4. Planar Kromatografi

1 KJ2053 Kromatografi (Analytiske metoder II) Lundanes Else, Reubsaet Léon, Greibrokk Tyge, Chromatography, Basic Principles, Sample Preparations and..., Wiley-VCH, 2014. ISBN:978-3-527-33620-3 4. Planar Kromatografi (Tynnsjikt-kromatografi) (eng.: Thin Layer Chromatography, TLC) 4. ATLC 4. B Papirkromatografi (kort) 1

2 4 A. 1. Innledning Tynnsjikt-kromatografi (TLC) er en planar kromatografi-teknikk. TLC finnes i 2 versjoner / 2 verdener : 1. Rel. innarbeidet, kvalitativ (evt. semi-kvantitativ) analyse-teknikk: -- enkel og rask ( fort å gæli ). Populær som enkel screening -metode. (Lab.-forsøk!) 2. HP-TLC, High Performance TLC: -- avansert, instrument-basert kvantitativ analyseteknikk, (omtrent på nivå med HPLC). 2

3 4. A. 1. Innledning Remember : Innen TLC brukes veldig mye adsorpsjonskromatografi (LSC) men TLC er ikke automatisk adsorpsjonskromatografi. TLC kan også være - fordelingskromatografi (LLC), - ionebytterkromatografi (IEC) og - eksklusjonskromatografi (SEC)! avhengig av SF'en i sjiktet En demonstrasjonsvideo: første del av: (TLC & 'Flash' med fluorescerende stoffer) 3

4 4. A. 2. Enkel TLC TLC etter versjon 1: (enkel og rask ( fort å gæli )) Fordeler: - raskt, enkelt, relativt billig (utstyr og forbruk), - brukes oftest analytisk, kan også brukes mikro-preparativt (tidl. lab.-eksp.). TLC-resultater kan relativt enkelt overføres til kolonne-kromatografi (f.eks. prep. kolonner, flash -kolonner evt. HPLC). og evt. motsatt vei E. Lundanes & al. : Chro. (2014) : p., Ch. 4. 4

5 4. A. 2. Enkel TLC Den stasjonære fasen i TLC er fordelt som et tynt sjikt på et glatt, tett, (stivt &) inert underlag (vanligvis). Underlag: glass, plast, aluminium. I sjiktet : LSC : silikagel, aluminiumoksid, Florisil : (NP-TLC ) LLC: cellulose, polyamid, kiselgur (NP- eller RP-TLC) derivatisert silika: C8, C18, CN, diol, amino, chiral,...; SEC (gel), ionebyttere. Kvarts-staver med et tynt på-smeltet silika-sjikt brukes ved deteksjon med FID (i Iatroscan -systemet). Den mobile fasen flyter gjennom sjiktet v.h.a. kapillærstrøm): inn i og forbi det porøse SF-laget (som tørt adsorpsjonsmiddel, eller en SF påført et porøst bærematerial). MF tar med seg (eluerer) analyttene, som er påført sjiktet som flekker ("spots") eller striper ("streaks"). Eluering (også fremkalling, eng. development) skjer normalt isokratisk. Vist her (mest vanlig): vertikal lineær utvikling. 5

6 4. A. 2. Enkel TLC Analyttene forflyttes med hastigheter som er avhengig av hver komponents kromatografiske retensjon framover i sjiktet til ulike avstander fra starten. Utviklingen/elueringen forgår vanligvis i en bestemt tid (ofte tilsvarende en bestemt MF-vandringslengde), hvoretter prøvekomponentenes vandringslengder registreres. Valg av MF er avhengig: av retensjonsmekanisme (SF-type), og av prøvens egenskaper (tilpasses for optimale R F - verdier). Vist her (mest vanlig): vertikal lineær utvikling. 6

7 4. A. 3. Retensjon ved LSC Analyttene forflyttes med hastigheter som er avhengig av hver komponents kromatografiske retensjon framover i sjiktet til ulike avstander fra starten. Valg av MF er avhengig: av retensjons-mekanisme (SF-type), og av prøvens egenskaper (tilpasses for optimale R F -verdier). Ved TLC etter versjon 1: (enkel og rask ( fort å gæli )) : a) mest vanlig med normal fase LSC ( b) nest mest vanlig med omvendt fase TLC i dag.) SF-egenskaper - for a) (d.v.s. for NP-LSC) : Polare metalloksider : mest: silikagel sjeldnere: Aluminiumoksid 7

8 4. A. 3. Retensjon ved LSC Retensjon ved adsorpsjon av prøven til adsorpsjonssentra på SF til polare strukturer på adsorbent-overflaten: Bruker polare interaksjoner - sterkest med polare analytter - sterkest retensjon for polare stoffer. F.eks.: Separasjon av aromater på NP-LSC plate: Stoff med mest polar gruppe (OH) mest retardert. N.B.: Optimal R F 0,2 0,5 : (her bare tilfelle for kresol). (TLC figur er hypotetisk ikke eksperimentell! ) Estimerte rel. adsorpsjonsenergier på silkagel: fenol kresol benzene 7,7 5,7 1,5 N.B.: Størst retensjon av SF, når SF en er rent og tørt. Adsorbert vann (= deaktivert adsorpsjonsmiddel) ) gir svakere retensjon 8

9 4. A. 3. Retensjon ved LSC Retensjon ved adsorpsjon av prøven til adsorpsjonssentra polare strukturer på adsorbent-overflaten: Bruker polare interaksjoner - sterkest med polare analytter - sterkest retensjon for polare stoffer. N.B.: Det er konkurranse om adsorpsjonsseter på SF : den sterkeste (mest polare) vinner. Analytter er bare mobil (i MF) når desorbert - upolar MF kan dårlig utkonkurrere anlytter. Derfor : polare MF kan konkurrere godt analytter taper lettere mye i MF lavere retensjon - høye R F upolare MF konkurrerer dårlig analytter best adsorbert lite i MF stor retensjon - lave R F MF-valg / -optimering: justere MF-polaritet / MF-styrke slik at R F = 0,2-0,5! (Vist for NP:) 9

10 4. A. 4. Elueringsdmiddelstyrke ved LSC Derfor : polare MF kan konkurrere godt analytter taper lettere mye i MF lavere retensjon - høye R F upolare MF konkurrerer dårlig analytter best adsorbert lite i MF stor retensjon - lave R F MF-valg / -optimering : justere MF-polaritet / MF-styrke MF-styrke (Solvent Strength): MF-styrke: Endring ved innblanding av ulike sterke løsningsmiddel i et (veldig) svakt ett (her n-heptan): (J.M. Miller ) Fra: T. Geibrokk & al. "Kromatografi" (1994) Praksis/trening på Lab-forsøk 1 10

11 4. A. 5. Retensjons-mål i planar kro.: R F -verdien Tynnsjikt-kromatogrammet dokumenteres ved R F - eller R r -verdi for flekkene. Retarderingsfaktor eller R F -verdi : R F = a / b, 0 < R F < 1,00 R r (a ) = a / a (= ret. rel. til a ) Meget viktig med betingelser som gir reproduserbare R F -verdier (el. R r -verdier). Problemfaktorer: bl.a. mulig avdamping av MF fra åpent sjikt. (God beskrivelse av gjennomføringen av TLCeksperiment derfor viktig). Ikke reproduserbar SF- og/eller MF-egenskaper (sammensetning, aktivitet, ) Gunstige R F -verdier: ca. 0,2 0,5 (tilsv. k = 1 4) Og husk: k (1 - R F ) / R F = (1/R F ) - 1 11

12 4. A. 6. Utviklingsalternativer i planar kro. /TLC Alternativer til lineær vertikal utvikling : Radiær utvikling (typisk innenfra utover) Horisontal utvikling 2-dimensjonalt utvikling (1 flekk pr. plate, først i x-, så i y-retning) Overutvikling Gradient-utvikling (ulike varianter ) Over-pressured layer chromatography (OPLC) Sirkulær sentrifugal utvikling (Chromatotron, prep. TLC) Etc., etc. (alle fig. her: www. google. com ) Gir ulike forutsetninger for rapportering av R F -verdier (ofte uaktuell) el. R r -verdier). Derfor : God beskrivelse/spesifikasjon av TLC-eksperiment er viktig. 12

13 4. A. 7. Effektivitet i TLC Platetall, N: (alle fig. her: www. google. com ) N = 16 ( R F L MF / d S ) 2 = 16 (L X / d s ) 2 d S : Flekk-diameter (i elueringsretning) etter fremkallingen. L X : Vandringslengde av flekk X. N er her et observert platetall, basert på størrelsen av den synlige flekken (eller den synlige bredden på båndet). Effektivitet i TLC: minker vanligvis med økende vandringslengde utover ca. 10 cm (for vanlig TLC) eller utover ca. 5 cm (for HPTLC). Årsak: MF-framdrift ved kapillærkrefter blir for sakte (sub-optimal) etter hvert som framdriften blir saktere ved lang vandringslende, flekkstørrelsen blir da kontrollert av longitudinal diffusjon. (Derfor utvikles HP-TLC kun få cm lang, f.eks. < 5cm) 13

14 4. A. 8. Prøveapplisering i TLC Små prøvemengder (få μg (eller lavere begrenset av deteksjonsfølsomhet), få μl løsning Spotting (flekkpåføring: v. kapillær, sprøyte, mikro-spraying) - før platen elueres. Ønsker: Lengst mulig ned på plata for lengst mulig elueringslengde (og høyest mulig MFhastighet) startflekk (hele) må være over væskenivået til MF i tank-bunnen, ikke skade sjiktet (avansert utstyr benytter på-spraying!), minst mulig flekkstørrelse (svakt prøve-lsm., gjentatt applisering med opptørking, bruk av oppkonsentreringsteknikker) Flekk "tørkes opp" før eluering starter (unngår plugg-eluering). Spesielle forhold / tiltak når TLC brukes mikro-preparativt (mg-skala, evt. m. ekstra-tykke plater, påsatt som langt bånd eller tett, overlappende flekkrekke). 14

15 4. A. 9. Deteksjon av analyttene Deteksjon av analyttene - avhengig av analytt-egenskaper: Lokalisering krever ofte ekstra synliggjøring (hvis ikke flekkene sterkt nok farget i synlig lys): Mange metoder : Fluorescerende stoffer kan synliggjøres med UV-lys-bestråling (fluorescenslampe-boks) UV-bestråling (i fluorescens-boks ) av TLC-platen som inneholder et fluorescerende reagens (F 254, også F 365 ) (ren/tom TLC-plate lyser da i farge - F 254 : grønn), UV-absorberende flekker reduseres fluorescensen (virker som UV-filter): gir mørke flekker på fluorescerende lys plate. Egnet for UV-absorberende analytter, bl.a. aromater, andre konjugerte umettede stoffer. Eksponering med jod-damp brune flekker (organiske stoffer på uorganisk sjikt). Derivatisering av usynlige flekker til synlige derivater ved spraying med / dypping i et reagens: f.eks. svovelsyre, fosformolybdensyre, ninhydrin, mange flere ofte selektive. H 2 SO 4, 12MO 3 H 3 PO 4 xh 2 O 15

16 4. A. 9. Deteksjon av analyttene Alternativ: instrumentell deteksjon/kvantifisering: Densitometer (respons for lysabsorberende stoffer: måler absorbanse ved refleksjon på SF-sjikt, (evt. transmisjon v. gjennomsiktig underlag). Avanserte instrumenter kan variere/scanne bølgelengden. (Kan evt. utføres i kombinasjon med derivatisering for (UV-) synliggjøring.) Spesialteknikk av TLC: Iatroscan; bruker flammeioniserings-detektor, FID, som detekterer organiske stoffer generelt; på silikagel belagte kvartsstaver (=TLC-"plater"). Ny: massespektrometriske teknikker med ved overflateioniseringsteknikker (DESI, MALDI, DART, f.eks.), el. flekkekstraksjon med massespektrometrisk deteksjon (ESI el. APCI) 16

17 4. A. 9. Deteksjon av analyttene Flere separate prøveappliseringer på samme sjikt (plate) er mulig/vanlig: kan analyseres parallelt (av samme prøve, ulike prøver, eller standarder). mulighet for betydelig effektivisering av analyser (i forhold til kolonne-kromatografi, der bare 1 prøve om gangen kan analyseres). Platene (sjiktet) kastes etter én gangs bruk: Kan ofte analysere sterkt forurensende prøver uten mye opprensing. TLC viser også sterkt retarderte prøvekomponenter, som flekker på, eller nær, startflekken (som i kolonnekromatografi ofte ikke elueres/vises). Gir et mer komplett/korrekt bilde av prøven. Enkelt å variere applisert prøvemengde (gjentatt påsetting på samme startflekk). 17

18 4. A.10. TLC-plater - selv-laging Plater kan evt. også lages selv (jfr. f.eks. tidligere K2053-TLC-eksperiment 1.e) : for storforbrukere, billig og enkel for fort å gæli (eller "for skole og hjem") sjikt med spesielle egenskaper eller spesielle SF (ikke-kommersielle), plater for preparativ bruk (ekstra tykke sjikt, ekstra mange) www.google... / www.expertsmind.com Tilsats-stoffer til TLC-sjiktet: - bindemidler (mekanisk stabilisering av sjiktet) : gips, stivelse evt. andre hemmeligholdte resepter (polymerer?). - fyllmaterial (reduksjon av retensjonen: kiselgur, deaktivert silika) - fluorescens-indikatorer ("F 254 ", "F 254+365 ") - modifiserende stoffer : - syrer, baser, buffere - komplekserende stoffer som sølvnitrat (C=C-dobbeltbindinger), blynitrat: polyoler (polyalkoholer)). 18

19 4. A. 11. HPTLC (High Performance TLC) Forbedrede sjikter, avanserte appliserings-, utviklings- og deteksjonsmetoder (ofte automatiserte); rask, effektiv, og høytoppløsende kvantitativ analyseteknikk med høy grad av nøyaktighet og presisjon. Fast and precise Thin Layer Chromatography, by Merck Millipore. 2012. 19

20. 4. A. 11. HPTLC (High Performance TLC) Forbedrede sjikter, avanserte appliserings-, utviklings- og deteksjonsmetoder (ofte automatiserte); rask, effektiv, og høytoppløsende kvantitativ analyseteknikk med høy grad av nøyaktighet og presisjon. Ved HPTLC brukes : ved vanlig TLC: mindre partikkelstørrelser: 4-8 mm ca. 8-20 mm, (jfr. KJ2053-forsøk 1) mindre sjikttykkelse: 0,1 el. 0,2 mm 0,2-0,3 mm mindre prøvevolum : 0,1-0,2 ml 1-5 ml (smale korte striper som start-flekker, påført helst med automatisk applikator) oftest manuell, og vanligst med runde start-flekker kortere vandringslengder (front): 3-6 cm og utviklingstider 3-20 min mindre flekker applisert 1-2 mm og etter utvikling 2-6mm større effektivitet (platetall pr. TLC-plate) <5000 og mindre platehøyde 0,01 mm deteksjonsgrenser: UV: 0,1-0,5 ng Fluorescens: 5-10 pg 10-15 cm 20-200 min 3-6 mm 6-15 mm <600 0,3 mm 1-5 ng 50-100 pg T. Greibrokk & al. : Chro. (1994) : p.230, CTab. 12.1. 20

21 4. A. 11. HPTLC (High Performance TLC) Forbedrede sjikter, avanserte appliserings-, utviklings- og deteksjonsmetoder (ofte automatiserte); rask, effektiv, og høytoppløsende kvantitativ analyseteknikk med høy grad av nøyaktighet og presisjon.. I HPTLC : I vanlig TLC: www- Heliobiotec - Lipid analytical techniques heliobiotec.cea.fr Principles and Practice of Thin Layer Chromatography... www.connecticutvalleybiological.com www.google.com (pictures) 21

22 4. B Papirkromatografi, (PC) Enkel planar kromatografi / (nesten) historisk : Typisk i planar format Normal : Papirkromatografi = LLC, væske-væske-fordelingskromatografi : Cellulose er bare bærematerial for en væske-sf: SF samles i amorfe karbohydrat-områder (uordnete kjeder) i overgangen mellom cellulose-fibrillene (ordnede/krystall-pakkede kjeder). MF = væsken som flyter forbi (v. kapillærkrefter, med, el. mot gravitasjon). Cellulose: β-1 4 poly- D-glukose I papirkromatografi er det vanligst med normal fase-fordeling (SF= polar, MF = upolar). SF består som oftest for en stor del av vann - tiltrukket av cellulosen som er hydrofil (hydrogenbindinger med glukose-oh) - det dannes en "cellulose/sukker-løsning" i de amorfe områdene. J.D. Wilson & J.K. Hamilton, Journ. Chem. Educ. (1986) 22

23 4. B Papirkromatografi, (PC) Enkel planar kromatografi / (nesten) historisk : Papirkromatografi (PC) Typisk i planar format Normal : Papirkromatografi = LLC Teknisk: - Dårligere separasjonsevne (enn TLC) p.g.a. fibrøs struktur av papir (større d P ). - Som regel saktere enn TLC - mye lignende på TLC (applikasjon, deteksjon) - Kan gjennomføres med svært enkel og billig utstyr. Ganske vanlig med nedover-utvikling, ganske også ofte med over-utvikling. To grupper av MF/SF-systemer : to-fase-systemer : to ikke-blandbare faser i likevekt, én-fase-systemer : som regel blandinger (homogent blandet) av rel. polare og noe mindre polare løsningsmidler (bare brukt for normal fase-systemer). www.google.com (pictures) (F.eks.: ad 1. : n-butanol - eddiksyre- vann 4 + 1 + 5 (v/v, Partridge-system); ad 2. : pyridin - n-butanol - vann 1 + 1 + 1 v/v). En noe mer utdypende tekst om papir-kromatografi (fra tidligere KJ2053-forelesninger (ca. 2012/3)) finnes som ord / pdf-dokument på It's Learning : Forelesning / "04.B Litt ekstra om papirkro." 23

24 4. B Papirkromatografi, (PC) Enkel planar kromatografi / (nesten) historisk : Papirkromatografi (PC) Typisk i planar format Normal : Papirkromatografi = LLC www.bing.com (pictures) buggyandbuddy.com a) b) c) Figur 3 : Noen vanlige utviklingsmetoder for papirkromatogrammer : a) nedadstigende utvikling, (ofte brukt for over-utvikling) b) radiær utvikling, f.eks. (i petriskål, med filterpapir og veke (jfr. også illustrasjon på dette lysark (24)). c) meget enkle oppadstigende utvikling: øverst : i reagensglass, nederst: i erlenmeyerkolbe (jfr. også illustrasjoner på lysark 22 & 23) Figuren er fra denne teksten En noe mer utdypende tekst om papir-kromatografi (fra tidligere KJ2053-forelesninger (ca. 2012/3)) finnes som ord / pdf-dokument på It's Learning : Forelesning / "04.B Litt ekstra om papirkro." 24