1 ANTI-HEPCIDINANTISTOFFER OG ANVENDELSER DERAV Beskrivelse 5 10 Den foreliggende oppfinnelse er innen det medisinske felt, særlig innen feltet for antistoffer mot humant modent hepcidin. Oppfinnelsen angår nærmere bestemt hepcidin-25-selektive monoklonale antistoffer som er i stand til å nøytralisere humant modent hepcidin-bioaktivitet og derfor er nyttige for å øke serumjernnivåer, retikulocyttantall, antall av røde blodceller, hemoglobin og/eller hematokritt hos et menneske med formål av behandling eller forebygging av en humant modent hepcidin-fremmet sykdom, tilstand eller forstyrrelse, slik som anemi. 15 Egnede og effektive behandlinger for anemi, eller for anemi ved kronisk sykdom, er for øyeblikket begrenset. Erytroproteinadministrering er bare effektiv hos cirka 50 % av alle pasienter og er assosiert med uønskede bivirkninger. Transfusjoner er videre uønsket på grunn av risikoene for kontaminasjon, infeksjon og for mye jern. 20 25 Humant hepcidin, som er et polypeptid som uttrykkes hovedsakelig av hepatocytter, antas å være et viktig jernregulerende protein som negativt regulerer intestinal jernabsorpsjon, jernresirkulering ved hjelp av makrofager og jernmobilisering fra hepatiske jernlagre. Overproduksjon av hepcidin later til å spille en hovedrolle i patofysiologien for anemi og/eller anemi ved kronisk sykdom. 30 35 Humant hepcidin er kodet som et 84-aminosyrers prepropeptid inneholdende en typisk N-terminal 24-aminosyrers endoplasmisk retikulum-målsøkende signalsekvens og en 35-aminosyrers proregion med et konsensusfurinspaltingssted umiddelbart etterfulgt av det C-terminale 25-aminosyrers bioaktive jernregulerende hormonet, humant hepcidin-25 (SEQ ID NO: 1). En rekke N- terminale trunkerte former for humant hepcidin-25, slik som humant hepcidin-20 (dvs. aminosyrer 6 25 til SEQ ID NO: 1) og humant hepcidin-22 (aminosyrer 4 25 til SEQ ID NO: 1) er også kjent å dannes in vivo.
2 5 10 15 20 25 Selv om antistoffer for humant hepcidin er rapportert tidligere (se for eksempel US-patentsøknadspublikasjon 2004/0096990 og 2007/0224186 og PCTpatentsøknadspublikasjon WO 2008/097461), er det fortsatt et stort behov i teknikken for ytterligere legemidler til behandling av sykdommer og forstyrrelser assosiert med anemi, herunder anemi ved kronisk sykdom, slik som anemi ved kreft og anemi ved inflammasjon. Siden hepcidin-25 er den mest, om ikke eneste, fysiologisk relevante form for hepcidin hos mennesker, trengs det særlig antistoffer som selektivt målsøker humant hepcidin-25 sammenlignet med hepcidinpolypeptider som ikke er fysiologisk relevante. Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer derfor selektive, høyaffinitets, konstruerte terapeutiske antistoffer mot humant hepcidin-25 som har en rekke fordeler i behandlingen eller diagnostiseringen av forstyrrelser assosiert med forhøyede nivåer av modent hepcidin, slik som anemi. Disse antistoffene vil, idet de har høy affinitet og er nøytraliserende, humant konstruerte (eng.: human engineered) og svært selektive for fysiologisk relevante former for hepicidin hos mennesker, for eksempel redusere risikoen for bivirkninger og den kliniske dosen og den nødvendige doseringsfrekvensen for effektiv behandling. Den foreliggende oppfinnelse inkluderer også foretrukne nukleinsyrer som koder for foretrukne selektive hepcidin-25-antistoffer hvor nukleinsyrene er fremstilt for å fjerne kryptiske spleisesteder som resulterer i uønsket aggregering av visse antistoffer ifølge oppfinnelsen ved ekspresjon ved vertsceller hos pattedyr. Ytterligere fordeler avledet av den foreliggende oppfinnelse inkluderer således forbedret utbytte av antistoffproduktet av en ønsket renhetsgrad, hvorved produksjonskostnader reduseres, samt større grad av klinisk effekttivitet og sikkerhet for det administrerte antistoffproduktet. 30 35 Videre skiller ikke kommersielt tilgjengelige immunoassayer for humant hepcidin mellom de aktive, fysiologisk relevante formene for humant hepcidin fra inaktive, fysiologisk ikke-relevante hepcidinarter (se for eksempel Kemna, E.H., et al., Haematologica, 93(1):90-7 (2008)). For øyeblikket involverer de fleste fremgangsmåter for selektiv analyse av hepcidin-25 LC/MS (væskekromatografi/massespektroskopi) eller lignende tungvinte fremgangsmåter som krever separering av de forskjellige formene for hepcidin (se for eksempel (Gutierrez, J.A., et al., BioTechniques, 38:S13-S17 (2005), Murphy, ct al., Blood, 110:1048-54 (2007) og Kemna, E.H., et al., Clin. Chem. 53:620-8 (2007)). Mens disse assayene kan være nøyaktige og presise,
3 5 inhiberer deres kompleksitet, kostnad og det høye nivået av nødvendig operatørekspertise deres rutinegjennomføring. Det er følgelig også et stort behov for ytterligere antistoffer som binder humant modent hepcidin med høy affinitet for deres anvendelse i relativt enkle, hurtige og robuste immunoassayer for den spesifikke påvisningen eller målingen av modne former for humant hepcidin for diagnostiske og/eller prognostiske anvendelser. 10 Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer et antistoff som binder humant hepcidin-25 med en K D på 800 pm eller mindre som bestemt ved hjelp av overflateplasmonresonans (SPR) ved 25 C, og omfatter seks CDR-er valgt fra gruppen bestående av: i) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 og HCDR3 med aminosyresekvenser som vist i henholdsvis SEQ ID NO: 52, 60, 62, 65, 71 og 75, 15 ii) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 og HCDR3 med aminosyresekvenser som vist i henholdsvis SEQ ID NO: 42, 76, 62, 79, 87 og 46, 20 iii) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 og HCDR3 med aminosyresekvenser som vist i henholdsvis SEQ ID NO: 41, 53, 31, 63, 84 og 46, vi) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR2, HCDR2 og HCDR3 med aminosyresekvenser som vist i henholdsvis SEQ ID NO: 43, 30, 31, 32, 44 og 46, 25 v) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 og HCDR3 med aminosyresekvenser som vist i henholdsvis SEQ ID NO: 43, 53, 61, 63, 85 og 46, og vi) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 og HCDR3 med aminosyresekvenser som vist i henholdsvis SEQ ID NO: 43, 57, 61, 63, 84 og 46. 30 I andre aspekter tilveiebringer oppfinnelsen isolerte nukleinsyremolekyler som koder for antistoffer ifølge oppfinnelsen; vektorer omfattende
4 5 nukleinsyremolekyler som koder for antistoffer ifølge oppfinnelsen, eventuelt operativt bundet til kontrollsekvenser gjenkjent av en vertscelle omdannet med vektoren; vertsceller omfattende vektorer omfattende nukleinsyremolekyler som koder for antistoffer ifølge oppfinnelsen; en fremgangsmåte for fremstilling av et antistoff ifølge oppfinnelsen omfattende dyrking av vertsceller omfattende vektorer omfattende nukleinsyremolekyler som koder for antistoffer ifølge oppfinnelsen slik at nukleinsyren uttrykkes, og eventuelt gjenvinning av antistoffet fra vertscellekulturmediet. 10 15 I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en farmasøytisk sammensetning omfattende et antistoff ifølge oppfinnelsen og et farmasøytisk akseptabelt bærestoff eller fortynningsmiddel. Den farmasøytiske sammensetningen omfatter fortrinnsvis en homogen eller i det vesentlige homogen populasjon av et antistoff ifølge oppfinnelsen og et farmasøytisk akseptabelt bærestoff eller fortynningsmiddel. 20 I en annen utførelsesform tilveiebringer oppfinnelsen et antistoff som selektivt binder humant hepcidin-25 med en K D på cirka 800 pm eller mindre til anvendelse i behandling. Oppfinnelsen tilveiebringer også et antistoff som selektivt binder humant hepcidin-25 med en K D på cirka 800 pm eller mindre til anvendelse i behandling eller forhindring av anemi hos en pasient. 25 30 Den foreliggende oppfinnelse inkluderer anvendelsen av et antistoff som selektivt binder humant hepcidin-25 med en K D på cirka 800 pm eller mindre, for fremstilling av et legemiddel til behandlingen av anemi, herunder anemi ved kronisk sykdom og anemi ved kreft. Oppfinnelsen inkluderer videre anvendelsen av et antistoff som selektivt binder humant hepcidin-25 med en K D på cirka 800 pm eller mindre, for fremstilling av et legemiddel for økning av serumjernnivåer, retikulocyttantall, antall av røde blodceller, hemoglobin og/eller hematokritt hos et dyr, fortrinnsvis et pattedyr, mer foretrukket en human pasient. 35 Den foreliggende oppfinnelse inkluderer en fremgangsmåte for økning av serumjernnivåer, retikulocyttantall, antall av røde blodceller, hemoglobin og/eller hematokritt som omfatter administering til en human pasient som har behov for
5 dette, av en effektiv mengde av et antistoff som selektivt binder humant hepcidin-25 med en K D på cirka 800 pm eller mindre. 5 10 I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for behandling av en pasient med en modent hepcidin-fremmet forstyrrelse som drar fordel av en økning i serumjernnivåer, retikulocyttantalll, antall av røde blodceller, hemoglobin og/eller hematokritt, inkludert, men ikke begrenset til, anemi, f.eks. anemi som følge av en infeksjon, inflammasjon, kronisk sykdom og/eller kreft hvor fremgangsmåten omfatter administering av en effektiv mengde av et selektivt hepcidin-25-antistoff ifølge oppfinnelsen til en pasient med behov for dette. 15 20 Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre et immunoassay selektivt for humant modent hepcidin. Fremgangsmåten inkluderer: å oppnå, for det første, en prøve som skal analyseres for humant modent hepcidin og bringe prøven i kontakt med et antistoff ifølge oppfinnelsen under egnede betingelser for binding og tillate at humant modent hepcidin som er til stede, å danne et antigenantistoff-kompleks; og deretter å detektere nærvær eller fravær av komplekset og/eller bestemme mengden av komplekset i prøven ved hjelp av en immunoassaymetode. 25 Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre fremgangsmåter for diagnostisering av en humant modent hepcidin-fremmet tilstand hos en pasient ved å bestemme nivåene av humant modent hepcidin i en prøve med biologisk fluid fra pasienten og sammenligne nivåene av humant modent hepcidin i prøven med nivået av humant modent hepcidin i en prøve med biologisk fluid fra én eller flere kontrollindivider eller med en referansestandard. 30 35 En fremgangsmåte for overvåkning av modent hepcidin-fremmet forstyrrelse hos en pasient er også tilveiebrakt. Fremgangsmåten inkluderer bestemmelse av nivåene for modent hepcidin i en prøve av et biologisk fluid fra en pasient som lider av, eller med risiko for, en modent hepcidin-fremmet forstyrrelse på et første tidspunkt; bestemmelse av nivået for modent hepcidin i én eller flere prøver av det biologiske fluidet fra pasienten ved ett eller flere tidspunkter; sammenligning av nivåene av modent hepcidin bestemt ved forskjellige tidspunkter og derved overvåkning av den modent hepcidin-fremmede
6 forstyrrelsen. Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre et analysesett for gjennomføring av et immunoassay, herunder et antistoff ifølge oppfinnelsen og en egnet beholder. BESKRIVELSE AV TEGNINGENE 5 10 Figur 1 viser et MALDI-TOF-massespekter av flere former for humant hepcidin isolert fra humane sera. Signal 1 har en masse som stemmer overens med den forventede masse for intakt humant hepcidin-25. Signal 2, 3 og 4 har masser som stemmer overens med N-terminalt trunkerte former for humant modent hepcidin (hepcidin-24, hepcidin-22 og hepcidin-20). Massespekteret ble generert på et MALDI-TOF-massespektrometer ved hjelp av en positivt ion-metode med lineær modus med α-cyano-4-hydroksykanelsyre (peptidmatrise) som prøvematrise som beskrevet i eksempel 5 nedenfor. 15 Figur 2 viser et MALDI-TOF-massespekter av den samme prøven som i figur 1 med anvendelse av 3,5-dimetyl-4-hydroksykanelsyre (sinapinsyrematrise) som prøvematrise. Signal 1 representerer intakt humant hepcidin-25. Det ble ikke observert signal for pro-hepcidin. Massespekteret ble generert på et massespektrometer som anvender en positivt ion-metode med linær modus som beskrevet i eksempel 5 nedenfor. 20 Figur 3A viser aminosyresekvensene til fullstendig human lettkjedestruktur O2 med innlagte CDR-er. De fire strukturregionene er merket som FRL1, 2, 3 og 4 (henholdsvis SEQ ID NO: 39, 40, 96 og 97). Figur 3B viser aminosyresekvensene til den humane tungkjedestrukturen VH1-69 med innlagte CDR-er. De fire strukturregionene er merket som FRH1 4 (henholdsvis SEQ ID NO: 35 38). 25 Figur 4A viser aminosyresekvensene til den humane lettkjedestrukturen O18 med innlagte CDR-er. De fire strukturregionene er merket som FRL1, 2, 3 og 4 (henholdsvis SEQ ID NO: 154, 40, 156 og 97). 30 Figur 4B viser aminosyresekvensene til den humane tungkjedestrukturen VH1-18 med innlagte CDR-er. De fire strukturregionene er merket FRH1, 2, 3 og 4 (henholdsvis SEQ ID NO: 157, 36, 158 og 38).
7 Figur 5A viser aminosyresekvensene til den humane lettkjedestrukturen L12 med innlagte CDR-er. De fire strukturregionene er merket som FRL1, 2, 3 og 4 (henholdsvis SEQ ID NO: 159, 40, 160 og 97). 5 Figur 5B viser aminosyresekvensene til den humane tungkjedestrukturen VH1-46 med innlagte CDR-er. De fire strukturregionene er merket FRH1, 2, 3 og 4 (henholdsvis SEQ ID NO: 157, 36, 161 og 38). 10 15 Følgende forkortelser er anvendt heri: ACN: acetonitril, BSA: bovint serumalbumin, DTT: ditiotreitol, EDTA: etylendiamintetraeddiksyre, ELISA: enzymbundet antistoffassay, IMAC: immobilisert metallaffinitetskromatografi, IPTG: isopropyl-β-d-1-tiogalaktopyranosid, Mab: monoklonalt antistoff, Mab-er: monoklonale antistoffer, MALDI-TOF: matriseassosiert laserdesorpsjonsionisering-flytid (eng.: Matrix-Associated Laser Desportion Ionziation-Time of flight), PBS: fosfatbufret saltløsning, SPR: overflateplasmonresonans, TFA: trifluoreddiksyre. Alle aminosyreforkortelser anvendt i denne beskrivelsen er de godkjent av United States Patent and Trademark Office som angitt i 37 C.F.R. 1.822 (B)(2). 20 25 Som anvendt heri refererer betegnelsen "hepcidin" til en hvilken som helst form av hepcidinproteinet kjent å finnes hos pattedyr. Som anvendt heri refererer betegnelsen "modent hepcidin" til en hvilken som helst moden, bioaktiv form av hepcidinproteinet uttrykt hos pattedyr. Som anvendt heri refererer betegnelsen "humant hepcidin" til en hvilken som helst form for hepcidinproteinet som finnes hos mennesker. Som anvendt heri refererer betegnelsen "humant hepcidin-25" til den modne formen av humant hepcidin med aminosyresekvensen som vist i SEQ ID NO: 1. 30 35 Betegnelsen "antistoff" med henvisning til et anti-hepcidin-antistoff ifølge oppfinnelsen (eller bare "antistoff ifølge oppfinnelsen"), som anvendt heri, refererer til et humant konstruert monoklonalt antistoff eller et fullstendig humant monoklonalt antistoff, med mindre annet er angitt. Antistoffene ifølge oppfinnelsen er fortrinnsvis humant konstruerte antistoffer. Antistoffer ifølge oppfinnelsen kan produseres ved hjelp av for eksempel rekombinante teknikker, fagdisplayteknikker, syntetiske teknikker, f.eks. CDR-poding eller kombinasjoner av slike teknikker eller andre teknikker som er velkjent i teknikken. Betegnelsen "monoklonalt antistoff" refererer til et antistoff som er avledet fra en enkelt kopi
8 5 10 eller klon, herunder for eksempel en hvilken som helst eukaryotisk klon, prokaryotisk klon eller fagklon, og ikke fremgangsmåten hvorved det produseres. Et antistoff som anvendt heri, kan være et intakt antistoff (omfattende en komplett Fc-region eller en fullengde Fc-region), eller en del eller et fragment av et antistoff omfattende en antigen-bindingsdel, f.eks. et Fabfragment, Fab'-fragment eller F(ab') 2 -fragment for et humant konstruert eller fullstendig humant antistoff. Foretrukne antigen-bindingsfragmenter av et antistoff ifølge oppfinnelsen beholder evnen til å inhibere eller nøytralisere én eller flere bioaktivitetskarakteristikker av en moden form av et pattedyrhepcidin in vivo eller in vitro. I en utførelsesform kan for eksempel en antigen-bindingsdel av et antistoff ifølge oppfinnelsen inhibere interaksjonen mellom humant hepcidin-25 og én eller flere reseptorer, f.eks. human ferroportin (SEQ ID NO: 25), og/eller kan inhibere hepcidinindusert internalisering av ferroportin. 15 20 Et "antistoff ifølge oppfinnelsen" eller bare "antistoff" som anvendt heri kan videre være et enkeltkjede Fv-fragment som kan produseres ved å sammenkoble DNA-et som koder for LCVR-et og HCVR-et med en bindingssekvens. (Se Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, bd. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, s. 269 315, 1994). Det skal forstås at uavhengig av om antigen-bindingsfragmenter eller - deler er spesifisert, inkluderer betegnelsen "antistoff" som anvendt heri slike fragmenter eller deler i tillegg til enkeltkjedeformer, med mindre annet er angitt. 25 30 35 Betegnelsene "selektiv" eller "selektivt" anvendt heri med henvisning til henholdsvis et anti-hepcidin-25-antistoff eller bindingen derav, refererer til et antistoff som selektivt binder hepcidin-25 med en K D på 1000, 500, 200, 100, 50, 10 eller 5 ganger mindre enn antistoffet binder minst én forløperform av hepcidin-25 og/eller minst én N-terminalt trunkert art av modent hepcidin kjent å dannes i de samme pattedyrartene, som målt ved SPR ved 25 C. Et hepcidin- 25-selektivt antistoff ifølge oppfinnelsen kan i tillegg eller eventuelt binde til hepcidin-25, men binder ikke, eller binder minimalt, til minst én forløperform av hepcidin-25 og/eller minst én N-terminalt trunkert art av modent hepcidin kjent å dannes i de samme pattedyrartene som bestemt ved hjelp av immunoassayog/eller MALDI-TOF-massespektrometrimetoder anvendt av fagmannen, inkludert, men ikke begrenset til, assayet beskrevet i eksempel 5 heri. Fortrinnsvis binder et anti-hepcidin-25-selektivt antistoff ifølge den foreliggende
9 5 10 15 20 25 30 35 oppfinnelse humant hepcidin-25 med en K D på 1000, 500, 200, 100, 50, 10 eller 5 ganger mindre enn antistoffet binder humant pro-hepcidin, fortrinnsvis humant pro-hepcidin med aminosyresekvensen vist i SEQ ID NO: 34, og/eller minst én N-terminalt trunkert form av humant modent hepcidin, som målt ved hjelp av SPR ved 25 C. Et anti-hepcidin-25-selektivt antistoff ifølge oppfinnelsen binder i tillegg eller eventuelt til humant hepcidin-25, men binder ikke eller binder minimalt til humant pro-hepcidin, fortrinnsvis humant pro-hepcidin med aminosyresekvensen vist i SEQ ID NO: 34, og/eller minst én N-terminalt trunkert art av modent hepcidin kjent å dannes i de samme pattedyrartene som bestemt ved hjelp av immunoassay- og/eller MALDI-TOF-massespektrometrimetoder anvendt av fagmannen, inkludert, men ikke begrenset til, assayet beskrevet i eksempel 5 heri. Mer foretrukket binder et anti-hepcidin-25-selektivt antistoff ifølge den foreliggende oppfinnelse humant hepcidin-25 med en K D på 1000, 500, 200, 100, 50, 10 eller 5 ganger mindre enn antistoffet binder humant prohepcidin med aminosyresekvensen vist i SEQ ID NO: 34, og minst én N-terminalt trunkert form av humant modent hepcidin, som målt ved hjelp av SPR ved 25 C. Et anti-hepcidin-25-selektivt antistoff ifølge oppfinnelsen binder i tillegg eller eventuelt til humant hepcidin-25, men binder ikke eller binder minimalt til humant pro-hepcidin (SEQ ID NO: 34), og minst én N-terminalt trunkert art av modent hepcidin kjent å dannes i de samme pattedyrartene som bestemt ved hjelp av immunoassay- og/eller MALDI-TOF-massespektrometrimetode anvendt av fagmannen, inkludert, men ikke begrenset til,assayet beskrevet i eksempel 5 heri. Mest foretrukket binder et anti-hepcidin-25-selektivt antistoff ifølge den foreliggende oppfinnelse i) humant hepcidin-25 med en K D på 1000, 500, 200, 100, 50, 10 eller 5 ganger mindre enn antistoffet binder humant pro-hepcidin ( SEQ ID NO: 34) og ii) humant hepcidin-25 med en K D på 1000, 500, 200, 100, 50, 10 eller 5 ganger mindre enn antistoffet binder humant hepcidin-20 (dvs. aminosyre 6 25 til SEQ ID NO: 1) og/eller humant hepcidin-22 (aminosyre 4 25 til SEQ ID NO: 1) som målt ved hjelp av SPR ved 25 C. Et anti-hepcidin-25- selektivt antistoff ifølge oppfinnelsen binder i tillegg eller eventuelt til humant hepcidin-25, men binder ikke eller binder minimalt til i) humant pro-hepcidin (SEQ ID NO: 34) og ii) humant hepcidin-20 og/eller humant hepcidin-22, som bestemt ved hjelp av immunoassay- og/eller MALDI-TOFmassespektrometrimetoder anvendt av fagpersoner, inkludert, men ikke begrenset til, assayet beskrevet i eksempel 5 heri.
10 5 Betegnelsen "detektere" eller "detektering" anvendes i videste forstand for å inkludere kvantitative, semikvantitative eller kvalitative målinger av et målmolekyl. I et aspekt kan heri beskrevne fremgangsmåter bare bestemme nærvær eller fravær av et bestemt hepcidinpolypeptid i en biologisk prøve og således at hepcidinpolypeptidet er detekterbart eller eventuelt udetekterbart i prøven som bestemt ved fremgangsmåten. 10 Betegnelsen "epitop" viser til den delen av et molekyl som er i stand til å bli gjenkjent og bundet av et antistoff ved én eller flere av antistoffets antigenbindingsregioner. 15 20 25 Betegnelsen "bioaktivitet", når det henvises til et antistoff ifølge oppfinnelsen, inkluderer, men er ikke begrenset til epitop- eller antigenbindingsaffinitet, antistoffets stabilitet in vivo og/eller in vitro, antistoffets immunogene egenskaper, f.eks. når det administreres til en human pasient, og/eller evnen til å nøytralisere eller antagonisere en bioaktivitet av hepcidin, in vivo eller in vitro, inkludert, men ikke begrenset til, inhibering av serumjernnivådysregulering i en inflammasjon, f.eks. IL-6, provokasjonsassay, f.eks. som beskrevet i eksempel 4 heri. De ovennevnte egenskapene eller karakteristikkene kan observeres eller måles ved hjelp av teknikker anerkjent i teknikken, inkludert, men ikke begrenset til, scintillasjonsproksimitetsassayer, ELISA, ORIGEN-immunoassay (IGEN), fluorescerende bråkjølingsteknikk, fluorescerende ELISA, kompetitiv ELISA, SPR-analyse, inkludert, men ikke begrenset til, SPR-analyse ved hjelp av en BIAcore-biosenser, in vitro- og in vivo-nøytraliseringsassayer uten grense (se for eksempel internasjonal publikasjon nr. WO 2006/062685), reseptorbinding og immunhistokjemi med vevseksjoner fra forskjellige kilder, herunder menneske, primat eller en hvilken som helst annen kilde etter behov. 30 35 Betegnelsen "bioaktivitet" med henvisning til modent hepcidin, herunder hepcidin-25, inkluderer, men er ikke begrenset til, spesifikk binding av modent hepcidin til et annet protein, inkludert, men ikke begrenset til, dets reseptorferroportin, én eller flere ferroportinmedierte funksjoner av modent hepcidin, slik som modent hepcidin-indusert internalisering og/eller degradering av ferroportin (se for eksempel Nemeth, E., et al., Hepcidin Regulates Iron Efflux by Binding to Ferroportin and Inducing Its Internalization, Science 306, 2090 2093, (2004)), modent hepcidin-regulering av ferroportinmediert jerneffluks,
11 5 10 serumjernnivåer, retikulocyttantall, antall av røde blodceller, hemoglobin og/eller hematokritt hos et menneske, proteinstabilitet, dvs. modent hepcidin som påvirker nivåene eller aktiviteten til et annet protein in vivo eller in vitro og hepcidinekspresjonsnivåer og/eller vevsdistribusjon. Betegnelsen "inhibere" eller "nøytralisere" som anvendt heri med hensyn til bioaktiviteten til et antistoff ifølge oppfinnelsen betyr evnen til i det vesentlige å antagonisere, prohibere, forhindre, begrense, senke, oppløse, eliminere, stoppe, redusere eller reversere en bioaktivitet av humant modent hepcidin, inkludert, men ikke begrenset til, humant modent hepcidin-bioaktivitet som målt i eksempel 3 eller 4 heri. 15 20 25 Antistoffene ifølge den foreliggende oppfinnelse karakteriseres ved å ha en K D for humant hepcidin-25 på mindre enn 1000 pm, fortrinnsvis mindre enn 800 pm, mer foretrukket mindre enn 400 pm, enda mer foretrukket mindre enn 200 pm, enda mer foretrukket mindre enn 100 pm, enda mer foretrukket mindre enn 75 pm, eller mest foretrukket mindre enn 50 pm, som bestemt ved SPR ved 25 C. Antistoffet binder fortrinnsvis selektivt humant hepcidin-25 med en K D på mindre enn 800 pm, fortrinnsvis mindre enn 400 pm, mer foretrukket mindre enn 200 pm, enda mer foretrukket mindre enn 100 pm, enda mer foretrukket mindre enn 75 pm, eller mest foretrukket mindre enn 50 pm, som bestemt ved SPR ved 25 C også selektivt binder minst ett hepcidin-25 av annen art, slik som cynomolgous-ape hepcidin-25. Mer foretrukket binder slike antistoffer selektivt cynomolgous-ape hepcidin-25 med en K D på mindre enn 800 pm, enda mer foretrukket mindre enn 400 pm, enda mer foretrukket mindre enn 200 pm, enda mer foretrukket mindre enn 100 pm, enda mer foretrukket mindre enn 75 pm, eller mest foretrukket mindre enn 50 pm, som bestemt ved hjelp av SPR ved 25 C. 30 35 Antistoffene ifølge den foreliggende oppfinnelse inkluderer anti-hepcidin-25- selektive antistoffer med en K D for humant hepcidin-25 på mellom 800 pm og 30 pm, fortrinnsvis mellom 400 pm og 30 pm, mer foretrukket mellom 200 pm og 30 pm, enda mer foretrukket mellom cirka 100 pm og 30 pm, enda mer foretrukket mellom 75 pm og 30 pm, eller mest foretrukket mellom 50 pm og 30 pm, som bestemt ved SPR ved 25 C. Fortrinnsvis har slike antistoffer også en K D for hepcidin-25 hos cynomolgous-ape på mellom 800 pm og 10 pm, mer
12 5 10 foretrukket mellom 400 pm og 10 pm, enda mer foretrukket mellom 200 pm og 10 pm, enda mer foretrukket mellom 100 pm og 10 pm, enda mer foretrukket mellom 75 pm og 10 pm, eller mest foretrukket mellom 50 pm og 10 pm, som bestemt ved SPR ved 25 C. Antistoffene ifølge den foreliggende oppfinnelse inkluderer også antistoffer med en K D for humant hepcidin-25 og/eller hepcidin-25 hos cynomolgous-ape på minst 20 ganger, minst 30 ganger, minst 40 ganger, minst 50 ganger, minst 60 ganger, minst 70 ganger, minst 80 ganger, minst 90 ganger, minst 100 ganger eller minst 200 ganger mindre enn antistoffets K D for hepcidin-25 hos mus og/eller rotte hepcidin-25, som bestemt ved SPR ved 25 C. 15 20 Antistoffene ifølge den foreliggende oppfinnelse inkluderer også antistoffer med en k off -hastighet fra humant hepcidin-25 på mellom 1 x 10 2 s -1 og 1,8 x 10 4 s -1, fortrinnsvis mellom 8,5 x 10 3 s -1 og 1,8 x 10 4 s -1, mer foretrukket mellom 7,7 x 10 4 s -1 og 1,8 x 10 4 s -1, enda mer foretrukket mellom 6,5 x 10 5 s -1 og 1,8 x 10 4 s -1 eller mest foretrukket mellom 5,5 x 10 4 s -1 og 2,0 x 10 4 s -1, som bestemt ved SPR ved 25 C. Fortrinnsvis binder også et slikt antistoff selektivt humant hepcidin-25 med en K D på mellom 800 pm og 30 pm, enda mer foretrukket mellom 400 pm og 30 pm, enda mer foretrukket mellom 200 pm og 30 pm, enda mer foretrukket mellom 100 pm og 30 pm, enda mer foretrukket mellom 75 pm og 50 pm, eller mest foretrukket mellom 50 pm og 30 pm, som bestemt ved SPR ved 25 C. 25 30 Den foreliggende oppfinnelse inkluderer også antistoffer som binder humant hepcidin-25, fortrinnsvis selektivt, med en K D på 200 pm eller mindre og nøytraliserer eller antagoniserer minst en humant modent hepcidin-bioaktivitet in vitro eller in vivo. Et antistoff ifølge oppfinnelsen har fortrinnsvis en IC 50 på mindre enn 200 nm, mer foretrukket mindre enn 100 nm, enda mer foretrukket mindre enn 75 nm, eller mest foretrukket mindre enn 50 nm i et assay in vitro eller in vivo av modent hepcidin-bioaktivitet som for eksempel beskrevet i eksempel 3 eller 4 heri. 35 Et antistoff ifølge oppfinnelsen inkluderer også anti-humant hepcidin-25- bindende, fortrinnsvis selektiv bindende, antistoffer som i det vesentlige inhiberer IL-6-indusert serumjernreduksjoner i et cynomolgus-ape-assay som
13 5 beskrevet i for eksempel eksempel 4 heri. Slike antistoffer inhiberer fortrinnsvis serumjernreduksjoner hos en cynomolgus-ape indusert av en 5 µg/kg dose av humant IL-6 med minst 30 %, minst 40 %, minst med 50 %, minst med 60 %, minst 70 %, minst 80 %, minst med 90 %, eller minst med 100 % innen 6 timer etter å ha mottatt en intravenøs dose av antistoffet ved cirka 10 mg/kg. 10 15 Et antistoff ifølge oppfinnelsen har en IC 50 på mindre enn 200 nm, fortrinnsvis mindre enn 100 nm, mer foretrukket mindre enn 75 nm, enda mer foretrukket mindre enn 50 nm eller mest foretrukket mindre enn 25 nm i det modent hepcidin-induserte ferroportininternaliseringsassayet beskrevet i eksempel 3 heri. Et antistoff ifølge oppfinnelsen har fortrinnsvis en IC 50 på mellom 200 nm og 25 nm, mer foretrukket mellom cirka 100 nm og 50 nm, mer foretrukket mellom 100 nm og 25 nm, enda mer foretrukket mellom 75 nm og 25 nm eller mest foretrukket mellom 75 nm og 50 nm i det modent hepcidin-induserte ferroportininternaliseringsassayet beskrevet i eksempel 3 heri. 20 25 30 I en annen utførelsesform har et antistoff ifølge oppfinnelsen en IC 50 mellom 200 nm og 25 nm, fortrinnsvis mellom 100 nm og 50 nm, mer foretrukket mellom 100 nm og 25 nm, enda mer foretrukket mellom 75 nm og 25 nm, eller mest foretrukket mellom 75 nm og 50 nm i det hepcidin-induserte ferroportininternaliseringsassayet beskrevet i eksempel 3, en k off -hastighet fra humant hepcidin-25 på mellom 1 x 10 2 s -1 og cirka 1,8 x 10 4 s -1, fortrinnsvis mellom 8,5 x 10 3 s -1 og 1,8 x 10 4 s -1, mer foretrukket mellom cirka 7,7 x 10 4 s -1 og 1,8 x 10 4 s -1, enda mer foretrukket mellom 6,5 x 10 4 s -1 og 1,8 x 10 4 s -1 eller mest foretrukket mellom 5,5 x 10 4 s -1 og 2,0 x 10 4 s -1, som bestemt ved hjelp av SPR ved 25 C, og selektivt binder humant hepcidin-25 med en K D på mellom 800 pm og 30 pm, fortrinnsvis mellom 400 pm og 30 pm, mer foretrukket mellom 200 pm og 30 pm, enda mer foretrukket mellom 100 pm og 30 pm, enda mer foretrukket mellom 75 pm og 50 pm eller mest foretrukket mellom 50 pm og 30 pm, som bestemt ved SPR ved 25 C. 35 Betegnelsen "Kabat-nummerering" som anvendt heri erkjennes i teknikken og refererer til et nummereringssystem for aminosyrerester som er mer variable (dvs. hypervariable) enn andre aminosyrerester i et antistoffs tung- og lettkjederegioner (Kabat, et al., Ann. NY Acad. Sci. 190:382 93 (1971), Kabat, et al.,
14 Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242 (1991)). 5 Et polynukleotid er "operativt bundet" når det plasseres i et funksjonelt forhold med et annet polynukleotid. En promoter eller enhancer er for eksempel operativt bundet til en kodingssekvens hvis den påvirker sekvensens transkripsjon. 10 Betegnelsen "pasient" refererer til et pattedyr, fortrinnsvis et menneske. I visse utførelsesformer har pasienten en forstyrrelse som vil dra fordel av et redusert hepcidin-25-nivå, en reduksjon i hepcidin-25-bioaktivitet og/eller en økning i serumjernnivå, retikulocyttantall, antall av røde blodceller, hemoglobin og/eller hematokritt. 15 20 Betegnelsen "vektor" viser til et nukleinsyremolekyl som kan transportere en annen nukleinsyre hvortil den er blitt operativt bundet, inkludert, men ikke begrenset til, plasmider og viralvektorer. Visse vektorer kan utføre autonom replikasjon i en vertscelle hvortil de tilføres, mens andre vektorer kan integreres i genomet til en vertscelle ved tilførsel til vertscellen og derved replikeres sammen med vertsgenomet. Visse vektorer kan videre styre ekspresjonen av genene hvortil de er operativt bundet. Slike vektorer betegnes heri som "rekombinante ekspresjonsvektorer" (eller bare "ekspresjonsvektorer"). Eksempler på vektorer er velkjent i teknikken. 25 30 Som anvendt heri anvendes uttrykkene "celle" og "vertscelle" om hverandre og betyr en hvilken som helst prokaryotisk celle (f.eks. bakterieceller slik som E. coli) eller fortrinnsvis eukaryotisk celle (f.eks. gjærceller, planteceller, insektsceller eller pattedyrceller slik som CHO-celler) som enten er lokalisert in vitro eller in vivo. En vertscelle inkluderer celler som er transformert, transdusert, transfektert eller infisert med én eller flere rekombinante ekspresjonsvektorer omfattende et polynukleotid som koder for et antistoff ifølge oppfinnelsen. En vertscelle kan være lokalisert in vitro eller in vivo. Vertsceller kan for eksempel være plassert i et transgent dyr eller en transgen plante. 35 Hver tung kjede i et fullengde antistoff omfatter en N-terminal tungkjede variabel region (heri "HCVR") og en C-terminal tungkjede konstant region. Hver
15 5 10 lett kjede i et fullengde antistoff omfatter en N-terminal lettkjede variabel region (heri "LCVR") og en C-terminal lettkjede konstant region. HCVR-ene og LCVRene kan videre deles opp i hypervariabilitetsregioner, kalt komplementaritetsbestemmende regioner ("CDR-er"), innlagt med regioner som er mer konservert, kalt strukturregioner ("FR"). Et antistoffs funksjonelle evne til å binde et bestemt antigen eller epitop er i hovedsak påvirket av de seks CDRene som finnes i antistoffets variable region. Hver HCVR og LCVR er sammensatt av tre CDR-er (HCDR1, HCDR2 og HCDR3 i HCVR-en og LCDR1, LCDR2 og LCDR3 i LCVR-en) og fire strukturregioner ordnet fra amino-terminal til karboksy-terminal i følgende rekkefølge: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 15 20 25 Betegnelsen "CDR" eller "komplementaritetsbestemmende region" som anvendt heri er følgelig ment å bety ikke-tilstøtende antigenkombineringssteder funnet i den variable regionen til både tungkjede- og lettkjede-polypeptider. Disse bestemte regionene er beskrevet av Kabat, et al., J. Biol. Chem. 252, 6609 6616 (1977), Kabat, et al., Sequences of protein of immunological interest, (1991), og av Chothia, et al., J. Mol. Biol. 196:901 917 (1987) og av MacCallum, et al., J. Mol. Biol., 262:732 745 (1996), hvor definisjonene inkluderer overlapping eller undergrupper av aminosyrerester når de sammenlignes med hverandre. I den foreliggende beskrivelsen er aminosyrenes tilordning til hvert domene i samsvar med velkjente konvensjoner (f.eks. Kabat, (1991) og/eller Chothia (1987)). CDR-ene inneholder mesteparten av restene som danner bestemte interaksjoner med antigenet. Tabell 1 og 2 nedenfor viser aminosyresekvensene og konsensusaminosyresekvensene som koder for foretrukne CDR-er for antistoffer ifølge den foreliggende oppfinnelse.
16 Tabell 1 Fab LCDR1 LCDR2 LCDR3 JXB7 31B2 Hu22 SASSSVSSTYLH (SEQ ID NO: 26) SASSSVSSTYLH (SEQ ID NO: 26) SASSRVSSTYLF (SEQ ID NO: 43) 1 SLSSRVSSTYLF (SEQ ID NO: 47) 2 SISSRVSSTYLF (SEQ ID NO: 48) 3 SWSSRVSSTYLF (SEQ ID NO: 49) 4 SAGSRVSSTYLF (SEQ ID NO: 50) 5 SASSRVVSTYLF (SEQ ID NO: 51) 6 SASSRVSSTYLF (SEQ ID NO: 43) 7 SASSRVSSTYLF (SEQ ID NO: 43) 8 SASSRVSSTYLF (SEQ ID NO: 43) 9 SASSRVSSTYLF (SEQ ID NO: 43) 10 SASSRVSSTYLF (SEQ ID NO: 43) 11 SASSRVSSTYLF (SEQ ID NO:43) 12 SASSRVSSTYLF (SEQ ID NO: 43) 13 SASSRVSSTYLF (SEQ ID NO: 43) *Konsensus SX 1 X 2 SX 3 VSSTYLF (SEQ ID NO: 52) RTSTLAS (SEQ ID NO: 30) RTSTLAS (SEQ ID NO: 30) RTSTLAS (SEQ ID NO: 30) RTSTLAS (SEQ ID NO: 30) RTSTLAS (SEQ ID NO: 30) RTSTLAS (SEQ ID NO: 30) RTSTLAS (SEQ ID NO: 30) RTSTLAS (SEQ ID NO: 30) RTSPLAS (SEQ ID NO: 53) RTSALAS (SEQ ID NO: 54) RTSWLAS (SEQ ID NO: 55) RTSTGAS (SEQ ID NO: 56) RTSTLTS (SEQ ID NO: 57) RTSTLVS (SEQ ID NO: 58) RTSTLLS (SEQ ID NO: 59) RTSTLAS (SEQ ID NO: 30) RTSX 4 X 5 X 6 S (SEQ ID NO: 60) QQWSGYPFT (SEQ ID NO:31) QQWSGYPFT (SEQ ID NO:31) QQWSGYPFT (SEQ ID NO:31) QQWSGYPFT (SEQ ID NO: 31) QQWSGYPFT (SEQ ID NO: 31) QQWSGYPFT (SEQ ID NO: 31) QQWSGYPFT (SEQ ID NO: 31) QQWSGYPFT (SEQ ID NO: 31) QQWSGYPFT (SEQ ID NO: 31) QQWSGYPFT (SEQ ID NO: 31) QQWSGYPFT (SEQ ID NO: 31) QQWSGYPFT (SEQ ID NO: 31) QQWSGYPFT (SEQ ID NO:31) QQWSGYPFT (SEQ ID NO: 31) QQWSGYPFT (SEQ ID NO:31) QQWSGYPFV (SEQ ID NO:61) QQWSGYPFX 7 (SEQ ID NO: 62) * X 1 er A, L, I, eller W; X 2 er S eller G; X 3 er R eller S; X 4 er T, P, A, eller W; X 5 er L eller G; X 6 er A, T, V, eller L; X 7 er T eller V
17 Tabell 2 Fab HCDR1 HCDR2 HCDR3 JXB7 31B2 Hu22 GYTFTIYPIE (SEQ ID NO: 27) GYTFYIYPIS (SEQ ID NO: 29) GYTFTIYPIS (SEQ ID NO: 32) NFHPYNGDTNYNEKFKG (SEQ ID NO: 28) NFHPYKGLTNYNEKFKG (SEQ ID NO: 33) NFHPYLGDTNYNEKFKG (SEQ ID NO: 44) GGTGSFDY (SEQ ID NO: 46) GGTGSFDY (SEQ ID NO: 46) GGTGSFDY (SEQ ID NO: 46) 14 GYTFLIYPIS (SEQ ID NO: 63) 15 GYTFWIYPIS (SEQ ID NO: 64) 16 GYTFTIYPIS (SEQ ID NO: 32) 17 GYTFTIYPIS (SEQ ID NO: 32) 18 GYTFTIYPIS (SEQ ID NO: 32) 19 GYTFTIYPIS (SEQ ID NO: 32) 20 GYTFTIYPIS (SEQ ID NO: 32) 21 GYTFTIYPIS (SEQ ID NO: 32) 22 GYTFTIYPIS (SEQ ID NO: 32) 23 GYTFTIYPIS (SEQ ID NO: 32) *Konsensus GYTFX S IYPI X 9 (SEQ ID NO: 65) NFHPYLGDTNYNEKFKG (SEQ ID NO: 44) NFHPYLGDTNYNEKFKG (SEQ ID NO: 44) NFHPYLGTTNYNEKFKG (SEQ ID NO: 66) NFHPYLGLTNYNEKFKG (SEQ ID NO: 67) NFHPYLGVTNYNEKFKG (SEQ ID NO: 68) NFHPYLGMTNYNEKFKG (SEQ ID NO: 69) NFHPYLGDANYNEKFKG (SEQ ID NO: 70) NFHPYLGDTNYNEKFKG (SEQ ID NO: 44) NFHPYLGDTNYNEKFKG (SEQ ID NO: 44) NFHPYLGDTNYNEKFKG (SEQ ID NO: 44) NFHPYLGX 10 XI 11 NYNEKFKG (SEQ ID NO: 71) GGTGSFDY (SEQ ID NO: 46) GGTGSFDY (SEQ ID NO: 46) GGTGSFDY (SEQ ID NO: 46) GGTGSFDY (SEQ ID NO: 46) GGTGSFDY (SEQ ID NO: 46) GGTGSFDY (SEQ ID NO: 46) GGTGSFDY (SEQ ID NO: 46) GGFGSFDY (SEQ ID NO: 72) GGTGAFDY (SEQ ID NO: 73) GGTGSFPY (SEQ ID NO: 74) GGX 12 GX 13 FX 14 Y (SEQ ID NO: 75) * X 8 er T, W, Y, eller L; X 9 er S eller E; X 10 er D, T, L,V, eller M; X 11 er T eller A; X 12 er T eller F; X 13 er S eller A; X 14 er D eller P 5 SEQ ID NO for aminosyresekvensene og konsensusaminosyresekvensene som koder for mer foretrukne CDR-er for antistoffer ifølge den foreliggende oppfinnelse er angitt i tabell 3 nedenfor.
18 Tabell 3 Fab LCDR1 SEQ ID NO: LCDR2 SEQ ID NO: LCDR3 SEQ ID NO: HCDR1 SEQ ID NO: HCDR2 SEQ ID NO: HCDR3 SEQ ID NO: 1,5 43 57 61 63 80 46 1,7 43 58 61 32 81 46 1,10 43 53 61 63 82 46 1,13 43 57 61 63 83 46 1,15 43 30 61 63 82 46 3,2 43 53 61 63 84 46 3,6 43 53 61 32 84 46 3,7 43 57 61 63 85 46 3,8 43 53 31 63 84 46 3,9 43 53 61 63 86 46 3,12 43 57 61 63 84 46 3,23 43 53 61 63 85 46 Hu22 43 30 31 32 44 46 L1,5 41 53 31 63 84 46 H1,39 43 53 31 78 84 46 *Konsensus 42 76 62 79 87 46 5 10 15 Humane lettkjede konstante regioner er klassifisert som kappa eller lambda og karakteriseres av en bestemt konstant region som er kjent i teknikken. Humane tungkjede konstante regioner er klassifisert som gamma, mu, alfa, delta eller epsilon og definerer antistoffets isotype som henholdsvis IgG, IgM, IgA, IgD og IgE, og flere av disse kan videre deles inn i underklasser, f.eks. IgG 1, IgG 2, IgG 3, IgG 4. Hver tungkjede-type har en bestemt konstant region med en sekvens som er velkjent i teknikken. Lettkjede konstant region kappa og tungkjede konstant region IgG 1, IgG 2 og IgG 4 er foretrukne konstante regioner i antistoffene ifølge oppfinnelsen. Foretrukne humane tungkjede konstante regioner for antistoffene ifølge den foreliggende oppfinnelse er de tungkjede konstante regionenes aminosyresekvenser som vist i SEQ ID NO: 90 94 og en hvilken som helst variant derav med 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 eller cirka 15 aminosyreendringer (herunder substitusjoner, innskudd eller delesjoner). Mer foretrukne humane tungkjede konstante regioner for antistoffene ifølge den
19 5 10 foreliggende oppfinnelse er de tungkjede konstante regionenes aminosyresekvenser som vist i SEQ ID NO: 93 og 94. Den humane tungkjede konstante regionen for antistoffene ifølge den foreliggende oppfinnelse som er mest foretrukket, er den tungkjede konstante regionens aminosyresekvens vist i SEQ ID NO: 93. Foretrukne humane lettkjede konstante regioner for antistoffene ifølge den foreliggende oppfinnelse er de lettkjede konstante regionenes kappaaminosyresekvens som vist i SEQ ID NO: 89 og en hvilken som helst variant derav med 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 eller cirka 10 aminosyreendringer (herunder substitusjoner, innskudd eller delesjoner). Den humane lettkjede konstante regionen for antistoffene ifølge den foreliggende oppfinnelse som er mest foretrukket, er den lettkjede konstante regionens kappa-aminosyresekvens som vist i SEQ ID NO:89. 15 20 25 30 35 Som anvendt heri refererer "antigenbindingsregion" eller "antigenbindingsdel" til den delen av et antistoffmolekyl, innenfor den variable regionen, som inneholder aminosyrerestene som interagerer med et antigen og gir antistoffet dets spesifisitet og affinitet for antigenet. Denne antistoffdelen inkluderer strukturaminosyrerestene som er nødvendige for å opprettholde riktig konformasjon for antigenbindingsrestene. Den foreliggende oppfinnelse inkluderer et antistoff som selektivt binder hepcidin-25 med en K D på cirka 800 pm eller mindre som bestemt ved SPR ved 25 C, og hvor antistoffet omfatter minst én CDR valgt fra gruppen bestående av i) en HCDR3 med aminosyresekvensen som vist i SEQ ID NO: 75, og ii) en LCDR3 med aminosyresekvensen som vist i SEQ ID NO: 62. Et slikt antistoff omfatter fortrinnsvis seks CDR-er omfattende aminosyre- og/eller konsensusaminosyresekvenser valgt fra gruppen bestående av: i) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 og HCDR3 med aminosyresekvenser som vist i henholdsvis SEQ ID NO: 52, 60, 62, 65, 71, og 75, og ii) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 og HCDR3 med aminosyresekvensene som vist i henholdsvis SEQ ID NO: 42, 76, 62, 79, 87 og 46. Et antistoff ifølge den foreliggende oppfinnelse omfatter mer foretrukket seks CDR-er valgt fra gruppen bestående av: i) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 og HCDR3 med aminosyresekvenser som vist i henholdsvis SEQ ID NO: 41, 53, 31, 63, 84 og 46, ii) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 og HCDR3 med aminosyresekvensene som vist i henholdsvis SEQ ID NO: 43, 30, 31, 32, 44 og
20 5 10 15 20 46, iii) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 og HCDR3 med aminosyresekvensene som vist i henholdsvis SEQ ID NO: 43, 53, 61, 63, 85, og 46, og iv) LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1, HCDR2 og HCDR3 med aminosyresekvensene som vist i henholdsvis SEQ ID NO: 43, 57, 61, 63, 84 og 46. Antistoffet ifølge oppfinnelsen omfatter enda mer foretrukket to tungkjedepolypeptider og to lettkjede-polypeptider, og hvor hvert av tungkjedepolypeptidene har aminosyresekvensen som vist i SEQ ID NO: 9 og hvert av lettkjede-polypeptidene har aminosyresekvensen som vist i SEQ ID NO: 17. Antistoffet har enda mer foretrukket en IC 50 på mellom cirka 100 nm og cirka 50 nm i det hepcidin-induserte ferroportininternaliseringsassayet beskrevet i eksempel 3, en k off -hastighet fra humant hepcidin-25 på mellom cirka 5,5 x 10 4 s -1 og cirka 2,0 x 10 4 s -1, som bestemt ved SPR ved 25 C, og binder selektivt humant hepcidin-25 med en K D på mellom cirka 100 pm og cirka 50 pm. Antistoffet ifølge oppfinnelsen omfatter mest foretrukket to tungkjedepolypeptider og to lettkjede-polypeptider, og hvor hvert av tungkjedepolypeptidene har aminosyresekvensen som vist i SEQ ID NO: 8 og hvert av lettkjede-polypeptidene har aminosyresekvensen som vist i SEQ ID NO: 16, hvor antistoffet har em IC 50 på mellom cirka 100 nm og cirka 50 nm i det hepcidininduserte ferroportininternaliseringsassayet beskrevet i eksempel 3, en k off - hastighet fra humant hepcidin-25 på mellom cirka 5,5 x 10 4 s -1 og cirka 2,0 x 10 4 s -1, som bestemt ved hjelp av SPR ved 25 C, og binder selektivt humant hepcidin-25 med en K D på mellom cirka 100 pm og cirka 50 pm. 25 30 35 Andre foretrukne antistoffer ifølge oppfinnelsen omfatter en LCVR med en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEQ ID NO: 124, 125, 126 og 127. Et antistoff ifølge oppfinnelsen omfatter mer foretrukket en HCVR med en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEQ ID NO: 148, 128, 150 og 151. Et antistoff ifølge oppfinnelsen omfatter enda mer foretrukket en LCVR med SEQ ID NO: 126 og en HCVR med SEQ ID NO: 148. Et antistoff ifølge oppfinnelsen omfatter enda mer foretrukket en LCVR med SEQ ID NO: 127 og en HCVR med SEQ ID NO: 148. Et antistoff ifølge oppfinnelsen omfatter enda mer foretrukket en LCVR med SEQ ID NO: 125 og en HCVR med SEQ ID NO: 151. Et mest foretrukket antistoff ifølge oppfinnelsen omfatter en LCVR med SEQ ID NO: 124 og en HCVR med SEQ ID NO: 150. Slike LCVR-er er fortrinnsvis bundet til en lettkjede konstant region av human opprinnelse eller avledet av en lettkjede konstant region av human opprinnelse, fortrinnsvis en human kappa-kjede og
21 5 10 mest foretrukket en kappa-kjede med SEQ ID NO: 89. Slike HCVR-er er fortrinnsvis bundet til en tungkjede konstant region av human opprinnelse eller avledet av en tungkjede konstant region av human opprinnelse, fortrinnsvis IgG 1, IgG 2 eller IgG 4, mer foretrukket, en tungkjede konstant region omfattende en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av SEQ ID NO: 90, 91, 92, 93 og 94, og mest foretrukket en tungkjede konstant region omfattende aminosyresekvensen med SEQ ID NO: 93. Antistoffet har fortrinnsvis en IC 50 på mellom cirka 100 nm og cirka 50 nm i det hepcidin-induserte ferroportininternaliseringsassayet beskrevet i eksempel 3, en k off -hastighet fra humant hepcidin-25 på mellom cirka 5,5 x 10 4 s -1 og cirka 2,0 x 10 4 s -1, som bestemt ved SPR ved 25 C, og binder selektivt humant hepcidin-25 med en K D på mellom cirka 100 pm og cirka 50 pm. 15 20 Et antistoff ifølge oppfinnelsen kan omfatte et tungkjede-polypeptid med en aminosyresekvens som vist i SEQ ID NO: 6 og et lettkjede-polypeptid med en aminosyresekvens som vist i SEQ ID NO: 14. Et tungkjede-polypeptid med en aminosyresekvens som vist i SEQ ID NO: 6 kan kodes av en polynukleotidsekvens med SEQ ID NO: 2. Et lettkjede-polypeptid med en aminosyresekvens som vist i SEQ ID NO: 14 kan kodes av et polynukleotid med nukleinsyresekvensen som vist i SEQ ID NO: 10. 25 Et antistoff ifølge oppfinnelsen omfatter et tungkjede-polypeptid med en aminosyresekvens som vist i SEQ ID NO: 7 og et lettkjede-polypeptid med en aminosyresekvens som vist i SEQ ID NO: 15. Et tungkjede-polypeptid med en aminosyresekvens som vist i SEQ ID NO: 7 kan kodes av en polynukleotidsekvens med SEQ ID NO: 3. Et lettkjede-polypeptid med en aminosyresekvens som vist i SEQ ID NO: 15 kan kodes av et polynukleotid med nukleinsyresekvensen som vist i SEQ ID NO: 11. 30 35 Et antistoff ifølge oppfinnelsen omfatter også et tungkjede-polypeptid med en aminosyresekvens som vist i SEQ ID NO: 8 og et lettkjede-polypeptid med en aminosyresekvens som vist i SEQ ID NO: 16. Et tungkjede-polypeptid med en aminosyresekvens som vist i SEQ ID NO: 8 kan kodes av en polynukleotidsekvens som vist i SEQ ID NO: 4. Et lettkjede-polypeptid med en aminosyresekvens som vist i SEQ ID NO: 16 kan kodes av et polynukleotid med nukleinsyresekvensen som vist i SEQ ID NO: 12.
22 5 I en annen utførelsesform omfatter et antistoff ifølge oppfinnelsen et tungkjedepolypeptid med en aminosyresekvens som vist i SEQ ID NO: 9 og et lettkjedepolypeptid med en aminosyresekvens som vist i SEQ ID NO: 17. Et tungkjedepolypeptid med en aminosyresekvens som vist i SEQ ID NO: 9 kan kodes av en polynukleotidsekvens med SEQ ID NO: 5. Et lettkjede-polypeptid med en aminosyresekvens som vist i SEQ ID NO: 17 kan kodes av et polynukleotid med nukleinsyresekvensen som vist i SEQ ID NO: 13. 10 Foretrukne humant konstruerte antistoffer ifølge oppfinnelsen kalles heri Mabs L1.5, Hu22, 3.12 og 3.23. SEQ ID NO for aminosyresekvensene som koder for de tunge kjedene, de lette kjedene, de tung- og lettkjede variable regionene og CDR-er for Mabs L1.5, Hu22, 3.12 og 3.23 er angitt i tabell 4 nedenfor. Tabell 4 Mab Tung Lett HCV HC HC HC LCV LC LC LC kjede kjede R CDR1 CDR2 CDR3 R CDR1 CDR2 CDR3 L1.5 6 14 148 63 84 46 126 41 53 31 Hu2 2 7 15 128 32 44 46 127 43 30 31 3.12 8 16 150 63 84 46 124 43 57 61 3.23 9 17 151 63 85 46 125 43 53 61 15 20 25 Alminnelige molekylærbiologiteknikker anvendes for å fremstille den rekombinante ekspresjonsvektoren, transfektere vertscellene, velge for transformanter, isolerte vertscellelinjer som produserer et antistoff ifølge oppfinnelsen, dyrke disse vertscellene og gjenvinne antistoffet fra kulturmediet. Den foreliggende oppfinnelse er også rettet mot vertsceller som uttrykker et anti-hepcidin-antistoff ifølge oppfinnelsen. En rekke vertsekspresjonssystemer kjent i teknikken kan anvendes for å uttrykke et antistoff ifølge den foreliggende oppfinnelse, herunder prokaryotiske (bakterielle) og eukaryotiske ekspresjonssystemer (slik som gjær-, bakulovirus-, plante-, pattedyr- og andre dyreceller, transgeniske dyr og hybridomceller) i tillegg til fagdisplayekspresjonssystemer.
23 5 10 Et antistoff ifølge oppfinnelsen kan fremstilles ved hjelp av rekombinant ekspresjon av immunglobulin lett- og tungkjede-gener i en vertscelle. For å uttrykke et antistoff rekombinant blir en vertscelle transformert, transdusert, infisert eller lignende med én eller flere rekombinante ekspresjonsvektorer som bærer DNA-fragmenter som koder for immunglobulin lette og/eller tunge kjeder i antistoffet slik at de lette og/eller tunge kjedene uttrykkes i vertscellen. Den tunge kjeden og den lette kjeden kan uttrykkes uavhengig fra forskjellige promotere hvortil de er operativt bundet i én vektor, eller eventuelt kan den tunge kjeden og den lette kjeden uttrykkes uavhengig fra forskjellige promotere hvortil de er operativt bundet i to vektorer én som uttrykker den tunge kjeden, og én som uttrykker den lette kjeden. Den tunge kjeden og lette kjeden kan eventuelt uttrykkes i forskjellige vertsceller. 15 20 Den rekombinante ekspresjonsvektoren kan i tillegg kode for et signalpeptid som letter utskilling av antistoffets lette og/eller tunge kjede fra en vertscelle. Antistoffets lett- og/eller tungkjede-gen kan klones til vektoren slik at signalpeptidet blir operativt bundet i rammen til antistoffkjedegenets aminoterminal. Signalpeptidet kan være et immunglobulinsignalpeptid eller et heterologt signalpeptid. De rekombinante antistoffene utskilles fortrinnsvis til mediet hvor vertscellene dyrkes, hvorfra antistoffene kan gjenvinnes eller renses. 25 30 Et isolert DNA som koder for en HCVR, kan konverteres til et fullengde tungkjede-gen ved operativt å binde det HCVR-kodende DNA-et til et annet DNA-molekyl som koder for tungkjede konstante regioner. Sekvenser for menneskers, og andre pattedyrs, gener i den tungkjede konstante regionen er kjent i teknikken. DNA-fragmenter omfattende disse regionene kan for eksempel oppnås ved hjelp av alminnelig PCR-amplifikasjon. Den tungkjede konstante regionen kan være en hvilken som helst type, (f.eks. IgG, IgA, IgE, IgM eller IgD), klasse (f.eks IgG 1, IgG 2, IgG 3 og IgG 4 ) eller underklasse av en konstant region og en hvilken som helst allotypisk variant derav som beskrevet i Kabat (supra). 35 Et isolert DNA som koder for en LCVR-region, kan konverteres til et fullengde lettkjede-gen (samt til et Fab-lettkjede-gen) ved operativt å binde det LCVR- kodende DNA-et til et annet DNA-molekyl som koder for lettkjede konstante