres de tidligere enn små som har adgang til SF 3. Er diffusjonskoeffisienten til superkritiske fluider sammenlignbare med gasser? (bør endres til viskositeten) 4. Er løselighetsegenskapene til superkritiske fluider sammenlignbare med gasser? 5. Elektroosmose er en sonespredningsprosess ved gasskromatografi. 6. Ved elektrokromatografi brukes elektroosmose i steden for væskepumpe. 7. En molekylærsikt-plt-kolonne brukes til GSC. 8. Flammeioniseringsdetektoren (FID) har dårlig linearitet av responsen. D(SFC) 10-3 * 10-4 D(GC) 10-1 (D(LC) 10-6 ). En god del lavere (100-1000 ganger), men også et stykke unna væsker, (også 100-1000 ganger)) SF kan solvatisere (noe avh. av tetthet (trykk & temp.) noe som gasser ikke kan. Dermed er løselighetsegenskapene til SF ene bedre enn gassenes. Elektroosmose er en ladnings-avhengig massetransport-mekanismus for en elektrolytt ved elektroforese (og elektrokromatografi). Elektroosmose er ikke aktuell ved GC JA Elektroosmose er en ladnings-avhengig massetransportmekanismus for en elektrolytt. Er MF en en elektrolytt, og har SF ladede funksj. grupper kan elektroosmose brukes i steden for mek. væskepumpe til å forflytte MF en. JA PLT = Porous Layer pen Tubular: innebærer porøst (fast-stoff-)lag på kolonnevegg (uten væske tilstede). En typisk (moderne) kolonneform for GSC (Gass-faststoff GC). Lineariteten til FID er ca. 10 6-10 7 -- en av de største blant GC-detektorene 9. TypeB -silika brukes typisk for enkel preparativ LSC. 10. Som stasjonærfase i Bioaffinitetskormatografi (BAC) brukes ren ubehandlet silika. Type B -silika er modenere, høy-ren silikagel. Den bir altfor dyr for bruk i enkel preparativ LSC (der simpel, billig, urenere silkagel brukes, p.g.a. rel store mengder og (ofte) engangsbruk av SF). Bioaffinitetskromatogafi forutsetter en høyt-selektiv ligand på SF med spesiell (bio-)affinitet til analytten. På ubehandlet silika finnes ikkje en slik ligand, bare uselektive H-grupper. fortsetter på neste side

Side 14 av 14 (ppgave 7 fortsetter) Gi Ja/Nei svar pluss (nødvendig!) kort forklaring ("fordi "): (1 poeng pr. riktig og begrunnet svar: uten forklaring ansees ja/nei som potensielt tipping og telles som følger : riktig svar gir + 0,2 poeng, feil svar gir -0,2 poeng (trekk!). 11. Dersom t 0 = 0.75 min og forbindelse A eluerer ut med retensjonstid t R,A = 2,25 min, betyr det at ca 67 % av stoffet foreligger i mobil fase (MF). 12. Ved papirkromatografi er god ventilering av utviklingskaret under eluering viktig for god retensjon av analyttene. 13. Vann er den mest brukte mobile fasen i superkritisk fluid kromatografi, SFC. 14. Platehøyden i kapillær-gc er mye lavere enn i pakket kolonne-gc og hovedårsak for den høye effektiviteten i kapillær-gc. 15. Gir ionebytterkromatografi av en prøve med Ca 2+ og NH + 4 ved ph 2 på en sterkt sur kationbytter en god separasjon? 16. Bruken av Kompakte overflatefunksjonaliserte C18-faser i RP-HPLC er best egnet (er hovedsakelig) for analyser av biologiske makromolekyler. 17. Beskyttelses-forkolonner (Guardcolumns), som er forbruksvare, kan være billige og dårlige kopier av hovedkolonnens SF. 18. Gradient-eluering i GLC skjer typisk ved temperaturendring frå høy til lav temperatur. 19. Ved detektor-orientert derivatisering må blandingen og reaksjonen med reagens alltid skje før analytten har kommet på kolonnen. 20. Spektra-opptaket ved koblede metoder (kro./spektr.) må være sakte slik at en kan måle et gjennomsnittsspektrum av toppen. Ja/Nei JA JA, fordi. k = ( tr to) / to k= = 2,2,5 0,75 / 0,75 = 2 = n MF /N SF andel stoff i mobilfase det er 33 % (= R i %) Tvert imot -- ventilering gir ureproduserbar retensjon (som ikkje kalles god), og i forhold til ønskede idealforhold måles for høye RF-verdier (liksom for dårlig retensjon) Vann trenger for høyt trykk og for høy temperatur til å bli superkritisk. (Den mest brukte mobile fasen i superkritisk fluid kromatografi, SFC er C 2.) Hovedårsaken er den mye større kolonnelengden i kapillær-gc. Platehøyden i kapillær-gc er bare moderat lavere enn i pakket kolonne-gc. Ved ph 2 er en sterkt sur KB ionisert (IEC er mulig). Ved ph 2 er NH 4 protonert/kationisk og retarderes. Men Ca 2+ har dobbelt så stor ladning og forventes å retarderes klart sterkere. - Biologiske makromolekyler diffunderer svært sakte: Porøse partikler har lang diff.-veier i porene:stor HS SMF derimot har kompakte ingen, HS SMF =0, mer effektiv. - Biologiske makromolek. på RP-faser: ofte stor retensjon (k) og langsåm fasetransfer (H SF ) p.g.a. multipoint -binding mellom analytt og SF. Fordel med rel. lite SF som gir lavere k: Kompakte SF har mye lavere overflateareal dermed my mindre C-% (prop. til effektiv SF) i kolonna enn porøse RP-SF-kolonner. Samlet: ikke for høy k og lavere H SF. Lavere massetransferbidrag (H SF og H SMF ) tillater ikke minst raskere eluering. Dårlige forkolonner, sjølv om de er små, vil likevel ødelegge mye av effektiviteten til en god hovudkolonne. Derfor må forkolonnen være (nesten) like god som hovedkolonnen. mvendt er korrekt. Start ved høy temp. (høye damptrykk): retensjon for analytter flest er lav (for de lettflyktige altfor lav); ingen (positiv) effekt på kromatogram ved å senke temperaturen etterpå. Kan også skje mellom kolonne og detektor, etter kolonnen/separasjonen, om derivatiserings-reaksjonen er raskt, og reaksjonssystemet/ reaktoren ikke reduserer effektiviteten for mye. For sakte: ulike deler av spektret måles ved ulike konsentrasjoner ikke-representativt spektrum. gså umulig å se om spektret er likt over hele kro.-topp om toppen er homogen / ren.